CN1305932C - 碳水化合物修饰的聚合物、其组合物及其应用 - Google Patents

碳水化合物修饰的聚合物、其组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了含有用于输送药物和其他活性试剂(例如核酸)的碳水化合物修饰的聚合物(例如环糊精修饰的聚乙烯亚胺)的组合物。还公开了含有碳水化合物修饰的聚合物载体(它在控制条件下释放该试剂)的组合物。本发明还公开了含有偶联到靶向输送药物到其作用位点的生物识别分子上的碳水化合物修饰的聚合物载体的组合物。

Description

碳水化合物修饰的聚合物、其组合物及其应用
相关申请
本申请是基于2002年2月22日提交的美国临时申请60/358,830和2002年10月10日提交的美国临时申请60/417,747，它们的说明书在这里整体引作参考。
背景技术
将核酸转移到特定细胞中是基因治疗的根本。但是，问题之一是如何成功的使足够量的核酸转移到要治疗的宿主细胞中。在这方面，选择的一个方法是将核酸整合到病毒载体中，尤其是逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒中。这些系统利用了病毒的进入细胞的机制和它们对抗降解的保护作用。但是，这些方法也有缺陷，尤其是产生能够在宿主机体中传播的感染性病毒颗粒的风险，而且，对于逆转录载体，还有插入突变的风险。另外，将治疗性的或疫苗性的基因插入到病毒基因组中的能力仍然有限。
无论如何，能够在基因治疗中使用的病毒载体的开发都需要使用缺陷病毒和互补细胞系的复杂技术。
因此，另外一个方法(Wolff等人，Science 247，1465-68，1990；Davis等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，7213-18，1996)是，向肌肉中或血液中施用天然质粒的核酸，并且结合有或者一起施用能促进其转染的化合物，例如蛋白、脂质体、带电类脂或阳离子聚合物如聚乙烯亚胺，它们是良好的体外转染剂(Behr等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6982-6，1989；FELGNER等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7，1987；BOUSSIF等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，7297-301，1995)。
关于肌肉，自J.A.Wolff等人首次公布肌肉组织能够整合以游离质粒形式注射的DNA以来(Wolff等人，Science 247，1465-1468，1990)，许多人试图改进该方法(Manthorpe等人，1993，Human Gene Ther.4，419-431；Wolff等人，1991，BioTechniques 11，474-485)。这些尝试出现了一些趋势，例如尤其是：
把DNA吸附到随后将被推入肌肉组织的珠子上，用机械方法使DNA进入细胞(“基因枪”)(Sanders Williams等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2726-2730；Fynan等人，1993，BioTechniques 11，474-485)。已经证实这些方法对接种疫苗有效，但是只能作用于组织的上层。就肌肉而言，还需要通过手术来接近肌肉，因为这些微粒不能穿过皮肤组织；
注射DNA，不是以游离质粒的形式，而是结合能够作为载体方便复合物进入细胞的分子。迄今为止，已经证实用于许多其他转染方法的阳离子类脂令人失望，因为已经进行的一些试验表明它会抑制转染(Schwartz等人，1996，Gene Ther.3，405-411)。阳离子多肽和聚合物也有类似发现(Manthorpe等人，1993，Human Gene Ther.4，419-431)。唯一较好的组合是把DNA与聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮混合。与注射裸DNA相比，由这些组合得到的提高不到10倍(Mumper等人，1996，PharmaceuticalResearch 13，701-709)；以及
预处理要注射溶液的组织，以改进DNA的扩散和/或稳定性(Davis等人，1993，Hum.Gene Ther.4，151-159)，或促进核酸的进入，例如诱导细胞的增殖或再生现象。这种处理具体包括使用局部麻醉剂或心脏毒素、血管收缩剂、内毒素或其他分子(Manthorpe等人，1993，Human Gene Ther.4，419-431；Danko等人，1994，Gene Ther.1，114-121；Vitadello等人，1994，Hum.Gene Ther.5，11-18)。这些预处理方法难以控制，尤其是为了能够有效而需要注射剂量非常接近致死量的丁哌卡因。为了改进扩散而预先注射高渗葡萄糖并不能提高肌肉的转染水平(Davis等人，1993)。
单独使用质粒DNA或与合成载体相结合，还在体内转染了其他组织(Cotton和Wagner综述(1994)，Current Opinion in Biotechnology 4，705；Gao和Huang(1995)，Gene Therapy，2，710；Ledley(1995)，Human GeneTherapy 6，1129)。研究的主要组织是肝、呼吸上皮组织、血管壁、中枢神经系统和肿瘤。在所有的这些组织中，发现转入的基因的表达水平太低而不能达到治疗应用(例如在肝中，Chao等人(1996)Human Gene Therapy 7，901)，尽管近期将质粒DNA转入血管壁得到了一些令人鼓舞的结果(Iires等人(1996)Human Gene Therapy 7，959和989)。在脑中，转染效率非常低，在肿瘤中也类似(Schwartz等人1996，Gene Therapy 3，405；Lu等人1994，Cancer Gene Therapy 1，245；Son等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，12669)。
发明内容
在一些实施方案中，通过提供碳水化合物修饰的聚阳离子聚合物，例如碳水化合物修饰的聚乙烯亚胺(PEI)，本发明实现了改进转染方法的需要。在一些实施方案中，本发明涉及如下新发现，即较高水平的碳水化合物修饰(即每个聚合物亚单位的碳水化合物部分的平均数目较高)可以降低聚阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺的毒性，而较低水平的碳水化合物修饰一般与高效的转染速度更相容。因此，本发明的一些实施方案提供了碳水化合物修饰的聚乙烯亚胺，其中选择的碳水化合物修饰的程度能够提供高效的转染和降低对靶细胞的毒性。在一些实施方案中，本发明的碳水化合物修饰的聚乙烯亚胺聚合物具有线性(无分支的)聚乙烯亚胺骨架。在一些优选的实施方案中，本发明提供了环糊精修饰的聚阳离子聚合物，例如环糊精修饰的聚乙烯亚胺。在一些实施方案中，本发明还提供了制备所述聚合物的方法。在另外的一些实施方案中，本发明还提供了治疗性组合物，它含有治疗剂、例如核酸(例如质粒或其他载体)和本发明的碳水化合物修饰的聚合物。还描述了通过施用治疗有效量的本发明的治疗性组合物的治疗方法。
可以用于修饰聚合物来改进它们的毒性状况的碳水化合物包括环糊精(CD)、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘油糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔洛糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、鼠李糖、塔格糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、岩藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖、纤维二糖，等。在一些实施方案中，聚合物用环糊精部分和/或半乳糖基团修饰。
在一方面，本发明涉及一种试剂包，它含有碳水化合物聚合物，例如如下所述的环糊精修饰的聚乙烯亚胺(CD-PEI)，任选的结合有药学上可接受的赋形剂，以及将聚合物和核酸相结合用作转染系统的使用说明。该使用说明还可以进一步包括将所述组合物应用到病人的说明。
在另一方面，本发明涉及一种制药商业的运营方法，包括生产这里描述的聚合物或试剂包并向医疗保健服务者推介在治疗医学病症中，例如把核酸转染到病人体内时使用该聚合物或试剂包的益处。
在进一方面，本发明提供了一种制药商业的运营方法，包括提供一个销售这里描述的聚合物或试剂包的分销网络，并提供给病人或医生使用该聚合物或试剂包来治疗医学病症，例如把核酸转染到病人体内的说明材料。
这样，一方面，本发明涉及一种含有聚乙烯亚胺(例如，含有至少约10个或更多个连续的乙烯亚胺单体的聚合物，优选含有至少50个或更多个所述单体)的聚合物，所述聚乙烯亚胺与碳水化合物部分，例如环糊精部分相偶联。所述聚乙烯亚胺可以是分支的或线性的聚合物。所述环糊精部分可以共价偶联到聚乙烯亚胺上，也可以通过包合络合物连接到聚乙烯亚胺上(例如，用客体基团共价修饰聚合物，环糊精部分通过与这些部分形成包合络合物来偶联)。在一些实施方案中，至少一部分碳水化合物部分偶联到聚合物的内部氮上(即聚合物骨架中的氮原子，而不是聚合物链末端的伯氨基)。该聚合物可以具有下式的结构：
其中，R每次出现时分别独立的代表H、低级烷基、包含环糊精部分的基团或
Figure C0380445400082
m每次出现时分别独立的代表大于10的整数。
聚合物中乙烯亚胺单元与环糊精部分的比例可以在约4∶1到20∶1之间，甚至是约9∶1到20∶1之间。
另一方面，本发明涉及具有下式结构的聚合物：
Figure C0380445400091
其中，R每次出现时分别独立的代表H、低级烷基、包含碳水化合物部分的基团或
Figure C0380445400092
m每次出现时分别独立的代表大于10的整数。
在一些实施方案中，聚合物是线性聚合物(例如，R代表H、低级烷基或包含碳水化合物部分的基团)。在一些实施方案中，约3-15％的R代表包含碳水化合物部分的基团，所述碳水化合物部分优选不是半乳糖或甘露糖。在一些实施方案中，碳水化合物部分包括环糊精部分，甚至还可以基本上是由环糊精部分组成。在一些实施方案中，约3-25％的R代表包含环糊精部分的基团。
另一方面，本发明涉及含有与核酸混合和/或结合的上述聚合物的组合物。在另一方面，本发明涉及用核酸转染细胞的方法，它包括用该组合物接触细胞的步骤。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种试剂包，它含有上述的聚合物和指导将聚合物和核酸结合以用核酸转染细胞的说明。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种制药商业的运营方法，它包括提供一个销售上述试剂包或聚合物的分销网络，并提供给病人或医生使用该聚合物来治疗医学病症的说明材料。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种含有上述聚合物且直径在50-1000nm之间的微粒。该微粒还可进一步含有核酸，和/或进一步含有通过连接到聚合物上的环糊精部分的包合络合物连接到聚合物上的聚乙二醇链。
附图说明
图1表明，当将AD-PEG(金刚烷-聚乙二醇结合物)以与CD-PEI的比例为3∶1(重量)的量与聚合复合物(polyplexes)混合时，能够稳定CD-PEI聚合复合物对抗盐诱导的聚集。即使添加PEG到与CD-PEI的比例为10∶1(重量)也不会影响聚合复合物对盐的稳定性。
图2表明，当将AD-PEG以与CD-PEI的比例为20∶1(重量)的量与聚合复合物混合时，能够稳定CD-PEI聚合复合物对抗盐诱导的聚集。即使添加PEG到与CD-PEI的比例为20∶1(重量)也不会影响聚合复合物对盐的稳定性。
图3比较了用聚合物运送载体将寡核苷酸运送到培养的细胞中的转染效率。
图4显示了使用不同CD-PEI载体时的体外转染水平。
图5说明了如何通过重度接枝的β-环糊精使与PEI一起转染的核酸的IC50增加2个数量级。
图6描述了转染的核酸在小鼠肝内的表达。
图7显示了以带有荧光素酶基因的半乳糖靶向的CD-PEI聚合物为基质的微粒转染肝癌细胞的实验结果。
图8显示了CD负载与CD-bPEI的转染效率之间的相互关系。
图9显示了CD负载与CD-bPEI的毒性之间的相互关系。
图10比较了CD-bPEI、CD-lPEI的转染效率以及氯奎对这些聚合物转染的影响。
图11是CD-PEI微粒的光电子显微照片。
图12表明AD-PEG修饰的微粒能稳定CD-PEI微粒对抗盐诱导的聚集。
图13表明了使用CD-PEI微粒转染的效率。
具体实施方式
I.概述
线性的和分支的聚乙烯亚胺(PEI)是目前用于体外转染的最有效的阳离子聚合物。但是，因为其制剂困难(在盐中聚集)和聚合物的毒性方面的原因，PEI的体内应用受到限制(Chollet等人2001J of Gene Med)。改进PEI的制剂条件的方法包括在聚合物上连接聚乙二醇(PEG)和在聚合复合物上连接PEG(Ogris等人1999 Gene Ther 6：595-605；和ERBACHER等人1999 J Gene Med 1：210-222)。但是，PEI-PEG不能把DNA浓缩到小的、球状的微粒中，而在聚合复合物上连接PEG则难以控制和放大规模。因此，目前的体内PEI系统及其全身性输送不具有前途。
以前曾经证实线性的基于环糊精的聚合物(CDP)具有较低的体外(在许多不同的细胞系中)和体内毒性(Gonzalez等人1999 Bioconjugate Chem10：1068-1074；和Hwang等人2001 Bioconjugate Chem 12(2)：280-290)。我们发现将环糊精从聚合物骨架上去除会导致该阳离子聚合物的高毒性。这一发现使我们相信，环糊精能够减少阳离子聚合物的毒性。在一些实施方案中，本发明开发了一种在基于环糊精的阳离子聚合物中使用环糊精来提高由这些聚合物形成的聚合复合物的稳定性和靶向性的新方法。
由于目前的线性CDP转染到哺乳动物细胞系内的效率很低(＜2％转染率)，本发明的环糊精修饰的聚合物将PEI的良好品质(不依赖于氯奎的有效转染)和基于环糊精的聚合物的良好品质(低毒，且能够修饰和稳定聚合复合物)结合起来。因此，如下所述，合成并测试了连接有环糊精的聚乙烯亚胺聚合物。因此，在一些实施方案中，优选的本发明的碳水化合物修饰的聚合物是环糊精修饰的聚合物，例如环糊精修饰的聚乙烯亚胺。
本发明总体上涉及含有碳水化合物修饰的聚阳离子聚合物和核酸的组合物。在不同的实施方案中，所述的核酸可以是表达结构，例如包括蛋白的编码序列或反义序列；反义序列；RNAi结构；siRNA结构；寡核苷酸或诱饵如DNA结合蛋白的诱饵。
在一些实施方案中，本发明的组合物比其他技术有许多优点。大多数的技术要么具有较高的转染率和较高的毒性(PEI，Lipofectamine)，要么具有较低的转染率和较低的毒性(线性CDP，其他可降解的阳离子聚合物)。但是，这里所披露的聚合物，例如CD-PEI，在体内具有较高的转染率和较低的毒性。已经证明，半乳糖基化和甘露糖基化的PEI具有高的转染率并且毒性比未修饰的PEI低，但是这些聚合物不具有稳定性并且在体内容易聚集。通过包合络合物修饰技术，这里披露的碳水化合物修饰的聚合物适合于体内应用。这将有利于这些聚合复合物的稳定性和靶向性。另外，这里描述的碳水化合物修饰方法能使IC50提高约100倍，而半乳糖和甘露糖修饰的PEI只能使IC50提高约10-20倍。
II.定义
为了方便，本说明书、实施例和权利要求书中使用的术语总结如下。
术语“ED50”指药物产生50％最大反应或效果时的剂量。
主题化合物关于主题治疗方法的“有效量”是指制剂中的治疗量，根据治疗或预防特定疾病的临床上可接受的标准，当它用作目的剂量方案的一部分时，会增加神经细胞群的存活。
术语“医疗保健服务者”是指给私人、社会等提供医疗保健服务的个人或组织。“医疗保健服务者”的例子包括医生、医院、继续照顾退休人群的社区、有技术背景的护理机构、亚急性照顾机构、诊所、特色诊所、独立的流动中心、家庭保健处和HMO等。
术语“IC50”是指抑制剂组合物产生50％最大抑制效果时的浓度。当该抑制剂组合物抑制细胞生长时，该IC50是导致50％细胞生长最大抑制时的浓度。
术语“LD50”是指药物使实验对象50％致死时的剂量。
要用主题方法治疗的“病人”或“对象”是包括人的哺乳动物。
“防止退化”是指减少细胞的损失(例如细胞凋亡)或减少细胞功能(例如，在多巴胺能神经元的情况下为多巴胺的释放)的损伤。如这里所使用的，“预防”疾病或状况的治疗剂一般是指相对于未治疗的对照样本而言，能减少样本发生疾病或状况的化合物，或者延迟该疾病或状况的一种或多种症状发生的化合物。
术语“前药”是指在生理条件下能够转化成本发明的治疗活性剂的化合物。制备前药的常用方法是引入经选择的可在生理条件下发生水解而释放出所需分子的基团。在一些实施方案中，前药是通过宿主动物的酶活性来转化的。
术语“治疗指数”是指以LD50/ED50来定义的药物治疗指数。
“营养因子”是指直接或间接影响神经细胞例如多巴胺能或GABA能细胞的存活或功能的分子。
“营养量”是指在给定条件下主题化合物足以提高神经细胞例如多巴胺能或GABA能细胞的存活率或功能表现的量。
“酰基”是指适于酰化氮原子以形成酰胺或氨基甲酸酯、酰化碳原子以形成酮、酰化硫原子以形成硫酯基或酰化氧原子以形成酯的基团，例如连接到-C(＝O)-基上的烃基。优选的酰基包括苯甲酰基、乙酰基、叔丁基乙酰基、新戊酰基和三氟乙酰基。更优选的酰基包括乙酰基和苯甲酰基。最优选的酰基是乙酰基。
术语“酰基氨基”是本领域公知的，优选是指下面通式代表的基团：
其中，R9和R’11分别独立的代表氢或烃取代基，例如烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、碳环脂肪基和杂环脂肪基。
术语“胺”和“氨基”是本领域公知的，是指未取代和取代的胺以及铵盐，例如可以通过下面的通式来表示：
Figure C0380445400132
其中，R9、R10和R’10分别独立的代表氢或烃取代基，或者R9、R10和它们结合的氮原子一起形成在环结构中有4-8个原子的杂环。在优选的实施方案中，R9、R10和R’10都不是酰基，例如R9、R10和R’10选自：氢、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、碳环脂肪基和杂环脂肪基。这里使用的术语“烷基胺”是指如上定义的具有至少一个取代的或未取代的烷基结合到上面的胺基。带有正电荷的氨基(例如有R’10存在时)称作“铵基”。在铵基以外的氨基中，氨基优选是碱性的，例如其共轭酸的pKa大于7。
术语“酰胺基”和“酰胺”是本领域公知的，是指氨基取代的羰基，例如下面通式所代表的基团：
其中，R9、R10的定义同上。在一些实施方案中，酰胺包括酰亚胺。
“烷基”是指具有1-18个碳原子的饱和或不饱和烃基，优选具有1-12个碳原子，更优选具有1-6个碳原子，再优选具有1-4个碳原子。烷基链可以是直链的(如正丁基)或支链的(如仲丁基、异丁基或叔丁基)。优选的支链烷基具有一个或两个分支，优选一个分支。优选的烷基是饱和的。不饱和的烷基具有一个或多个双键和/或一个或多个三键。优选的不饱和烷基具有一个或两个双键或一个三键，更优选的具有一个双键。烷基链可以未取代或被1-4个取代基所取代。优选的烷基是未取代的。优选的取代的烷基是单-、二-或三-取代的。优选的烷基取代基包括卤素、卤代烷基、羟基、芳基(如苯基、甲苯基、烷氧基苯基、烷氧基羰基苯基、卤代苯基)、杂环基和杂芳基。
术语“链烯基”和“炔基”是指具有与上述烷基类似的长度和可能的取代的不饱和脂肪基，但是它们各自含有至少一个双键或三键。除非特别说明，术语链烯基和炔基各自优选指低级链烯基和低级炔基。当术语烷基与术语链烯基和炔基出现在一起时，术语烷基是指饱和烷基，而不包括链烯基和炔基。
这里使用的术语“烷氧基”是指“-O-烷基”基团。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是由氧共价连接的两个烃基。因此，使烃基成为醚的烃基取代基可以是烷氧基或者其他的基团，例如-O-芳基、-O-杂芳基、-O-杂烷基、-O-芳烷基、-O-杂芳烷基、-O-碳环脂肪基或-O-杂环脂肪基。
术语“烷硫基”是指“-S-烷基”基。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等。“硫醚”是连接有两个烃基取代基的硫原子，例如其中的氧被替换为硫的醚。这样，碳原子上的硫醚取代基是指烃取代的硫原子取代基，例如烷硫基或芳硫基等。
这里使用的术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。
“芳环”是指芳烃基环。芳环是单环或稠合双环，例如苯基、萘基等。单环芳环含有5-10个碳原子，优选5-7个碳原子，最优选环中有5-6个碳原子。双环芳环含有8-12个碳原子，优选环中有9或10个碳原子。术语“芳基”也包括其中只有一个环是芳环的双环，例如，另一个环是环烷基、环烯基或杂环基。芳环可以是未取代的或在环上取代有1至约5个取代基。优选的芳环取代基包括：卤素、氰基、低级烷基、杂烷基、卤代烷基、苯基、苯氧基或它们的任意组合。更优选的芳环取代基包括低级烷基、氰基、卤素、卤代烷基。
“碳环脂肪环”是指饱和或不饱和的烃环。碳环脂肪环不是芳香性的。碳环脂肪环是单环，或稠合的、螺环或桥接的双环。单环的碳环脂肪环含有约4-10个碳原子，优选4-7个碳原子，更优选环中有5-6个碳原子。双环的碳环脂肪环含有8-12个碳原子，优选环中有9-10个碳原子。碳环脂肪环可以是未取代的或在环上取代有1-4个取代基。优选的碳环脂肪环取代基包括卤素、氰基、烷基、杂烷基、卤代烷基、苯基、苯氧基或它们的任意组合。更优选的取代基包括卤素和卤代烷基。优选的碳环脂肪环包括环戊基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。更优选的碳环脂肪环包括环己基、环庚基和环辛基。
“碳水化合物修饰的聚合物”是共价或缔合(即通过包合复合物)连接到一个或多个碳水化合物部分上的聚合物。
术语“碳水化合物部分”包括被本领域的普通技术人员认为是碳水化合物并且共价结合到聚合物上的任何分子。碳水化合物部分包括单糖和多糖。碳水化合物部分包括丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖和更高分子量的单糖(D型或L型)，以及含有单一类型的单糖或不同单糖的混合物的多糖。多糖可以是任何聚合形态(例如支链的、线性的或环状的)。单糖的例子包括葡萄糖、果糖、吡喃型葡萄糖。多糖的例子包括蔗糖、乳糖和环糊精。
术语“羰基”是本领域公知的，它包括下面通式所代表的基团：
其中，X是一个键或代表氧或硫，R11代表氢、烃取代基或药学可接受的盐，R’11代表氢或烃取代基。当X是氧且R11或R’11不是氢时，该式代表酯。当X是氧且R11如上定义时，这里的该基团是指羧基，特别是当R11是氢时，该式代表羧酸。当X是氧且R’11是氢时，该式代表“甲酸酯”。一般的，当上式的氧原子被替换为硫时，该式代表“硫羰基”。当X是硫且R11或R’11不是氢时，该式代表“硫酯”。当X是硫且R11是氢时，该式代表“硫代羧酸”。当X是硫且R’11是氢时，该式代表“硫代甲酸酯”。另一方面，当X是键、R11不是氢且该羰基是连接到烃基上时，上式代表“酮基”。当X是键、R11是氢且该羰基是连接到烃基上时，上式代表“醛基”或“甲酰基”。
“Ci烷基”是具有i个碳原子的烷链。例如，C4烷基含有4个碳原子。C4烷基可以是饱和的，或含有一个或两个双键(顺式或反式)或一个三键的不饱和的。优选的C4烷基是饱和的。优选的不饱和C4烷基具有一个双键。C4烷基可以是未取代的或有一个或两个取代基。优选的取代基包括低级烷基、低级杂烷基、氰基、卤素和卤代烷基。
“卤素”是指氟、氯、溴、碘取代基。优选的卤素是氟、氯、溴。更优选的卤素是氯和氟。
“卤代烷基”是指有一个或多个卤素取代基的支链、支链或环状的烃基。优选的卤代烷基是C1-C12；更优选的是C1-C6；再优选的是C1-C3。优选的卤素取代基是氟和氯。最优选的卤代烷基是三氟甲基。
“杂烷基”是具有碳原子和至少一个杂原子的饱和或不饱和链，其中没有两个杂原子是相邻的。杂烷基链的链上含有1-18个主原子(碳和杂原子)，优选1-12个，更优选1-6个，再优选1-4个。杂烷基链可以是直链的或支链的。优选的支链杂烷基具有一个或两个支链，优选一个支链。优选的杂烷基是饱和的。不饱和的杂烷基具有一个或多个双键和/或一个或多个三键。优选的不饱和杂烷基具有一个或多个双键或一个三键，更优选一个双键。除非另外说明，杂烷基链可以是未取代的或有一个至约四个取代基。优选的杂烷基是未取代的。优选的杂烷基取代基包括卤素、芳基(如苯基、甲苯基、烷氧基苯基、烷氧基羰基苯基、卤代苯基)、杂环基、杂芳基。例如，被下述取代基取代的烷基链是杂烷基：烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基)、芳氧基(如苯氧基、氯代苯氧基、甲苯氧基、甲氧基苯氧基、苄氧基、烷氧基羰基苯氧基、酰氧基苯氧基)、酰氧基(如丙酰氧基、苯甲酰氧基、乙酰氧基)、氨基甲酰氧基、羧基、巯基、烷硫基、酰硫基、芳硫基(如苯硫基、氯代苯硫基、烷基苯硫基、烷氧基苯硫基、苄硫基、烷氧基羰基苯硫基)、氨基(氨基、单-和双-C1-C3烷氨基、甲基苯基氨基、甲基苄基氨基、C1-C3烷基酰氨基、氨基甲酰氨基、脲基、胍基)。
“杂原子”是指多价的非碳原子，例如硼、磷、硅、氮、硫或氧原子，优选氮、硫或氧原子。含有超过一个杂原子的基团可以含有不同的杂原子。
“杂芳环”是指环中含有碳和1至约4个杂原子的芳环。杂芳环是单环或稠合双环。单环杂芳环的环中含有约5至约10个主原子(碳和杂原子)，优选5-7个，更优选5-6个。双环杂芳环的环中含有8至12个主原子，优选9-10个。术语“杂芳基”还包括环中仅有一个环是芳环的双环，例如另一个环是环烷基、环烯基或杂环基。杂芳环可以是未取代的或在环上被1至约4个取代基取代。优选的杂芳环取代基包括卤素、氰基、低级烷基、杂烷基、卤代烷基、苯基、苯氧基或它们的任意组合。优选的杂芳环包括噻吩基、噻唑基、唑基、吡咯基、嘌呤基、嘧啶基、吡啶基和呋喃基。更优选的杂芳环包括噻吩基、呋喃基和吡啶基。
“杂环脂肪环”是环中含有碳和1至约4个杂原子的饱和或不饱和的非芳香环，其中环中不存在两个相邻的杂原子，并且优选与杂原子连接的环碳原子上没有羟基、氨基或硫醇基与之相连接。杂环脂肪环是单环，或是稠合或桥接的双环。单环杂环脂肪环的环中含有约4个至约10个主原子(碳和杂原子)，优选4-7个，更优选5-6个。双环杂环脂肪环的环中含有8至12个主原子，优选9-10个。杂环脂肪环可以是未取代的或在环上被1至约4个取代基取代。优选的杂环脂肪环取代基包括卤素、氰基、低级烷基、杂烷基、卤代烷基、苯基、苯氧基或它们的任意组合。更优选的取代基包括卤素和卤代烷基。杂环基包括，例如，噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、苯并吡喃、氧杂蒽、夹氧硫蒽、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、乙内酰脲、唑啉、咪唑啉三酮、三唑啉酮、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、喹啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩嗪、吡咯烷、氧杂环戊烷、硫杂环戊烷、唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺如氮杂环丁酮和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺酸内酯等。优选的杂环脂肪环包括哌嗪基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基和哌啶基。杂环也可以是多环。
术语“羟基”是指-OH。
“低级烷基”是指含有1-5个碳主原子的烷基链，优选含有1-4个碳主原子，更优选含有1或2个碳主原子。低级烷基可以是饱和的或不饱和的。优选的低级烷基是饱和的。低级烷基可以是未取代的或被1个或2个取代基取代。优选的低级烷基取代基包括氰基、卤素、三氟甲基、氨基和羟基。在本申请中，优选的烷基是低级烷基。在优选的实施方案中，这里指定的烷基取代基是低级烷基。同样的，“低级链烯基”和“低级炔基”具有相似的链长。
“低级杂烷基”是指含有1-4个主原子的杂烷链，优选含有1-3个主原子，更优选含有1或2个主原子。低级杂烷基含有1个或2个不相邻的杂原子主原子。优选的低级杂烷基含有一个杂原子主原子。低级杂烷基可以是饱和的或不饱和的。优选的低级杂烷基是饱和的。低级杂烷基可以是未取代的或被1个或2个取代基取代。优选的低级杂烷基取代基包括氰基、卤素、三氟甲基和羟基。
“Mi杂烷基”是具有i个主原子的杂烷基链。例如M4杂烷基含有1个或2个不相邻的杂原子主原子。含有1个杂原子主原子的M4杂烷基可以是饱和的，或含有一个双键(顺式或反式)或一个三键的不饱和的。优选的含有2个杂原子主原子的M4杂烷基是饱和的。优选的不饱和的M4杂烷基具有一个双键。M4杂烷基可以是未取代的或有一个或两个取代基。优选的取代基包括低级烷基、低级杂烷基、氰基、卤素和卤代烷基。
“主原子”是指链中或环中的多价原子(如C、O、N或S原子)，它构成链或环的一部分。例如，在甲酚中，6个碳原子是环中的主原子，而氧原子和甲基取代基的碳原子则不是环中的主原子。
这里使用的术语“硝基”是指-NO2。
“药学上可接受的盐”是指在任意酸性基团(如羟胺酸或羧酸)上形成的阳离子盐，或者在任意碱性基团(如氨基或胍基)上形成的阴离子盐。这些盐是本领域公知的。参见，例如，世界专利公布87/05297，Johnston等，公开日1987年9月11日，在这里引作参考。这种盐由本领域普通技术人员公知的方法制备。本领域普通技术人员可以考虑到改进溶解度、稳定性、配制容易、价格等因素而优选某一种盐。对这些盐的确定和优化都在本领域普通技术人员的实践范围内。优选的阳离子包括碱金属(如钠和钾)、碱土金属(如镁和钙)、有机阳离子，如三甲基铵、四丁基铵等。优选的阴离子包括卤化物(如氯化物)、磺酸盐、羧酸盐、磷酸盐等。这些盐显然包括可以提供一个光学中心的加成盐。例如，可以从本发明的化合物制备手性酒石酸盐。该定义包括这种手性盐。
“苯基”是未取代或有1-5个取代基的6元单环芳环。取代基可以位于苯环的邻位、间位或对位，或其任意组合。优选的苯基取代基包括卤素、氰基、低级烷基、杂烷基、卤代烷基、苯基、苯氧基或其任意组合。更优选的苯环上的取代基包括卤素和卤代烷基。最优选的取代基是卤素。
术语“多环”和“多环基团”是指双环或多环(如环烷基、环烯基、杂芳基、芳基和/或杂环基)，其中一个环的两个或多个主原子也是第二个环的主原子。通过不相邻的原子连接的环定义为“桥”环，通过相邻的原子连接的环定义为“稠合环”。
术语“巯基”是指-SH；术语“磺酰基”是指-SO2-。
小的有机分子上的“取代”或“取代基”一般是指结合到氢以外的基团上的多价原子上的位置，例如链或环上的主原子以外的位置。这种基团包括这里定义的和本领域公知的其他基团，例如卤素、烷基、链烯基、炔基、叠氮化物、卤代烷基、羟基、羰基(如羧基、烷氧基羰基、甲酰基、酮或酰基)、硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯、硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、膦酸酯、亚膦酸酯、胺、酰胺、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、甲硅烷基、醚、环烷基、杂环基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳烷基、芳烷基、芳基或杂芳基。本领域的普通技术人员可以理解，如果合适的话，某些取代基，例如芳基、杂芳基、多环基、烷氧基、烷氨基、烷基、环烷基、杂环基、链烯基、炔基、杂烷基、杂烯基和杂炔基它们自己也可以被取代。本发明不以任何方式限制有机化合物容许的取代基。应当理解，“取代”或“被...取代”包括了暗含条件，即该取代符合被取代的原子和取代基容许的价数，并且该取代得到稳定的化合物，例如，它不会自发的进行转变，如重排、环化、消去、水解等。
如这里所使用的每一个表达的定义，例如烷基、m、n等，当它在任何结构中出现多次时，表示它们在该相同的结构中具有相互独立的定义。
缩写Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts和Ms分别代表甲基、乙基、苯基、三氟甲磺酰基，九氟丁磺酰基、对甲苯磺酰基和甲磺酰基。本领域的普通有机化学技术人员使用的更全面的缩写列表可以参见Journal of OrganicChemistry每一卷的首发版本；该列表一般做成表格，标题是 Standard List of Abbreviations。该列表中出现的缩写，以及本领域的普通有机化学技术人员使用的所有缩写，在这里引作参考。
术语邻位、间位和对位分别是指1，2-、1，3-、1，4-双取代的苯。例如，1，2-二甲基苯和邻二甲基苯是同义的。
这里使用的短语“保护基团”是指保护潜在的反应官能团、避免发生不需要的化学转变的临时取代基。这种保护基团的例子分别包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚、醛和酮的缩醛和缩酮。参阅保护基团化学领域的相关知识。(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups In Organic Synthesis，第2版；Wiley：New York，1991；和Kocienski，P.J.Protecting Groups，Georg Thieme Verlag：New York，1994)。
为了本发明的目的，化学元素的标记符合Handbook of Chemistry andPhysics，67版，1986-87，CAS版，内部封面的元素周期表。也为了本发明的目的，术语“烃”包括所有含有至少一个C-H键的化合物或基团。广义言之，允许的烃包括非环状的和环状的、支链的和直链的、碳环的和杂环的、芳香的和非芳香的有机化合物，它们可以是未取代的或被取代的。
上述化合物的预期等价物包括其对应的和具有相同应用性能的化合物，其中取代基的一种或多种简单改变不会对化合物的功效产生负面影响。本发明的化合物一般可以通过通用反应流程所示的方法来制备，例如，如下所述，或者通过其改进方案，使用容易获得的原料、试剂和常规合成步骤。在这些反应中，也可以使用这里没有提及但是其本身是公知的改变方法。
III.典型的聚合物组合物
主题聚合物包括线性的和/或分支的聚乙烯亚胺聚合物，它被结合到聚合物骨架上(如通过结合到聚合物链中的氮原子上)的碳水化合物部分，例如环糊精修饰。聚合物(在碳水化合物修饰之前)优选的分子量至少是2,000，例如2,000-100,000，优选5,000-80,000。在一些实施方案中，主题聚合物具有下式的结构：
Figure C0380445400221
其中R每次出现时独立的代表H、低级烷基、碳水化合物部分(任选通过连接基团连接，例如亚烷基链或聚乙二醇寡聚体)，或
Figure C0380445400222
m每次出现时分别独立的代表大于10的整数，例如10-10,000，优选10-5,000，或100-1,000。
在一些实施方案中，至少约1％的R包括碳水化合物部分，更优选至少约2％，或至少约3％，甚至高达约5％、10％、15％或20％。
在一些实施方案中，聚合物是线性的，即R不会代表
Figure C0380445400223
在一些实施方案中，碳水化合物部分占碳水化合物修饰的聚合物重量的至少约2％、3％、4％，最高达5％、7％，甚至10％。当碳水化合物部分包括环糊精时，碳水化合物部分可以占共聚物重量的至少2％，优选至少5％或10％，或甚至高达20％、40％、50％、60％、80％，甚至90％。
在一些实施方案中，聚合物中至少约2％、3％或4％、最高达5％、7％、甚至10％、15％、20％或25％的乙烯亚胺亚单位被碳水化合物部分修饰。但是，在一些这样的实施方案中，不超过25％、30％、35％、40％或50％的乙烯亚胺亚单位被修饰。在优选的实施方案中，所选择的碳水化合物的修饰水平可以使毒性低于未修饰的聚合物的毒性的20％，而转染效率至少是5％的乙烯亚胺亚单位被修饰的相应聚合物的效率的30％。优选的，每6-15个乙烯亚胺亚单位中就有一个被碳水化合物修饰。
带有易于用环糊精部分衍生化的亲核氨基取代基的聚乙烯亚胺共聚物也可以用于制备本发明范围内的环糊精修饰的聚合物。典型的碳水化合物修饰的范围是10-15％的乙烯亚胺基团，15-20％的乙烯亚胺基团，20-25％的乙烯亚胺基团，25-30％的乙烯亚胺基团，30-40％的乙烯亚胺基团，或者这些范围中两个或多个的组合。
当碳水化合物部分通过连接基团连接时，该连接基团可以是亚烷基链、聚乙二醇(PEG)链、聚琥珀酸酐、聚癸二酸(PSA)、聚-L-谷氨酸、聚乙烯亚胺、寡糖、氨基酸链、或其他任何适合的连接物。在特定的聚合物或聚合反应中，可以有多种类型的连接物。在一些实施方案中，连接基团本身在生理条件下可以是稳定的，例如亚烷基链，或者它在生理条件下可以裂解，例如被酶裂解(例如，连接物含有的多肽序列是肽酶的底物)或者被水解(例如，连接物含有可水解的基团，如酯或硫酯)。连接基团可以是无生物活性的，例如PEG、聚乙醇酸或聚乳酸链，或者可以是生物学活性的，例如寡肽或多肽，当其从基团上裂解下来时可以与受体结合、使酶失活等。各种生物相容性和/或生物易蚀性的寡聚连接基团是本领域公知的，对连接物的选择会影响材料的最终性能，例如它在移植时是否耐久，它在移植后是否逐渐变形或收缩，或者它是否逐渐降解或被身体吸收。连接基团可以通过任何合适的键或官能团，包括C-C键、酯、醚、酰胺、胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、脲、磺酰胺等，连接到目的基团上(例如聚合物的链和碳水化合物)。
在一些实施方案中，本发明的连接基团代表亚烃基，其中的一个或多个亚甲基任选的被Y基所替换(条件是Y基之间相互不相邻)，其中每一个Y在每次出现时分别独立的选自取代的或未取代的芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基、或-O-、C(＝X)(其中X是NR1、O或S)、-OC(O)-、-C(＝O)O、-NR1-、-NR1CO-、-C(O)NR1-、-S(O)n-(其中n是0、1或2)、-OC(O)-NR1、-NR1-C(O)-N1-、-NR1-C(＝NR1)-NR1-和-B(OR1)-；R1在每次出现时分别独立的代表H或低级烷基。
在一些实施方案中，连接基团代表衍生的或未衍生的氨基酸。在一些实施方案中，带有一个或多个末端羧基的连接基团可以结合到聚合物上。在一些实施方案中，这些末端羧基中的一个或多个可以通过(硫)酯或酰胺键共价连接到治疗剂或环糊精部分上来进行封闭。在另一些实施方案中，带有一个或多个末端羟基、巯基、氨基的连接基团可以掺入到聚合物中。在优选的实施方案中，这些末端羟基中的一个或多个可以通过碳酸酯、氨基甲酸酯、硫代碳酸酯或硫代氨基甲酸酯键共价到连接到治疗剂或碳水化合物(如环糊精)基团上来进行封闭。在一些实施方案中，这些(硫)酯、酰胺、(硫代)碳酸酯、(硫代)氨基甲酸酯键可以是生物水解性的，即在生物条件下能够被水解。
在一些实施方案中，碳水环化合物基团可以通过非共价的缔合作用连接到聚合物上。例如，聚合物链可以被能够与环糊精形成包合复合物的基团修饰，如金刚烷基。在适于形成包合复合物的条件下，修饰的聚合物可以结合包含环糊精部分和任选的碳水化合物部分(它可以是第二个环糊精部分，即该化合物可以是对称的)的化合物，从而形成复合物，如聚合物-金刚烷∷环糊精-连接物-碳水化合物。这样，不用将碳水化合物共价连接到聚合物本身上就可以用碳水化合物修饰该聚合物。相似的，这里描述的环糊精修饰的聚合物也可以用含有连接到能够与环糊精形成包合复合物的基团上的聚乙二醇(PEG)链的分子来处理。如下面更详细的描述，相对于没有形成这种包合复合物的微粒而言，这样修饰的聚合物微粒是稳定的(例如，因为在其表面有PEG“刷子层”)。可替换的或附加的，包合复合物可以用于把配基偶链到聚合物上(例如，把聚合物靶向定在病人体内的特定组织、器官或其他区域)，或者修饰聚合物的物理、化学或生物性能。
典型的环糊精部分包括基本上由6-8个糖基组成的环结构，例如环糊精和氧化的环糊精。环糊精部分任选的含有连接基团，它在该环结构和聚合物骨架之间形成共价键，其链中优选具有1-20个原子，例如烷基链，包括二羧酸衍生物(如戊二酸衍生物、琥珀酸衍生物等)，和杂烷基链，例如寡聚乙二醇链。环糊精部分还可以进一步含有一个或多个碳水化合物部分，优选直接(如通过碳水化合物连接)或通过连接基团连接到环核心的简单的碳水化合物部分如半乳糖。
环糊精是含有通过α-(1，4)键连接的天然D-(+)-吡喃型葡萄糖单元的环状多糖。最常见的环糊精是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，它们分别含有6个、7个或8个吡喃型葡萄糖单元。结构上，环糊精的环状性质形成螺纹环或圆环的形状，它具有一个内部的非极性的或疏水的腔，仲羟基位于环糊精环的一侧，伯羟基位于另外一侧。这样，以β-环糊精为例，环糊精经常用下面的结构图表示。
Figure C0380445400251
仲羟基所在的一侧比伯羟基所在的一侧具有更大的直径。环糊精内腔的疏水性使它可以包合多种化合物。(Comprehensive SupramolecularChemistry，第3卷，J.L.Atwood等编，Pergamon Press(1996)；T.Cserhati，Analytical Biochemistry，225：328-332(1995)；Husain等，Applied Spectroscopy，46：652-658(1992)；FR 2665169)。其他修饰聚合物的方法披露在Suh，J.和Noh，Y.，Bioorg.Med.Chem.Lett.1998，8，1327-1330。
通过与能够适合环糊精疏水腔的不同药物形成包合复合物，或者通过与其他生物活性分子(如寡核苷酸及其衍生物)形成非共价缔合复合物，环糊精已经用作不同治疗性药物的运输载体。例如，参见美国专利4,727,064、5,608,015、5,276,088和5,691,316。不同的含有环糊精的聚合物及其制备方法是本领域的公知技术。Comprehensive Supramolecular Chemistry，第3卷，J.L.Atwood等人编，Pergamon Press(1996)。
IV.方法和组合物的典型应用
根据本发明的治疗性组合物含有治疗剂和本发明的碳水化合物修饰的聚合物，例如，本发明的环糊精修饰的聚合物，或对培养细胞的IC50大于25μg/ml的碳水化合物修饰的聚合物。治疗剂可以是任何合成的或天然的生物活性治疗剂，包括本领域已知的那些。合适的治疗剂包括，但是不限于，抗生素、类固醇、多核苷酸(如基因组DNA、cDNA、mRNA和反义寡核苷酸)、质粒、多肽、多肽片段、小分子(如阿霉素)和其他的生物活性大分子，如蛋白和酶。治疗性组合物优选是无菌的和/或非致热的，例如，施用后基本不会使病人的体温升高。
本发明的治疗性组合物可以由本领域公知的方法制备。在一个优选的实施方案中，本发明的共聚物与治疗剂如上所述的混合，然后让其自行聚集。根据本发明，治疗剂和本发明的碳水化合物修饰的聚合物相互缔合，从而使共聚物作为该治疗剂的输送载体。治疗剂和碳水化合物修饰的聚合物可以以本领域公知的方式相缔合，例如，静电相互作用和疏水相互作用。缔合度可以用本领域公知的方法确定，包括，例如，荧光研究、DNA迁移率研究、光散射、电子显微镜技术，并且可以根据治疗剂进行变化。作为一种输送模式，例如，含有本发明的共聚物和DNA的本发明的治疗性组合物可以用于辅助转染，即把DNA吸收进动物(如人)细胞中。(Boussif，O.Proceedings of the National Academy of Sciences，92：7297-7301(1995)；Zanta等，Bioconjugate Chemistry，8：839-844(1997))。
本发明的治疗性组合物可以是，例如，固体、液体、混悬液或乳状液。本发明的治疗性组合物优选是可以注射的形式，如肿瘤内的或静脉内的注射。本发明的治疗性组合物的其他施用模式包括(取决于治疗性组合物的状态)本领域公知的方法例如，但是不限于，口服施用，局部应用，肠道外的、静脉内的、鼻内的、眼内的、颅内的或腹膜内的注射。
依赖于使用的治疗剂的类型，本发明的治疗性组合物可以用于多种治疗方法(如DNA疫苗、抗生素、抗病毒剂)来治疗遗传性的或获得性的疾病，例如囊肿性纤维化、谷彻氏(Gaucher)疾病、肌肉萎缩、AIDS、癌症(如多骨髓瘤、白血病、黑色素瘤、卵巢癌)、心血管疾病(如渐进性心衰竭、再狭窄、血友病)、神经疾病(如脑外伤)。
在本发明的一些实施方案中，治疗方法使用治疗有效量的本发明的治疗性组合物。如本领域所公知，治疗有效量需要根据各个病例来确定。需要考虑的因素包括，但是不限于，要治疗的疾病和患者的身体特征。
本发明的另一个实施方案是一种组合物，它含有至少一种具有农业用途的生物活性化合物和本发明的线性的环糊精修饰的聚合物或线性的氧化的环糊精修饰的聚合物。所述农用生物活性化合物包括本领域已知的那些。例如，合适的农用生物活性化合物包括，但是不限于，杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、防霉剂。
实施例
现在对本发明进行一般性的描述，结合下面的实施例可以更容易的理解本发明，这些实施例只是用来解释本发明的特定方面和实施方案，而不是用来限制本发明。
实施例1不同CD负载的CD-bPEI的合成和特征鉴定
Figure C0380445400281
把分支的PEI25,000(295.6mg，Aldrich)和6-单甲苯磺酰基-β-环糊精(2.287g，Cyclodextrin Technologies Development，Inc.)溶解于100mL不同H2O/DMSO溶剂混合物中(表1)。得到的混合物在70℃搅拌72小时。溶液逐渐变黄。然后将溶液转移到Spectra/Por MWCO 10,000膜中，用水透析6天。然后冻干去水，得到浅色的固体。基于1H NMR(Varian 300MHz，D2O)δ5.08ppm(s br.，CD的C1H)，3.3-4.1ppm(m br.CD的C2H-C6H)，2.5-3.2ppm(m br.PEI的CH2)的质子积分计算环糊精/PEI比例。
发现负载到PEI上的环糊精随着反应混合物中H2O的量的减少而增加(表1)。
         表1：H2O对环糊精负载的影响
 H2O/DMSO(mL)   水的量(％)   乙烯亚胺/CD
  60/40   60   19.9
  40/60   40   16.8
  20/80   20   14.7
  5/95   5   12.6
  1/99   1   10.5
  0.1/99.9   0.1   8.4
  0/100   0   6.3
实施例2线性PEI-CD的合成
Figure C0380445400291
低负载：把线性PEI(50mg，Polysciences，Inc.，MW 25,000)溶解于无水DMSO(5mL)中。向溶液中加入环糊精单甲苯磺酸酯(189mg，75当量，Cyclodextrin Technologies Development，Inc.)。在氩环境下于70-72℃搅拌溶液4天。然后将溶液在水中透析(总透析体积约50mL)6天(Spectra/Por7MWCO 25,000膜)。冻干后得到lPEI-CD(46mg)。1H NMR(Bruker AMX500MHz，D2O)δ5.09(s br.，CD的C1)，3.58-4.00(m br.CD的C2-C6)，2.98(m br.PEI)。8.8％的PEI重复单元被连接到CD上。
高负载：把线性PEI(50mg，Polysciences，Inc.，MW 25,000)溶解于无水DMSO(10mL)中。向溶液中加入环糊精单甲苯磺酸酯(773mg，300当量，Cyclodextrin Technologies Development，Inc.)。在氩环境下于70-72℃搅拌溶液4天。然后将溶液在水中透析(总透析体积约50mL)6天(Spectra/Por7MWCO 25,000膜)。透析袋中发现有沉淀。使用0.2μM注射式过滤器去除沉淀(未反应的CD-单甲苯磺酸酯)，滤出液用25,000MWCO膜继续透析24小时。冻干后得到lPEI-CD(75mg)。1H NMR(Bruker AMX 500MHz，D2O)δ5.09(s br.，CD的C1)，3.58-4.00(m br.CD的C2-C6)，2.98(m br.PEI)。11.6％的PEI重复单元被连接到CD上。
实施例3不同CD负载的CD-lPEI的合成和特征鉴定
Figure C0380445400292
把线性的PEI25,000(500mg，Polysciences，Inc.)和6-单甲苯磺酰基-β-环糊精(3.868g，Cyclodextrin Technologies Development，Inc.)溶解于36mLDMSO中。得到的混合物在70℃搅拌6天。溶液逐渐变黄。然后将溶液转移到Spectra/Por MWCO 10,000膜上，用水透析6天。然后冻干去水，得到浅色的固体。基于1H NMR(Varian 300MHz，D2O)δ5.08ppm(s br.，CD的C1H)，3.3-4.1ppm(m br.CD的C2H-C6H)，2.5-3.2ppm(m br.PEI的CH2)的质子积分计算环糊精/PEI比例。在本实施例中，环糊精/PEI的比例为8.4。
实施例4
CD-PEI与质粒的制剂：AD-PEG材料的盐稳定作用
在水中制备浓度为0.5mg/mL的质粒DNA(pGL3-CV，含有在SV40启动子控制下的荧光素酶基因的质粒)。在水中制备浓度为2.0mg/mL的分支CD-PEI。在水中制备浓度为10mg/mL和100mg/mL的AD-PEG5000。(具体参见2001年12月19日提交的美国专利申请10/021,312的实施例22-28)。
混合需要量的AD-PEG5000和6μL分支CD-PEI来制备聚合复合物。该聚合物溶液然后加入6μL DNA溶液中。
将聚合复合物溶液转移到光散射比色皿中。加入1.6mL PBS(150mM)，加入盐后，立即使用Zeta Pals动态光散射检测器(BrookhavenInstruments)检测微粒的大小10分钟。结果如图1所示。
CD-PEI与寡DNA的制剂：AD-PEG的盐稳定作用
在水中制备浓度为0.5mg/mL的寡DNA(FITC-Oligo)。在水中制备浓度为2.0mg/mL的分支CD-PEI。在水中制备浓度为10mg/mL和100mg/mL的AD-PEG5000。
混合需要量的AD-PEG5000和6μL分支CD-PEI来制备复合物。该聚合物溶液然后加入6μL DNA溶液中。
将聚合复合物溶液转移到光散射比色皿中。加入1.6mL PBS(150mM)，加入盐后，立即使用Zeta Pals动态光散射检测器(BrookhavenInstruments)检测微粒的大小10分钟。结果如图2所示。
实施例5
体外质粒转染
在24孔平板上以200,000细胞/mL的浓度涂布PC3细胞。24小时后，用3μg/孔的以5∶1的重量比与分支CD-PEI复合的pEGFP-Luc(含有在CMV启动子控制下的EGFP-Luc融合基因的质粒)转染细胞。(对于每个孔，转染混合物是在60μL水中制备，然后向溶液中加入1mL OptiMEM(Life Technologies公司的无血清培养基)。最终的溶液用于转染细胞。)。转染后4小时，去除培养基，替换为5mL完全培养基。转染后48小时，用流动细胞计数仪测定细胞的EGFP表达。25％的检测细胞有EGFP表达。
通过分支CD-PEI输送寡DNA
在6孔平板上以300,000细胞/孔的浓度涂布PC3细胞。24小时后，用3μg/孔的以5∶1的重量比与分支PEI(修饰的或未修饰的)或分支CD-PEI复合的FITC-Oligo复合物转染细胞。转染后15分钟，用PBS冲洗细胞，胰蛋白酶消化，用流动细胞计数仪测定对荧光寡DNA的吸收。25％的检测细胞有EGFP表达。结果如图3所示。
不同CD-PEI聚合物的转染效率
用下面的几种CD-PEI聚合物转染PC3细胞。
  聚合物   量/单体   乙烯亚胺/CD
  b-PEI2000-CD-Lb-PEI2000-CD-Hb-PEI10000-CD-Lb-PEI10000-CD-Hb-PEI70000-CD-Lb-PEI70000-CD-Hl-PEI25000-CD-Ll-PEI25000-CD-H   1782168911198119155192   9.57.427192316.811.48.6
命名定义如下：b-PEI2000-CD-L是连接有分子量为2000的分支PEI的环糊精。前缀“l”表示线性PEI基质。“L”和“H”代表“轻度”和“重度”连接的聚合物(参见最右列所示的各乙烯亚胺/CD比例)。CD-PEI聚合物是根据实施例1所述的方法制备的。
在6孔平板上以200,000细胞/孔的浓度涂布PC3细胞。24小时后，用3μg/细胞的pEGFP-Luc质粒转染细胞，该质粒与CD-PEI聚合物以15N/P在1mL Optimem中结合。转染后5小时，每孔中加入4mL完全培养基。转染后48小时，用胰蛋白酶消化细胞并收集，用流动细胞计数仪测定细胞的EGFP表达。结果如图4所示。随着分子量的增加，转染效率也升高。线性PEI结合物的转染效率比分支PEI结合物高。
实施例6
CD-PEI的体外毒性
在96孔平板上以60,000细胞/mL的浓度涂布PC3细胞(每孔0.1mL)。24小时后，把在培养基中的聚合物溶液加入到第三列，进行横向系列稀释。细胞培养24小时，然后用PBS冲洗，每孔加入50μL的MTT(在PBS中，2mg/mL)，再在每孔加入150μL的完全培养基。培养4小时。去除溶液，加入150μL的DMSO。在540nm测定吸收。分支CD-PEI的结果如图5所示。
不同CD-PEI聚合物的毒性。与甘露糖基化的PEI(Man-JET-PEI)比较
通过MTT分析测定环糊精连接的1PEI和bPEI聚合物对PC3细胞的IC50。作为对比，测定了甘露糖基化的PEI(Man-JET-PEI)和母体PEI(JET-PEI)(购自Polyplus Transfections(Illkirch，France))的IC50。IC50的测定如下：
在96孔平板上以60,000细胞/mL的浓度涂布PC3细胞24小时(每孔0.1mL)。把聚合物全部加入到第三列，进行横向系列稀释。24小时后，用PBS冲洗细胞，每孔加入50μL的MTT(在PBS中，2mg/mL)，再在每孔加入150μL的完全培养基。培养4小时后去除培养液，加入150μL的DMSO。在540nm测定吸收。
IC50值如下表所示。在第一列中的聚合物成对分组显示(母体聚合物和修饰的聚合物)。每一种聚合物的IC50值列在第二列中，单位为μg/mL。第三列显示了糖修饰后毒性的降低，计算方法是用修饰的PEI的IC50值除以母体PEI的IC50值。环糊精修饰的PEI的IC50值比甘露糖基化的PEI的IC50值高出40倍。另外，高连接密度的修饰会得到比母体聚合物更高的耐受性增强(90倍对20倍)。
  聚合物   IC50(μg/mL)   提高倍数
  b-PEI25000b-PEI25000-CD   7.51000 133
  l-PEI25000l-PEI25000-CD   111000 90
  JET-PEIMan-JET-PEI   1.123 20
实施例7通过分支CD-PEI体内输送DNA
对Balb-C小鼠门静脉注射含有200μg的pGL3-CV(AD-PEG∶CD-PEI∶pGL3-CV的重量比为15∶5∶1)的PEG化的CD-PEI。将小鼠麻醉后，注射荧光素，并在注射后4.5小时使用Xenogen相机照相。检查肝脏中的荧光酶表达，光发射结果如图6所示。
实施例8半乳糖基化的CD-PEI体外转染肝癌细胞
通过在形成聚合复合物时加入AD-PEG5000-半乳糖(金刚烷-聚乙二醇-半乳糖)或AD-PEG5000(关于金刚烷结合物及其包合复合物的详细信息，参见PCT公开WO02/49676)，用PEG-半乳糖和PEG修饰基于CD-PEI的聚合复合物(含有α-荧光酶质粒)。AD-PEG5000-半乳糖或AD-PEG5000中的金刚烷与环糊精形成包合复合物，并且用PEG-半乳糖或PEG修饰微粒的表面。将这些聚合复合物暴露给HepG2细胞，一种表达脱唾液酸糖蛋白受体的肝癌细胞。半乳糖修饰的聚合复合物使荧光酶的表达增加10倍，如图7所示，用半乳糖介导的吸收表示转染的增加。
实施例9
确定CD-bPEI环糊精负载对转染效率的影响
转染前24小时，在24孔平板上以50,000细胞/孔的浓度涂布PC3细胞。临转染前，将每个孔中的细胞用PBS冲洗一次，然后加入200μL含有聚合复合物(1μg以10 N/P与按照实施例1合成的聚阳离子复合的DNA)的Optimem(Invitrogen)。4小时后，吸出转染介质，替换为1mL的完全培养基。再过24小时后，用PBS冲洗细胞，添加100μL细胞培养裂解缓冲液(Cell Culture Lysis Buffer(Promega，Madison，WI))进行裂解。使用Promega公司的荧光酶分析试剂分析细胞裂解物的荧光酶活性。使用光度计(Monolight 3010C，Becton Dickinson)对光单位积分10秒以上。观察到PEI∶CD的比例大于10时有较高的转染率(参见图8)。
确定CD-bPEI环糊精负载对细胞毒性的影响
在96孔平板上以5,000细胞/孔的浓度涂布PC3细胞24小时。聚合物加到第三列，进行横向系列稀释。24小时后，用PBS冲洗细胞，每孔中添加50μL MTT(在PBS中，2mg/mL)，再加入150μL完全培养基。在37℃培养4小时后，去除培养基，加入150μL的DMSO来溶解甲
Figure C0380445400341
结晶。在540nm测定吸光度确定细胞存活率。所有的实验重复3次取平均值。图示出平均吸光度与聚合物浓度的关系，通过在线性吸光区域插值来确定IC50值。在bPEI上结合的CD越多，聚合物的耐受性越高(参见图9)。
实施例10
确定CD-lPEI环糊精负载对细胞毒性的影响
根据实施例9的方法确定CD-lPEI聚合物(PEI∶CD为8.4，合成方法见实施例3)对PC3细胞的IC50，并且与母体lPEI聚合物的IC50进行对比。CD-lPEI的IC50(220μg/mL)比lPEI的IC50(15μg/mL)大15倍。
确定氯奎对CD-lPEI转染效率的影响
在6孔平板上以250,000细胞/孔的浓度涂布PC3细胞。24小时后，用在1mL Optimen中的以N/P与聚合物复合的5μg pEGFP-luc质粒转染细胞(在一些样品中，加入含有200μM氯奎的Optimen)。转染4小时后，去除培养基，替换为5mL的完全培养基。转染后48小时，用PBS冲洗细胞，用胰蛋白酶消化，用流动细胞计数仪测定EGFP表达。在lPEI上以PEI∶CD为8.4的比例结合环糊精不影响转染效率。结果如图10所示。
实施例11
配制基于CD-bPEI和CD-lPEI的微粒
向DNA(在水中，0.1mg/mL)中加入等体积的聚阳离子(溶解于水或D5W中)。通过改变聚阳离子溶液的浓度来调整聚合物氮与DNA磷的比例(N/P)。
CD-bPEI微粒的电子显微镜观察
按照上述方法，使用CD-bPEI(PEI∶CD为12.6)以10N/P配制聚合复合物。把5μL聚合复合物放到400目的涂碳铜网上45秒，此后用滤纸吸干多余的液体。在吸干之前，用2％乙酸双氧铀负染色样品45秒。在临放样品之前，将400目的涂碳铜网辉光放电。在80kV下使用Philips 201电子显微镜照相，如图11所示。
CD-bPEI和CD-lPEI微粒的粒度
按照上述方法，使用CD-bPEI(PEI∶CD为12.6)以10N/P配制微粒，然后加入1.2mL水进行稀释。使用ZetaPals动态光散射监测仪(BrookhavenInstrument Corporation)测量微粒大小。每一种样品检测三次，取平均粒度。
  聚合物   平均微粒直径(nm)   标准偏差(nm)
  bPEI   290   3
  lPEI   115   2
  CD-bPEI   96   1
  CD-lPEI   93   1
加入AD-PEG后CD-bPEI和CD-lPEI微粒的盐稳定作用
按照上述方法配制微粒，然后加入1.2mL PBS进行稀释。每隔10分钟，用ZetaPals动态光散射监测仪检测微粒大小。样品重复3次，每一个时间点的数据取平均粒度。加入AD-PEG有助于稳定CD-bPEI和CD-lPEI微粒对抗盐诱导的聚集。向bPEI和lPEI微粒中加入AD-PEG不会影响盐诱导的聚集，结果如图12所示。
实施例12
使用CD-bPEI和CD-lPEI微粒输送寡核苷酸
在6孔平板上以2,000,000细胞/孔的浓度涂布PC3细胞。24小时后，用5μg以10N/P与聚阳离子复合的荧光标记的寡核苷酸转染细胞。15分钟后，用PBS细胞洗涤缓冲液冲洗细胞，用胰蛋白酶消化，用流动细胞计数仪测定对聚合复合物的吸收。使用CD-bPEI(PEI∶CD为12.6)和CD-lPEI(PEI∶CD为8.4)可以有效地向培养的细胞输送寡核苷酸，结果如图13所示。
实施例13
CD-lPEI和CD-bPEI聚合物的体内耐受性
对雌性的Balb/C小鼠静脉注射0.4mL基于CD-lPEI和CD-bPEI的聚合复合物(D5W溶液)，注射速度为约0.2ml/15秒。注射24小时后处死小鼠，收集血液分析转氨酶、肌酸酐、血小板和白细胞。
组：
1.对照
2.CD-bPEI    10N/P             0.1mg DNA/mL
3.CD-bPEI    10N/P             0.2mg DNA/mL
4.CD-bPEI    10N/P             0.3mg DNA/mL
5.CD-lPEI    10N/P             0.1mg DNA/mL
6.CD-lPEI    10N/P             0.2mg DNA/mL
7.CD-lPEI    10N/P             0.3mg DNA/mL
测定的CD-bPEI的最大耐受剂量是9mg/kg(假定20g小鼠，剂量0.1mg DNA/mL)。对于0.2mg DNA/mL的剂量，所有的小鼠都存活，但是血小板量减少。
测定的CD-lPEI的最大耐受剂量是至少36mg/kg(假定20g小鼠，剂量0.3mg DNA/mL)。没有观察到血小板抑制或升高的肝酶水平。而且，在最高剂量下所有的小鼠都存活。
作为对比，测定的lPEI的LD50是约3-4mg/kg(50％的Balb/C小鼠在注射50μg以10N/P与lPEI复合的DNA后死亡；Chollet等J GeneMedicine v4：84-91(2002))。
在异种移植的肿瘤中注射CD-lPEI聚合复合物的体内表达
把CD-lPEI微粒注射到Neuro2a肿瘤小鼠的肿瘤(每个小鼠注射120μg以10N/P与CD-lPEI复合的DNA)。48小时后，分离肿瘤，均质后分析荧光酶的表达。测定的平均表达是2500RLU/mg组织。
实施例14
半乳糖-bPEI的合成
Figure C0380445400381
方法
a.合成甲苯磺酰基-半乳糖
在0℃，将无水吡啶(10mL)中的对甲苯磺酰氯(5.8g，30.5mmol，Acros)逐滴加入到无水吡啶(50mL)中的D-半乳糖(5g，27.8mmol，Aldrich)溶液中。室温下搅拌溶液4小时。用甲醇(MeOH，2mL)终止反应，用75mL的CHCl3稀释，用冰冷的水(50mL)洗2次。将有机相减压干燥。
将残余物进行C8反相柱色谱，用0-50％的乙腈水溶液进行梯度洗脱。在装有UV168检测器，蒸发光散射(ELS)检测器和C18反相柱(Alltech)的Beckman Coulter System Gold HPLC系统上分析各级分，用乙腈/水梯度溶液作为洗脱剂，流速为0.7mL/分钟。合并适宜的级分并蒸发至干。通过质谱证实由该方法得到了甲苯磺酰基-半乳糖：电喷雾解离：357.1[M+Na]+，690.7[2M+Na]+。
b.合成不同半乳糖负载量的半乳糖-bPEI
低负载：把分支PEI25,000(64.9mg，0.0026mmol，Aldrich，MW 25,000)和甲苯磺酰基-半乳糖(13mg，0.039mmol)溶解于22mL的H2O/DMSO(5/95)中。在70℃搅拌溶液3天。然后将溶液转移到Spectra/Por MWCO 10,000膜中用水透析6天。冻干去水后得到浅色固体。基于1H NMR的质子积分(Varian 300MHz，D2O)计算半乳糖/PEI比例。
高负载：把分支PEI25,000(64.9mg，0.0026mmol，Aldrich，MW 25,000)和甲苯磺酰基-半乳糖(130mg，0.39mmol)溶解于22mL的H2O/DMSO(5/95)中。在70℃搅拌溶液3天。然后将溶液转移到Spectra/Por MWCO 10,000膜中用水透析6天。冻干去水后得到浅色固体。基于1H NMR的质子积分(Varian 300MHz，D2O)计算半乳糖/PEI比例。
实施例15
合成半乳糖-lPEI
Figure C0380445400391
方法：
低负载：把线性PEI25,000(100mg，0.004mmol，Polyscience，MW 25,000)和甲苯磺酰基-半乳糖(20mg，0.06mmol)溶解于7.2mL的DMSO中。在70℃搅拌溶液6天。然后将溶液转移到Spectra/Por MWCO 10,000膜中用水透析6天。冻干去水后得到浅色固体。基于1H NMR的质子积分(Varian300MHz，D2O)计算半乳糖/PEI比例。
高负载：把线性PEI25,000(100mg，0.004mmol，Polyscience，MW 25,000)和甲苯磺酰基-半乳糖(200mg，0.6mmol)溶解于7.2mL的DMSO中。在70℃搅拌溶液6天。然后将溶液转移到Spectra/Por MWCO 10,000膜中用水透析6天。冻干去水后得到浅色固体。基于1H NMR的质子积分(Varian300MHz，D2O)计算半乳糖/PEI比例。
所有的上述参考文献和公开文本都在这里引作参考。
本领域的普通技术人员可以认识到或者能够使用常规的实验来确定本发明描述的特定实施方案的许多等价方案。这些等价方案包括在如下权利要求书中。

Claims (25)

1.一种聚合物，它含有与环糊精部分共价偶联的聚乙烯亚胺，其中，聚合物中乙烯亚胺单元与环糊精部分的比例在4∶1到20∶1之间。
2.如权利要求1所述的聚合物，其中所述的聚乙烯亚胺是分支的聚合物。
3.如权利要求1所述的聚合物，其中所述的聚乙烯亚胺是线性的聚合物。
4.如权利要求1所述的聚合物，其中所述的聚合物具有下式的结构：
其中，R每次出现时分别独立的代表H、低级烷基、包含环糊精部分的基团或
Figure C038044540002C2
m每次出现时分别独立的代表大于10的整数。
5.如权利要求1所述的聚合物，其中所述的乙烯亚胺单元与环糊精部分的比例在9∶1到20∶1之间。
6.一种包含下式结构的聚合物：
其中，R每次出现时分别独立的代表H、低级烷基、包含碳水化合物部分的基团或
Figure C038044540002C4
m每次出现时分别独立的代表大于10的整数，其中3-15％的R代表包含除半乳糖和甘露糖以外的其它碳水化合物部分的基团，其中所述的碳水化合物部分包含环糊精部分。
7.如权利要求6所述的聚合物，其中所述的碳水化合物部分基本上由环糊精部分组成。
8.一种组合物，它含有权利要求1的聚合物和核酸。
9.一种用核酸转染细胞的方法，它包括使细胞与权利要求8的组合物接触的步骤。
10.一种试剂包，它含有权利要求1的聚合物和指导将聚合物和核酸结合以用核酸转染细胞的说明。
11.一种组合物，它含有权利要求6的聚合物和核酸。
12.一种用核酸转染细胞的方法，它包括使细胞与权利要求11的组合物接触的步骤。
13.一种试剂包，它含有权利要求6的聚合物和指导将聚合物和核酸结合以用核酸转染细胞的说明。
14.一种微粒，它含有权利要求1的聚合物，并且其直径在50-1000nm之间。
15.如权利要求14所述的微粒，它还含有核酸。
16.如权利要求14所述的微粒，它还含有通过与环糊精部分的包合复合物偶联到聚合物上的聚乙二醇链。
17.一种微粒，它含有权利要求6的聚合物，并且其直径在50-1000nm之间。
18.如权利要求17所述的微粒，它还含有核酸。
19.如权利要求17所述的微粒，它还含有通过与环糊精部分的包合复合物偶联到聚合物上的聚乙二醇链。
20.一种聚合物，它含有共价偶联到碳水化合物部分上的线性聚乙烯亚胺，其中，聚合物中2-25％的乙烯亚胺单元被碳水化合物部分修饰。
21.如权利要求20所述的聚合物，其中的碳水化合物部分包含环糊精部分。
22.如权利要求20所述的聚合物，其中的碳水化合物部分基本上由环糊精部分组成。
23.一种组合物，它含有权利要求20的聚合物和核酸。
24.一种用核酸转染细胞的方法，它包括使细胞与权利要求23的组合物接触的步骤。
25.一种试剂包，它含有权利要求20的聚合物和指导将聚合物和核酸结合以用核酸转染细胞的说明。
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