CN112535738B - 奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents
奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112535738B CN112535738B CN202011420447.6A CN202011420447A CN112535738B CN 112535738 B CN112535738 B CN 112535738B CN 202011420447 A CN202011420447 A CN 202011420447A CN 112535738 B CN112535738 B CN 112535738B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oxaliplatin
- domain antibody
- single domain
- polyethylene glycol
- prodrug
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用,所述奥沙利铂偶联物其具有下式所示的结构:奥沙利铂前药‑单域抗体‑聚乙二醇;其中,奥沙利铂前药为奥沙利铂四价铂前药,聚乙二醇为分子量为5‑40kDa的聚乙二醇。本发明的偶联物相比于小分子奥沙利铂而言,具有低成本、高载药量、高肿瘤靶向性及渗透性、长效血液循环的优势。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域,涉及一种能够提高奥沙利铂的肿瘤靶向能力并延长其在体内的血液循环时间的方法及其应用。
背景技术
当前癌症是造成患者高死亡率的最严重疾病之一,由于环境污染和不良的生活习惯等各种诱发因素,癌症的发病率和病死率呈现快速上升趋势。化疗、放疗和手术切除是目前临床肿瘤治疗中最常用的三种治疗策略,其中化疗手段,无论是单纯化疗还是辅助化疗都被认为是最有效和最有前途的治疗策略。临床上最常用的小分子抗癌药物在化疗中起着核心作用,目前三种铂类小分子药物(顺铂,卡铂和奥沙利铂)已获全球批准用于治疗人类癌症,其中,奥沙利铂作为第三代铂类抗肿瘤药物,相比于顺铂和卡铂而言,能更有效地抑制DNA的合成,具有更强的细胞毒性。然而该小分子药物在临床应用中也存在着一些问题,比如高的全身毒性、低的有效富集和严重的毒副作用等。这些问题大大限制了小分子药物的有效剂量水平和疗效。因此,开发能够克服相关限制的肿瘤靶向药物是至关重要的。
抗体药物偶联(ADC)将细胞毒性药物与高度特异性的单克隆抗体结合在一起,成为小分子药物在体内和体外靶向肿瘤递送的一种有效手段。到目前为止,一些研究表明ADC在恶性肿瘤的治疗中显示出良好的应用前景。如高亲和性的人源的抗C-Met抗体与奥沙利铂偶联,可作为肝癌的一种靶向化疗方案。(Ma,Yilan,et al.Frontiers in Oncology 9(2019):717.)然而,目前抗体面临的一些挑战,如制备过程复杂且成本高、尺寸较大(150kDa;尺寸:14.2nm×8.5nm×3.8nm)及肿瘤穿透能力差等,也严重限制了其应用。
近年来,单域抗体(VHH)作为一种新型的纳米靶向制剂受到了广泛的青睐。2018年,首个单域抗体药物Caplacizumab被欧洲药物管理局(EMA)批准用于治疗成人获得性血栓性血小板减少性紫癜(aTTP)。该药物也于2019年获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准。对比单克隆抗体,单域抗体分子量要小得多(12-14kDa;尺寸:2.5nm×4nm×3nm),它比单克隆抗体更容易接近抗原内部的靶点,从而具有更高的抗原结合能力和组织穿透能力。同时,它还存在许多其他优势,比如低的生产成本、较好的亲水性和热稳定性,较低的免疫原性及较高的载药量等。对比小分子药物,它比小分子药物分子量要大,在体内的肾脏清除速率比小分子慢;它相比于小分子药物具有更好的肿瘤靶向性,给药时可避免非特异性的杀伤。这些优势都大大促进了单域抗体近年来的快速发展。因此将奥沙利铂与单域抗体偶联,以实现较低的成本、较高的载药量、高的药物的肿瘤靶向性及渗透性是非常有必要的。
虽然单域抗体在应用方面具有很大优势,但是它的小体积对其在临床上的应用仍然存在一定的限制。虽然相比于小分子奥沙利铂来说它的循环时间有所提高,但即使将其与奥沙利铂偶联,它的肾脏清除相比于抗体仍然要快得多。所以通过一些策略延长单域抗体在体内的循环时间,并保留其相对于抗体的优势以达到更好的疗效是非常关键的。已有研究报道通过聚乙二醇化来实现药物的血液循环时间。但是,不同长度的聚乙二醇与药物偶联后,会改变药物的理化性质,从而相应的改变药物的生物活性,产生与原来药物不同的治疗效果。
因此,一种既能够通过实现肿瘤靶向性和渗透性来改善奥沙利铂严重的毒副作用和低的有效富集的缺点,也能够通过偶联合适长度的聚乙二醇来极大的延长奥沙利铂的血液循环时间,并保证一定的疗效的方法急需被研究。
发明内容
本发明针对上述提到的问题进行设计。目前奥沙利铂药物存在的主要问题就是其高的全身毒性、严重的毒副作用及低的肿瘤富集性。将奥沙利铂与单域抗体进行偶联,通过提高奥沙利铂的靶向性及肿瘤渗透性可以改善其存在的缺点,但是因为单域抗体尺寸较小,在体内的循环时间较短,这限制了奥沙利铂-单域抗体偶联物的进一步应用。通过在单域抗体上连接聚乙二醇可以弥补这个劣势,但是目前关于在单域抗体上偶联多少长度聚乙二醇的问题尚未有具体的研究。
基于上述问题,本发明实施例探究了一定范围内不同长度的聚乙二醇对奥沙利铂前药-单域抗体偶联物的药代动力学特性及生物活性的影响,研究了一种既能够改善奥沙利铂缺点,也能够在一定范围内极大的延长奥沙利铂的血液循环时间,并保证一定的疗效的方法。
在本发明的实施例中,所使用的单域抗体可以是靶向某些特定类型的肿瘤细胞表面过表达的受体的单域抗体,如靶向人表皮生长因子受体1(EGFR),人表皮生长因子受体2(HER-2)及血管表皮生长因子受体(VEGFR)的单域抗体等。
在本发明的实施例中,所述的奥沙利铂四价铂前药在递送过程中是惰性的,只有在进入肿瘤细胞还原环境中被还原为二价铂,才会释放出奥沙利铂发挥作用,达到杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤生长的目的。
在本发明的实施例中,所述的奥沙利铂四价铂前药可以通过将奥沙利铂氧化成轴向(即与奥沙利铂分子所在平面垂直的轴)含两个羟基的四价铂,然后通过羟基与羧基的反应将功能基团连接的方法得到。
在本发明的实施例中,所述的奥沙利铂四价铂前药轴向上的功能基团包括马来酰亚胺基、羧基、叠氮基团或炔基基团等。
在本发明的实施例中,所述聚乙二醇可以是分子量5-40kDa的直链或支链聚乙二醇。
在本发明的实施例中,制备奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物的方法包括:
1)奥沙利铂前药通过功能基团与所述单域抗体的偶联,可通过基因工程的方法在单域抗体的C端连接含活性基团的标签,标签上的活性基团与奥沙利铂前药通过位点特异性反应进行偶联。例如,将含有马来酰亚胺基的奥沙利铂前药配合物与C端含半胱氨酸的单域抗体偶联:将所述单域抗体通过还原剂处理以得到活性巯基;所述单域抗体与所述含有马来酰亚胺基的奥沙利铂前药配合物以物质的量的关系为1∶3-1∶30的条件反应;所述反应可以在室温(25-35℃)下进行;所述反应时长为6h-24h。
2)所述单域抗体的聚乙二醇化可通过在单域抗体的C端连接含活性基团的标签,通过酶促反应催化标签上的活性基团与聚乙二醇的反应来实现。例如,在一个实施例中,在单域抗体的C端连接亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸(L-L-Q-S)标签,利用标签上的谷氨酰胺上的γ-酰胺基与氨基聚乙二醇上的氨基通过谷氨酰胺转氨酶的定点催化反应进行偶联。所述的单域抗体与所述氨基聚乙二醇的浓度的物质的量的关系为1∶1-1∶10,反应体系中谷氨酰胺转氨酶的浓度为0.5-2U/mL。该反应条件温和,在室温(25-35℃)进行0.5-2h即可。
在另一个实施例中,通过在单域抗体的C端连接亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸-苏氨酸-甘氨酸(L-P-E-T-G)标签,在聚乙二醇的一端连接甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(G-G-G)标签,利用转肽酶的催化作用,将聚乙二醇与单域抗体偶联。
在本发明的一个实施例中,探究不同聚乙二醇长度对奥沙利铂前药-单域抗体偶联物的药代动力学特性及生物活性的影响主要包括以下步骤:
第一步:运用分子克隆的技术在单域抗体的C端融合上“-接头1-活性基团标签1-接头2-活性基团标签2”片段,其中接头1为3个(G4S)(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸),接头2为3个(GS)(甘氨酸-丝氨酸),C标签是C-C-C(半胱氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸),Q标签是L-L-Q-S(亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸)。将融合标签后的单域抗体的质粒转入原核表达体系中。
第二步:带标签的单域抗体通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的表达菌株表达,通过镍柱亲和层析的方法初步纯化,AKTA蛋白纯化仪进一步纯化。
第三步:利用酶促反应分别将不同长度的聚乙二醇连接到第二步得到的单域抗体上,得到多种聚乙二醇化的单域抗体。
第四步:制备含有功能基团的奥沙利铂四价铂前药。
第五步:分别将奥沙利铂四价铂前药与不同长度的聚乙二醇化的单域抗体通过前面提及的定点偶联的方法连接。
第六步:通过细胞实验探究不同的奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物的药效。
第七步:通过以特定的剂量对实验小鼠进行尾静脉注射第五步得到的多种不同的奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物,分别在不同的时间点对小鼠进行眼眶静脉丛取血,然后通过电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定血浆中铂的浓度。
第八步:整合第七步得到的关于血浆中铂的浓度的数据,计算药代动力学相关参数,评估不同的聚乙二醇对药代动力学特性的影响。
基于以上研究,一方面,本发明提出一种奥沙利铂偶联物,其具有下式所示的结构:
奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇;
其中,奥沙利铂前药为奥沙利铂四价铂前药,聚乙二醇为分子量为5-40kDa的聚乙二醇。
在一些实施例中,所述奥沙利铂四价铂前药的轴向上包含马来酰亚胺基基团(单域抗体通过其中的巯基与马来酰亚胺基发生加成反应进行偶联)、羧基基团(单域抗体通过其中的氨基与羧基发生缩合反应进行偶联)、叠氮或炔基基团(单域抗体通过其中的炔基修饰基团与叠氮发生点击反应进行偶联,或者单域抗体通过其中的叠氮修饰基团与炔基发生点击反应进行偶联)等。
在一些实施例中,所述单域抗体为靶向人表皮生长因子受体1(EGFR),人表皮生长因子受体2(HER-2)或血管表皮生长因子受体(VEGFR)的单域抗体。
另一方面,本发明提供一种奥沙利铂偶联物的制备方法,包括:
制备奥沙利铂四价铂前药;
制备单域抗体-聚乙二醇偶联物,其中聚乙二醇为分子量为5-40kDa的聚乙二醇;
将所述奥沙利铂四价铂前药与所述单域抗体-聚乙二醇偶联物进行偶联。
在一些实施例中,制备奥沙利铂四价铂前药的步骤包括:
由奥沙利铂制备羟基奥沙利铂配合物;
将羟基奥沙利铂配合物中的一个羟基取代制备奥沙利铂四价铂前药,所述奥沙利铂四价铂前药的轴向上包含马来酰亚胺基基团、羧基基团、叠氮基团或炔基基团。
例如,在一个实施例中,使奥沙利铂与H2O2反应得到羟基奥沙利铂配合物。在一个实施例中,可以利用羟基奥沙利铂配合物与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯制备含有马来酰亚胺基的奥沙利铂四价铂前药,马来酰亚胺基可与单域抗体中的巯基反应进行偶联;在另一个实施例中,还可以利用羟基奥沙利铂配合物与酸酐反应制备含有羧基的奥沙利铂四价铂前药,羧基可与单域抗体中的氨基反应进行偶联。
在一些实施例中,制备单域抗体-聚乙二醇偶联物的步骤包括:
在单域抗体上连接含有第一活性基团的第一标签和含有第二活性基团的第二标签,所述第一活性基团能够与聚乙二醇结合,所述第二活性基团能够与奥沙利铂四价铂前药结合;
使所述第一活性基团与聚乙二醇结合得到单域抗体-聚乙二醇偶联物。
在一些实施例中,所述第一活性基团包括谷氨酰胺残基,所述聚乙二醇为氨基聚乙二醇,谷氨酰胺残基与氨基聚乙二醇的氨基通过谷氨酰胺转氨酶的定点催化反应进行偶联。
在一些实施例中,所述第一标签为肽,所述单域抗体与肽修饰的聚乙二醇在转肽酶的催化作用下进行偶联。
在一些实施例中,所述第二活性基团包括半胱氨酸残基,将半胱氨酸的巯基充分还原后与奥沙利铂四价铂前药中的马来酰亚胺基基团发生加成反应进行偶联;或者所述第二活性基团包括氨基,氨基与奥沙利铂四价铂前药中的羧基基团发生缩合反应进行偶联;或者所述第二活性基团包括叠氮基团,叠氮基团与奥沙利铂四价铂前药中的炔基基团发生点击反应进行偶联;或者所述第二活性基团包括炔基基团,炔基基团与奥沙利铂四价铂前药中的叠氮基团发生点击反应进行偶联。
又一方面,本发明提出一种所述奥沙利铂偶联物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的偶联物相比于小分子奥沙利铂而言,具有低成本、高载药量、高肿瘤靶向性及渗透性、长效血液循环的优势;
本发明的单域抗体可以利用基因工程的方法,在C端连接1-3个半胱氨酸,用于马来酰亚胺基功能化的四价奥沙利铂前药的定点偶联,该偶联过程中不存在有机溶剂,反应条件温和;
本发明的单域抗体的分子量小于15kDa,双功能单域抗体的分子量小于30kDa,具有较好的肿瘤组织渗透性;
依照本发明探究而筛选得到的较为合适的奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物,从细胞靶向性,药物积累量,细胞毒性,循环时间等方面研究的结果表明,该偶联物设计在肿瘤的靶向治疗方面具有巨大潜能,为今后其他小分子药物-单域抗体-聚乙二醇偶联物药物的设计提供了思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的马来酰亚胺基功能化四价铂的ESI-MS表征;
图2为本发明实施例1中制备的马来酰业胺基功能化四价铂的1H-NMR表征;
图3为本发明实施例3中纯化的在C端融合三个半胱氨酸和L-L-Q-S的单域抗体的鉴定和纯度检测;
其中:左图为分子筛图,其中不同位置峰从左到右分别为:单域抗体-聚乙二醇(30k)、单域抗体-聚乙二醇(20k)、单域抗体-聚乙二醇(10k)、单域抗体;右图为聚丙烯酰胺凝胶电泳图,1-4分别为:单域抗体、单域抗体-聚乙二醇(10k)、单域抗体-聚乙二醇(20k)、单域抗体-聚乙二醇(30k);
图4为本发明实施例3中纯化的单域抗体的靶向性情况;
其中:左边图为细胞核染色,中间为标记了FITC的单域抗体孵育细胞,右边为前面两张图的叠加图;
图5为本发明实施例7中奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物体系与DNA的体外反应;
其中:A:左侧为溴化乙锭与DNA反应,左侧为奥沙利铂与DNA反应;B-E:左侧分别是在没有还原剂ASA情况下,奥沙利铂前药-单域抗体、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(10k)、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(20k)、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k)与DNA反应;右侧分别是有还原剂ASA情况下,奥沙利铂前药-单域抗体、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(10k)、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(20k)、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k)与DNA反应;
图6为本发明实施例8中奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物体系的细胞积累情况;
其中:A:奥沙利铂;B:奥沙利铂前药-单域抗体;C:奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(10k);D:奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(20k);E:奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k);
图7为本发明实施例9中奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物体系的肿瘤细胞毒性测定;
其中:每组从左到右四个条带分别代表:奥沙利铂前药-单域抗体、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(10k)、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(20k)、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k)在铂浓度为100μM时的细胞存活率;
图8为本发明实施例10中奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物体系的药代动力学研究。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:四价铂前药的制备
依照本发明,我们在实施例中具体提供了四价的奥沙利铂前药的制备步骤。
将300mg奥沙利铂(山东铂源药业有限公司)分散在12mL 30%H2O2中,75℃避光反应2h,得到淡黄色溶液,将溶剂在旋转蒸发器上蒸发。然后用少量丙酮和大量冷乙醚沉淀产物,反复三次。真空干燥得到淡黄色的羟基奥沙利铂配合物(化合物1)。
为制备马来酰亚胺基功能化的四价铂前药,将化合物1和6-(马来酰亚胺基)已酸琥珀酰亚胺酯以一定的物质的量比例(1∶0.9)溶于5mL无水DMF中,在50℃黑暗条件下搅拌16h,得到黄色溶液,将溶剂在旋转蒸发器上蒸发。然后,用少量甲醇和大量冷乙醚沉淀产品,反复三次,然后真空干燥,得到为黄色粉末状产物马来酰亚胺基功能化的四价铂前药(化合物2)。产物经由ESI-MS和1H-NMR鉴定。结果见图1和图2。反应流程如下图所示:
实施例2:改造靶向EGFR的单域抗体的质粒
依照本发明提供的方法,在本实施例中所用单域抗体为抗EGFR单域抗体,其名称为7D12。首先,利用聚合酶链式反应(PCR),在全基因合成(生工生物工程有限公司)的7D12cDNA序列的C端添加“-接头1-C标签-接头2-Q标签”,并命名为7D12-C3Q。其中接头1为3个(G4S)(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸),接头2为3个(GS)(甘氨酸-丝氨酸),C标签是C-C-C(半胱氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸),Q标签是L-L-Q-S(亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸)。在PCR反应结束后,利用琼脂糖凝胶电泳对目的序列片段进行回收。
其次,利用限制性内切酶NdeI和XhoI对回收的目的序列片段进行酶切。同时,利用相同的限制性内切酶对表达载体pET-22b进行酶切,利用琼脂糖凝胶电泳纯化并进行回收。
最后,利用T4 DNA连接酶将限制性内切酶酶切后的目的序列片段和表达载体pET-22b连接。将连接后得到的质粒转化到原核(大肠杆菌)克隆菌株Top 10中,过夜培养后挑取单克隆,扩大培养12-20h,抽提质粒,测序鉴定(生工生物工程有限公司)。
改造后的单域抗体DNA序列(SEQ ID NO:1):
ATGCAGGTGAAACTGGAGGAGTCCGGTGGCGGCTCCGTACAGACTGGCGGTAGCCTGCGTCTGACTTGTGCAGCATCTGGTCGTACTTCTCGTTCTTACGGCATGGGCTGGTTCCGTCAGGCACCAGGCAAAGAGCGTGAATTCGTGAGCGGTATTAGCTGGCGTGGCGACAGCACCGGTTACGCTGACAGCGTCAAGGGTCGTTTCACGATCTCCCGCGACAACGCTAAGAACACGGTGGACCTGCAGATGAACTCCCTGAAACCTGAAGACGCCGCGATCTACTACTGCGCGGCAGCCGCCGGTAGCGCTTGGTACGGTACGCTGTACGAATACGATTACTGGGGTCAGGGTACCCAGGTGACCGTAAGCAGCGGCGGCGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGTTCCGGCGGCGGTGGCTCTTGTTGTTGCGGTTCCGGGTCCGGCTCCCTGCTGCAGAGC。
改造后的单域抗体氨基酸序列(SEQ ID NO:2):
MQVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCCCGSGSGSLLQS。
实施例3:实施例2中改造的单域抗体7D12-C3Q的表达纯化
1、7D12-C3Q在大肠杆菌中过表达:
将实施例2中得到的测序正确的质粒转入Rosetta-gami原核表达菌株中,将菌液涂板,挑取单克隆,扩大培养至200mL-1000mL的LB培养基(含100μg/mL氨苄抗生素)中培养。菌株培养至OD600=0.8-1.0时,加入异丙基硫代半乳糖苷(0.2-1mM),25℃诱导10-15h。培养结束后,以4000rpm,20min的条件于4℃离心收集菌体。
2、用Ni-NTA亲和层析树脂对7D12-C3Q初步纯化:
用结合缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,200mM NaCl)重悬菌体(20mL buffer/L菌液所得菌体)。将重悬菌液进行超声破碎(20KHz,15min)。以16000rpm转速于4℃将细胞破碎液离心30min。上清以0.45和0.22μm微孔滤膜进行抽滤,收集清液。
将上清倒入Ni-NTA亲和层析树脂柱中,置于4℃旋转摇床,孵育30min,使单域抗体充分结合到Ni-NTA亲和层析树脂上。
放出流穿液,加入20mL清洗缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0,200mM NaCl,20-25mM咪唑),置于4℃旋转摇床,孵育30min,以除去结合在树脂上的杂蛋白。放出流穿液后,以清洗缓冲液冲洗树脂三次。以20mL洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,200mM NaCl,500mM咪唑)将改造后的单域抗体从树脂上洗脱下来。收集含单域抗体的洗脱缓冲液,透析除去体系中的咪唑并浓缩。
将初步纯化得到的单域抗体7D12-C3Q通过蛋白纯化仪,用蛋白纯化柱(HiLoad 10/60Superdex 200column)进一步纯化。用结合缓冲液对纯化柱预平衡,进样后根据蛋白分子量(~15kDa)在相应的时间(~17mL)接样,最后通过超滤进行浓缩。
用紫外可见分光光度法法和BCA法确定蛋白浓度。
获得的7D12-C3Q单域抗体的纯度表征SDS-PAGE电泳图见图3。
实施例4:单域抗体-PEG偶联物的制备
将纯化得到的7D12-C3Q单域抗体(3mg/mL)与分子量分别为10kDa,20kDa,30kDa的氨基聚乙二醇(mPEG10k-NH2,mPEG20k-NH2,mPEG30k-NH2)(1mg/mL)混合,加入1U/mL的谷氨酰胺转氨酶,室温反应1h。反应后的产物聚乙二醇化单域抗体在蛋白纯化仪(HiLoad10/60Superdex 200column)中进行进一步纯化,纯化后的纯度通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,电泳图见图3。
实施例5:奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物的制备
在37℃的恒定温度下向实施例3中得到的单域抗体及实施例4所得的聚乙二醇化的单域抗体中加入相当于单域抗体5倍摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP),室温处理2h,使C端C标签上半胱氨酸的巯基被充分还原。随后使用蛋白纯化仪(HiTrapTMDesalting)对蛋白分别脱盐,以除去混合在体系中的还原剂。然后将30倍摩尔当量的实施例1中得到的马来酰亚胺基功能化的奥沙利铂四价铂前药加入到还原后的单域抗体及聚乙二醇化的单域抗体中,室温下搅拌12h后,通过蛋白纯化仪(HiTrapTMDesalting)除去体系中未参与反应的奥沙利铂四价铂前药。
通过BCA法测定蛋白的浓度,通过ICP-MS测量偶联物中铂的含量。结果表明,本发明可实现较高的药物负载量:铂/单域抗体为13.2-39.6mg/g。
实施例6:改造后的单域抗体的细胞靶向性验证
首先用荧光探针异硫氰酸荧光素(FITC,激发光488nm)标记改造后的单域抗体。将10倍摩尔当量的FITC(溶解于DMSO)缓慢加入已稀释于pH 8.5-9.0的PBS缓冲液的单域抗体中。4℃搅拌过夜后,通过在Tris-NaCl缓冲液(50mM Tris,200mM NaCl)中透析来终止反应,通过多次透析以去除多余的FITC。然后在PBS缓冲液(pH 7.4)中使用脱盐柱(GEHealthcare)进一步纯化FITC标记的单域抗体。
选取两种EGFR表达水平不同的典型肿瘤细胞来研究单域抗体的靶向能力。将表皮生长因子受体阳性(EGFR+)的肿瘤细胞A431和表皮生长因子受体阴性(EGFR-)的肿瘤细胞MCF-7分别接种于6孔板中,接种密度为2×105个细胞/孔,置于细胞培养箱中进行过夜培养。然后用含有10μM的FITC标记的单域抗体的1mL新鲜培养基替换培养孔中原有的培养基。将细胞在培养箱中进一步培养3小时。细胞核用DAPI染色(参照产品说明书)。随后,细胞用冷PBS洗涤3次,使用荧光显微镜检测荧光,分析单域抗体与细胞的结合情况。结果如图4所示,A431(EGFR+)细胞中可见明亮的绿色荧光,而MCF-7(EGFR-)细胞中没有绿色荧光信号,说明Nb具有显著的细胞特异性。同时,流式细胞仪分析进一步支持了这一结果。两种细胞分别与FITC标记的单域抗体孵育后,结果显示A431的荧光强度大大增加,而相同条件下MCF-7细胞的荧光强度几乎无变化。结果表明,改造后的单域抗体对EGFR阳性细胞仍具有较强的靶向作用,有望在疾病的靶向治疗中发挥作用。
实施例7:奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物与DNA的体外反应
四价铂很难与细胞核内DNA相互作用并产成细胞毒性,因此将四价铂还原为二价铂,二价铂再与细胞核DNA作用发挥毒性被认为是四价铂类药物发挥抗癌活性的关键。为了模拟肿瘤细胞内的还原环境,引入抗坏血酸(AsA),利用溴化乙锭(EtBr)荧光法测定缓冲溶液中DNA铂化程度来评价奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物的活性。EtBr是一种荧光探针,可以插入DNA链并在615nm处发出特征荧光。然而,一旦DNA被铂化,EtBr就不能再与它结合了,故而无法产生特征荧光。因此通过对615nm处特征荧光的检测来判断铂类化合物是否可以与DNA发生相互作用。
将鱼精DNA分别与奥沙利铂,奥沙利铂前药-单域抗体,奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇在添加/不添加还原剂AsA的情况下在37℃水浴中避光孵育24h。然后加入EtBr,用荧光光谱仪进行分析:在530nm处激发,615nm处发射,记录荧光光谱的吸收。如图5所示,在没有AsA时荧光只发生了很小的变化,这说明DNA和偶联物之间没有发生反应。相反,AsA加入后偶联物的荧光强度明显降低,说明负载在单域抗体及单域抗体-聚乙二醇上的奥沙利铂四价铂前药被激活了,表明奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物上的四价铂可以在进入细胞前保持惰性,而在在肿瘤细胞还原环境内被还原成二价铂,从而与细胞核内DNA产生相互作用,发挥毒性。
实施例8:本发明制备的奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇体系的细胞积累
由于单域抗体可靶向EGFR阳性的细胞,因此与单域抗体结合的药物在A431(EGFR+)细胞中积累量应高于MCF-7(EGFR-)细胞。为了验证这一假设,我们测量了奥沙利铂前药-单域抗体及奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇的细胞选择性积累量。选用处于增殖旺盛的对数生长期的细胞,按照5×105个细胞/孔的密度将A431和MCF-7细胞分别接种于6孔板中,在细胞培养箱中培养12h。然后用含100μM铂的奥沙利铂、奥沙利铂前药-单域抗体及奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇的1mL新鲜培养基替代原有培养基,37℃下孵育3h。随后弃去培养基,用PBS洗涤细胞三次,用胰酶消化细胞并对细胞计数,最后用王水消化细胞,ICP-MS测定细胞内铂的积累量。结果如图6所示,奥沙利铂在两种细胞间的积累量没有显著差异。由于细胞间的个体差异,MCF-7细胞的铂积累略高于A431细胞。相反,与奥沙利铂前药-单域抗体及奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇孵育的细胞完全逆转了这一结果。在A431(EGFR+)细胞中奥沙利铂前药-单域抗体及奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇的积累量远高于MCF-7(EGFR-)细胞,表现出的单域抗体优异的靶向性。然而,随着PEG分子量的增大,A431细胞中铂的积累量略有下降,但仍远高于MCF-7细胞中铂的积累。说明奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇仍然保持了单域抗体的大部分靶点能力,但聚乙二醇的偶联对受体介导的内吞作用有一定的不利影响。
实施例9:本发明制备的奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇体系的细胞毒性
将A431和MCF-7细胞以2×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中,于细胞培养箱中孵育过夜。设置实验组、对照组和空白组,实验组接种细胞且加入不同种类及不同浓度的药物,对照组接种细胞但不加入药物,空白组不接种细胞且不加药物。将细胞在细胞培养箱中继续培养72h。然后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL),继续培养4h。随后,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO),于37℃震荡箱中震荡15min,使结晶物充分溶解。使用Bio-Rad 680酶标仪在490nm处测量各孔的吸光度λ值。
细胞存活率(%)=[实验组λ值-空白组λ值]/[对照组λ值-空白组λ值]
细胞毒性测定实验结果如图7和表1所示,奥沙利铂对A431和MCF-7细胞无选择性细胞毒性,且对两种细胞均有很高的毒性。然而,当单域抗体与奥沙利铂偶联后,显示出两种细胞的细胞毒性有显著差异。奥沙利铂前药-单域抗体对EGFR阳性细胞(A431)有明显的抑制作用。相比之下,由于药物摄取受限,奥沙利铂前药-单域抗体对EGFR阴性细胞(MCF-7)的抑制作用有限。结果表明,奥沙利铂前药-单域抗体偶联物可以识别不同类型的肿瘤细胞,且具有抑制肿瘤细胞生长的潜力。而奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇的细胞毒性普遍低于奥沙利铂前药-单域抗体。这可能是由于聚乙二醇的偶联导致药物的生物活性下降。然而不同的细胞之间仍然有明显的差异性。在相同的100μM铂浓度下,MCF-7细胞几乎全部存活。而在奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k)孵育下,A431细胞存活率仅为48%。
表1:奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇偶联物体系的IC50(μM)值
实施例10:本发明制备的奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇体系的药代动力学研究
从实施例9中可以看出10-30kDa分子量的直链聚乙二醇均有效的保留了奥沙利铂前药-单域抗体的生物活性。所以,在本实施例中进一步探究不同分子量对药物在体内循环时间的影响。将不同的铂类药物单次注射入昆明鼠体内以进行药代动力学研究。将实验动物随机分为5组,每组3只。通过尾静脉注射的方法将铂类药物(奥沙利铂、奥沙利铂-单域抗体、奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇)(2mg/kg)注射入小鼠体内。分别于5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h对小鼠进行眼眶静脉丛取血。于4℃(3000g,10min)离心收集血浆。然后用盐酸和硝酸按3∶1的比例消化血浆,在加热板上300℃加热,去除溶液。然后用去离子水将样品稀释至4ml。ICP-MS测定血浆中铂的含量。
结果如图8所示,奥沙利铂在5min内几乎完全被清除干净。虽然奥沙利铂前药-单域抗体相对增加了循环时间,但单域抗体的尺寸仍然不够大,在24h内也被完全清除。聚乙二醇的引入显著改善了药物的药代动力学。随着聚乙二醇分子量的增加,药物的循环时间逐渐延长。奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k)在72h时的铂浓度仍然远高于奥沙利铂在5min时的浓度。这一结果进一步说明了聚乙二醇(30k)极大的延长了药物的循环时间。
结合所有的实验结果,依照本发明我们开发了一种基于单域抗体和奥沙利铂的靶向给药系统。该系统能够精确靶向EGFR阳性细胞,大大增加药物在细胞内的积累。相比之下,它对EGFR阴性细胞没有影响。为了在体内更好的应用奥沙利铂前药-单域抗体,我们在单域抗体的C端偶联了几种不同分子量的聚乙二醇。通过对奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇的细胞摄取、细胞毒性及体内循环时间的研究,在这几种偶联物中筛选出了具有高选择性、较高细胞毒性和长循环时间的奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k)。与奥沙利铂前药-单域抗体相比,奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k)的体内半衰期有较大改善。因此,奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇(30k)为奥沙利铂前药-单域抗体偶联体系的设计提供了新的线索。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种奥沙利铂偶联物,其具有下式所示的结构:
奥沙利铂前药-单域抗体-聚乙二醇;
其中,奥沙利铂前药为奥沙利铂四价铂前药,聚乙二醇为分子量为5-40 kDa范围内的聚乙二醇;
制备方法包括将含有马来酰亚胺基的奥沙利铂前药配合物与C端含半胱氨酸的单域抗体偶联;在单域抗体的C端连接亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸标签,利用标签上的谷氨酰胺上的γ-酰胺基与氨基聚乙二醇上的氨基通过谷氨酰胺转氨酶的定点催化反应进行偶联。
2.根据权利要求1所述的奥沙利铂偶联物,其中,所述单域抗体为靶向人表皮生长因子受体1、人表皮生长因子受体2或血管表皮生长因子受体的单域抗体。
3.一种奥沙利铂偶联物的制备方法,包括:
制备奥沙利铂四价铂前药;
制备单域抗体-聚乙二醇偶联物,其中聚乙二醇为分子量为5-40 kDa范围内的聚乙二醇;
将所述奥沙利铂四价铂前药与所述单域抗体-聚乙二醇偶联物进行定点偶联。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其中,制备奥沙利铂四价铂前药的步骤包括:
由奥沙利铂制备羟基奥沙利铂配合物;
将羟基奥沙利铂配合物中的一个羟基取代制备奥沙利铂四价铂前药,所述奥沙利铂四价铂前药的轴向上包含马来酰亚胺基基团。
5.一种权利要求1-2任一项所述奥沙利铂偶联物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011420447.6A CN112535738B (zh) | 2020-12-04 | 2020-12-04 | 奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011420447.6A CN112535738B (zh) | 2020-12-04 | 2020-12-04 | 奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112535738A CN112535738A (zh) | 2021-03-23 |
CN112535738B true CN112535738B (zh) | 2022-09-09 |
Family
ID=75018275
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011420447.6A Active CN112535738B (zh) | 2020-12-04 | 2020-12-04 | 奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112535738B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115554239B (zh) * | 2021-07-01 | 2024-03-29 | 复旦大学 | 一种基于奥沙利铂偶联性两亲聚合物的胶束 |
WO2023284719A1 (en) * | 2021-07-13 | 2023-01-19 | Nanjing University | A pt conjugate and the use thereof |
CN115845079B (zh) * | 2022-11-24 | 2023-07-18 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102145176A (zh) * | 2011-04-11 | 2011-08-10 | 中国药科大学 | 一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物 |
CN102639566A (zh) * | 2009-10-02 | 2012-08-15 | 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 | 用于抗血管生成治疗的双特异性结合分子 |
CN105829346A (zh) * | 2014-01-31 | 2016-08-03 | 第三共株式会社 | 抗her2抗体-药物偶联物 |
CN106999605A (zh) * | 2014-09-25 | 2017-08-01 | 安迪高生物制药有限公司 | 生物材料和其用途 |
CN110872324A (zh) * | 2018-08-29 | 2020-03-10 | 中国科学院上海药物研究所 | 奥沙利铂偶联前药、其制备方法及用途 |
WO2020053627A1 (en) * | 2018-09-14 | 2020-03-19 | Universita' Degli Studi Di Pavia | Targeted single domain antibodies with catalytic activity (t-can) |
-
2020
- 2020-12-04 CN CN202011420447.6A patent/CN112535738B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102639566A (zh) * | 2009-10-02 | 2012-08-15 | 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 | 用于抗血管生成治疗的双特异性结合分子 |
CN102145176A (zh) * | 2011-04-11 | 2011-08-10 | 中国药科大学 | 一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物 |
CN105829346A (zh) * | 2014-01-31 | 2016-08-03 | 第三共株式会社 | 抗her2抗体-药物偶联物 |
CN106999605A (zh) * | 2014-09-25 | 2017-08-01 | 安迪高生物制药有限公司 | 生物材料和其用途 |
CN110872324A (zh) * | 2018-08-29 | 2020-03-10 | 中国科学院上海药物研究所 | 奥沙利铂偶联前药、其制备方法及用途 |
WO2020053627A1 (en) * | 2018-09-14 | 2020-03-19 | Universita' Degli Studi Di Pavia | Targeted single domain antibodies with catalytic activity (t-can) |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
分子修饰技术构建长效/靶向蛋白质药物;周展;《中国优秀博士学位论文全文数据库工程科技I辑》;20170115;第6-13页 * |
靶向性铂类抗肿瘤药物的制备及生物活性研究;黄蓉;《中国优秀博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20161215;第27-30页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112535738A (zh) | 2021-03-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112535738B (zh) | 奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用 | |
Sharma et al. | Glycosylation of PAMAM dendrimers significantly improves tumor macrophage targeting and specificity in glioblastoma | |
AU2015252518B2 (en) | New stable antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and use thereof | |
CN107952080A (zh) | 一种肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物、其制备方法及应用 | |
Zhao et al. | An iTEP-salinomycin nanoparticle that specifically and effectively inhibits metastases of 4T1 orthotopic breast tumors | |
CN103951754B (zh) | 一种靶向治疗和检测双功能的抗肿瘤双特异性小型化抗体 | |
Taskova et al. | Synthetic nucleic acid analogues in gene therapy: an update for peptide–oligonucleotide conjugates | |
CN112933219B (zh) | 一种dna-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途 | |
Mero et al. | Multivalent and flexible PEG-nitrilotriacetic acid derivatives for non-covalent protein pegylation | |
KR20190062320A (ko) | 글루타치온―s―전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 | |
Chen et al. | Hydroxyl-rich PGMA-based cationic glycopolymers for intracellular siRNA delivery: biocompatibility and effect of sugar decoration degree | |
Zhang et al. | Enhancing antitumor efficacy of nucleoside analog 5-fluorodeoxyuridine on HER2-overexpressing breast cancer by affibody-engineered DNA nanoparticle | |
WO2022077815A1 (zh) | 用于肿瘤主动靶向治疗的亲和体-细胞毒素偶联物及其纳米颗粒、制备方法、应用 | |
KR102279429B1 (ko) | 멀티 암 표적 항암 콘쥬게이트 | |
CA2478543A1 (en) | Multidrug multiligand conjugates for targeted drug delivery | |
Yang et al. | Multivalent Albumin–Neonatal Fc Receptor Interactions Mediate a Prominent Extension of the Serum Half-Life of a Therapeutic Protein | |
CN114392358A (zh) | 一种肿瘤靶向的核酸适体药物偶连物 | |
Li et al. | Engineering AND-Gate Aptamer-Signal Base Conjugates for Targeted Magnetic Resonance Molecular Imaging of Metastatic Cancer | |
JP2023507884A (ja) | 半減期が延長した薬物およびそのライブラリー、ならびに製造方法と使用 | |
CN106466484B (zh) | 一种具有细胞内吞介导功能的多靶向配体-药物偶联体 | |
CN113713117B (zh) | 一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备方法和应用 | |
CN114380886B (zh) | 一种肿瘤靶向多肽、多肽偶联药物及其应用 | |
CN114522244B (zh) | 视黄酸修饰的lytac分子及其制备方法和应用 | |
CN105985447B (zh) | 一种白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 | |
CN107226858A (zh) | 干扰素高分子结合体ifn-pmpc的制备及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |