CN106999605A - 生物材料和其用途 - Google Patents

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马亨德拉·佩尔绍德·代奥纳兰
格克汗·亚基奥卢
约安娜·斯塔马蒂
萨瓦斯·萨奥罗斯
普拉桑特·比姆拉奥·卡帕迪尼斯
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Abstract

本发明提供了化合物，其包含以5:1的最小偶合比偶合到载体分子的治疗剂；其中所述载体分子是(i)抗体片段或其衍生物或(ii)抗体模拟物或其衍生物；并且其中所述治疗剂偶合到赖氨酸氨基酸残基上；并且此外其中所述治疗剂不是光敏剂。还提供了涉及此类化合物的用途、方法以及其制造方法。

Description

生物材料和其用途
本发明涉及优化的靶向治疗化合物，其包含载体分子和活性治疗剂，由此向需要靶向治疗作用的各种疾病提供更有效的临床治疗。
当前的疾病治疗主要是非靶向的。药物被全身性地或经口投与，其暴露了许多其它组织以及患病的组织。举例来说，在癌症治疗中，化疗药物以对癌细胞(通常DNA或细胞复制相关的)尤其显著的机制起作用。然而，其它非癌性细胞也可能吸收化疗药物并且受影响，例如快速分裂骨髓干细胞，导致免疫抑制和疾病(化疗治疗的常见副作用)。在传染病中，抗细菌药物被引入到血液(经口或通过注射)中并且典型地干扰特定细菌代谢路径。其它组织暴露于药物可能导致副作用以及药物抗性的重大问题。受病毒感染的细胞也难以治疗，因为其代谢通常几乎等同于未受感染的人类细胞。
广泛假设，未来的医学进展很可能在于针对疾病定制药物。这意味着，向正确的靶组织或生物体递送治疗剂，而非现今所用的大多数常规药物的非选择性命中与未命中方法。这将导致所投与的剂量降低，副作用和毒性降低，并且患者的临床反应总体更好。
现今临床上使用的许多药物在药物积聚于正确的组织中后非常好地治疗特定疾病。因此，问题在于药物的特定靶向而非其作用机制。使药物或其它效应子靶向到所要细胞是一个非常确实的领域。主要靶向方法之一是使用抗体或细胞特异性配体作为多官能分子的靶向元件(例如Hudson PJ.《调研药物专家评论(Expert Opin Investig Drugs)》2000,9:1231-42；Borsi L等人《血液(Blood)》2003,102:4384-92)。
抗体天然地进化以充当哺乳动物免疫系统中的第一道防线。其是具有精致特异性和极大多样性的复杂糖蛋白。此多样性因程序性基因改组和靶向诱变而产生，产生大数量的不同抗体序列。此多样性意味着，抗体可以结合到自然界中通常为蛋白质的几乎任何靶分子。现在有可能在体外模拟抗体选择和产生，选择针对几乎任何所要标靶的重组人类抗体(Hoogenboom HR.《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》2005,23:1105-16)。
抗体可以以高度特异性结合到表达适当受体的靶细胞。抗体的亲和力是抗体多好地结合到标靶(抗原)的量度。其通常由平衡解离常数(Kd)描述。对于需要内化的抗体，缔合速率更重要，因为如果抗体被吸收到细胞中，那么解离速率不太关键。存在多种选择和操控具有所要结构和结合特性的抗体的技术(Wu AM和Senter PD,《自然·生物技术》2005,23:1137-46)。
如同所有生物分子，抗体的大小影响其体内药物动力学(Deonarain,MP等人1997,《蛋白质工程(Protein Eng)》.10,89-98；Batra SK等人《生物技术近期述评(Curr OpinBiotechnol)》.2002,13:603-8。)。较大分子归因于缓慢清除而在循环中持续较久(大糖蛋白通过肝脏的特异性吸收被清除)。对于在实验小鼠模型系统中识别癌细胞抗原的全抗体(分子量150KDa)，30-40％可以被肿瘤吸收，但因为其在循环中持续较久，所以其花费1-2天来达到大于一的肿瘤:血液比率。典型肿瘤:血液比率到约第3天是5-10(Boxer GM等人《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》1994,69:307-14。)。根据全抗体的临床试验，实际上传递到肿瘤的量是小鼠模型中所见量的约1％，但具有类似的肿瘤与器官比率(Epenetos AA等人《癌症研究(Cancer Res)》.1986,46:3183-91)。如果另一分子连接到抗体，那么新的大小和化学-物理特性决定了变更的药物动力学。另外，例如净电荷和亲水性的特性可以影响靶向动力学(Gangopadhyay,A等人《核医学与生物学(Nucl.Med.Biol)》1996,23:257-61)。
一些细胞表面抗原当由配体(例如抗体)结合时是静态的或非常缓慢地内化。存在一些具有需要内化的功能(例如细胞信号传导或吸收金属和脂质)的抗原。抗体可以用以通过此类抗原在细胞内递送药剂。
通过促进对可以特异性地靶向与疾病相关的生物标记的药物的开发，单克隆抗体(MAb)在近来年已经改变了医学的面貌[Carter PJ.《自然·免疫学综述(Nat RevImmunol)》.2006,6:343-57]。这具有从抑制癌症中的疾病相关因子(例如VEGF)或炎性疾病中的TNF到癌症中的肿瘤破坏的许多应用。在增殖性疾病中，受影响的细胞通常具有与所述细胞类型缔合或过度表达于所述细胞类型上的细胞表面受体(例如癌症中的突变正常细胞[Scott AM等人《自然·癌症综述(Nat Rev Cancer)》.2012,12:278-87]或自身免疫疾病中的过度刺激的免疫细胞[Chan AC与Carter PJ.《自然·免疫学综述》.2010,10:301-16])。许多肿瘤相关受体充当引起会导致肿瘤形成的不受控信号传导的生长因子。此类受体的实例包括表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员(EGFR/erbB1、ErbB2/HER2、HER3和HER4)、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子-1受体和Notch受体[Fauvel B与Yasri A.《MAb(MAbs)》.2014,6:838-51；Ménard S等人《致癌基因(Oncogene)》.2003,22,6570-8；Ranganathan P等人《自然·癌症综述》.2011,11:338-51；Parikh RA等人《肿瘤标靶与疗法(OncoTargets Ther)》.2014,7:969-83；Weroha SJ与Haluska P.《北美内分泌学与代谢临床(Endocrinol Metab Clin North Am)》.2012,41:335-50]
MAb可以结合到肿瘤相关受体并且抑制致癌信号传导，导致肿瘤消退或去除[ScottAM等人《自然·癌症综述》.2012,12:278-87,4；Fauvel B与Yasri A.《MAb》.2014,6:838-51]。各种免疫球蛋白子类的全MAb也可以引发导致肿瘤根除的免疫反应[Vanneman M与Dranoff G.《自然·癌症综述》2012,12:237-251]。
肿瘤可以进化克服MAb干预的机制，例如增加受体表达[Nahta R等人《自然·肿瘤学临床实践(Nature Clinical Practice Oncology)》,2006,3,269-280]、上调替代性致癌信号传导路径或信号传导路径蛋白的突变[Nahta R等人《自然·肿瘤学临床实践》,2006,3,269-280，Gallardo A等人《英国癌症杂志》.2012,106:1367-73]和下抑免疫反应[Pardoll DM.《自然·癌症综述》.2012,12:252-64]。商业批准的Mab(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(pannitumumab))可以延长存活数月但通常视为对于显著治愈并不够有力[Scott AM等人《自然·癌症综述》.2012,12:278-87，Sliwkowski MX与Mellman I.《科学(Science)》.2013,341:1192-8]。另外，患者可能会变得对MAb疗法具有抗性，导致复发、治疗选项变少和存活期缩短[Nahta R等人《自然·肿瘤学临床实践》,2006,3,269-280；BrandTM等人《癌症生物学与治疗(Cancer Biol Ther)》.2011 11:777-92]。
药物递送领域中的一个理想目标是将细胞毒性部分特异性地递送到人体中受疾病影响的区域，以使得患病的细胞在不影响正常细胞或引发非想要或有害副作用的情况下被根除。使细胞毒性有效负载连接到完整MAb可以增加其细胞杀伤效力并且使细胞毒性作用机制从免疫介导和信号传导介导的效应切换到更直接的肿瘤细胞破坏[Flygare JA等人《化学生物学与药物设计(Chem Biol Drug Des)》.2013,81:113-21；Sievers EL与SenterPD.《医学年评(Annu Rev Med)》.2013；64:15-29；Chari RV等人《应用化学国际英文版(Angew Chem Int Ed Engl)》.2014,53,3796-827；Teicher BA与Chari RV.《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》.2011,17:6389-97]。这有可能克服对‘游离’抗体和防碍成功结果的任何免疫相关条件的药物抗性[Barok M等人《乳癌研究(Breast Cancer Res)》.2011,13:R46；Baron JM等人《肿瘤学药学实践杂志(J Oncol Pharm Pract)》.2014.[印刷前的电子版]。这些所谓的抗体-药物共轭物(ADC)在本领域中是熟知的并且对于产生有力、特异性、安全并且稳定的ADC经历了可观的研究[Flygare JA等人《化学生物学与药物设计》.2013,81:113-21；Sievers EL与Senter PD..《医学年评》.2013；64:15-29；Chari RV等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827；Teicher BA与Chari RV.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97；Adair JR等人《生物疗法专家评论(Expert Opin Biol Ther)》.2012,12:1191-206；LoRusso PM等人《临床癌症研究》.2011,17:6437-47]。
最近的研究潮流归因于以下原因而开始显示出前景：充分表征/验证的人类或人类化抗体与破坏微管功能的极有力药物(例如奥瑞他汀(auristatin)和类美登素(maytansinoid)[Alley SC等人《药理学与实验治疗学杂志(J Pharmacol Exp Ther)》.2009,330:932-8；Erickson HK等人《癌症研究》.2006,66:4426-33])和DNA损害剂(例如刺孢霉素(calicheamycin)和PBD[Kung Sutherland MS等人《血液》2013,122:1455-63；deVriesJF等人《白血病(Leukemia)》.2012,26:255-64])稳定相关。ADC(例如曲妥珠单抗-恩他新(emtansine))已经展现出优于相同非共轭抗体加游离化疗药物的临床功效(增长的存活期和降低的副作用)[Amiri-Kordestani L等人《临床癌症研究》.2014,20:4436-41]。效力较低的细胞毒性药物(例如阿霉素(doxorubicin))仍作为ADC在开发但由于不充足的药物通过靶向MAb递送而产生限制[Govindan SV等人《分子癌症治疗学(MolCancer Ther)》2013,12:968-78]。对改进ADC和药物与载体分子的共轭的研究已经聚焦于使用聚合物作为连接子以连接载体与药物[Carlson B.《生物技术保健(BiotechnologyHealthcare)》2012,9:28-31；US 8808679 B2]。此方法有效连接两个分子但增加了共轭物的大小和合成复杂性。增加ADC的大分子大小引起药物动力学(例如增加的血液半衰期)[Deonarain MP等人(2015)《药物开发专家评论(Exp.Opin.Drug Discov)》10；463-81；Constantinou A等人(2010)《生物技术快报(Biotechnol Lett)》32:609-22]和药效动力学(例如减小的肿瘤穿透)[Dennis MS等人(2007)《癌症研究》67:254-61])的变化。提高ADC功效的直接方法是产生具有低(典型地为2-4)DAR(药物抗体比率)的更均质共轭物的位点特异性共轭，意味着由于增加的来自较高有效负载暴露的毒性和对非优化的高DAR物质的凝集物的不良反应，因此高DAR不是有效方法[Hamblett等人《临床癌症研究》2004,10:7063-7070]。
已经获得大量关于ADC的临床经验[Amiri-Kordestani L等人《临床癌症研究》.2014,20:4436-41]，但仍存在显著限制[Lu D等人《癌症化疗与药理学(Cancer ChemotherPharmacol)》.2014,74:399-410；Monjanel H等人《英国血液学杂志(Br J Haematol)》.2014,166:306-8；Robak T与Robak E.《调研药物专家评论》.2014,23:911-24.]。使用本领域中所描述的共轭方法，抗体上的载药量未高到足以向靶组织递送充足浓度的药物，以导致长期治愈[Teicher BA与Chari RV.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97]，或产生显著反应，其中标靶以低水平表达[Wang X等人《分子癌症治疗学》.2011,10:1728-39]。当使用具有相对低毒性的药物(例如阿霉素、紫杉烷(taxane)和甲氨蝶呤(methotrexate))时，低载药量也是有害的，因为需要更多的这些药物来实现所需要的治疗效果。然而，试图使用载量较高的ADC典型地向药物代谢和清除所涉及的组织(例如肝和肾系统)产生具有以下各者的ADC：下降的结合功能[Chari RV等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827；Burke,PJ等人《生物共轭化学(Bioconjugate Chem)》.2009,20,1242-1250]、降低的溶解度[ChariRV等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827；Hollander,I等人《生物共轭化学》.2008,19,358-361；Burke,PJ等人《生物共轭化学》.2009,20,1242-1250；Zhao RY等人《药物化学杂志(J Med Chem)》.2011,54:3606-23]和凝集趋势[Chari RV等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827；Hollander,I等人《生物共轭化学》.2008,19,358-361；Burke,PJ等人《生物共轭化学》.2009,20,1242-1250；Zhao RY等人《药物化学杂志》.2011,54:3606-23；King,H等人《生物共轭化学》.1999,10,279-288](其三者均导致不良药物动力学特性)[Hamblett,KJ等人《临床癌症研究》.2004,10,7063-7070；Shen BQ.《自然·生物技术》.2012,30:184-9.]、减少的药物递送、较低的治疗功效、增加的副作用和非想要毒性[Litvak-Greenfeld D与Benhar I.《先进药物递送综述(Adv Drug Deliv Rev)》.2012,64:1782-99]。
当前抗体和ADC的另一限制是长血清半衰期(1-3周)的不合需要的副作用[Litvak-Greenfeld D与Benhar I.《先进药物递送综述》.2012,64:1782-99；E.L.Sievers等人《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》2001,19,3244-3254]，其可能会导致胃肠道损害、周围神经病和免疫抑制[J.J.Lee与S.M.Swain.《临床肿瘤学杂志》2006,24:1633-1642；M.A.Jordan与L.Wilson,《自然·癌症综述》2004,4,253-265]。另外，当前基于全抗体的疗法和ADC展现不良扩散特性和较低的组织灌注特性[Teicher BA与Chari RV.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97；Jain RK.《先进药物递送综述》.2012,64:353-365；Dennis MS等人《癌症研究》.2007,67:254-61]，其导致较低浓度到达实体肿瘤的核心或最差血管化区域[Teicher BA与Chari RV.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97；Dennis MS等人《癌症研究》.2007,67:254-61.]。因此，当前ADC针对较大实体肿瘤[Teicher BA与Chari RV.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97]、不良血管化的肿瘤或具有致密基质的肿瘤不太有效。
Hamblett等人《临床癌症研究》2004,10:7063-7070详细研究了单甲基奥瑞他汀E(MMAE)向抗CD30单克隆抗体上的载药量。其发现，尽管共轭物的IC50效力测量值随偶合的药物分子的数目而增加，但当从4个药物/抗体增加到8个药物/抗体时，体内抗肿瘤活性不增加。此外，载有8药物的共轭物在体内不良地耐受，可以投与的共轭物的数目从载有4药物的共轭物到载有8药物的共轭物减半。另外，载有8药物的共轭物从身体清除得比载有4药物的共轭物快两倍。Hamblett鉴别出，为了实现最佳临床效果(通过平衡肿瘤活性、耐受性和清除)，抗体载4药物是最讲得通的。此观察结果已经得到许多其它支持[例如Chari RV等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827]。
此外，根据Kim等人《分子癌症治疗学》2008,7:2486-2497已知，抗体片段在需要依靠替代性策略(例如将聚合物用于偶合)之前可以偶合到最多四个药物分子[US2013/0101546]。
WO 2014/068443A1、WO 2014/134457A2、WO 2013/082254A1、WO 2012/104344A1和US 2010/0136033A1各自描述了药物共轭到抗体片段。然而，这些文献中无一者提出了克服抗体片段凝集的方法，所述方法将为小于全IgG的蛋白质的高DAR比率所需。
举例来说，WO 2014/068443(Pfizer)描述了共轭到赖氨酸残基上和特定V-κ赖氨酸-188残基。其对于全IgG(150kDa)展现约2-4的平均DAR，一些有效负载的最大DAR为7.8。此研究表明，对于30kDa(1/5大小)的scFv片段，熟练人员将合理地预期DAR为不高于2。
WO 2014/134457(Immunogen)描述了制备DAR为约4-5的基于IgG的ADC的直接和间接赖氨酸共轭。尽管对于完整抗体提出DAR可高达20，但对于1/5大小的scFv，这将等同于DAR为约4。
WO 2012/104344(GenMab)描述了一种抗CD74全抗体(HuMab-CD74)和使用直接和间接赖氨酸方法具有多种有效负载的共轭物。所公开的DAR在3.7到4.1范围内，对于1/5大小的抗体片段，这最多等同于DAR为1。
ADC疗法领域的近期综述(Chari等人《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed)》2014,53:3796-3827)强调了，当前ADC对于常规地用于临床环境中不够有效。近期FDA对两种ADC分子的上市许可显示，ADC的原理可以起作用，但此治疗领域中30多年的研究仅使得两种药物得到批准用于临床证实了，由于难以有效地进行ADC研究，这些药物是例外情况而非规则。
因此，需要制备可减少或消除当前ADC方法的显著限制的改进的ADC。
本发明现在提供了经优化以减少当前ADC疗法的限制的此类改进的ADC、以及其用途和其制造方法。
在本发明的第一方面，提供了一种化合物，其包含以5:1的最小偶合比偶合到载体分子的治疗剂；其中所述载体分子是(i)抗体片段或其衍生物或(ii)抗体模拟物或其衍生物；并且其中所述治疗剂偶合到赖氨酸氨基酸残基上；并且此外其中所述治疗剂不是光敏剂。
术语“载体分子”包括治疗剂所偶合的任何试剂的含义。载体分子包含氨基酸并且包括肽、多肽和蛋白质。具体来说，载体分子意图是抗体片段或抗体模拟物。
术语“偶合比”意指偶合到一个载体分子的治疗剂分子的数目。
术语“光敏剂(photosensitising agent)”(光敏剂(photosensitiser)、光敏药物可互换地使用)应视为指属于需要次级物理干预来激活其细胞毒性特性的一类药物的化合物。所述化合物以其单态吸收特定波长下的光的光子。这产生短时间存活的激发单态。其可以通过系统间过渡转化为较长时间存活的三重态。此三重态光敏剂可以由于自由基光氧化、单态氧和不涉及氧气的光反应而具有细胞毒性特性。当使用例如Savellano MD与HasanT[《临床癌症研究》.2005.11:1658-58]所描述方法的方法用至少0.1焦耳的光源照射时，光敏剂的光依赖性效力必须是至少1μM。光敏剂还可以视为需要次级物理干预来激活其细胞毒性特性的一类药物，其所述特性是细胞杀伤的主要机制。
对于不为光敏剂的治疗剂，我们意指除了光敏剂以外的任何治疗剂。此类治疗剂不具有光敏剂的任何光物理特性，即其不会吸收光的光子以便进入激发态。当用至少0.1焦耳的光源照射时，非光敏剂的光依赖性效力必须不大于1μM，并且优选是0μM[Kostron等人(2003)《光动力疗法：方法和方案(Photodynamic Therapy:Methods and Protocols)》(《光化学与光生物科学(Photochemical&Photobiological Sciences)》中的综合系列,皇家化学学会出版社(Royal Society of Chemistry publishers))
类似于其它治疗剂共轭物，包含偶合到载体分子的光敏剂的化合物先前已经进行了描述(例如WO 2007/042775和WO 2010/106341)，然而，此类共轭物与非光敏剂药物共轭物展现出显著差异。举例来说，存在对光敏剂进行空间隔离以便减少和/或避免骤冷的明显基本原理。当考虑治疗剂功能时，因为非光敏剂药物不能骤冷(这纯粹是一种光相关现象)或不具有任何在空间上相互作用的自身抑制特性，所以其空间隔离常规地被认为是无关的，并且因此现在极其出人意料地发现，通过最优地间隔非光敏剂，可以制备改进的ADC分子。
光敏剂归因于其可导致血液蛋白质结合的平面疏水性结构而被熟知具有长血清半衰期，这促成了其皮肤光敏性[Hopper C.《柳叶刀肿瘤学(Lancet Oncol)》.2000；1 212-9；Korbelik M.《光化学与光生物学(Photochem Photobiol)》.1993；57:846-50]。使其共轭到亲水性抗体上加速了血液清除，减少这些副作用[Bhatti M,P等人《国际癌症杂志(Int JCancer)》.2008,122:1155-63；Palumbo A等人《英国癌症杂志》.2011,104:1106-15]。相反地，使小分子非光敏剂药物共轭将减缓其清除，因为其天然地快速从循环清除[Pimm MV等人《国际癌症杂志》.1988,41:886-91]
术语“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换地使用并且指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列。这些短语还指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的并且可以表示有义链或反义链；和肽核酸(PNA)或任何DNA样或RNA样材料。在本文的序列中，A是腺嘌呤，C是胞嘧啶，T是胸嘧啶，G是鸟嘌呤，并且N是A、C、G或T(U)。预期在多核苷酸是RNA时，本文所提供序列中的T(胸嘧啶)经U(尿嘧啶)取代。一般来说，本发明所提供的核酸区段可以由基因组的片段和短寡核苷酸连接子或由一系列寡核苷酸或由个别核苷酸组装，以提供能够表达于包含衍生自微生物或病毒操纵子或真核基因的调节元件的重组转录单元中的合成核酸。
术语“多肽”或“肽”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列或其片段和天然存在或合成的分子。多肽“片段”、“部分”或“区段”是至少约5个氨基酸、优选至少约7个氨基酸、更优选至少约9个氨基酸并且最优选至少约17个或更多个氨基酸的一段氨基酸残基。为了具活性，任何多肽必须具有充足长度以呈现生物和/或免疫活性。
如本文所用，术语“纯化的”或“大体上纯化的”表示指定核酸或多肽在大体上不存在其它生物大分子(例如多核苷酸、蛋白质等)下存在。在一个实施例中，多核苷酸或多肽经纯化以使得其构成所存在指定生物大分子的至少95重量％、更优选至少99重量％(但可能存在水、缓冲剂和其它小分子，尤其分子量小于1kDa的分子)。
如本文所用，术语“分离的”是指与至少一种与核酸或多肽一起存在于其天然来源中的其它组分(例如，核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施例中，核酸或多肽仅(如果有的话)在溶剂、缓冲剂、离子或通常存在于其溶液中的其它组分存在下可见。术语“分离的”和“纯化的”不涵盖存在于其天然来源中的核酸或多肽。
当在本文中用以指多肽或蛋白质时，术语“重组”意味着，多肽或蛋白质衍生自重组(例如，微生物、昆虫或哺乳动物)表达系统。“微生物”是指细菌或真菌(例如，酵母)表达系统中得到的重组多肽或蛋白质。作为产物，“重组微生物”定义了基本上不含天然内源物质并且未伴有相关天然糖基化的多肽或蛋白质。表达于大多数细菌培养物(例如大肠杆菌(E.coli))中的多肽或蛋白质将不含糖基化修饰；表达于酵母中的多肽或蛋白质将具有通常不同于表达于哺乳动物细胞中的多肽或蛋白质的糖基化模式。
术语“OptiLink”或“OptiLinked”在本文中用以指优化根据本发明的抗体片段以便最大化有效负载共轭负载量同时最小化体外或体内共轭物凝集同时保持抗体结合功能。
提供较高负载量的治疗剂到载体分子上的替代性最小偶合比包括至少6:1、至少7:1和至少8:1或更大。
使药物分子偶合到氨基酸残基可以在多个不同氨基酸处进行。表1列出了针对赖氨酸残基的共轭策略，其展示了可以用于此偶合方法的偶合化学物质。
表1用于使药物偶合到赖氨酸氨基酸上的官能团
抗体片段和模拟物在氨基酸序列和使药物偶合到的官能团的数目和间隔方面不同。最常见的频繁用于共轭的官能团是N末端处和赖氨酸残基上可见的伯胺。特定治疗剂-抗体片段共轭物的有效性的主要决定因素是治疗剂分子所连接到的残基的空间隔离。这些残基在抗体表面上必须分开并且拓扑隔离以实现所得共轭物的有效偶合和最优药物动力学。
可共轭残基优选处于可以耐受化学修饰而不会变得不稳定或易于凝集的位置。
一般来说，蛋白质折叠以在具有亲水性表面的分子的中心处形成疏水性核心以能够实现于生理溶剂中的溶解度。例如赖氨酸和精氨酸的碱性残基、例如谷氨酸酯和天冬氨酸酯的酸性残基、例如丝氨酸(和有时酪氨酸)、半胱氨酸、谷酰胺和天冬酰胺的极性残基通常都见于蛋白质的表面上。在许多实例中，这些残基参与维持所述蛋白质的结构和功能。赖氨酸残基是最常存在的表面氨基酸[Hermanson,GT,《生物共轭技术(BioconjugateTechniques)》,第1章,第30页,学术出版社(Academic Press)(2008)]并且在碱性pH下优先与NHS-酯反应。
在抗体片段(例如单链Fv)的实例中，每个结构域由可变重(VH)和可变轻(VL)结构域组成。其可以是任何家族的VH和VL结构域之一。在抗原结合环(互补决定区，即CDR)的情况下，这些序列特异性针对于所述抗体识别其同源抗原的能力。其可以经操纵以改变抗体的特异性或亲和力但不用于其它原因。结构域序列的主要部分是构架区。图1(根据Knappik等人《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》2000,296:57-86修改)指示了人类可变结构域中的哪些残基往往会存在于抗体的表面处和哪些区往往会是内部作为核心的一部分。考虑到抗体之间高度的结构和序列同源性，这些区通常可以适用于所有抗体序列。表面构架区往往会含有带电或极性残基。
如果所述治疗剂和所述载体分子在偶合形式下的功能和物理特性与非偶合形式下的特性相比定性地大体上不变，那么这是一种优势。
对于定性地大体上不变，我们意指，治疗剂保持其治疗功能但当共轭时此可以定量地不同(例如与非共轭药物相比，治疗功能可以增强)；并且载体分子在共轭时结合到与非共轭时相同的标靶但可以定量地不同(例如结合亲和力可以更高)。
术语“结合亲和力”包括载体分子与其标靶(例如(但不限于)抗体片段和抗原)之间的结合强度的含义。
本发明化合物应具有<100nM、优选<1nM、更优选<10pM并且甚至更优选<0.1pM的IC50。
如果化合物的IC50比非共轭时的治疗剂低出高达10倍(即效力大10倍)，那么这是优选的。IC50可以低至少10倍(其与初始IC50的10％相同)并且效力优选将变为非共轭IC50的高达100％。甚至更优选地，效力是更高的并且因此百分比优选是200％、500％、1000％(即效力大10倍)或更好。药物就其自身来说效力可能不良(例如无法穿过细胞膜)但以ADC形式效力很大(因此1000％或更好)。
半数最大抑制浓度(IC50)是物质抑制特定生物或生物化学功能的有效性的量度。此量度指示了一半地抑制既定生物过程(或其组分)需要多少特定药物或其它物质(抑制剂)。既定化合物的IC50的测定是一种常规，并且典型地通过构筑剂量反应曲线和检验不同浓度拮抗剂对逆转激动剂活性的效果来测定。IC50值通过测定抑制激动剂的最大生物反应的一半所需要的浓度来计算。
化合物应具有至少2小时、优选4小时、或者8、16、32、64或128小时的鼠类血清半衰期。血清半衰期还可以在小鼠或人类中测量。化合物的血清半衰期优选比非共轭时的载体分子高出高达5倍、优选高出高达10倍。与非共轭形式相比，化合物可以具有缩短的半衰期。半衰期缩短50％(例如从4hr到2hr)如果与其它有利特征(例如低或减少的凝集)结合，那么是药理学上可接受的。凝集对于scFv或类似大小的片段将导致<1hr的快速清除，降低生物可用性以及可能诱导有害的免疫反应。如果载体分子的半衰期维持得接近非共轭载体分子的半衰期，那么这是优选的，小幅缩短是可耐受的。至多10倍增加的半衰期增加是理想的(例如在小鼠中4hr到20hr)。
血清半衰期是化合物的血清水平降低到其初始值的一半的所计算持续时间。既定化合物的血清半衰期的测定是一种常规，并且典型地通过测量在化合物投与到生物体之后血清中随时间推移的药物量来测定。血清半衰期临床上是重要的，因为其将决定为了一贯地实现在临床上有效范围内的血清药物水平所需的剂量方案。
本发明化合物在生理学上相容的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水或生理盐水)中在室温(例如20℃)下应具有至少1mg/ml的溶解度。更优选是2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、15mg/ml或20mg/ml。在一个实施例中，本发明化合物在不存在添加剂或赋形剂下具有所述溶解度。在一替代性实施例中，本发明化合物在一种或多种添加剂或赋形剂(例如当以根据管理机构可接受的赋形剂的残余或不可去除量存在时)存在下具有所述溶解度。
产生本发明化合物的共轭反应还可以具有添加剂或赋形剂以促进反应和化合物溶解度。实例是聚山梨醇酯-20、吐温-80、甘氨酸、麦芽糖、组氨酸、普朗尼克F-68、辛酸、N-乙酰基色氨酸、苯甲醇、苯甲酸、丙二醇、(氯)丁醇、异丙醇和甘油[Hollander I.等人《生物共轭化学》.2008,19:358-361；Patapoff TW与Esue O.《药物开发与技术(Pharm DevTechnol)》.2009,14:659-64]。其通常在加工期间去除但有时以根据管理机构可接受的赋形剂的残余或不可去除量存在[http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm]。
本发明化合物优选在至多0.5％聚山梨醇酯、1％甘油、0.5％甘氨酸、0.1％组氨酸、0.5％氯丁醇、5％丙二醇、2％苯甲醇、0.05％辛酸和/或0.1％N-乙酰基色氨酸存在下具有上文所述的溶解度。
本发明化合物在生理学上相容的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水或生理盐水)中在室温(例如20℃)下应展现<5％、优选<1％的凝集水平。凝集可以通过分析尺寸排阻HPLC测量与单体共轭物特有的滞留时间时洗脱的共轭物相比高分子量材料的百分比来测试。
本发明化合物的药物与抗体比率应高于类似集结的蛋白质所实现的比率，增加的益处是药物有利地可接近以经由酶、物理或化学机制在细胞内部或外部释放。
赖氨酸残基通常见于抗体结构域的表面处。在生殖系人类VH1家族的成员的情况下，存在5-6个赖氨酸残基，其中仅一者或两者彼此接近。一残基接近另一者的定义可以是一级序列相邻因此3维结构相邻者。或者，残基根据一级序列可以隔离，但由于抗体结构域的折叠的结构而空间相邻。直接相邻的氨基酸残基可以定义为空间相隔3-4埃。
使治疗剂偶合到直接相邻的赖氨酸残基上将导致较差的药物动力学和治疗效果(例如增加的凝集和较差的溶解度)。当赖氨酸残基进一步隔离、优选相隔两个氨基酸(3.5到7.5埃)、更优选相隔三个氨基酸(7到12埃)、更优选相隔四个氨基酸(10-15埃)、甚至更优选地相隔五个氨基酸(15-20埃)、又甚至更优选地相隔六个氨基酸(20-25埃)或更大时，偶合更有效。载体分子应经选取、选择或工程化以具有这些特性。载体分子具有的赖氨酸残基越多，隔离越优，载体分子将越好地形成有效并且有力的共轭物。
确定用于治疗剂偶合的氨基酸残基彼此接近还是相邻的方法在本领域中是众所周知的。Clustal序列比对(使用网络资源，例如来自欧洲生物信息研究所(Europeanbioinformatics Institute)的http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)是用于比较一级氨基酸序列的良好确立的工具。此外，在不存在载体分子的完整3维结构数据的情况下，有可能使用良好确立的技术(例如同源建模)使用已知结构(例如，鼠类scFv的结构)推导载体分子的可能结构，和由此鉴别用于偶合的残基在空间上是接近还是相邻。由例如抗体和抗体片段展现的高度同源性意指这些技术可以以高度置信度应用。同源建模的网络资源是可获得的，例如来自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)的专家生物信息分析系统(Expert Bioinformatics Analysis System)(http://expasy.org)，其还提供了免费桌面建模程序SwissPDB Viewer。此外，帝国理工学院(Imperial College)的Phyre服务器可以产生同源模型(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id ＝index)[Kelley LA与Sternberg MJ.《自然·实验室指南(Nat Protoc)》.2009；4:363-71]。
如果赖氨酸残基的分布对于共轭和最优药物动力学并不有利，那么载体分子可以使用标准分子生物技术(例如定点诱变)来改变以去除不良间隔的残基(例如太接近地定位的)或引入充分间隔的残基。
治疗剂可以在氨基酸处直接偶合到载体分子。或者，治疗剂可以间接偶合到载体分子。
存在多种使细胞毒性药物共轭到抗体和抗体片段的方式[Ducry,L,(编)(2013),《抗体-药物共轭物(Antibody-Drug Conjugates)》书籍,《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》第1045卷,第9-12章,胡马纳出版社(Humana Press)；Hermanson,G(2013)《生物共轭技术》书籍,第2-6章,学术出版社]。此概述于表2中。赖氨酸残基对于共轭是有利的，因为其可以多重地存在于抗体的表面上而不导致有害效果(例如非想要的交联)。举例来说，共轭到赖氨酸上可以是直接的(表2)，使用具有N-羟基-琥珀酰胺酯或异硫氰酸酯反应性基团的药物或药物连接子。间接赖氨酸共轭方法包括用双官能连接子(例如可获自Pierce Chemicals(Thermo)和Quanta Bioscience的那些)使氨基衍生化以产生次级反应性基团(例如2-亚氨基硫杂环戊烷)以产生反应性硫醇以便共轭到具有硫醇或马来酰亚胺反应性基团的药物或药物连接子。一些赖氨酸残基由于归因于所述残基周围的微环境的增强的亲核性而可能特别易于共轭[Doppalapudi VR等人《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci U S A)》.2010,107:22611-6.]。已知其它共轭方法，例如天然化学连接[Hackenberger CP与Schwarzer D.《应用化学国际英文版》.2008；47:10030-74.]、包括使用酶的位点特异性共轭[Behrens CR与Liu B.《MAb》.2014,6:46-53]和二硫键桥接技术[L等人《化学通讯(Chem Comm)》,2013,49,8187-8189；Badescu G等人《生物共轭化学》.2014,25:1124-36.]。近期的共轭方法包括使用甲磺酰基苯基噁二唑反应性连接子形成硫醚[Barbas C F B等人《生物共轭化学》,2014,25,1402-1407]、经由使用酪氨酸点击反应的酪氨酸选择性标记[Barbas C F B等人《生物共轭化学》2013,24,520-532]和四嗪与应变炔烃之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德(Inverse-electron Demand Diels-Alder，IeDDA)反应[Fox,J M.2008,130,13518-13519]、[Chin J W和Lang K《化学评论(Chemicalreviews)》,2014,114,4764-4806]。
本发明的一个实施例是携有N-羟基-琥珀酰亚胺酯的药物与多个(n个)赖氨酸残基的直接共轭，其中n>4。本发明的另一实施例是与n个赖氨酸残基的间接共轭，其中交联剂SMCC用以修饰表面赖氨酸残基，产生可还原硫醇以便共轭到携有硫醇或马来酰亚胺基团的药物或药物连接子。
具有相同反应性基团的药物的混合物可以在化学共轭反应中用以产生具有多于一种细胞毒性治疗药物类型或治疗药物与诊断剂(例如荧光染料)的组合的共轭物[Fernandez-Fernandez A等人《应用生物化学与生物技术(Appl Biochem Biotechnol)》.201,165:1628-51.]。此类共轭物可能可用于克服药物抗性或允许联合成像与治疗(治疗诊断)。
对于“小分子”，我们意指具有相对低分子量的天然存在或人工产生(例如，经由化学合成)的分子。优选的小分子具生物活性，因为其在动物、优选哺乳动物、更优选人类中产生局部或全身性效应。在某些优选实例中，小分子是药物并且小分子被称为“药物分子”或“药物”或“治疗剂”。在某些实施例中，药物分子的分子量(MW)小于或等于约5kDa。在其它实施例中，药物分子的MW小于或等于约1.5kDa。在其它实施例中，药物分子选自长春花生物碱(vinca alkaloid)、海兔毒素(dolostatin)、奥瑞他汀、微管溶素(tubulysin)、倍癌霉素(duocarmycin)、激酶抑制剂、玫瑰树碱(ellipticine)、MEK抑制剂、KSP抑制剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂和拓扑异构酶抑制剂和其类似物[Carmen和J.Carlos Menéndez(2008).《抗癌药物的医药化学(The medicinal chemistry of anti-cancer drugs)》,爱思唯尔出版社(Elsevier Press)；Cragg GM等人(2012).《来自天然产品的抗癌剂(Anti-cancer agents from natural products)》,第2版,CRC出版社(CRC press)]。优选地但未必，药物是已经被适当政府机构或主体(例如FDA)视为使用起来安全并且有效的药物。举例来说，FDA列出的供人类使用的药物都视为适用于此技术。
实践中可以使用的药物分子的类型包括(但不限于)抗癌物质、放射性核素、维生素、抗AIDS物质、抗生素、免疫抑制剂、抗病毒物质、酶抑制剂、神经毒素、阿片类药物、安眠药、抗组胺、润滑剂、镇静剂、抗惊厥剂、肌肉松弛剂和抗帕金森(anti-Parkinson)物质、抗痉挛剂和肌肉收缩剂(包括通道阻滞剂、缩瞳药和抗胆碱能剂)、抗青光眼化合物、抗寄生虫和/或抗原虫化合物、细胞-胞外基质相互作用的调节剂(包括细胞生长抑制剂和抗粘附分子)、血管舒张剂、DNA、RNA或蛋白质合成的抑制剂、抗高血压药、止痛剂、退热剂、类固醇和非类固醇抗炎剂、抗血管生成因子、抗分泌因子、抗凝剂和/或抗血栓剂、局部麻醉剂、眼药、前列腺素、抗抑郁剂、抗精神病物质、止吐剂、成像剂。
优选地，载体分子选择性结合到标靶。标靶可以是靶细胞或胞外靶分子。靶细胞是治疗剂要递送到的或位于治疗剂要递送到的组织中的细胞。
术语“选择性结合”和“结合选择性”指示，本发明的抗体的可变区仅仅识别和结合本发明的多肽(即，能够将本发明的多肽与其它类似多肽区分，尽管多肽家族中可见序列一致性、同源性或类似性)，但还可以通过与抗体的可变区外部的并且具体来说分子的恒定区中的序列的相互作用而与其它蛋白质(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或ELISA技术中的其它抗体)相互作用。用以测定本发明的抗体的结合选择性的筛检分析在本领域中是熟知的并且常规地实践。关于此类分析的综合论述，参看Harlow等人(编),《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》；冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)；纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)(1988),第6章。
载体分子在结合靶细胞时可以内化到细胞中以便将治疗剂引入到细胞内部的作用位点。或者，载体分子在结合标靶或靶细胞时不内化到细胞中，并且代替地，治疗剂在细胞外部起作用。另一替代方案是载体分子在结合标靶之后从治疗剂解偶合。换句话说，治疗剂从载体释放以变成游离分子。这些游离分子然后可以在细胞外部起作用，或通过非抗体依赖性途径吸收到细胞中。
在一个实施例中，载体分子可以是抗体片段。术语“抗体片段”应理解为指不包括全抗体的全部结构域的任何基于抗体的分子。其预期包括野生型抗体、合成抗体、重组抗体或抗体杂合体的片段。
如果抗体片段排除了全抗体的Fc区，那么这是优选的。具体来说，如果抗体片段不包括全抗体的CH2和CH3区，那么这是优选的。
适用于本发明中的抗体片段选自scFv、Fv、Fab、F(ab')2、Fab-SH、dsFv、bc-scFv、sdAb、di-scFvs(也称为bi-scFvs)、Fcabs、结构域抗体、纳米抗体、VHH结构域、双特异性形式例如双特异性T细胞啮合体、双功能抗体和tandabs。
抗体片段是全免疫球蛋白的具有优于完全抗体的有利特性的功能部分，所述有利特性例如向致密或实体肿瘤中的穿透更快、与正常组织的交叉反应性降低和从循环中的清除更快，因此总的来说减少正常组织暴露。本领域中众所周知，抗体片段展现更快药物动力学，更快分散到组织中和消除(ADME吸附、分布、代谢和排泄特性)。其还更容易在更具成本效益的系统(例如微生物表达系统)中制备[de Marco A.《微生物细胞工厂(Microb CellFact)》.2009,8:26；Spadiut O等人《生物技术趋势(Trends Biotechnol)》.2014,32:54-60]。
抗体片段可以通过化学或酶裂解制备，但更优选地，使用重组DNA技术制备。后者引起不确定的于原核或真核细胞系中的蛋白质表达和基因修饰，产生具有增强的或额外的特性的片段。抗体片段通常具有至少一个可变(V-)结构域，因为V-结构域含有互补决定区(CDR)或用于抗原结合的环[Carter PJ.《自然·免疫学综述》.2006,6:343-57]。最近，CDR样环已经插入到非可变结构域(例如恒定-重-3，CH3结构域)中，使得这些结构域能够结合到可用或预定标靶[Wozniak-Knopp,G等人《蛋白质工程、设计与选择(ProteinEng.Des.Sel.)》2010,23,289-297]。
对于要有效地用作细胞毒性药物的载体媒剂的抗体片段，其必须具有经由化学共轭(或强并且特异性的非共价相互作用)允许高载药量而不会不利地影响蛋白质稳定性、抗体-抗原结合和药物有利的特性(例如溶解度、凝集和免疫原性)的生物物理学特性。这些特征极少为抗体片段所固有[ A与Plückthun A.《分子生物学杂志》.2001,305:989-1010]，因此这些额外益处必须工程化到抗体片段中以使其实际上可用[SchaeferJV与Plückthun A.《蛋白质工程、设计与选择》.2012,25:485-506]。这种特征的一个实例是将额外或更多最优分布的表面赖氨酸残基并入到抗体片段上，因此增加其使用胺定向化学过程进行药物共轭的能力。可以使用其它氨基酸，例如最优分布的半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸酯、天冬氨酸酯、精氨酸、天冬酰胺、组氨酸和丝氨酸，但赖氨酸由于良好确立并且成功的化学共轭方法和对不具有特定活化基团的共轭的相对惰性而更优选[Ducry,L,(编)(2013),《抗体-药物共轭物》书籍,《分子生物学方法》第1045第,第10章,胡马纳出版社]。还可以使用非天然氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸和甲酰基-甘氨酸[Behrens CR与Liu B.《MAb》.2014,6:46-53]。用于抗体片段修饰的位置的鉴别可以是通过直接分析抗体片段(或亲代全抗体)的3维结构(如果可获得)或通过使用多种软件资源(例如Phyre)同源建模[Kelley LA与Sternberg MJ.《自然·实验室指南》.2009；4:363-71]。选择位置的准则包括：(1)氨基酸的使用在所述位置处已经是有利或保守的(从例如IMGT或Kabat的数据库鉴别[PatrickChames(编),《抗体工程化：方法和方案(Antibody Engineering:Methods andProtocols)》,第二版,《分子生物学方法》,第907卷,第1章])或通过借助制备和测试抗体片段突变体的实际证实；(2)将残基分布得远离会干扰抗原结合的位置；和(3)隔离共轭残基，以使得其在化学反应或药物释放反应期间不会空间上阻碍(或预计会阻碍)彼此或形成高度疏水性片导致凝集
蛋白质表面赖氨酸残基的优化可以通过增加、减小或再间隔(例如，通过定点诱变)来实现，以使得其更可接近以生物共轭、允许更完全并且因此更均相的共轭反应，并且同时不会不利地影响抗原结合、蛋白质稳定性、溶解度或凝集特性。残基可以单独、逐步或多重地操纵。
编码待表达的抗体片段或优化抗体片段的核苷酸序列可以通过诱变现有基因序列或通过基因合成而制备，插入到克隆载体中用于序列/结构证实，并且再克隆到携有用于蛋白质表达的适当调节元件的载体中，使用确定的分子生物学方法，例如Sambrook等人[《分子克隆(Molecular Cloning)》书籍(2000),第3版,冷泉港]或[Patrick Chames(编),《抗体工程化：方法和方案》,第二版,《分子生物学方法》,第907卷,第18-23章]描述的那些。这些元件包括启动子、增强子、终止子、翻译调节序列和用于克隆选择的标记基因(例如用于大肠杆菌的羧苄青霉素(carbenicillin)、用于哺乳动物细胞的新霉素(neomycin))。
可以使用可抑制型、组成型或诱导型的原核表达系统。适当大肠杆菌启动子包括Lac、Tac、T7、T4、SP6、T3、λPR/PL、Trp、RecA和热休克启动子。替代性原核宿主包括芽孢杆菌属(Bacillus)和具有相应启动子的其它细菌。
大肠杆菌可以用作宿主[de Marco A.《微生物细胞工厂》.2009,8:26；Spadiut O等人《生物技术趋势》.2014,32:54-60]，并且适当菌株包括K12或B-衍生物，例如来自例如新英格兰生物实验室(New England Biolabs)或默克公司(Merck)的供应商的JM109、TG1、HB2151、XL1、BL21、BL21(DE3)、大肠杆菌大肠杆菌 等。
载体表达系统包括允许周质分泌(使用附接到抗体片段基因的pelB或ompA前导序列)以允许二硫键形成[de Marco A.《微生物细胞工厂》.2009,8:26]或于氧化还原修饰的宿主中的胞溶质表达以允许二硫键形成[Sonoda H等人《蛋白质表达与纯化(Protein ExprPurif)》.2010,70:248-53]的表达系统。可以附接额外融合蛋白以帮助折叠和纯化，例如硫氧还蛋白还原酶(trx)[Sonoda H等人《蛋白质表达与纯化》.2010,70:248-53]，其随后通过蛋白水解通过可商购自例如普洛麦格(Promega)的供应商的特定地引入的肽裂解标签(例如TEV或因子-Xa)而去除。本发明的特定实施例包括使用载体(例如pET20b)于大肠杆菌BL21(DE3)中的周质表达和使用载体pET32Xa/LIC于大肠杆菌中的胞溶质表达[Lobstein J等人《微生物细胞工厂》.2012,11:56]。不需要链内二硫化物的工程化抗体需要分泌到周质空间中。
核酸还可以表达于真核宿主(例如酵母、昆虫和哺乳动物细胞)中[PatrickChames(编),《抗体工程化：方法和方案》,第二版,《分子生物学方法》,第907卷,第18-23章]]。酵母细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，昆虫细胞包括果蝇(Drosophila)，并且哺乳动物细胞包括啮齿动物(CHO，ATCC-CCL61，SP2/0)、非人类灵长类动物(COS-7，ATCC CRL1651)和人类细胞(HEK ATCC85257)。应使用适当启动子和调节元件，例如用于毕赤酵母属表达的pPIC系列载体、用于昆虫细胞表达的pBLUEBAC和用于哺乳动物细胞表达的pCDNA1/2/3/4中所见的那些。哺乳动物细胞表达启动子的实例包括SV40、CMV、IgH，与适当增强子，例如SV40增强子、IgH或κ增强子等。对于真核表达，适当分泌信号必须附接到基因以便传代到分泌系统以允许蛋白质折叠、糖基化(如果需要)、二硫键形成和胞外易位。哺乳动物分泌信号序列的一个实例是免疫球蛋白信号序列。
表达于异源宿主中的蛋白质可以使用多种不同方法分离和纯化[Scopes(1993)《蛋白质纯化：原理和实践(Protein Purification:Principles and Practice)》(施普林格化学高等教材(Springer Advanced Texts in Chemistry))]。可以通过离心收集培养物上清液，可以使细胞裂解(例如化学清洁剂)或物理破坏(例如，弗氏压碎器(FrenchPress)，声处理)，并且可溶或不可溶部分保留。如果蛋白质是可溶的，那么可以在天然条件下使用离子交换色谱法、亲和色谱法(使用预工程化的标签，例如poly-HIS、FLAG、cMyc)和尺寸排阻色谱法。如果蛋白质是不可溶的，那么可以使用化学变性(例如通过脲)随后再折叠[Deonarain MP与Epenetos AA.《英国癌症杂志》.1998,77:537-46]或在变性条件下纯化(例如poly-HIS固定的金属亲和色谱法，IMAC)。最终蛋白质纯度使用分析工具例如SDS-PAGE、SEC、氨基酸分析或质谱分析来评估，并且最终蛋白质功能使用ELISA、流式细胞术、免疫组织化学或细胞生物分析[Harlow与Lane(1998)《使用抗体(Using antibodies)》,冷泉港]或Biacore-SPR[Van Regenmortel MH等人《分子识别杂志(J.Mol Recognit)》.1998,11:163-7]来评估。
在一个实施例中，载体分子可以是抗体模拟物。术语“抗体模拟物”应理解为指可以如抗体一样特异性地结合抗原但结构上与抗体不相关的有机化合物。其通常是摩尔质量为约3到20kDa的人工肽或蛋白质。核酸和小分子可以视为抗体模拟物，但抗体模拟物不包括由其组成的人工抗体、抗体片段和融合蛋白。一些类型的抗体模拟物具有抗体样肽构象，例如β-片层。
适用于本发明中的抗体模拟物[Wurch T等人《生物技术趋势》.2012,30:575-82]是DARPin、亲和抗体(affibody)、affitin、anticalin、avimer、kunitz结构域肽、adnectin、centyrin、Fynomer、IgNAR和单抗体(monobody)。
载体分子可以是人类化或人类的。
人类化抗体适用于向人类投与而不会由人类引起针对所投与的免疫球蛋白的免疫反应。人类化形式的抗体是完整免疫球蛋白、主要由人类免疫球蛋白的序列组成并且含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人类化可以根据Winter和同事(Jones等人,《自然(Nature)》,321:522-525(1986)；Riechmann等人,《自然》,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,《科学》,239:1534-1536(1988))的方法执行。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架残基经相应非人类残基置换。人类化抗体还可以包含在受体抗体中和在所引进的CDR或构架序列中都不存在的残基。一般来说，人类化抗体将包含大体上所有的至少一个并且典型地两个可变区，其中所有或大体上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区并且所有或大体上所有的构架区是人类免疫球蛋白共有序列的构架区。人类化抗体最优地还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)、典型地人类免疫球蛋白的恒定区(Jones等人,1986；Riechmann等人,1988；和Presta,《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》,2:593-596(1992))。
本发明化合物的载体分子的优选标靶是细胞表面或肿瘤标记，包括(但不限于)5T4、AOC3、C242、CA-125、CCL11、CCR 5、CD2、CD3、CD4、CD5、CD15、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD31、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD74、CD80、CD125、CD138、CD141、CD147、CD152、CD154、CD326、CEA、CTLA-4、EGFR、ErbB2、ErbB3、EpCAM、叶酸受体、FAP、纤维结合蛋白剪接变异体(EDA、EDB、CSIII)、GD2、GD3、GPNMB、HGF、HER2、ICAM、IGF-1受体、VEGFR1、EphA2、TRPV1、CFTR、gpNMB、CA9、Cripto、ACE、APP、肾上腺素受体-β2、Claudine 3、间皮素、乳凝集素、IL-2受体、IL-4受体、IL-13受体、整合素(包括α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αIIbβ3整合素)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE、IGF-1受体、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-22、IL-4、IL-5、IL-6、干扰素受体、ITGB2(CD18)、LFA-1(CD11a)、L-选择素(CD62L)、粘蛋白、MUC1、肌肉抑制素、NCA-90、NGF、PDGFRα、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、狂犬病、RANKL、呼吸道融合病毒、恒河猴因子、SLAMF7、鞘氨醇-1-磷酸酯、TAG-72、T细胞受体、腱生蛋白C、TGF-1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR2、波形蛋白、基质受体和类似标靶、细胞凋亡标记(例如磷酸-胆碱)
具体来说，如果载体分子特异性结合到HER2、EGFR、HER3、MUC1、EpCAM、CEA、纤维结合蛋白-EDB、CD19、CD20、CD22、LeY、CD30、CD33、CD79b、GPNMB、PSMA、CD56、CD37、叶酸受体、CA6、CD27L、MUC16、CD66e、CD74、Trop-2或鸟苷酸环化酶，那么这是优选的。
本发明的载体分子可以是衍生自以下全抗体中任一者或与以下全抗体中任一者具有等效结合特异性的抗体片段：3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)(REOPRO)、阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿夫妥珠单抗(afutuzumab)、阿珠单抗(alacizumab)、ALD518、阿仑单抗(alemtuzumab)(CAMPATH)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿玛西单抗(amatuximab)、麻安莫单抗(anatumomab)、安鲁金单抗(anrukinzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)(CEA-SCAN)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿利珠单抗(atlizumab)(托珠单抗(tocilizumab)，Actemra，RoActemra)、阿托木单抗(atorolimumab)、贝频珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)(Simulect)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)(LYMPHOSCAN)、贝利单抗(belimumab)(BENLYSTA)、贝那利珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)(SCINITIMUN)、贝伐单抗(贝伐单抗)(AVASTIN)、比西单抗(biciromab)(FIBRISCINT)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、布林莫单抗(blinatumomab)、贝伦妥单抗(brentuximab)、贝伐珠单抗(briakinumab)、康纳单抗(canakinumab)(ILARIS)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、卡罗单抗(capromab)、卡托莫西单抗(catumaxomab)(REMOVAB)、CC49、西利珠单抗(cedelizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)(ERBITUX)、西他土珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、昔瓦土单抗(clivatuzumab)、康纳木单抗(conatumumab)、CR6261、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)(ZENAPAX)、达土木单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)(PROLIA)、地莫单抗(detumomab)、阿托度单抗(dorlimomab)、多立珠单抗(dorlixizumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、艾库组单抗(eculizumab)(SOLIRIS)、埃巴单抗(edobacomab)、依决洛单抗(edrecolomab)(PANOREX)、依法利珠单抗(efalizumab)(RAPTIVA)、依芬古单抗(efungumab)(MYCOGRAB)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾思莫单抗(elsilimomab)、恩莫单抗(enlimomab)、伊匹莫单抗(epitumomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)(REXOMUN)、埃达珠单抗(etaracizumab)(ABEGRIN)、艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)(NEUTROSPEC)、法拉莫单抗(faralimomab)、伐吐珠单抗(farletuzumab)、非维珠单抗(felvizumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)(HuZAF)、福拉韦单抗(foravirumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、加利昔单抗(galiximab)、甘替鲁单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉瑞昔单抗(girentuximab)、格雷巴土木单抗(glembatumumab)、戈利木单抗(golimumab)(SIMPONI)、戈利昔单抗(gomiliximab)、伊巴珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)(INDIMACIS-125)、英西单抗(imciromab)(MYOSCINT)、英利昔单抗(infliximab)(REMICADE)、英妥木单抗(intetumumab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、伊珠单抗(inotuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、凯利昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)(CEA-CIDE)、来金珠单抗(lebrikizumab)、来马索单抗(lemalesomab)、乐地单抗(lerdelimumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、利韦单抗(libivirumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)(BOSATRIA)、美替木单抗(metelimumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗木单抗(morolimumab)、莫维珠单抗(motavizumab)(NUMAX)、莫罗单抗(muromonab)-CD3(ORTHOCLONEOKT3)、他那可单抗(nacolomab)、他那莫单抗(naptumomab)、那他珠单抗(natalizumab)(TYSABRI)、奈巴库单抗(nebacumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(THERACIM)、诺非单抗(nofetumomab)、奥克雷珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、奥法木单抗(ofatumumab)(ARZERRA)、奥拉妥单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)(XOLAIR)、翁提西珠单抗(ontecizumab)、奥普珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)(OVAREX)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)(SYNAGIS)、帕尼单抗(panitumumab)(VECTIBIX)、帕诺库单抗(panobacumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、潘妥莫单抗(pemtumomab)(THERAGYN)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARG)、培克珠单抗(pexelizumab)、平妥莫单抗(pintumomab)、普立昔单抗(priliximab)、普托木单抗(pritumumab)、PRO140、雷韦单抗(rafivirumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷珠单抗(ranibizumab)(LUCENTIS)、雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)(RITUXAN)、罗妥木单抗(robatumumab)、罗塔利珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)(LEUKARREST)、鲁利单抗(ruplizumab)(ANTOVA)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomabpendetide)、司韦单抗(sevirumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西法木单抗(sifalimumab)、思图昔单抗(siltuximab)、西利珠单抗(siplizumab)、苏兰珠单抗(solanezumab)、索尼普西珠单抗(sonepcizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、司他莫单抗(stamulumab)、硫索单抗(sulesomab)(LEUKOSCAN)、他珠单抗(tacatuzumab)(AFP-CIDE)、特特拉克斯坦(tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、帕他普莫单抗(taplitumomab paptox)、替非珠单抗(tefibazumab)(AUREXIS)、阿替莫单抗(telimomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗(teneliximab)、替利珠单抗(teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗(tigatuzumab)、TNX-650、托珠单抗(tocilizumab)(阿利珠单抗(atlizumab)，ACTEMRA)、托利珠单抗(toralizumab)、托西莫单抗(tositumomab)(BEXXAR)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、曲美木单抗、土库珠单抗(tucotuzumab)、妥韦单抗(tuvirumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)(STELERA)、伐利昔单抗(vapaliximab)、维多珠单抗(vedolizumab)、维托珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维西珠单抗(visilizumab)(NUVION)、伏洛昔单抗(volociximab)(HUMASPECT)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)(HuMEX-EGFr)、扎木单抗(zanolimumab)(HuMAX-CD4)、齐拉木单抗(ziralimumab)和阿佐莫单抗(zolimomab)。
治疗剂优选是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
对于细胞毒性剂，我们意指典型地通过杀伤细胞而对细胞具毒性的药剂。毒性可以通过坏死或细胞凋亡导致细胞死亡。
对于细胞抑制剂，我们意指抑制或终止细胞生长和/或繁殖的药剂。
优选地，治疗剂选自以下类别的治疗剂：细胞周期进程抑制剂、血管生成抑制剂、MAPK信号传导路径抑制剂、PI3K/m-TOR/AKT路径抑制剂、激酶抑制剂、RTK抑制剂、HDAC抑制剂、蛋白质伴侣蛋白抑制剂、PARP抑制剂、Wnt/Hedgehog/Notch信号传导路径抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、DNA结合药物、DNA损害药物、DNA烷基化药物、微管稳定剂、微管去稳定剂、铂化合物、激酶抑制剂、吡啶并咔唑和其衍生物和拓扑异构酶异I和II抑制剂。
DNA结合或烷基化药物的实例包括CC-1065和其类似物、蒽环霉素(anthracycline)(例如阿霉素、表柔比星(epirubicin)、艾达霉素(idarubicin)、道诺霉素(daunorubicin))和其类似物、玫瑰树碱和其衍生物、烷基化剂(例如卡奇霉素(calicheamicin)、放线菌素(dactinomycin)、丝裂霉素(mitromycin)、吡咯并苯并二氮呯)和衍生物。
CC-1065类似物的实例包括多卡霉素(duocarmycin)SA、多卡霉素C1、多卡霉素C2、多卡霉素B2、DU-86、KW-2189、比折来新(bizelesin)、断-阿多来新(seco-adozelesin)和其衍生物。
微管稳定和去稳定剂的实例包括紫杉烷化合物，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)；类美登素；海兔毒素；西马多丁(cemadotin)；奥瑞他汀和其类似物；微管溶素A和B衍生物；长春花生物碱衍生物；埃博霉素(epothilone)；和隐藻素(cryptophycin)。
类美登素或类美登素类似物的实例包括美登醇(maytansinol)和美登醇类似物、美登素(maytansine)或DM-1和DM-4。奥瑞他汀的实例包括奥瑞他汀E(海兔毒素-10的衍生物)、奥瑞他汀EB、奥瑞他汀EFP、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、奥瑞他汀F和海兔毒素。长春花生物碱的实例包括长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和诺维本(navelbine)(长春瑞滨(vinorelbine))。埃博霉素化合物的实例包括埃博霉素A、B、C、D、E和F和其衍生物。铂化合物的实例包括顺铂(cisplatin)卡铂(carboplatin)奥沙利铂(oxaliplatin)异丙铂(iproplatin)、欧恩纳铂(onnaplatin)和四铂(tetraplatin)。拓扑异构酶I抑制剂的实例包括喜树碱(camptothecin)、喜树碱衍生物、喜树碱类似物和非天然喜树碱，例如CPT-11(伊立替康(irinotecan))、SN-38、拓扑替康(topotecan)、9-氨基喜树碱、9-溴喜树碱、二氟替康(diflomotecan)、鲁比替康(rubitecan)、赛拉替康(silatecan)、勒托替康(lurtotecan)、依沙替康(exatecan)、贝洛替康(belotecan)、吉马替康(gimatecan)、卡仑尼替星(karenitecin)、勒托替康和S39625。
血管生成抑制剂的实例包括VEGF抑制剂、MetAP2抑制剂、P1GF抑制剂、VGFR抑制剂、PDGFR抑制剂。VGFR和PDGFR抑制剂的实例包括索拉非尼(sorafenib)舒尼替尼(sunitinib)和瓦他拉尼(vatalanib)。细胞周期进程抑制剂的实例包括CDK抑制剂，例如BMS-387032和PD0332991；Rho激酶抑制剂，例如GSK429286；关卡激酶抑制剂，例如AZD7762；极光激酶抑制剂，例如AZD1152、MLN8054和MLN8237；PLK抑制剂，例如BI2536、BI6727(Volasertib)、GSK461364、ON-01910(Estybon)；和KSP抑制剂，例如SB743921、SB715992(伊斯平斯(ispinesib))、MK-0731、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。PI3K/m-TOR/AKT信号传导路径抑制剂的实例包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、GSK-3抑制剂、ATM抑制剂、DNA-PK抑制剂和PDK-1抑制剂。
PI3激酶的实例包括BEZ235、BGT226、BKM120、CAL101、CAL263、去甲氧基甲绿胶霉素(demethoxyviridin)、GDC-0941、GSK615、IC87114、LY294002、Palomid 529、哌立福新(perifosine)、PF-04691502、PX-866、SAR245408、SAR245409、SF1126、渥曼青霉素(Wortmannin)、XL147和XL765。AKT抑制剂的实例包括AT7867。MAPK信号传导路径抑制剂的实例包括MEK、Ras、JNK、B-Raf和p38MAPK抑制剂。MEK抑制剂的实例包括GDC-0973、GSK1120212、MSC1936369B、AS703026、RO5126766和R04987655、PD0325901、AZD6244、AZD8330和GDC-0973。B-raf抑制剂的实例包括CDC-0879、PLX-4032和SB590885。
p38MAPK抑制剂的实例包括BIRB 796、LY2228820和SB 202190。
受体酪氨酸激酶(RTK)调节剂/抑制剂的实例包括抗ErbB2受体药物，例如AEE788(NVP-AEE 788)、BIBW2992(阿法替尼(Afatinib))、拉帕替尼(Lapatinib)、埃罗替尼(erlotinib)和吉非替尼(Gefitinib)
多特异性RTK抑制剂的实例包括靶向FGFR、FLT-3、VEGFR-PDGFR和Bcr-Abl受体的AP24534(普纳替尼(Ponatinib))；靶向FLT-3和VEGFR-PDGFR受体的ABT-869(立尼法尼(Linifanib))；靶向VEGFR-PDGFR、Flt-1和VEGF受体的AZD2171；靶向VEGFR-PDGFR、FGFR、Flt-3和c-Kit受体的CHR-258(多韦替尼(Dovitinib))；靶向VEGFR、PDGFR、KIT、FLT-3和CSF-IR的舒尼替尼(Sutent)；靶向VEGFR、PDGFR、Raf/Mek/Erk路径的丝氨酸/苏氨酸激酶和玫瑰树碱的索拉非尼和瓦他拉尼。
蛋白质伴侣蛋白抑制剂的实例包括HSP90抑制剂，例如17AAG衍生物、BIIB021、BIIB028、SNX-5422、NVP-AUY-922和KW-2478。HDAC抑制剂的实例包括贝林司他(Belinostat)(PXD101)、CUDC-101、决昔诺司他(Droxinostat)、ITF2357(吉韦诺他(Givinostat)，加韦诺他(Gavinostat))、JNJ-26481585、LAQ824(NVP-LAQ824，达欣斯特(Dacinostat))、LBH-589(帕比司他(Panobinostat))、MC1568、MGCD0103(莫塞诺他(Mocetinostat))、MS-275(恩替诺特(Entinostat))、PCI-24781、吡咯沙敏(Pyroxamide)(NSC 696085)、SB939、曲古抑菌素A(Trichostatin A)和伏立诺他(Vorinostat)(SAHA)。PARP抑制剂的实例包括依尼帕瑞(iniparib)(BSI 201)、奥拉帕尼(olaparib)(AZD-2281)、ABT-888(维利帕瑞(Veliparib))、AG014699、CEP 9722、MK 4827、KU-0059436(AZD2281)、LT-673、3-氨基苯甲酰胺、A-966492和AZD2461。Wnt/Hedgehog信号传导路径抑制剂的实例包括维莫德吉(vismodegib)(RG3616/GDC-0449)、环巴胺(cyclopamine)(11-去氧芥芬胺)(Hedgehog路径抑制剂)和XAV-939(Wnt路径抑制剂)。Notch路径抑制剂的实例包括γ-分泌酶抑制剂MK0752、RO4929097、PF-03084,014、LY450139、BMS-708163、γ-分泌酶改性剂MPC-7869和显性阴性mastermind/CSL/notch化合物。
RNA聚合酶抑制剂的实例包括鹅膏毒素(amatoxin)，例如α-鹅膏菌素(α-amanitin)、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素、ε-鹅膏菌素、一羟鹅膏毒素酰胺(amanullin)、一羟鹅膏毒肽羧酸(amanullic acid)、三羟鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、鹅膏素(amanin)和二羟鹅膏毒肽酰胺原(proamanullin)。
药物有效负载可以以合成方式修饰以使其可使用多种方法(表2)共轭到生物分子(例如抗体)。此类化学修饰描述于[Chari RV等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827]中。实例包括美登素派生物、MMAE和MMAF、阿霉素、西马多丁、SN38和P5(海兔毒素-15中存在的五肽)和吡咯并苯并二氮呯二聚体(PBD)。
类美登素在本领域中是熟知的，并且适用于共轭到细胞结合剂上的衍生物可以根据美国专利第5,208020号、第5,416064号、第7,276497号和[Chari RV等人《药物化学杂志》2006,49,4392]和[Chari RV等人《药物化学杂志》2011,22,717]中完全公开的已知方法以合成方式制备。具有异双官能连接子的硫醇封端的类美登素处的反应产生经反应性NHS酯封端的不可还原稳定连接用于直接共轭到细胞结合剂上，如WO 2010/141566和[Chari RV等人]《药物化学杂志》2011,54,3606中所公开。异双官能连接子除了胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺NHS酯和巯基反应性末端之外，还含有带负电的磺酸酯基或亲水性不带电的PEG基。
包括单甲基奥瑞他汀E(MMAE)的奥瑞他汀描述于美国专利第20060074008号和[Senter PD等人]《自然·生物技术》2003,21,778中，其公开了一种具有蛋白酶敏感性缬氨酸-瓜氨酸二肽作为组织蛋白酶B的裂解位点和自我牺牲型氨基甲酸对氨基苯甲酯的连接子。具有不可裂解连接子的单甲基奥瑞他汀F(MMAF)共轭物描述于美国专利第20110070428号中。
CC-1065和多卡霉素家族的环丙基吲哚DNA烷基化剂的类似物公开于[GoldmacherVS等人《癌症研究》,1995,55,4079]和美国专利第8680293号中。
吡咯并苯并二氮呯二聚体(PBD)和共轭物已经描述于[Senter PD等人《生物共轭化学》2013,24:1256；McEarchern JA等人《血液》,2013,122:1455]和美国专利第2014234346号和WO 2014 031566中
道诺霉素/阿霉素类似物也是适合有效负载并且已经在[Firestone RA等人《控制释放杂志(J.Controlled Release)》,1996,39:251]和WO2012024223中公开作为马来酰亚氨基封端的药物。可释放组织蛋白酶B的阿霉素公开于[Dubowchik G M等人《生物共轭化学》,2002,13,855]中。更有力的衍生物阿霉素-2-吡咯啉基和吗啉基-阿霉素公开于[Senter PD等人《生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett)》2006,16:358]和WO2014124227中。具有反应性酯基的奈莫柔比星(Nemorubicin)(阿霉素的代谢物)衍生物和共轭物公开于美国专利第2014227299号中
可以使用的紫杉烷公开于[Ojima I等人《药物化学杂志》2002,45,5620]和[OjimaI《化学研究述评(Acc.Chem.Res)》2008,41,108]和美国专利第72766499号中
SN-38，拓扑异构酶抑制剂伊立替康(喜树碱衍生物)的活性代谢物是适合有效负载，并且具有可裂解的并且并入PEG的连接子的共轭物公开于[Goldenberg DM等人《药物化学杂志》2008,51:6916]和WO2010/093395中
隐藻素属于最有力的抗有丝分裂剂，并且经由马来酰亚胺和反应性酯形成的共轭物公开于WO 2011/001052中。
微管溶素与海兔毒素-10具有结构类似性并且呈现作为微管蛋白修饰剂的高效力。这些和更简单的前微管溶素(pretubulysin)变异体公开于WO2014/0227295和[Kazmaier U等人《欧洲有机化学杂志(Eur.J.Org.Chem.)》2011,3050]中。
近期研究用作有效负载的一类有力药物是RNA聚合酶II抑制剂，例如α-鹅膏菌素，鹅膏毒素的双环八肽组分。到赖氨酸残基上的共轭物通过以下方式形成：用碳酸二琥珀酰亚胺酯活化胺封端的鹅膏菌素过夜，随后与细胞结合剂反应，如WO2012/041504中所公开
优选的治疗剂选自西马多丁、P5(西马多丁的早期前体)、P5-C5(具有5碳间隔基的P5)、阿霉素、玫瑰树碱、MMAE、MMAF、太平洋紫杉醇、奥瑞他汀、美登素、海兔毒素、喜树碱、SN-38和吡咯并苯并二氮呯二聚体(PBD)、PNU-159862和吲哚啉并苯并二氮呯二聚体(IGN)。
根据本发明的化合物的特定实例包括(但不限于)其中：
(i)所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是西马多丁；
(ii)所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是阿霉素
(iii)所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是玫瑰树碱。
(iv)所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是MMAE。
(v)所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是(P5)-C5。
(vi)所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是美登素
(vii)所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是吡咯并苯并二氮呯二聚体(PBD)。
(viii)所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是MMAF。
这些特定实例可以使用任何scFv作为载体分子，但scFv的优选实例是结合到HER2者，例如scFv(C6.5)或其修饰形式scFv(TCT)(SEQ ID NO:2，参看实例27)。scFv的替代性优选实例是具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的氨基酸序列的那些。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的第一方面的化合物和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
在本发明的第三方面，提供了第一或第二方面的化合物或组合物，其用于诊断、治疗和/或预防疾病。
在本发明的第四方面，提供了第一或第二方面的化合物或组合物，其用于诊断、治疗和/或预防选自以下的疾病：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；和自身免疫疾病。
在本发明的第五方面，提供了如第一和第二方面中任一项所定义的化合物或组合物，其用于制造供治疗和/或预防选自以下的疾病用的药剂：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；和自身免疫疾病。
在本发明的第六方面，提供了一种治疗或预防选自以下的疾病的方法：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；和自身免疫疾病。
在本发明的第三、第四、第五和第六方面，疾病可以是例如以下的癌症：
实体肿瘤，包括(但不限于)：肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、绒膜癌、脊索瘤、血管肉瘤、甲状腺、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰脏癌、骨癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌、胃癌(例如，胃肠癌)、口腔癌、鼻癌、喉癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓性癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms'tumor)、子宫颈癌、腹膜癌、肝细胞癌、肝肿瘤、唾液癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌、头颈癌、肾细胞癌、急性退行性大细胞癌、皮肤退行性大细胞癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、非小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤，血液癌，包括(但不限于)：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性成淋巴细胞性B细胞白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、急性成骨髓细胞性白血病(AML)、急性前髓细胞性白血病(APL)、急性成单核细胞性白血病、急性红白血病性白血病、急性成巨核细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性未分化的白血病、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性和慢性白血病，淋巴瘤，例如霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin'sLymphoma)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症( macroglobulinemia)、重链病、真性红细胞增多症(Polycythemia vera)。
疾病或者可以是例如以下的自身免疫疾病：
活性慢性肝炎、阿狄森氏病(addison's disease)、过敏性肺泡炎、变态反应、过敏性鼻炎、阿尔波特氏综合征(alport's syndrome)、过敏反应、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、关节炎、蛔虫病、曲霉病、萎缩性过敏症、萎缩性皮炎、萎缩性鼻炎、白塞氏病(behcet'sdisease)、支气管哮喘、卡普兰氏综合征(caplan's syndrome)、心肌病、脂泻病、恰加斯氏病(chagas'disease)、慢性丝球体肾炎、柯根氏综合征(cogan's syndrome)、冷凝集素病、先天性风疹感染、CREST综合征、克罗恩氏病(crohn's disease)、冷球蛋白血症、库欣氏综合征(cushing's syndrome)、皮肌炎、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(dressler'ssyndrome)、伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambertsyndrome)、埃可病毒感染、脑脊髓炎、内分泌眼病、艾伯斯坦-巴尔病毒(艾伯斯坦-巴尔病毒)感染、马肺气肿病、红斑、埃文斯综合征(Evan's Syndrome)、费尔蒂氏综合征(Felty's Syndrome)、纤维肌痛、法曲氏睫状体炎(Fuch's Cyclitis)、胃萎缩、胃肠过敏症、巨细胞动脉炎、丝球体肾炎、古德帕斯丘氏综合征(goodpasture's syndrome)、移植物抗宿主疾病、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、格林-巴利病(Guillain-Barre disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、亨诺-许兰紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、特发性肾上腺萎缩、特发性肺纤维化、IgA肾病、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(I型)、兰伯特-伊顿综合征、蹄叶炎、扁平苔癣、类狼疮肝炎、淋巴球減少症、美尼尔氏病(Meniere'sdisease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、多腺综合征、早老性痴呆、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺现象(raynauds phenomenon)、复发性流产、莱特尔氏综合征(Reiter's syndrome)、风湿热、类风湿性关节炎、萨姆普特氏综合征(Sampter's syndrome)、血吸虫病、施密特氏综合征(Schmidt's syndrome)、硬皮病、舒尔曼氏综合征(Shulman's syndrome)、斯耶格伦氏综合征(Sjorgen's syndrome)、交感性眼炎、全身红斑性狼疮、颞动脉炎、甲状腺炎、血小板减少症、甲状腺中毒症、中毒性表皮坏死溶解、B型胰岛素抗性、I型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉牙肿病(Wegener's granulomatosis)。
优选地，疾病选自结肠癌、肺癌、乳癌、头/颈癌、前列腺癌、皮肤癌、胃/胃肠癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肾癌、卵巢癌、甲状腺癌和骨癌。
在本发明的第七方面，提供了一种制备如第一或第二方面中所定义的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(i)提供治疗剂；
(ii)提供载体分子；
(iii)在至少一种极性非质子溶剂和水性缓冲剂存在下共轭所述治疗剂与所述载体分子。
术语“非质子溶剂”意指不具有OH基并且因此无法供给氢键的溶剂。
适当极性非质子溶剂是(但不限于)由以下组成的群组：二甲亚砜(DMSO)；乙腈；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；二甲基乙酰胺(DMA)；HMPA；二噁烷；四氢呋喃(THF)；二硫化碳；乙二醇二甲醚和二乙二醇二甲醚；2-丁酮(MEK)；环丁砜；硝基甲烷；N-甲基吡咯烷酮；吡啶；和丙酮。可以使用的其它极性非质子溶剂为本领域技术人员所熟知。
作为此方法的一部分的共轭治疗剂与载体分子的步骤优选使用以下参数中的任一者或其组合执行：
●约0℃与约37℃之间、优选约10到约30℃的温度。
●约6.0与约10.0之间、优选约7.5到约9的pH。
●持续0.1小时与48小时之间。
本发明的方法还可以包括一个或多个选自以下的其它步骤：
(iv)使用赋形剂促进反应
(v)预孵育溶剂和缓冲剂组分以最小化不良混合效应
(vi)时间上受控地添加反应组分
(vii)将所述化合物与药学上可接受的载剂组合以形成药物组合物。
实例
现将参看以下图式描述体现本发明的一方面的实例，其中：
图1.人类可变结构域中的氨基酸残基的表面/溶剂可接近性
根据Knappik等人(2000)《分子生物学杂志》296,57-86改动。灰度级从深(＝高)到浅(＝低)指示可接近的表面/溶剂百分比。根据Honegger A与Pluckthun A[《分子生物学杂志》2001,309:657-70]的编号方案。约70％被视为显著溶剂暴露的。
图2.纯化scFv-TCT
泳道1：分子标记
泳道2：在第2次通过Ni-NTA树脂之后的澄清裂解物
泳道3：具有洗涤缓冲液1的最终洗液
泳道4：具有洗涤缓冲液2的第1次洗液
泳道5：洗脱部分
泳道6：在于TEV裂解缓冲液中渗析之后的汇集洗脱部分。矩形表示融合-TCT。
泳道7：TEV裂解开始之后16小时。上面的方形表示裂解的scFv(TCT)。下面的方形表示裂解的硫氧还蛋白融合搭配物。
泳道8：分子标记
泳道9：裂解的TCT
泳道10：保持结合到Ni-NTA的蛋白质
泳道11-18：来自图20的尺寸排阻柱(35kDa)的部分
图3.通过在PBS缓冲液中在superdex-75柱上的尺寸排阻色谱法纯化scFv-TCT
峰1-太稀以致无法呈现于考马斯染色的PAGE凝胶上，高分子量污染物
峰2-scFv TCT的高分子量凝集物。
峰3-纯单体scFv TCT，对应于凝胶上的泳道11-18(图19)
图4.ScFv(TCT)-玫瑰树碱共轭物的SDS-PAGE
玫瑰树碱(化合物21)共轭物。1＝32当量，14％DMSO；2＝16当量，14％DMSO；3＝16当量，6％DMSO；D＝透析的，Z＝Zeba柱脱盐的；CS＝可溶粗物质反应；P＝不可溶/沉淀粗物质反应。样品负载量＝2.4μg(ADC)、1.9μg(scFv)。
标记(M)的MW，kDa，从上到下：250,130,100,70,55,35,25,15,10
图5.scFv(TCT)-玫瑰树碱共轭物的UV-Vis
图6.比较玫瑰树碱和PEG-玫瑰树碱scFv共轭物的SDS-PAGE
玫瑰树碱(化合物21)和PEG-玫瑰树碱(化合物23)共轭物。1＝scFv(TCT)-PEG-玫瑰树碱，20当量；2＝scFv(TCT)-玫瑰树碱，20当量；3＝scFv(TCT)-PEG-玫瑰树碱，32当量；4＝scFv(TCT)-PEG-玫瑰树碱，64当量；Z＝Zeba柱脱盐的；CS＝可溶粗物质反应；P＝不可溶/沉淀粗物质反应。样品负载量＝1.8μg。
标记(M)的MW，kDa，从上到下：250、130、100、70、55、35、25、15、10
图7.样品2：ScFv(TCT)-玫瑰树碱共轭物的SDS-PAGE
D＝透析的；Z＝Zeba柱脱盐的；C＝可溶粗物质反应；P＝不可溶/沉淀粗物质反应。Ell＝玫瑰树碱样品负载量＝2.5μg。
标记(M)的MW，kDa，从上到下：250、130、100、70、55、35、25、15、10
图8.样品4：全IgG-玫瑰树碱共轭物的SDS-PAGE
D＝透析的；Z＝Zeba柱脱盐的；C＝可溶粗物质反应；P＝不可溶/沉淀粗物质反应，Ell＝玫瑰树碱。样品负载量＝2.5μg。
标记(M)的MW，kDa，从上到下：250、130、100、70、55、35、25、15、10
图9.阿霉素衍生物两步共轭到C6.5scFv的SDS-PAGE
上图，HMFG1IgG共轭物，下图，C6.5scFv共轭物。
HMFG1/C6＝游离抗体，S＝可溶部分，P＝沉淀物，A＝阿霉素-马来酰亚胺(化合物12)共轭物，B＝阿霉素-PEG-马来酰亚胺(化合物48)共轭物。
标记(M)的MW，kDa，从上到下：250、130、100、70、55、35、25、15、10
图10.对共轭到SPDP连接子的C6.5scFv的HER2抗原的ELISA
图11.ScFv(TCT)-西马多丁ADC在HPLC-SEC纯化之后的SDS-PAGE凝胶
标记(M)的MW，kDa，从上到下：250、130、100、70、55、35、25、15、10。
西马多丁(化合物2)共轭物(化合物69)。1＝16药物当量；2＝48药物当量；3＝112药物当量；S＝HPLC-SEC纯化；Z＝进一步Zeba缓冲液交换。
图12.通过HPLC-SEC分析的scFv和scFv-西马多丁ADC
a)用于G2000SWxl SEC柱以证实洗脱的蛋白质和共轭物的尺寸的校准标记。柱在PBS/20％异丙醇中以1ml/min运行。值是：
RT(min) 分子量(kDa) 样品
6.43 80 醇脱氢酶
8.48 30 碳酸酐酶
11.25 13 溶菌酶
10.9 <1 西马多丁
b)上面的迹线，scFv(TCT)，下面的迹线，scFv(TCT)-西马多丁ADC样品-1，通过SEC-HPLC分析。柱在PBS/20％异丙醇中以0.5ml/min运行。
c)上面的迹线，scFv(TCT)-西马多丁ADC样品-2，中间的迹线，scFv(TCT)-西马多丁ADC样品-3，通过SEC-HPLC分析，下面的迹线，证实蛋白质/肽含量的UV-Vis光谱。柱在PBS/20％异丙醇中以0.5ml/min运行。
图13.ScFv(TCT)-西马多丁ADC样品2的(a)TIC，(b)ESI-MS，(c)去卷积-MS和计算DAR
图14.ScFv(TCT)-西马多丁ADC样品1的(a)TIC，(b)ESI-MS，(c)去卷积-MS和计算DAR
图15.ScFv(TCT)-西马多丁ADC样品3的(a)TIC，(b)ESI-MS，(c)去卷积-MS和计算DAR
图16.ScFv(TCT)的(a)TIC，(b)ESI-MS，(c)去卷积-MS和计算DAR
图17.scFv(TCT)的MALDI-MS
图18.scFv(TCT)-西马多丁ADC样品1的MALDI-MS
图19.scFv(TCT)-西马多丁ADC样品2的MALDI-MS
图20.scFv(TCT)-西马多丁ADC样品3的MALDI-MS
图21HER2上scFv(TCT)西马多丁ADC的ELISA
图22.scFv(TCT)-P5C5ADC的SDS-PAGE
P5C5药物(化合物6)和共轭物(化合物71)。1＝scFv(TCT)-P5C5，30当量；2＝scFv(TCT)-P5C5，112当量；C＝粗反应混合物；S＝SEC纯化和浓缩之后的样品；F＝SEC纯化、浓缩和缓冲液交换之后的最终样品。样品负载量＝2μg。
标记(M)的MW，kDa，从上到下：250、130、100、70、55、35、25、15、10
图23.SEC纯化后样品的分析HPLC迹线-在280nm下监测
a)上面的迹线，scFv(TCT)，中间的迹线，scFv(TCT)-P5C5ADC(30当量)，下面的迹线，scFv(TCT)-P5C5ADC(112当量)。柱在PBS/20％异丙醇中以0.5ml/min运行。
b)左边的迹线，来自(a)的scFv和scFv-ADC的比较展示归因于载药量的较早滞留(与16.9min的scFv洗脱相比，是15.7和15.9min)，但展示非凝集单体峰，右边的迹线，展示蛋白质/肽光谱的ADC之一的UV-Vis迹线。柱在PBS/20％异丙醇中以0.5ml/min运行。
图24.各种ADC的SDS-PAGE
P5C5药物(化合物6)、西马多丁C5药物(化合物4)和共轭物(化合物71)。1＝scFv(TCT)-P5C5，16当量；2＝scFv(TCT)-P5C5，30当量；3＝scFv(TCT)-P5C5，112当量；4＝曲妥珠单抗-P5C5，16当量；5＝曲妥珠单抗-P5C5，32当量；6-7＝scFv(TCT)-西马多丁-C5；8＝曲妥珠单抗-西马多丁-C5；Z＝最终Zeba脱盐的样品；Sc＝HPLC-SEC和浓缩之后的样品；C＝粗反应混合物。样品负载量＝1.9μg。
标记(M)的MW，kDa，从上到下：250、130、100、70、55、35、25、15、10。
图25.曲妥珠单抗共轭物的HPLC纯化迹线(A280nm)
上面的迹线展示游离曲妥珠单抗IgG，下面的3个迹线展示不同共轭反应当量下的各种ADC。样品在经标记校准的G3000SWxl柱上运行。柱在PBS/20％异丙醇中以0.5ml/min运行。洗脱的标记如下：
分子量(kDa) 滞留时间(min) 样品
223.8 18.1 β淀粉酶
146.8 18.9 醇脱氢酶
66.5 21.2 BSA
29 23.7 碳酸酐酶
14.5 29.7 溶菌酶
IgG(滞留时间＝11.7min)和IgG-ADC(滞留时间＝10.9-11.4min)都在约150kDa下洗脱，表明极少/无凝集。
图26,覆叠用于比较的来自图25的曲妥珠单抗共轭物的HPLC纯化迹线(A280nm)
峰1＝曲妥珠单抗，2＝曲妥珠单抗-P5C5(16当量共轭反应)，3＝2＝曲妥珠单抗-西马多丁(16当量共轭反应)，2＝曲妥珠单抗-P5C5(32当量共轭反应)
图27.scFv(TCT)-P5C5共轭物的HPLC纯化迹线(A280nm)
scFv(TCT)-P5-C5ADC具有比游离scFv(滞留时间＝16.9min)更快的滞留时间(15.7min、15.6min和15.4，与增加的共轭当量和因此DAR)。scFv(TCT)-西马多丁滞留时间是16.1min和15.7，与增加的DAR。仍保持在单体scFv范围内的全部具有极少或不具有凝集。柱在PBS/20％异丙醇中以0.5ml/min运行。
图28.曲妥珠单抗-P5C5于PBS中的UV/Vis吸收光谱
图29.scFv(TCT)-P5C5共轭物于PBS中的UV/Vis吸收光谱
图30.HER2上scFv(TCT)P5-C5ADC的ELISA
图31.基于P5C5的ADC对表达HER2的SKBr3细胞的剂量反应细胞杀伤活性
图32.游离P5C5药物对表达HER2的SKBr3细胞和HER2阴性U87细胞的剂量反应细胞杀伤活性
图33.基于P5C5的ADC对HER2阴性U87细胞的剂量反应细胞杀伤活性
图34.经scFv-西马多丁ADC免疫的候选小鼠血清的ELISA测试
图35.抗scFv-西马多丁MAb的候选杂交瘤克隆株的ELISA
图36.使用抗小鼠过氧化酶二级抗体，通过蛋白质印迹(Western Blot)对鼠类Mab的候选杂交瘤培养基上清液检测
图37.用以通过蛋白质印迹检测scFv-西马多丁ADC的候选杂交瘤条件培养基
印迹1-3和5-7、10和11负载如下：标记；ADC；TCT；和游离西马多丁。
印迹4和8负载如下：标记；ADC；和游离西马多丁。
图38.放射性标记的scFv(TCT)-西马多丁共轭物的血液清除.
西马多丁共轭物(化合物69)。
图39.放射性标记的scFv(TCT)-西马多丁共轭物的脾吸收.
西马多丁共轭物(化合物69)。
图40.通过总抗体ELISA测量的展示scFv-TCT和scFv-TCT-ADC的血液清除的药物动力学概况.
西马多丁共轭物(化合物69)。
图41.通过总ADC ELISA测量的展示scFv-TCT-ADC的血液清除的药物动力学概况.
西马多丁共轭物(化合物69)。
图42.展示scFv-TCT和scFv-TCT-ADC的血液清除的类似性的比较药物动力学概况，在图40与41中使用的两个分析测量.
图43.经两种scFv(TCT)-P5C5ADC DAR处理的携有SKBr3肿瘤异种移植物的裸小鼠中的肿瘤消退研究.
P5C5共轭物(化合物71)。
图44.(A)scFv(TCT1067)-乙酸酯和(B)scFv(TCT)-乙酸酯纯化共轭物在0.5ml/min下运行和与各别非共轭抗体相比的HPLC SEC迹线(A280nm).
图45.scFv(TCT)-乙酸酯共轭物的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)是10min处的主峰的去卷积质量。
图46.scFv(TCT1067)-乙酸酯共轭物的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)是10.3min处的主峰的去卷积质量。
图47.(A)scFv(TCT)-MMAF-C5ADC 1和(B)scFv(TCT)-MMAF-C5ADC 2纯化共轭物在1ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLC SEC迹线(A280nm).
图48.展示scFv(TCT)-MMAF-C5ADC 2与scFv(TCT)非共轭抗体相比的SDS-PAGE还原凝胶(12％).
展示了所用的尺寸标记。
图49.scFv(TCT)-MMAF-C5ADC 1的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)是10.2min处的主峰的去卷积质量。
图50.scFv(TCT)-MMAF-C5ADC 2的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B-E)展示了10-12min处的主峰的去卷积质量。
图51.(A)scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC 1和(B)scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC 2纯化共轭物在1ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLC SEC迹线(A280nm).
图52.scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC 1和ADC 2的LCMS数据.
(A)和(B)是scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC1的LCMS数据，其中(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)是9.3-10.6min之间的主峰的去卷积质量。(C)和(D)是scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC2的LCMS数据，其中(C)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(D)是9.9-12min之间的主峰的去卷积质量。
图53.展示scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC 1和2与scFv(TCT1067)非共轭抗体相比的SDS-PAGE还原凝胶(12％).
尺寸标记如图48中所示。
图54.scFv(TCT1067)-P5-C5ADC 1在1ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLCSEC迹线(A280nm).
图55.展示scFv(TCT1067)-P5-C5ADC 1与scFv(TCT1067)非共轭抗体相比的SDS-PAGE还原凝胶(12％).
尺寸标记如图48中所示。
图56.scFv(TCT1067)-P5-C5ADC 1的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)是8.2min处的主峰的去卷积质量。
图57.scFv(TCT)-AF-C5ADC 1在0.5ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLCSEC迹线(A280nm).
图58.scFv(TCT)-AF-C5ADC 1的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)是9.5min处的主峰的去卷积质量。
图59.scFv(TCT1067)-AF-C5ADC 1、2和3在1ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLC SEC迹线(A280nm).
图60.scFv(TCT)-AF-C5ADC 1、2和3的LCMS数据.
(A)和(B)是scFv(TCT)ADC 1的LCMS数据，其中(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)是8.1min处的主峰的去卷积质量。(C)和(D)是scFv(TCT)-AF-C5ADC 2的LCMS数据，其中(C)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(D)是9.4min处的主峰的去卷积质量。(E)和(F)是scFv(TCT)-AF-C5ADC 3的LCMS数据，其中(E)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(F)是9.9min处的主峰的去卷积质量。
图61.展示scFv TCT-AF-C5ADC 1、2和3与scFv(TCT1067)非共轭抗体相比的SDS-PAGE还原凝胶(12％).
尺寸标记如图48中所示。
图62.scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9ADC 1在1ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLC SEC迹线(A280nm).
图63.scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9ADC 1的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B-E)展示了主峰的去卷积质量。
图64.展示scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9 ADC 1与scFv(TCT1067)非共轭抗体相比的SDS-PAGE还原凝胶(12％).
尺寸标记如图48中所示。
图65.scFv(TCT1067)-MMAF-C5-P5-C5ADC 1在1ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLC SEC迹线(A280nm).
图66.scFv(TCT1067)-MMAF-C5-P5-C5ADC 1的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B-F)展示了的主峰的去卷积质量。
图67.scFv(TCT1067)-美登素-PEG(12)DM1ADC 1和2在1ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLC SEC迹线(A280nm).
图68.scFv(TCT1067-美登素-PEG(12)DM1ADC 1和2的LCMS数据.
(A)和(B)是scFv(TCT1067)-美登素-(PEG12)DM1ADC 1的LCMS数据，其中(A)是LCMS迹线(UV和TIC)，并且(B)展示了主峰的去卷积质量。(C)和(D)是scFv(TCT1067-美登素-PEG(12)DM1ADC 2的LCMS数据，其中(C)是UV LCMS迹线并且(D)是指示样品中存在的物质的DAR的TIC LCMS迹线。
图69.展示scFv(TCT1067)-美登素-PEG(12)DM1ADC 1和2与scFv(TCT1067)非共轭抗体相比的SDS-PAGE还原凝胶(12％).
尺寸标记如(A)中所示
图70.表45中描述的反应1、2、4、5和6的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶.反应3不产生可溶蛋白质.
M＝分子量标记。
P＝非共轭scFv(帕尼单抗)，
T＝非共轭scFv(TCT1067)。
更高DAR物质归因于增加的分子量而迁移得更慢，scFv(TCT1067)共轭物展现增加的DAR。尺寸标记如图68中所示。
图71.(A)scFv(帕尼单抗)-AF-C5ADC和(B)scFv(TCT1067)-AF-C5在1ml/min下运行和与非共轭抗体相比的HPLC SEC迹线(A280nm).
图72.scFv(Pani-AF-C5)ADC 1、2和4-6的LCMS数据.
(A)和(B)是scFv(Pani-AF-C5)ADC 1的LCMS数据，其中(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)展示了样品1的主峰的去卷积质量。(C)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(D)展示了样品2的主峰的去卷积质量。(E)-(H)是scFv(TCT1067-AF-C5)ADC 4-6的LCMS数据，其中(E)是样品4的LCMS迹线(UV和TIC)，(F)展示了样品4的主峰的去卷积质量，(G)展示了样品5的去卷积质量，并且(H)展示了样品6的去卷积质量。
图73.游离MMAF的体外细胞毒性曲线图.
游离MMAF细胞毒素对(A)U87细胞(B)SKBr3细胞(C)BT474细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图74.非共轭抗体的体外细胞毒性曲线图.
非共轭scFv(TCT1067)和曲妥珠单抗对(A)U87细胞(B)BT474细胞(C)SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况
图75.非共轭抗体的体外细胞毒性曲线图.
非共轭scFv(TCT)对BT474细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图76.基于MMAF的ADC的体外细胞毒性曲线图.
抗体片段ADC scFv(TCT)-MMAF-C5DAR 6.6、scFv(TCT0167)-MMAF-C5DAR6.4、非共轭曲妥珠单抗和曲妥珠单抗(trastuzumab)-MMAF-C5对(A)U87细胞(B)BT474细胞(C)SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图77.基于MMAF的ADC的体外细胞毒性曲线图.
抗体片段共轭物scFv(TCT)-MMAF-C5DAR 8、scFv(TCT0167)-MMAF-C5DAR 8.7和曲妥珠单抗-MMAF-C5对(A)U87细胞(B)BT474细胞(C)SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图78.基于P5-C5的ADC的体外细胞毒性曲线图.
(A)游离P5-C5药物和(B)抗体片段共轭物scFv(TCT1067)-P5-C5DAR 10.6(H1)和DAR 12.5(H2)对U87细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图79.基于P5-C5的ADC的体外细胞毒性曲线图.
(A)游离P5-C5药物和(B)抗体片段共轭物scFv(TCT1067)-P5-C5DAR 10.6(H1)和DAR 12.5(H2)对SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图80.基于P5-C5的ADC的体外细胞毒性曲线图.
(A)游离P5-C5药物和(B)抗体共轭物scFv(TCT1067)-P5-C5DAR 10.6(H1)和曲妥珠单抗DAR6对BT474细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图81.游离奥瑞他汀F的体外细胞毒性曲线图.
游离奥瑞他汀细胞毒素对(A)U87细胞(B)SKBr3细胞(C)BT474细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图82.基于奥瑞他汀F的ADC的体外细胞毒性曲线图.
抗体片段ADC scFv(TCT1067)-AF-C5，DAR 2.7(L)、scFv(TCT1067)-AF-C5，DAR6.2(M)、scFv(TCT1067)-AF-C5，DAR 11.8(H)和曲妥珠单抗-AF-C5，DAR 4.8对(A)U87细胞(B)BT474细胞(C)SKBr3细胞(D)NCI-N87细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图83.游离DM1药物的体外细胞毒性曲线图.
游离DM1-PEG9细胞毒素对(A)U87细胞(B)SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况
图84.基于DM1-(dPEG12)的ADC的体外细胞毒性曲线图.
抗体片段ADC scFv(TCT1067)-DM1-(dPEG12)，DAR 3.5(L)、scFv(TCT1067)-DM1-(dPEG12)DAR 5.5(M)、scFv(TCT1067)-DM1-(dPEG12)，DAR 8(H)对(A)U87细胞(B)SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图85.游离MMAE药物的体外细胞毒性曲线图.
游离MMAE细胞毒素对(A)U87细胞(B)SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况
图86.基于MMAE的ADC的体外细胞毒性曲线图.
抗体片段ADC scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9，DAR9和曲妥珠单抗-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9，DAR 4对(A)U87细胞(B)BT474细胞(C)SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况
图87.游离奥瑞他汀药物持续4和96hr的体外细胞毒性曲线图.
游离奥瑞他汀细胞毒素持续(A)4和(B)96小时孵育对SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况
图88.曲妥珠单抗和scFv(1067)-奥瑞他汀-C5共轭物持续4和96hr的体外细胞毒性曲线图.
曲妥珠单抗-奥瑞他汀-C5和scFv(1067)-奥瑞他汀-C5持续(A)4和(B)96小时孵育对SKBr3细胞的细胞杀伤剂量反应概况.
图89.在2hr投与scFv和IgG-ADC之后BT474肿瘤切片的荧光图像.
(A)高亲和力scFv(TCT1067)-P5C5共轭物，(B)中亲和力scFv(TCT)-P5C5共轭物，(C)曲妥珠单抗-P5C5共轭物，(D)投与生理盐水的对照.
图90.鼠类模型中scFv(TCT)-MMAF-C5和对照(化合物118)的药物动力学清除分析.
将单个静脉内剂量以5mg/kg注射到雌性BALB/c小鼠中。在指定时间点获取血浆样品，并且通过ELISA使用抗蛋白质检测(总蛋白质，由实线、封闭符号指示)和其中相关抗药物检测(总ADC，由虚线、空心符号指示)分析。展示了每个组和实验一式三份各份的平均值的SE。ADC scFv(TCT)-MMAF-C5(圆形)(n＝3)、曲妥珠单抗-MMAF-C5(三角形)(n＝3)和scFv(TCT)(方形)(n＝4)。对照scFv(TCT)值由单独PK研究提供。
图91.鼠类模型中scFv(TCT1067)-MMAF-C5和对照(化合物118)的药物动力学清除分析.
将单个静脉内剂量以5mg/kg注射到雌性BALB/c小鼠中。在指定时间点获取血浆样品，并且通过ELISA使用抗蛋白质检测(总蛋白质，由实线、封闭符号指示)和其中相关抗药物检测(总ADC，由虚线、空心符号指示)分析。展示了每个组和实验一式三份各份的平均值的SE。ADC scFv(TCT1067)-MMAF-C5(圆形)(n＝3)、曲妥珠单抗-MMAF-C5(三角形)(n＝3)和scFv(TCT1067)(方形)(n＝3)。
图92.鼠类模型中scFv(TCT)-P5C5和对照(化合物71)的药物动力学清除分析.
将单个静脉内剂量以5mg/kg注射到雌性BALB/c小鼠中。在指定时间点获取血浆样品，并且通过ELISA使用抗蛋白质检测(总蛋白质，由实线、封闭符号指示)和其中相关抗药物检测(总ADC，由虚线、空心符号指示)分析。展示了每个组和实验一式三份各份的平均值的SE。ADC scFv(TCT)-P5C5(圆形)(n＝3)、曲妥珠单抗-P5C5(三角形)(n＝3)和scFv(TCT)(方形)(n＝4)。对照scFv(TCT)和曲妥珠单抗-P5C5值由单独PK研究提供。
图93.鼠类模型中scFv(TCT1067)-AF-C5和对照(化合物122)的药物动力学清除分析.
将单个静脉内剂量以2mg/kg注射到雌性BALB/c小鼠中。在指定时间点获取血浆样品，并且通过ELISA使用抗蛋白质检测(总蛋白质，由实线、封闭符号指示)和其中相关抗药物检测(总ADC，由虚线、空心符号指示)分析。展示了每个组和实验一式三份各份的平均值的SE。ADC scFv(TCT1067)-AF-C5(圆形)(n＝3)和scFv(TCT1067)(方形)(n＝3)。
图94.鼠类模型中scFv(TCT1067)-DM1(dPEG12)和对照(化合物124)的药物动力学清除分析.
将单个静脉内剂量以2mg/kg注射到雌性BALB/c小鼠中。在指定时间点获取血浆样品，并且通过ELISA使用抗蛋白质检测(总蛋白质，由实线、封闭符号指示)和其中相关抗药物检测(总ADC，由虚线、空心符号指示)分析。展示了每个组和实验一式三份各份的平均值的SE。ADC scFv(TCT1067)-DM1(dPEG12)(圆形)(n＝3)和scFv(TCT1067)(方形)(n＝3)。
图95.大鼠模型中scFv(TCT1067)-P5-C5和对照(化合物124)的药物动力学清除分析.
(A)将单个静脉内剂量以4mg/kg注射到雄性史泊格-多利(Sprague-Dawley)大鼠中。在指定时间点获取血浆样品，并且通过ELISA使用抗蛋白质检测(总蛋白质，由实线、封闭符号指示)和其中相关抗药物检测(总ADC，由虚线、空心符号指示)分析。展示了每个组和实验一式三份各份的平均值的SE。ADC scFv(TCT1067)-P5C5(圆形)(n＝3)和scFv(TCT1067)(方形)(n＝3)。(B)注射scFv(TCT1067)的大鼠，3个动物样品的在HER2-BiacoreSPR芯片上分析的经24小时收集的10倍浓缩尿液。展示了scFv参考。尿液样品的大量偏移是由于尿液组分的浓缩。(C)注射scFv(TCT1067)-P5C5共轭物的大鼠，3个动物样品的在HER2-Biacore SPR芯片上分析的经24小时收集的10倍浓缩尿液。展示了scFv(TCT1067)-P5C5参考。尿液样品的大量偏移是由于尿液组分的浓缩。
图96.BT474异种移植模型中经scFv(TCT1067)-MMAF-C5、曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(化合物118)和游离MMAF治疗剂的肿瘤生长抑制或根除.
(A)绘制3种剂量的scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC(圆形)、2种剂量的曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(三角形)和对照(方形)的肿瘤体积相对于时间(天数)。每个组由6只动物组成并且展示了平均值的SE。插图是鉴于前30天缩放的。第二曲线图是一部分第一曲线图(由加框区域展示)的放大图。(B)(A)中的相同组从处理开始的体重变化百分比。
图97.BT474异种移植模型中经scFv(TCT)-MMAF-C5、曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(化合物118)和游离MMAF治疗剂的肿瘤生长抑制或根除.
(A)绘制2种剂量的scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC(圆形)、2种剂量的scFv(TCT)-MMAF-C5ADC(叉号)、2种剂量的曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(三角形)和对照(方形)的肿瘤体积相对于时间(天数)。每个组由6只动物组成并且展示了平均值的SE。(B)(A)中的相同组从处理开始的体重变化百分比。
图98.BT474异种移植模型中经scFv(TCT1067)-P5C5和曲妥珠单抗-P5C5共轭物(化合物71)的肿瘤生长抑制或根除.
(A)绘制一种给药方案的scFv(TCT1067)-P5-C5ADC(菱形)、一种给药方案的scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC(圆形)、一种给药方案的曲妥珠单抗-MMAF共轭物(三角形)、一种给药方案的曲妥珠单抗-P5-C5共轭物(菱形)和对照(方形)的肿瘤体积相对于时间(天数)。每个组由6只动物组成并且展示了平均值的SE。(B)(A)中的相同组从处理开始的体重变化百分比。
图99.BT474人类乳癌异种移植模型中经两种不同DAR下的scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物(121)的肿瘤生长抑制或根除.
(A)绘制两种治疗剂scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F(L)低DAR，2.7和scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F(M)中DAR，5.7和媒剂对照的肿瘤体积相对于时间(天数)。每个组由6只动物组成并且展示了平均值的SE。(B)(A)中的相同组从处理开始的体重变化百分比。
图100.BT474人类乳癌异种移植模型中经三种不同DAR下的scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物(121)的肿瘤生长抑制或根除.
(A)绘制两种治疗剂scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F(L)低DAR，2.7和scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F(M)中DAR，5.7、scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F(H)高DAR，11和媒剂对照的肿瘤体积相对于时间(天数)。每个组由6只动物组成并且展示了平均值的SE。
图101.scFv(TCT)与TCO-PEG4-NHS的共轭物的SDS PAGE.
泳道2-4是经纯化抗体片段(scFv)共轭物。
1＝未经修饰的scFv(TCT)储备；
2＝具有4药物当量的scFv(TCT)共轭物；
3＝具有6药物当量的TCT共轭物；
4＝具有16药物当量的scFv(TCT)共轭物。
泳道6-8是纯化之前的抗体片段共轭物。
6＝具有4药物的scFv(TCT)共轭物；
7＝具有6药物当量的scFv(TCT)共轭物；
8＝具有16药物当量的scFv(TCT)共轭物。
展示了所用的尺寸标记。
图102.scFv(TCT)-TCO-PEG4的LCMS数据.
(A)是LCMS迹线(UV和TIC)并且(B)是10.76min处的主峰的去卷积质量。
图103：scFv(TCT-1067)-SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG5ADC 1、2、3、4在1ml/min下运行和与非共轭scFv(TCT1067)相比的HPLC SEC迹线.(A)280nm下的吸光度的概况(B)360nm下的吸光度的概况
图104：展示scFv(TCT1067)-SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG5共轭物1和2与非共轭scFv(TCT1067)相比的SDS-PAGE还原凝胶(4-20％).
图105：展示双功能抗体(TCT)-AF-C5和scFv(TCT)-AF-C5共轭物相对于其各别非共轭抗体，双功能抗体(TCT)和scFv(TCT)的SDS PAGE还原凝胶(4-20％).
所有实例的共同因素
所有SDS-PAGE凝胶都是还原的。
表3.实例中所用的摩尔消光系数
项目 摩尔消光系数
ε280nm，C6.5和scFv(TCT) 65422
ε280nm，HMFG1IgG 210000
ε343nm硫酮 8080
ε280nm硫酮 5100
ε阿霉素488nm 11294
ε阿霉素280nm 8487
ε阿霉素-PEG 488nm 10218
ε阿霉素-PEG 280nm 14021
ε玫瑰树碱429nm 3603
ε玫瑰树碱280nm 22990
ε玫瑰树碱-PEG 429nm 1810
ε玫瑰树碱-PEG 280nm 8838
合成实验程序
除非另外陈述，否则实验通常在惰性气氛(氮气)下执行，尤其在利用对氧气或湿气敏感的试剂或中间物的情况下。商业溶剂和试剂是可获得的最好等级并且未经进一步纯化即使用。无水溶剂获自安可乐斯(Acros)或西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。随后对反应物进行薄层色谱(tlc)、LCMS或HPLC和通过拜泰齐(Biotage)自动化色谱法使用正或逆相支撑物或通过逆相HPLC执行的纯化。经由冻干/冷冻干燥浓缩来自拜泰齐或HPLC的逆相洗脱份。除非另外陈述，否则质谱数据由LCMS报告或通过直接注入使用电喷雾(ES)作为电离模式。质子和碳核磁共振(NMR)的化学位移都以百万分率(ppm)表示，氘化溶剂作为内部参考。
实例1-制备西马多丁-NHS(2)
向P5(100mg，0.18mmol)于DMF(5mL)中的搅拌溶液中添加HATU(62mg，0.16mmol)，随后添加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(63μL，0.36mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌30min。然后经10min逐滴添加反应混合物到4-(氨基甲基)苯甲酸(30mg，0.20mmol)于DMF(5mL)中的浆液中，并且将其在氮气下在室温下搅拌30min，在减压下浓缩，并且通过制备型HPLC(MeCN/H2O[0.1％TFA]；4mL/min；4min20％MeCN，20-23％经2min，23-25％经14min，25-30％经2min，30-80％经3min，5min80％MeCN)纯化，收集tR＝9.96min，得到呈白色固体状的标题产物1 85mg(69％)。HRMS(m/z)C36H57N6O计算值685.4289[M+H]实验值685.4307；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.86(br.s,1H),9.62(br.s,1H),8.92(br.s,1H),8.40(t,J＝6.0Hz,1H),7.87(d,J＝8.0Hz,2H),7.36(d,J＝8.2Hz,2H),6.55(br.s,1H),4.99(d,J＝11.0Hz,1H),4.61-4.51(m,2H),4.42-4.24(m,3H),3.77-3.63(m,3H),3.60-3.51(m,2H),3.09(s,3H),2.78(s,3H),2.75(s,3H),2.32-2.22(m,1H),2.20-1.87(m,8H),1.86-1.69(m,3H),1.00-0.93(m,6H),0.88(dd,J＝11.8,6.6Hz,6H),0.71(d,J＝6.7Hz,3H)ppm。
向西马多丁酸1(15mg，0.02mmol)和DIPEA(16μL 0.09mmol)于DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加TSTU(12mg，0.04mmol)，并且将其在氮气下在室温下搅拌1h，在减压下浓缩，并且通过制备型HPLC(MeCN/H2O[0.1％TFA]；4mL/min；25-35％MeCN经20min，35-80％经5min，2min在80％MeCN下)纯化，收集tR＝12.29min，得到呈白色固体状的标题产物2 13mg(76％)；HRMS(ES)(m/z)C40H60N7O9[M+H]计算值782.4453实验值：784.4449 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.64(br.s,1H),9.18-9.13(m,1H),8.93(br.s,1H),8.39(t,J＝6.3Hz,1H),8.07(d,J＝8.2Hz,2H),7.85(d,J＝8.1Hz,2H),7.58(d,J＝8.1Hz,2H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),6.55(br.s,4H),4.99(d,J＝10.9Hz,1H),4.61(d,J＝5.9Hz,2H),4.58-4.52(m,2H),4.42-4.22(m,3H),3.77-3.63(m,3H),3.60-3.51(m,2H),3.08(s,3H),2.89(s,3H),2.81-2.72(br.d,5H),2.69-2.66(m,1H),2.32-2.22(m,1H),2.20-2.05(m,3H),2.00-1.87(m,3H),1.85-1.69(m,3H),1.00-0.93(m,6H),0.91-0.81(m,6H),0.71(d,J＝6.7Hz,3H)ppm。
实例2-制备西马多丁C5-NHS(4)
向西马多丁酸1(20mg，0.03mmol)于无水DMF(1.5mL)中的搅拌溶液中添加HATU(10mg，0.03mmol)，随后添加DIPEA(10μL，0.06mmol)，并且将所得混合物在氮气下在室温下搅拌30min。然后经10min逐滴添加反应混合物到5-氨基戊酸(3.8mg，0.03mmol)于无水DMF(1.5mL)中的浆液中，并且将其在室温下搅拌30min，在减压下浓缩，并且通过制备型HPLC(MeCN/H2O[0.1％TFA]；4mL/min；4min 20％MeCN，20-23％经2min，23-25％经14min，25-30％经2min，30-80％经3min，5min 80％MeCN)纯化，收集tR＝12.18min，得到呈白色固体状的标题产物3 20mg(88％)。HRMS(m/z)C41H66N7O8[M+H]计算值784.4973实验值：784.4921；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.64(br.s,1H),8.93(br.s,1H),8.45(t,J＝5.8Hz,1H),8.36(t,J＝6.1Hz,1H),7.77(d,J＝7.8Hz,2H),7.30(d,J＝8.0Hz,2H),6.56(br.s,2H),4.99(d,J＝10.9Hz,1H),4.60-4.51(m,2H),4.42-4.30(m,2H),4.28-4.20(m,1H),3.77-3.62(m,3H),3.60-3.52(m,2H),3.28(q,J＝6.4Hz,3H),3.09(s,3H),2.81(s,3H),2.80-2.70(m,3H),2.35-2.22(m,2H),2.18-1.88(m,7H),1.85-1.58(m,7H),1.29-1.22(m,2H),0.99-0.93(m,5H),0.90-0.81(m,8H),0.71(d,J＝6.9Hz,2H)ppm。
向西马多丁C5 3(20mg，0.03mmol)和DIPEA(10μL 0.06mmol)于无水DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加TSTU(14mg，0.05mmol)，并且将所得混合物在氮气下在室温下搅拌1h，在减压下浓缩，并且通过制备型HPLC(MeCN/H2O[0.1％TFA]；3mL/min；25-35％MeCN经20min，35-80％经5min，8min在80％MeCN下)纯化，收集tR＝12.13min，得到呈白色固体状的标题产物415mg(65％)；MS(m/z)881.5[M+H]；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.64(br.s,1H),8.93(br.s,1H),8.45(t,J＝5.8Hz,1H),8.36(t,J＝6.1Hz,1H),7.77(d,J＝7.8Hz,2H),7.30(d,J＝8.0Hz,2H),6.56(br.s,2H),4.99(d,J＝10.9Hz,1H),4.60-4.51(m,2H),4.42-4.30(m,2H),4.28-4.20(m,1H),3.77-3.62(m,3H),3.60-3.52(m,2H),3.28(q,J＝6.4Hz,3H),3.09(s,3H),2.81(s,3H),2.80-2.70(m,7H),2.35-2.22(m,2H),2.18-1.88(m,7H),1.85-1.58(m,7H),1.29-1.22(m,2H),0.99-0.93(m,5H),0.90-0.81(m,8H),0.71(d,J＝6.9Hz,2H)ppm。
实例3-制备P5-C5-NHS(6)
向P5(100mg，0.18mmol)于无水DMF(5mL)中的搅拌溶液中添加HATU(62mg，0.16mmol)，随后添加DIPEA(63μL，0.36mmol)，并且将所得混合物在氮气下在室温下搅拌30min。然后经10min逐滴添加反应混合物到5-氨基戊酸(23mg，0.20mmol)于无水DMF(5mL)中的浆液中，并且将其在室温下搅拌30min，在减压下浓缩，并且通过制备型HPLC(MeCN/H2O[0.1％TFA]；4mL/min；4min 10％MeCN，10-20％经4min，20-30％经8min，2min 30％MeCN)纯化，收集tR＝13.58min，得到呈白色固体状的标题产物5 93mg(79％)；MS(m/z)651.4[M+H]；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.59(br.s,1H),8.92(d,J＝7.7Hz,1H),7.78(t,J＝5.8HZ,0.6H),7.73(t,J＝5.8Hz,0.4H),4.97(d,J＝11.0Hz,1H),4.57(t,J＝8.2Hz,1H),4.51(dd,J＝8.4,5.2Hz,1H),4.23(dd,J＝8.4,3.7Hz,1H),3.75-3.68(m,3H),3.66-3.59(m,1H),3.57-3.50(m,2H),3.25-3.11(m,1H),3.08(s,3H),3.01-2.89(m,1H),2.77(dd,J＝14.2,4.2Hz,6H),2.67(t,J＝7.3Hz,1H),2.60(s,1H),2.32-2.24(m,1H),2.22-2.09(m,3H),2.06-1.99(m,2H),1.96-1.86(m,3H),1.84-1.68(m,3H),1.64-1.56(m,2H),1.50-1.43(m,2H),0.96(dd,J＝9.4,6.6Hz,6H),0.88-0.82(m,9H),0.71(d,J＝6.6Hz,3H)ppm。
向P5C5 5(93mg，0.14mmol)和DIPEA(58μL 0.33mmol)于无水DMF(10mL)中的搅拌溶液中添加TSTU(76mg，0.25mmol)，并且将所得混合物在氮气下在室温下搅拌1h，在减压下浓缩，并且通过制备型HPLC(MeCN/H2O[0.1％TFA]；4mL/min；4min 15％MeCN，15-30％经8min，5min在30％下，30-40％经2min，3min在40％MeCN下)纯化，收集tR＝13.29min，得到呈白色固体状的标题产物6 78mg(73％)；MS(m/z)748.4[M+H]；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.59(br.s,1H),8.92(d,J＝7.7Hz,1H),7.78(t,J＝5.8HZ,0.6H),7.73(t,J＝5.8Hz,0.4H),4.97(d,J＝11.0Hz,1H),4.57(t,J＝8.2Hz,1H),4.51(dd,J＝8.4,5.2Hz,1H),4.23(dd,J＝8.4,3.7Hz,1H),3.75-3.68(m,3H),3.66-3.59(m,1H),3.57-3.50(m,2H),3.25-3.11(m,1H),3.08(s,3H),3.01-2.89(m,1H),2.82(s,3H),2.77(dd,J＝14.2,4.2Hz,6H),2.67(t,J＝7.3Hz,1H),2.60(s,1H),2.32-2.24(m,1H),2.22-2.09(m,3H),2.06-1.99(m,2H),1.96-1.86(m,3H),1.84-1.68(m,3H),1.64-1.56(m,2H),1.50-1.43(m,2H),0.96(dd,J＝9.4,6.6Hz,6H),0.88-0.82(m,9H),0.71(d,J＝6.6Hz,3H)ppm。
实例4-制备阿霉素-dPEG(7)-NHS:(7)
向阿霉素.HCl(15mg，0.026mmol)于无水DMF(2ml)中的搅拌悬浮液中添加DIPEA(22.5μl，0.013mmol)，并且在氮气下搅拌30min，得到澄清深红色溶液。将其溶解于5ml注射器中并且经20min逐滴添加到双-dPEG7-NHS(24.1mg，0.039mmol)和DIPEA(22.5μl，0.13mmol)于无水DMF(2ml)中的搅拌溶液中。然后将所得溶液在氮气下在室温下搅拌3h，并且在高真空下蒸发，得到深红橙色油。将其通过急骤色谱[硅胶：10％MeOH/DCM]纯化，并且将适当洗脱份(Rf 0.38)收集、合并并且蒸发，得到呈红橙色粘性油状的标题产物7 10.4mg(39％)；MS(m/z)C49H64N2O23Na计算值1071.3798(M+Na)实验值1071.3805
实例5-制备阿霉素-dPEG8-NHS酯(10)
将阿霉素盐酸盐(94mg，0.161mmol)溶解于无水DMF(10mL)中，并且添加DIPEA(89μl，0.483mmol)。将混合物搅拌10min，之后添加NHS-PEG8-N3(100mg，0.177mmol)，随后在暗处在氮气下在室温下搅拌18h。将反应混合物在真空下蒸发并且通过急骤色谱[硅胶：5％MeOH/DCM]纯化，得到呈红色油状的所要Dox-dPEG8-叠氮化物8，121mg(76％)。(Rf 0.395，5％MeOH/DCM)；MS(m/z):1010.44[M++NH4]，1015.39[M++Na]，1031.37[M++K]，1H NMR(CDCl3):δ14.00(1H,s,6-OH),13.31(1H,s,11-OH),8.08(1H,d,J＝8Hz,3-H),7.84(1H,t,J＝8Hz,2-H),7.43(1H,d,J＝8Hz,1-H),5.53(1H,d,J＝4Hz,c-OH),5.33(1H,s,1'-OH),4.79(2H,s,14-H),4.19-4.11(5H,m,CH3-O-,5'-H,7-H),3.71-3.64(33H,m,3'-H,-CH2-O-(CH2-CH2-O)7-CH2-),3.42(2H,t,J＝8Hz,-CH2-N3),3.34-3.05(2H,q,J＝20Hz,10-H),2.46-2.16(3H,m,4'-H,b-H,d-H),1.94-1.77(4H,m,2'-H,8'-H),1.31(3H,d,J＝8Hz,6'-H)。
向Dox-dPEG8-叠氮化物8(120mg，0.121mmol)于2.5mL叔丁醇/水(1:1v:v)中的溶液中添加5-己炔酸(14mg，0.121mmol)于2.5mL叔丁醇/水(1:1)中的溶液。将反应物在室温下搅拌30min，随后添加硫酸铜(II)(2mg，0.012mmol)和(+)-L-抗坏血酸钠(5mg，0.024mmol)。使反应物升温到40℃，并且搅拌24h。然后将反应混合物用DCM(15mL)稀释并且添加柠檬酸溶液直到达到pH 4。然后将有机层用盐水(2×10mL)洗涤，并且将水层合并并且用DCM(4×10mL)反萃取。将有机洗脱份合并，经硫酸钠干燥，过滤，并且浓缩，得到深红色残余物。将其急骤色谱[硅胶：DCM增加达到20％MeOH/DCM)纯化，得到呈红色固体状的产物9，53.4mg(40％)。(Rf 0.20，10％MeOH/DCM)；MS(m/z):1106.05[M++H]，1128.00[M++Na 1H NMR(CDCl3):δ14.01(1H,s,6-OH),13.33(1H,s,11-OH),8.08(1H,d,J＝8Hz,3-H),7.82(1H,t,J＝8Hz,2-H),7.64(1H,s,-N-CH＝CN-),7.44(1H,d,J＝8Hz,1-H),5.55(1H,d,J＝4Hz,c-OH),5.33(1H,s,1'-OH),4.81(2H,s,14-H),4.55(2H,t,J＝4Hz,-CH＝CN-CH2-),4.16-4.11(5H,m,CH3-O-,5'-H,7-H),3.86(2H,t,J＝8Hz,-O-CH2-CH2-CN-),3.70-3.62(33H,m,3'-H,-(CH2-CH2-O)5-CH2-),3.35-3.06(2H,q,J＝20Hz,10-H),2.83(2H,t,J＝4Hz,-CH2-COOH),2.47-2.16(2H,m,b-H,d-H),2.07-2.02(3H,m,2'-H,4'-H),1.83-1.79(2H,m,8-H),1.36-1.28(5H,m,6'-H,-CH2-CH2-CH2-COOH).]。将Dox-dPEG8酸的溶液与TSTU和DIPEA一起于无水DMF中搅拌1h。使用高真空脱除溶剂，并且将残余物通过逆相HPLC纯化，得到NHS酯衍生物10。
实例6-制备阿霉素-dPEG12-SPDP(11)
向Dox.HCl(10mg，0.0172mmol)于无水DMF(2ml)中的搅拌悬浮液中添加DIPEA(7.7μl)，并且将反应混合物在氮气下搅拌10min，得到澄清红色溶液。向其中添加溶解于无水DMF(1ml)中的SPDP-dPEG12-NHS酯(17.3mg，0.044mmol)，并且将反应物在氮气下在室温下搅拌并且保护其不受光照过夜。通过高真空去除DMF，并且将深红色油通过急骤色谱[硅胶：10％MeOH/DCM Rf 0.36]纯化，得到呈红色粘性油状的所要产物11 16.2mg(70％)；HRMS(m/z)C62H85N8O21S2[M+H]计算值1341.5271实验值：1341.5380
实例7-制备阿霉素-SMCC(12)
向Dox.HCl(0.05g，0.086mmol)于无水DMF(10ml)中的悬浮液中添加SMCC交联剂(0.0346g，0.104mmol)和DIPEA(22.5μl，0.129mmol)，并且将反应物在遮蔽光下在氮气下在室温下搅拌12h。悬浮液在1h内变成溶液。在35℃下在高真空下脱除溶剂，得到深红色残余物。将其溶解于DCM(50ml)中，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且蒸发，得到深红色固体。将其通过急骤柱色谱[硅胶：1-5％MeOH/DCM，Rf 0.25]纯化，得到呈橙红色固体状的12，0.053g(78％)。MS(m/z)实验值785.25(M+Na)，关于C39H42N2O14Na计算
实例8-制备阿霉素-PAB-Cit-Val-dPEG7-NHS酯(16)
向Dox.HCl(25mg，0.043mmol)和Fmoc-Val-Cit-PNP 13(30mg，0.039mmol)于无水DMF(1ml)中的悬浮液中添加DIPEA(7.5μl，0.043mmol)，得到深红色溶液。将其在氮气下在室温下搅拌24h，之后在高真空下蒸发溶剂，并且将残余物用无水乙醚湿磨，得到红色固体Rf 0.22[硅胶：10％MeOH/DCM]。通过急骤色谱[硅胶：5％MeOH/DCM]纯化，得到呈红色固体状的所要产物14，25.2mg(55％)；HRMS(m/z)C61H67N6O18[M+H]计算值1171.4512实验值：1171.4534
向14(20mg，0.017mmol)于无水DCM(5ml)中的搅拌溶液中添加哌啶(10摩尔％)。在溶液混合物中显著的亮红色立即变成深褐色澄清溶液，并且搅拌10min，之后脱除所有溶剂，得到为红色粘性固体的所要化合物15。HRMS(m/z)C46H57N6O16[M+H]计算值949.3831实验值：949.3874。其未经进一步纯化即用于制备16。
经20min逐滴添加化合物15于无水DMF中的溶液到双-dPEG7-NHS和DIPEA(22.5μl，0.13mmol)于无水DMF中的搅拌溶液中。然后将所得溶液在氮气下在室温下搅拌3h，并且在高真空下蒸发，得到深红橙色油。将其通过急骤色谱[硅胶：10％MeOH/DCM]纯化，并且将适当洗脱份收集、合并并且蒸发，得到呈红橙色粘性油状的标题产物16。
实例9-制备喜树碱-dPEG3-NHS酯(19)
向喜树碱(400.0mg，1.1mmol)于无水DCM(100ml)中的搅拌溶液中相继地添加5-己炔酸(319.8mg，2.9mmol)、EDC(437.1mg，2.28mmol)和DMAP(139.4mg，1.14mmol)。将黄色悬浮液保持在N2下并且在暗处在室温下搅拌16小时。将所得浅褐色溶液用H2O(120ml)洗涤并且用DCM(100mL)萃取。将有机相合并，用盐水(100mL)洗涤，经MgSO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗物质通过急骤色谱[硅胶：以1-3％MeOH/DCM梯度]纯化，得到呈灰白色/黄色粉末状的喜树碱炔烃17，471.1mg(91.6％)；HRMS(m/z):C26H22N2O5计算值443.1623[M+H]，实验值443.1607。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.43(s,1H),8.25(d,J＝8.5Hz,1H),7.97(d,J＝8.3Hz,1H),7.86(ddd,J＝8.5,6.8,1.5Hz,1H),7.70(t,J＝7.8Hz,1H),7.28(s,1H),5.71(d,J＝17.3Hz,1H),5.43(d,J＝17.2Hz,1H),5.32(s,2H),2.78-2.59(m,2H),2.35-2.28(m,3H),2.18(dq,J＝13.6,7.5Hz,1H),2.05(t,J＝2.6Hz,1H),1.90(p,7.2Hz,2H),1.01(t,J＝7.5Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝172.1,167.5,157.4,152.4,148.9,146.2,146.0,131.2,130.70,129.6,128.5,128.2,128.1,120.3,96.0,83.0,75.9,69.5,67.1,49.9,32.4,31.9,23.2,17.7,7.6；IRλmax:3302.5,2984.3,2943.6,1753.6,1737.3,1669.3,1624.3,1564.1,1446.8,1405.6,1365.6,1351.3,1296.6,1234.1,1205.3,1166.5,1131.8,1088.4,1045.3,1011.2,976.5,946.6,909.3,825.4,786.2,762.2,722.4,652.0；
向喜树碱炔烃17(60mg，0.136mmol)于15ml 1:2H2O:叔丁醇中的搅拌溶液中相继地添加63.2mg叠氮基-PEG3-酸(0.271mmol，2eq)、2.7mg抗坏血酸钠(0.0136mmol，0.1eq)和2.2mg CuSO4(0.0136mmol，0.1eq)。将白色悬浮液在N2下并且在暗处在80℃下搅拌5h。在将澄清溶液冷却到RT之后，添加15ml DCM和15ml蒸馏H2O，并且分离有机层。将所获得的有机物用25ml 0.5M HCl和25ml 1:1 1M HCl:盐水洗涤(有机层变成荧光黄色)，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将粗物质通过急骤色谱[硅胶：10-15％MeOH/DCM梯度，随后0.1％甲酸10％MeOH/DCM]纯化。将适当洗脱份合并，在真空中浓缩，并且在回流下用热乙醚洗涤1小时。获得黄色粘性固体为所要产物18 71mg(78.4％)；HRMS(m/z):676.2644[M+H]，计算质量676.2669。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.44(s,1H,5-CH-芳香族),8.28(d,J＝8.6Hz,1H,4-CH-芳香族),7.97(d,J＝8.2Hz,1H,1-CH-芳香族),7.87(t,J＝7.7Hz,1H,3-CH-芳香族),7.70(t,J＝7.6Hz,1H,2-CH-芳香族),7.30(s,1H,7-CH-芳香族)，5.71(d,J＝17.2Hz,1H,8-CH2-O),5.44(d,J＝17.2Hz,1H,8-CH2-O),5.33(s,2H,6-CH2-N),4.52(td,J＝4.8,1.9Hz,2H),4.18(s,2H),3.86(t,J＝5.2Hz,2H),3.75(dd,J＝5.8,3.1Hz,2H),3.68-3.57(m,6H),2.82(t,J＝7.4Hz,3H),2.68-2.49(m,3H),2.31(dq,J＝14.8,7.4Hz,1H),2.18(dq,J＝14.7,7.4Hz,1H),2.06(p,J＝7.4Hz,2H),1.01(t,J＝7.5Hz,3H,10-CH3)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝172.39,167.73,157.40,152.23,146.08,131.52,130.86,129.36,128.56,128.23,122.57,120.29,96.37,75.82,70.39,69.50,67.13,50.12,49.99,32.84,31.81,24.43,24.24,7.59；IR cm-1:3422.20,2913.21,1745.90,1664.85,1616.45,1562.85,1501.82,1457.03,1404.63,1352.03,1299.22,1231.80,1132.95,1088.07,1048.25,994.41,947.36,815.25,787.33,763.06,724.93。
向喜树碱酸18酸(10mg)的搅拌溶液中添加含于无水DMF(3ml)中的160.3mg碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)(0.64mmol)和24mg三乙胺(0.24mmol)。使黄色溶液在室温下、在N2下并且在暗处保持搅拌。在16小时之后进一步添加160.4mg DSC(43eq)和24.1mg三乙胺。在再6小时之后，使反应停止，并且在真空中浓缩，得到橙色油。将其再溶解于15ml DCM中，用15ml0.5M HCl和15ml盐水洗涤，并且经Na2SO4干燥。重复此处理程序两次，并且用2×5ml H2O和5ml盐水执行一次最后洗涤。将经干燥的有机物过滤并且在真空中浓缩和冻干，得到呈白色吸湿性粉末状的所要化合物19，9mg。MS(m/z)773.2832(M+1),796.2639(M+Na)
实例10-制备玫瑰树碱-C6-NHS酯(21)
向玫瑰树碱(35mg，0.14mmol)于无水DMF(5ml)中的溶液中添加6-溴己酸(55.4mg，0.284mmol)，并且将反应混合物在120℃下搅拌4hr，并且然后在室温下再搅拌12hr，得到芥黄色沉淀物。将其过滤并且用冷无水乙醚洗涤。还在滤液中观察到一些沉淀，也将其收集起来。化合物20的所获得总合并产量是49.1mg(78％)。通过TLC[硅胶：MeCN:水:KNO3(饱和)]的分析展示产物为单个黄色斑点(Rf 0.55，玫瑰树碱Rf0.67)。HRMS(m/z)C23H25N2O2计算值361.1916(M+1)实验值361.1924
向酸20(10mg，0.023mmol)于无水DMF(1.5ml)中的部分悬浮液中相继添加TSTU(12mg，0.04mmol)和DIPEA(16.2μl，0.093mmol)，并且将反应混合物在氮气下在室温下搅拌1h。在反应过程中，悬浮液缓慢为澄清芥黄色的溶液所替代。随后对反应物进行TLC[硅胶：MeCN:水:KNO3(饱和)]，并且在完全后，使用高真空保持温度低于30℃脱除DMF。将残余物用无水乙醚湿磨并且风干，得到呈芥黄色的固体状的酯21；HRMS(m/z)关于C27H28BrN3O4计算
实例11-制备玫瑰树碱-PEG4-NHS酯(23)
在氮气下向玫瑰树碱(0.035g，0.142mmol)于无水DMF(4ml)中的搅拌溶液中添加溶解于无水DMF(1ml)中的Br-PEG4-酸(0.0936g，0.0284mmol)。将反应物在120℃下搅拌4h，使其冷却并且再在室温下搅拌12h。使用高真空脱除DMF，并且将残余物通过制备型HPLC[Chromolith HighResolution RP-18e 100×4.6mm]、100％10mMNa3PO4/pH 7到100％MeCN经27min阶段梯度在20℃下、在280和435nm下检测、收集tR 7.9min而纯化，得到呈黄色吸湿性固体状的酸22，40.6mg(50％)；HRMS(m/z)C25H35N2O6M-Br)计算值495.2495实验值495.2498
将玫瑰树碱-PEG4-酸22(0.0143g，0.00256mmol)溶解于无水DMSO(1ml)中，并且在氮气下搅拌。向其中添加TSTU(0.0136g，0.00451mmol)，随后添加DIPEA(18.5μl，0.105mmol)，并且将亮黄色溶液在氮气下在室温下搅拌1h。在高真空下脱除溶剂，并且将粘性残余物用无水乙醚湿磨，并且在倾析乙醚之后在高真空下干燥，得到呈黄色粘性固体状的23，11.4mg(66％)；HRMS(m/z)C32H38N3O(M-Br)计算值592.2659实验值592.2643
实例12-制备玫瑰树碱-PAB-Cit-Val-dPEG3-NHS酯(29)
向Cit-Val-PAB-OH(24)(0.10g，0.43mmol)于无水DMF(8mL)中的搅拌溶液中添加含于无水DMF(1mL)中的11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一酸(0.16g，0.43mmol)。然后添加EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉)(100mg，0.5mmol)，并且将溶液在氮气下在室温下搅拌过夜。在真空中去除溶剂，并且通过急骤色谱[硅胶：10％MeOH/DCM]纯化，得到呈白色固体状的产物25(0.21g，82％)。mp 139℃；HRMS(m/z)C26H42N8O8计算值617.3023[M+Na]。实验值617.2999，IR 3270,2925,2103,1629,1538,1272,1094,799cm-1；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.54(m,2H),7.29(d,J＝8.7Hz,2H),4.43-4.52(m,2H),4.30(d,J＝7.2Hz,2H),4.05(s,2H),3.59-3.77(m,10H),3.30(m,2H),3.04-3.25(m,2H),2.04-2.17(m,1H),1.67-1.95(m,2H),1.57(m,2H),0.97(m,6H)；1CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ17.9,19.2,26.8,29.3,31.1,39.6,49.9,53.2,56.5,62.6,69.2,69.6,69.6,69.7,69.8,70.3,118.8,126.9,17.5,158.9,170.3,170.7；
向PEG3叠氮化物连接子25于无水CH2Cl2(60mg于2mL中)中的搅拌溶液中逐滴添加HBr(33％于AcOH中，1M，0.04mL)。在10min之后，将烧瓶安置于冰上，然后缓慢添加NaHCO3，并且将溶液搅拌30min。在搅拌之后，将溶液过滤、用水和乙醚洗涤并且在真空中干燥，得到呈奶白固体状的溴甲苯衍生物26(20mg，33％)；HRMS(m/z)C26H42N8O7Br计算值657.2360(M+1)。实验值657.2357。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.63-7.50(m,2H),7.43-7.21(m,2H),4.60-4.47(m,2H),4.33-4.24(m,1H),4.06(s,2H),3.88-3.60(m,10H),3.52(s,2H),3.30-3.1(m,2H),2.20-2.07(m,1H),2.00-1.72(m,2H),1.72-1.54(m,2H),1.09-0.90(m,6H)；
将9-羟基玫瑰树碱(10mg，0.04mmol)和K2CO3(0.12g，0.08mmol)溶解于无水DMF(4mL)中，并且搅拌5min。添加呈于无水DMF中的溶液形式的溴化连接子26(30mg，0.04mmol)，并且将混合物在室温下搅拌17小时。在于真空中浓缩之后获得黑色固体，然后将其溶解于CHCl3:MeOH 9:1中、用水洗涤、干燥并且浓缩，得到呈深褐色固体状的烷基化玫瑰树碱衍生物27 24mg(76％)；MS(m/z)840[M]+；HRMS(m/z)C43H55N10O8计算值839.4204。实验值839.4202。IR 3272,2937,2107,1646,1526,1462,1415,1254,1103,807cm-1；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.38-8.10(m,1H),8.01(s,1H),7.99-7.81(m,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.68-7.48(m,2H),7.48-7.32(m,1H),7.30-6.98(m,1H),5.84(s,0H),4.54(dd,J＝1.5,8.9Hz,1H),4.31(q,J＝7.8Hz,1H),4.08(d,J＝9.3Hz,2H),3.92-3.46(m,9H),3.35(d,J＝17.3Hz,12H),3.17(d,J＝18.8Hz,3H),3.02(s,3H),2.89(s,3H),2.70(d,J＝7.6Hz,2H),1.90(s,1H),1.78(s,1H),1.60(s,2H),1.06-0.86(m,6H)；
在‘点击’条件下使用Cu(II)SO4和抗坏血酸使叠氮化物玫瑰树碱衍生物28经历与己炔酸的1,3环加成，得到具有羧酸的衍生物28。在无水DMF中用TSTU和DIPEA活化衍生物28的此末端羧酸将得到活化琥珀酰亚胺酯衍生物29。
实例13-制备玫瑰树碱-N-PAB-Cit-Val-dPEG3-NHS酯(33)
实例14-制备N-玫瑰树碱戊胺(36)
将叠氮化钠(0.6g，9.6mmol)溶解于DMF(20mL)中，并且添加1,5-二溴戊烷(1.2mL，8.7mmol)。将混合物在防爆屏就位下加热到50℃过夜。将溶液冷却到0℃，并且添加水(20mL)。然后将混合物用EtOAc(3×20mL)萃取、用水(20mL)和盐水(20mL)洗涤、经Na2SO4干燥并且浓缩以形成油，将其通过用正己烷柱色谱而纯化，得到呈透明油状的34(1.5g，90％)。叠氮化物染色试剂用以追踪叠氮化物，并且碘显像用以对起始二溴戊烷(离开柱的第一种化合物)染色。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.44(t,J＝6.7Hz,2H),3.32(t,J＝6.7Hz,2H),1.92(p,J＝7.0Hz,2H),1.69-1.61(m,2H),1.61-1.51(m,2H)。
添加玫瑰树碱(50mg，0.2mmol)到DMF(10mL)中的1-叠氮基-5-溴戊烷34(80mg，0.4mmol)中，并且将其加热到120℃维持4小时，随后在室温下搅拌三天。将橙色悬浮液用乙醚(10mL)处理并且过滤，得到呈黄色固体状的季铵化玫瑰树碱衍生物35 64mg(90％)。m.p.分解而不熔融>150℃IR 3065,2088,1598,1578,1463,1420,1401,1154,744,716,606cm-1；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.16(s,1H),10.09(s,1H),8.62-8.52(m,1H),8.44(dd,J＝11.7,7.6Hz,2H),7.71-7.57(m,2H),7.37(s,1H),4.72(t,J＝7.5Hz,2H),3.37(m,4H),3.30(s,3H),2.84(s,3H),1.62(p,J＝7.0Hz,2H),1.51-1.28(m,2H)；1C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ206.5,146.5,144.3,142.6,13.3,12.5,10.8,128.7,125.6,124.4,122.1,120.8,120.2,111.6,110.45,59.2,50.4,30.4,27.7,22.9,15.1,12.1；MS(ES+)m/z 358[M]+；HRMS(m/z)质量C22H24N5计算值358.2032。实验值358.2036。
将玫瑰树碱叠氮化物35(10mg，0.036mmol)溶解于甲醇(2mL)中。添加Pd/C，并且将氢气球连接到搅拌溶液。在6.5小时之后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且在真空中浓缩，得到呈亮橙色晶体状的玫瑰树碱胺36(7.0mg，58％)。重要地，吡啶环的还原可以在保持在氢气下过夜时进行，因此需要通过TLC(MeCN:H2O:KNO3 8:1:1)小心监测。m.p.分解而不熔融>150℃IR 2934,1598,1578,1419,1244,1176,747,628cm-1；1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.86(d,J＝1.1Hz,1H),8.38-8.27(m,3H),7.64-7.54(m,2H),7.36(ddd,J＝8.0,6.5,1.7Hz,1H),4.81-4.71(m,2H),3.25(s,3H),3.00-2.92(m,2H),2.78(s,3H),2.18(ddd,J＝12.2,10.2,6.8Hz,2H),1.83-1.72(m,2H),1.59(m,2H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ146.5,144.3,142.6,133.3,132.5,130.8,128.7,125.9,124.4,122.1,120.8,120.5,120.1,111.6,110.4,59.2,48.5,40.1,39.9,39.7,39.4,39.2,39.0,38.8,30.3,26.9,22.6,15.2,15.1,12.0；MS(m/z)332[M]+；HRMS(m/z)C22H26N3计算值322.2127。实验值332.2123。
将PEG3叠氮化物连接子25(20mg，0.03mmol)和碳酸双硝基苯酯(30mg，0.10mmol)溶解于DMF(2mL)中。添加DIPEA(0.1mL，0.07mmol)，并且将溶液加热到50℃维持3小时。在真空中去除DMF，添加水，并且将产物用CH2Cl2:MeOH 9:1萃取，随后干燥并且浓缩，得到呈深黄色油状的活化对硝基苯基衍生物30 20mg(74％)。IR 1652,1590,1516,1498,134,1288,1216,1109,850,753,629cm-1；1H NMR(400MHz,MeOD)8.30-8.39(m,2H),7.61-7.71(m,2H),7.40-7.53(m,4H),5.28(s,2H),4.50-4.61(m,1H),4.33(d,J＝7.1Hz,1H),4.09(s,2H),3.64-3.79(m,10H),3.22-3.14(m,1H),2.16(h,J＝6.9Hz,1H),1.79-1.92(m,2H),8.6Hz,2H),1.60(m,6H)；MS(ES+)782[M+Na]；13C NMR(100MHz,MeOD)δ172.0,171.3,171.0,163.8,163.8,161.1,155.8,152.6,145.3,140.4,130.6,129.2,125.7,121.9,119.8,115.1,70.8,70.3,70.2,70.1,69.7,50.4,48.3,48.1,47.8,47.6,47.4,47.2,47.1,30.9,18.4,17.4；HRMS(m/z)C33H45N9O12计算值782.3170[M+Na]+。实验值782.3173。
将玫瑰树碱胺36(11mg，0.03mmol)和活化连接子30(24mg，0.03mmol)溶解于无水DMF中。添加DIPEA(6μL，经由Gilson移液管添加，0.035mmol)，并且将反应混合物在室温下在暗处搅拌24小时。使产物通过添加乙醚而沉淀并且离心。去除上清液，并且将所得固体用乙醚洗涤并且干燥，得到呈黄色固体状的玫瑰树碱连接子衍生物31 10mg(36％)。MS(ES+)m/z 952[M]+；HRMS C49H66N11计算值952.5045。实验值952.4993。
在‘点击’条件下使用Cu(II)SO4和抗坏血酸使叠氮化物玫瑰树碱衍生物31经历与己炔酸的1,3环加成，得到衍生物32。在无水DMF中用TSTU和DIPEA活化衍生物32的末端羧酸将得到琥珀酰亚胺酯衍生物33。
实例15-制备6-马来酰亚氨基己酰基-MMAE(37)
向MMAE(0.05g，0.0694mmol)于新鲜蒸馏的无水DCM(2ml)中的悬浮液中添加6-马来酰亚氨基己酸(0.0221g，0.104mmol)，随后添加氰基膦酸二乙酯(21μl，0.139mmol)和DIPEA(37μl，0.208mmol)。在添加DIPEA时，反应混合物变得澄清，并且将其在氮气下在室温下搅拌12h，TLC[硅胶：5％MeOH/DCM，Rf 0.31]。将反应混合物用DCM(30ml)稀释，并且用10％柠檬酸(2×20ml)、水(20ml)、盐水(20ml)洗涤，并且浓缩到干燥。将粗物质通过急骤柱色谱[硅胶：5％MeOH/DCM]纯化，得到呈白色固体状的6-马来酰亚氨基己酰基-MMAE 37，0.023g(36％)。MS(m/z)实验值911.58(M+1)，关于C49H79N6O10计算
实例16-制备6-马来酰亚氨基己酰基-Val-Cit-PAB-MMAE(40)
在氮气下向val-cit-PAB 24(0.11g，0.29mmol)于无水N-甲基吡咯烷酮NMP(5ml)中的搅拌溶液中添加6-马来酰亚氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(0.0983g，0.318mmol)，并且将所得浅褐色溶液在室温下搅拌16h。在<40℃下通过高真空去除NMP。将所得稠油状残余物用无水乙醚(20ml)湿磨，将固体通过过滤收集并且用无水乙醚洗涤数次并且风干，得到灰白色粉末状的所要产物38，0.16g(98％)。TLC[硅胶：10％MeOH/DCMRf 0.21。MS(m/z)572.653(M+1)，关于C28H41N6O7计算
在氮气下向6-马来酰亚氨基己酰基-val-cit-PAB 38于无水DMF中的搅拌溶液中相继添加碳酸双(对硝基苯酯)和DIPEA，导致颜色从无色变为亮黄色。将溶液在氮气下在室温下搅拌1h，之后通过高真空去除DMF，得到油状残余物。将其用乙酸乙酯湿磨15min得到沉淀，通过添加乙醚使其完成。将固体收集并且用乙醚充分洗涤并且风干，得到灰白色固体。TLC[硅胶：10％MeOH/DCM Rf 0.46]。将其通过色谱[硅胶：5-10％MeOH/DCM梯度洗脱]纯化，得到呈白色固体状的活化连接子39，0.006g(46％)。MS(m/z)738..3091(M+H)，HRMS(m/z)C35H43N7O11Na M+Na计算值760.2918实验值760.2922
将活化连接子39(50mg，0.068mmol)、MMAE(32.6mg，0.045mmol)和N-羟基苯并三唑(1.4mg，0.0091mmol)于无水DMF(1ml)中搅拌2min，之后添加一滴吡啶，并且将反应物搅拌24h。然后通过高真空去除溶剂，并且将残余物通过逆相制备型HPLC纯化，在冻干之后得到呈白色粉末状的所要产物40；MS(m/z)1316.7(M+H)。
实例17-制备太平洋紫杉醇-dPEG6-NHS酯(44)
将太平洋紫杉醇(100mg，0.12mmol)和戊二酸酐(17mg，0.14mmol)溶解于无水DCM(10ml)中并且搅拌10min，随后添加无水吡啶(100μl，0.0013mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3天并且在真空下蒸发。使所获得的残余物由DCM再结晶，得到呈白色固体状的太平洋紫杉醇酸41，60.7mg(52.3％)。(Rf 0.26，3％MeOH/DCM)。1H NMR(CDCl3):δ8.16(2H,d,J＝4Hz,23-H,27-H),7.78(2H,d,J＝4Hz,39-H,43-H),7.66-7.36(11H,CH,Ar),6.28(2H,m,10-H,13-H),6.01(1H,q,J＝4Hz,3'-H),5.71(1H,d,J＝7.2Hz,2-H),5.52(1H,d,J＝3.2Hz,2'-H),5.00(1H,d,J＝8Hz,5-H),4.47(1H,q,J＝6.4Hz,7-H),4.29(2H,d,J＝8.4Hz,20-H),3.83(1H,d,J＝6.8Hz,3-H),2.53-2.16(15H,m,7-OH,6-H,14-H,g2-H,g4-H,29-H,31-H),2.06-1.70(7H,m,1-OH,g3-H,6-H,18-H,19-H),1.28-1.16(6H,m,16-H,17-H)。MS(m/z):968.36[M+],985.39[M++NH4],990.35[M++Na]。(理论：C52H57NO17 968.01)。
向太平洋紫杉醇酸41(26mg，0.027mmol)和SDPP(20mg，0.058mmol)于无水乙腈(5ml)中的搅拌溶液中添加TEA(20μl，0.143mmol)。将反应混合物在氮气下在室温下搅拌过夜，随后蒸发和通过硅胶色谱(MeOH/DCM＝3:97)纯化，得到呈白色固体状的太平洋紫杉醇NHS酯42，38mg(76％)。(Rf 0.48)。1H NMR(CDCl3):δ8.15(2H,d,J＝7.6Hz,23-H,27-H),7.72(2H,d,J＝7.6Hz,39-H,43-H),7.64-7.37(11H,CH,Ar),6.28(2H,m,10-H,13-H),6.01(1H,q,J＝4Hz,3'-H),5.71(1H,d,J＝7.2Hz,2-H),5.52(1H,d,J＝3.2Hz,2'-H),5.00(1H,d,J＝8Hz,5-H),4.47(1H,q,J＝6.4Hz,7-H),4.29(2H,d,J＝8.4Hz,20-H),3.83(1H,d,J＝6.8Hz,3-H),2.99-2.36(15H,m,7-OH,6-H,14-H,g2-H,g4-H,29-H,31-H),2.29-1.82(15H,m,1-OH,g3-H,6-H,18-H,19-H,n3-H,n4-H),1.28-1.16(6H,m,16-H,17-H)。MS(m/z):1065.38[M+],1087.36[M++Na]。(理论：C56H60N2O19 1065.08)。
向太平洋紫杉醇NHS酯42(32mg，0.03mmol)于无水DCM(5mL)中的溶液中添加H2N-PEG6-COOH(10.6mg，0.03mmol)和TEA(5μl，0.03mmol)。将反应混合物在氮气下搅拌过夜，随后用HCl(2×10mL，0.1M)和盐水(2×10mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥、过滤并且浓缩，得到呈透明油状的43，25mg(64％)。[硅胶：5％MeOH/DCM Rf 0.16]。1H NMR(CDCl3):δ8.16(2H,d,J＝7.6Hz,23-H,27-H),7.86(2H,d,J＝7.6Hz,39-H,43-H),7.65-7.30(11H,CH,Ar),6.28(2H,m,10-H,13-H),6.01(1H,q,J＝4Hz,3'-H),5.71(1H,d,J＝7.2Hz,2-H),5.50(1H,d,J＝3.2Hz,2'-H),5.00(1H,d,J＝8Hz,5-H),4.47(1H,q,J＝6.4Hz,7-H),4.29(2H,d,J＝8.4Hz,20-H),3.83(1H,d,J＝6.8Hz,3-H),3.73-3.47(24H,m,-CO-NH-(CH2-CH2-O)6-CH2-),2.62-1.87(24H,m,7-OH,6-H,14-H,18-H,g2-H,g4-H,29-H,31-H,1-OH,g3-H,6-H,19-H),1.28-1.16(6H,m,16-H,17-H)。MS(m/z):1303.56[M+],1325.56[M++Na],1341.55[M++K]。(理论：C67H86N2O23 1303.40)。
向太平洋紫杉醇-PEG6-酸43(22mg，0.017mmol)于无水DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加TSTU(11mg，0.034mmol)和DIPEA(15μl，0.085mmol)。将反应混合物在氮气下在室温下搅拌2h，随后浓缩，得到呈黄色油状的粗产物。将其通过急骤色谱[硅胶，3-5％MeOH/DCM]纯化，得到NHS酯44 15.2mg(64％)。[硅胶3％MeOH/DCMRf 0.18]。1H NMR(CDCl3):δ8.16(2H,d,J＝7.6Hz,23-H,27-H),7.86(2H,d,J＝7.6Hz,39-H,43-H),7.65-7.30(11H,CH,Ar),6.28(2H,m,10-H,13-H),6.01(1H,q,J＝4Hz,3'-H),5.71(1H,d,J＝7.2Hz,2-H),5.50(1H,d,J＝3.2Hz,2'-H),5.00(1H,d,J＝8Hz,5-H),4.47(1H,q,J＝6.4Hz,7-H),4.29(2H,d,J＝8.4Hz,20-H),3.83(1H,d,J＝6.8Hz,3-H),3.73-3.47(24H,m,-CO-NH-(CH2-CH2-O)6-CH2-),2.62-1.87(28H,m,7-OH,6-H,14-H,18-H,g2-H,g4-H,29-H,31-H,1-OH,g3-H,6-H,19-H,n3-H,n4-H),1.28-1.16(6H,m,16-H,17-H)。MS(m/z):1400.60[M+],1417.62[M++NH4],1422.58[M++Na],1338.60[M++K]。(理论：C71H89N3O26 1400.47)。
实例18-制备太平洋紫杉醇-PAB-Val-Cit-dPEG7NHS酯(47)
向太平洋紫杉醇(100mg，0.117mmol)和Fmoc-Val-Cit-PAB(74.8mg，0.00976mmol)于无水DCM(10ml)中的搅拌混合物中添加DMAP(14.3mg，0.117mmol)，并且在氮气下在室温下搅拌48h。蒸发溶剂以得到浅黄色结晶固体，将其通过急骤柱色谱[硅胶：3-5％MeOH/氯仿]纯化，得到所要化合物45。
向45于无水THF中的搅拌溶液中添加DBU并且搅拌10min，之后去除溶剂，得到脱除保护基的衍生物46，其未经进一步纯化即使用。
在氮气下经20-30min.逐滴添加46于无水DCM中的溶液到双-dPEG7NHS酯于无水DCM中的搅拌溶液中，之后将其搅拌2h、通过添加水淬灭、用DCM反萃取，并且将经合并的有机萃取物干燥和蒸发，得到粗物质47。
实例19-制备阿霉素-dPEG12-马来酰亚胺(48)
向Dox.HCl(10mg，0.017mmol)于无水DMF(2ml)中的搅拌悬浮液中添加DIPEA(7.7μl)，并且将反应混合物在氮气下搅拌10min，得到澄清红色溶液。向其中添加溶解于无水DMF(1ml)中的马来酰亚胺-dPEG12NHS酯(16.4mg，0.019mmol)，并且将反应物在氮气下在室温下搅拌并且保护其不受光照过夜。通过高真空去除DMF，并且将深红色油通过急骤色谱[硅胶：10％MeOH/DCM Rf 0.5]纯化，得到呈红色粘性油状的所要产物48 17.8mg(80％)；HRMS(m/z)C61H87N3O27Na[M+Na]计算值1316.5424实验值：1316.5601
实例20-制备西马多丁-SH(53)
实例21-制备西马多丁-OH(54)
实例22-制备西马多丁-O-PAB-Cit-Val-PEG3-NHS酯(57)
实例23-制备断CBI-β-葡糖苷酸-NHS酯(65)
实例24-制备6-马来酰亚氨基己酰基-SGD-1910(67)
实例25-制备美登醇DM4Mal-PEG4-NHS酯(68)
实例26-用于合成共轭物的流程
实例27-携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链Fv抗体片段的表达和纯化
构筑抗HER2细胞质表达scFv克隆株，TCT
将已知具有多个充分间隔的表面赖氨酸残基的scFv C6.5的开放阅读框(ORF)[Adams GP等人《癌症研究》,2001,61:4750-55]克隆到携有硫氧还蛋白的ORF作为融合标签以能够实现蛋白质的细胞质表达的表达载体pET32Xa/LIC(Novagen)中。为了促进融合标签在低成本下的裂解以及有效检测和监测所得scFv，将以下特征工程化到载体中：
a)TEV蛋白酶裂解位点，在因子Xa裂解位点的下游
b)TEV蛋白酶裂解位点与C6.5ORF之间的连接子区域。如果没有其，那么TEV蛋白酶不能裂解，很可能是由于scFv C6.5的结构空间上阻碍了接近其裂解位点的事实。
c)在C6.5的C末端处的T7标签序列。此标签因为其不具有赖氨酸残基而被选中。
所得蛋白质被称为scFv(TCT)(Tev裂解位点，C6.5，T7标签)。DNA序列可以见下：
钥匙：
粗体＝在TEV裂解之后留下的残余Ser
加下划线的＝连接子区域(GSGGSG)
无格式的＝C6序列
粗体斜体＝T7标签序列
裂解TCT的DNA序列
GGTAGCGGAGGTAGCGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATTGCAGTAGTTCCAACTGCGCAGCGTGGCCTGAATACTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTCACACCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA[SEQ IDNO:1]
裂解TCT的氨基酸序列
GSGGSGQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDVGYCSSSNCAAWPEYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYGHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTVL[SEQ ID NO:2]
氨基酸数目：272
分子量：28,160Da
理论PI：7.54
消光系数：65 235
抗HER2细胞质表达scFv克隆株，scFv(TCT)的15L生物反应器中的细菌表达
在 T7胜任大肠杆菌(NEB)中制备TCT。首先将四到五个单一集落的在选择性琼脂板上生长过夜的转化细胞接种于5ml选择性2TY培养基+1％葡萄糖中。将据观察生长得更快的1μl培养物转移到2YT+1％葡萄糖的新鲜选择性5ml培养物，并且使其在30℃下生长约10小时。采取这些步骤以确保细胞生长确实进入迟滞期太久，并且因此确保生长细胞内的质粒稳定性。
次日，将选择性O.5L+1％葡萄糖预先培养物用两个5ml培养物之一接种。所用的培养基，增压的极品肉汤(Supercharged Terrific Broth)[12g/l胰蛋白胨，24g/l酵母提取物，9g/l Na2HPO4，2.2g/l KH2PO4，2.6g/l NH4Cl，0.7g/l Na2SO4 1g/l NaCl，5g/l甘油]。将pH调节到7.4，高压釜处理，并且添加2mM MgSO4
在3.5hr之后，将预先培养物(OD600 0.8-1.2)转移到含有14.5L选择性(羧苄青霉素(carbenicillin)100μg/L)增压的极品肉汤+0.5％葡萄糖和0.05ml/L防沫剂PPG 2025的15L发酵器(Applikon P1000)中。将搅拌器叶片速度调节到200-500RPM之间以确保氧气充分溶解于培养基中。典型地，最初是200RPM并且诱导后是400-500。取决于培养物的倍增时间(典型培养物倍增时间(Td)是35-55分钟)，初始温度是37℃或30℃。
当培养物OD600约1.0时，将培养物温度控制调节到26℃并且保持约30分钟以稳定化。典型地在用15ml 50mM IPTG接种之后3.5-5小时执行诱导。最终IPTG培养物浓度50μM。非常重要的是，将细胞在用低浓度IPTG诱导之前充分调节到26℃，否则的话所产生的可溶蛋白质的量显著减少。发酵器与自动防沫剂施配器耦接，当泡沫积聚时触发所述施配器。
使培养物生长约16小时并且在5KRPM下使用贝克曼(Beckman)JLA8.1000收集15'。最终OD600＝35.7。
3)蛋白质纯化
将细胞再悬浮于裂解缓冲液(40mM Tris-HCl pH 8，750mM NaCl，2mM咪唑)中并且在液氮中冷冻。在裂解当天，将冷冻细胞彻底解冻，并且将裂解缓冲液调节到具有2M脲的最终浓度。脲和高浓度NaCl用以确保更好的IMAC纯化。用1D NMR探测经2M脲处理的scFv以确保scFv(TCT)的结构不受影响。
添加不含EDTA的完全片剂(罗氏诊断(Roche Diagnostics)，1/100ml裂解溶液)和Benzonase(Novagen>99纯度，5μl/100ml裂解溶液)。用耦接到冷却器的恒定细胞破碎系统(Constant Cell Disruption Systems)(型号TS5)执行裂解，保持细胞破碎腔室在4℃下。在27kpsi的压力下实现细胞破碎三次。裂解物的总体积量达2L。
将裂解物最初使用艾本德(Eppendorf)离心机5810R在4000rpm下旋转40分钟以去除大量细胞碎片，并且然后使用Sorvall RC6+、转子F21-8x50在17 000rpm下旋转两次40分钟。然后在真空下通过0.22μm PES滤纸(康宁(Corning))过滤澄清上清液。
然后在重力流下在柱中使用来自赛默科技(Thermo scientific)的HisPur Ni-NTA树脂执行IMAC。用含有2M脲的裂解缓冲液使柱平衡。使澄清上清液通过柱两次，随后用裂解缓冲液进行10床体积洗涤。然后将树脂用10床体积的洗涤缓冲液1(40mM Tris-HCl pH8，750mM NaCl，2M脲，10mM咪唑)、并且然后用洗涤缓冲液2(40mM Tris-HCl pH 8，750mMNaCl，2M脲，30mM咪唑)进一步洗涤，直到在OD 280nm下不存在显著吸光度。
然后将蛋白质洗脱(40mM Tris-HCl pH 8，750mM NaCl，250mM咪唑)，直到在OD280nm下不存在读数。然后将洗脱物于TEV裂解缓冲液(50mM tris-HCl pH 8，150mM NaCl)中广泛透析。然后将蛋白质溶液调节到约2mg/ml的浓度，并且添加还原谷胱甘肽到3mM的最终浓度。以0.15mg/100mg融合scFv(TCT)(fTCT)添加与聚组氨酸标签融合的内部制备TEV蛋白酶，并且使裂解在转动孵育箱上在4℃下进行14-18小时。
使裂解的蛋白质溶液通过Ni-NTA树脂3次。裂解的scFv(TCT)流动通过，而硫氧还蛋白融合标签、TEV蛋白酶和其它蛋白质保持结合到树脂。纯化的概述SDS-PAGE展示于图2中
将TCT scFv透析到储存缓冲液(20mM乙酸钠pH 5，150mM NaCl)中，并且然后执行SEC以去除高分子量污染物和scFv(TCT)可溶凝集物(图3)。选择此缓冲液而非不含有氨基的其它缓冲液，因为scFv(TCT)据展示在经历多个冻融循环之后在其中是稳定的。
实例28-单链Fv抗体片段为了携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的蛋白质工程化、表达和纯化
不具有充足充分间隔的赖氨酸残基并且证实不良共轭特性(典型DAR<5)的抗体片段可以通过定向诱变修饰以携有类似于scFv(TCT)的构形。使用来自文献[Alzari PM等人《免疫学年评(Annual Rev.Immunol.)》1988.6:555-80；Davies DR与Metzger H.《免疫学年评》.1983.1:87-117；Mariuzza RA等人《生物物理学与生物物理化学年评(Annual ReviewBiophys.&Biophysical Chem)》,1987,16:139-59]的通用并且可接受的抗体和蛋白质结构概念，结合3维分子建模软件(例如PyMOL，http://www.pymol.orgSchrodinger KK,日本(Japan))和比对工具(例如Clustal)，可以鉴别蛋白质一级序列内的可以突变为赖氨酸残基的位置，其中赖氨酸残基已知在所述位置处充分耐受(使用例如IMGT或Kabat的数据库)或已知(来自分辨的3D结构)或预计(使用例如Phyre的软件)在蛋白质表面处(图1)。免疫球蛋白折叠的非常保守的结构可以应用于抗体和抗体样结构域。具有新引入、去除或置换的赖氨酸残基的经修饰的抗体片段可以如实例27中所描述来表达和纯化，并且在将修饰接受为成功之前测试其热稳定性和化学稳定性以及结合功能。
实例29-玫瑰树碱衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链Fv抗体片段上的生物共轭
玫瑰树碱
使玫瑰树碱-C6-NHS(化合物21)在PBS中在pH 8.0下在6％MeCN中以变化量的DMSO(14％或6％)和两组不同过量药物当量共轭到scFv-TCT。对于反应1以5当量份并且对于反应2和3以2.7当量份添加NHS。更详细地说，将玫瑰树碱-NHS溶解于无水DMSO中，得到澄清黄色/橙色50mM储备溶液。将含于PBS pH 8.0中、储存在4℃下的scFv(TCT)储备溶液于经6％MeCN和14％或6％DMSO预平衡的脱气PBS pH 8.0中稀释。在于室温下在涡流上混合的同时每隔75min以5或2.7当量份添加NHS。完成添加后4hr，通过离心(2.5min，11k rpm)回收样品。将上清液回收并且通过经与每种样品的反应混合物相同的缓冲液预平衡的zeba柱(Pierce)纯化。然后将样品在4℃下在6％MeCN/PBS pH 7.3中透析到4000x过夜，然后到8000x。将样品回收，并且通过SDS-PAGE(图4)、UV/Vis光谱法(图5)和密度测定法分析。
在获得某一DAR后，共轭物变得不可溶并且从溶液中沉淀出。作为一个实例，经由zeba柱对在离心之后含有少量蛋白质/共轭物并且在纯化后甚至更少的以上样品1进行尝试，表明残余可溶共轭物疏水性很大并且粘附于柱。此反应的集结粒样品中存在大量蛋白质/共轭物，如主要在荧光凝胶中所见，即可溶共轭物的回收率低。这还得到了UV/Vis数据的支持。具有16当量药物的样品2和3的沉淀与具有32当量的反应1相比远没那么显著。根据考马斯和荧光检测两者，集结粒样品密集度更小并且可溶材料更突出。有迹象表明样品2在凝胶上迁移得没有样品3远，支持如下基本原理：DMSO的量增加可以导致药物的溶解度增加，由此增加反应的效率和产生更高DAR。总的来说，反应2的NHS当量小于1，产生更低DAR，其呈现得更可溶，但同时具有与3相同的当量数，由此支持了有机溶剂论点。
使用其在缓冲液中的UV/vis吸收光谱(图5)和玫瑰树碱酸的实验上获得的消光系数计算这些反应的DAR。使用荧光凝胶的密度测定法数据校正以分光光度法获得的比率(共轭药物％相较于未反应的/非共价结合的药物％，表4)。尽管药物的溶解度不良，但在最好的反应条件下获得超过5的药物:抗体比率。总蛋白质回收率是可接受的。
scFv-玫瑰树碱共轭物的药物比抗体负载量的定量
编号 反应 最终DAR
1 32当量，14％DMSO 5.4
2 16当量，14％DMSO 5.1
3 16当量，6％DMSO 3.9
表4.scFv(TCT)-玫瑰树碱ADC的最终DAR.
PEG-玫瑰树碱
使ScFv-TCT共轭到具有短PEG链的另一玫瑰树碱-NHS衍生物以增加水溶性(化合物23)。平行执行共轭，玫瑰树碱-NHS作为对照，使用对于玫瑰树碱最好的条件以便获得DAR5，其是可溶相中获得的最大值。将反应如先前所描述，使用99％纯scFv设置。将含于PBS pH8.0中的ScFv于经DMSO(14％)和MeCN(6％)预平衡的PBSpH 8.0中稀释，，并且然后在室温下在涡流上轻轻地震荡而孵育5min。将粗NHS药物溶解于无水DMSO中成为50mM储备溶液，并且经15min以两份添加，并且再在室温下孵育2hr。将样品通过离心回收并且储存在4℃下，随后使用经14％DMSO/6％MeCN/PBS pH 7.3预平衡的zeba柱纯化。将集结粒再悬浮于缓冲液和凝胶负载缓冲液中，并且通过SDS-PAGE(考马斯和荧光，图6)和UV/Vis光谱法分析所有样品。2的集结粒无法再溶解。
比较玫瑰树碱与PEG-玫瑰树碱，显而易见的是，在相同反应条件下(1和2)，PEG衍生物产生更高的可溶共轭物/蛋白质(化合物73)回收率。在考马斯和荧光检测两者中，2的条带与1相比非常弱。比较三种反应条件，其中研究当量数以提高DAR，凝胶上存在偏移，表明可能4的DAR高于3和1。4Z的蛋白质回收率小于其它两者，再次表明，达到了最大负载量后，此时更高DAR共轭物从溶液中沉淀出。
使用UV/Vis结合密度测定法数据(以计算非共价结合％)，DAR值计算如下：(1)：4.1(2)：2.0(3)：5.1和(4)：4.3(表5)。这证实，与玫瑰树碱相比，PEG玫瑰树碱产生高两倍的蛋白质回收率和高了多达两倍的DAR。共轭物沉淀似乎得到了改进。
编号 反应 最终DAR
1 20当量，14％DMSO，6％MeCN 4.1
2 20当量，14％DMSO，6％MeCN 2.0
3 32当量，14％DMSO，6％MeCN 5.1
4 64当量，14％DMSO，6％MeCN 4.3
表5.scFv(TCT)-PEG-玫瑰树碱ADC(化合物73)的最终DAR
在相同条件下在全IgG上执行共轭到玫瑰树碱，作为与scFv(TCT)的比较。SDS-PAGE凝胶指示至少等效的共轭荧光(图7和8)，因此类似DAR。
溶酶体可释放的玫瑰树碱
使可裂解二肽玫瑰树碱-NHS药物(化合物29)共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。最初，在各种缓冲液条件中测定纯经分离的可裂解二肽玫瑰树碱-NHS的水解速率。产生合理水解速率的条件，即不会太快而使得NHS在其与赖氨酸反应之前将水解为酸并且不会太慢而使得反应将花费太久来完成。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物于缓冲液中的浓度。后者是关键参数；药物于溶液中浓度更大，水解速率将降低更多。因此，浓度需要被控制以允许高效的水解速率。所鉴别和执行的条件是：
●缓冲液-具有20％DMSO和30％甘油的在pH 8.8下的具有NaCl的碳酸氢盐缓冲液；
●温度-25℃；
●混合条件-热混合器1000rpm；
●抗体在1mg/ml下，
●可裂解二肽玫瑰树碱-NHS-8当量添加份；和
●NHS-药物添加速率(每隔70-90分钟)。
典型地，将scFv(TCT)在热混合器上在4℃下解冻，然后使等分试样的温度缓慢升高到20℃。在使用之前使任何沉淀物下旋。
在无水经过滤的DMSO中制得可裂解二肽玫瑰树碱-NHS(化合物29)100mM储备溶液。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在艾本德微管中与经过滤的DMSO和甘油组合，并且使缓冲液在热混合器上在4℃下平衡，然后在于1000rpm下混合的同时使等分试样的温度升高到20℃。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后开始添加可裂解二肽玫瑰树碱-NHS。这通过以下方式来执行：每隔70min添加8当量NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在25℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr。然后通过离心(2.5min，11k rpm)收集样品。唯一可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中并且其非常低。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
通过SGS M-Scan执行质谱分析。对共轭物以及ScFv-TCT(对照)通过MALDI-MS分析，并且然后通过LC-MS进一步分析。所有样品都产生很好分辨的峰。
实例30-阿霉素衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链Fv抗体片段上的生物共轭
(a)阿霉素-NHS衍生物的一步共轭
使具有NHS反应性基团的阿霉素衍生物(化合物7、10、16)共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。最初，在各种缓冲液条件中测定纯经分离的阿霉素-NHS衍生物的水解速率。产生合理水解速率的条件，即不会太快而使得NHS在其与赖氨酸反应之前将水解为酸并且不会太慢而使得反应将花费太久来完成。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物于缓冲液中的浓度。后者是关键参数；药物于溶液中浓度更大，水解速率将降低更多。因此，浓度需要被控制以允许高效的水解速率。所鉴别和执行的条件是：
●缓冲液-具有20％DMSO、30％甘油和1％Tween的在pH 7.8下的具有NaCl的碳酸氢盐缓冲液；
●温度-25℃；
●混合条件-热混合器1000rpm；
●抗体在1mg/ml下；
●阿霉素-NHS衍生物-2当量添加份；和
●NHS-药物添加速率-每隔70-90分钟。
典型地，将scFv(TCT)在热混合器上在4℃下解冻，然后使抗体等分试样的温度缓慢升高到20℃。在使用之前使等分试样下旋以收集任何沉淀物。
在无水经过滤的DMSO中制得阿霉素-NHS衍生物100mM储备溶液。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在艾本德微管中与经过滤的DMSO和甘油组合，并且使缓冲液在热混合器上在4℃下平衡，然后在于1000rpm下混合的同时使等分试样的温度升高到20℃。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后开始添加阿霉素-NHS衍生物。
这通过以下方式来执行：每隔70min添加4当量NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在25℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr。然后通过离心(2.5min，11k rpm)收集样品。唯一可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中并且其非常低。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且然后通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
通过SGS M-Scan执行质谱分析。对共轭物以及ScFv-TCT(对照)通过MALDI-MS分析，并且然后通过LC-MS进一步分析。所有样品都产生很好分辨的峰。使用阿霉素药物与抗体的消光系数测定DAR
(b)阿霉素-马来酰亚胺衍生物的两步共轭
为了使阿霉素马来酰亚胺衍生物(化合物48、12)共轭到抗体上，将抗体的天然赖氨酸化学转化为首先受保护的硫醇，随后将其还原以获得游离硫醇。游离硫醇然后可以与阿霉素的马来酰亚胺衍生物反应以获得含有硫醚键的共轭物。
优化将硫醇引入到抗体上的第一步骤。这涉及使SPDP连接子共轭到抗体上以在连接基团与抗体之间形成酰胺键。赖氨酸优化的scFv促进了产生高SPDP取代共轭物以用于马来酰亚胺衍生药物的子序列共轭。
总的来说，SPDP即使在较低pH(7或8)下也共轭得很好。当以充足TCEP(115摩尔过量)还原时，其产生高达12的SH:scFv比率。执行SPDP共轭以引入各种比率的SPDP连接子/抗体。
将1mg/ml下的抗体，C6.5和HMFG1稀释到含有1mM EDTA、3％DMSO和6％MeCN的脱气PBS pH 8中。在无水DMSO中制备新鲜无色SPDP溶液，并且添加所需量到抗体溶液中。将样品在滚筒上在室温下孵育3hr并且在4℃下孵育过夜。当观察到最少沉淀时，通过离心收集样品。使用Zeba旋转柱(赛默科技)和缓冲液交换为具有1mM EDTA的脱气PBS pH 8，来去除过量/非共轭SPDP连接子。记录样品的UV/vis光谱。
为了还原连接子以释放抗体上的游离硫醇和同时吡啶-2-硫酮，如下执行。首先将TCEP溶解(新鲜)于水中以制得500mM储备溶液。将SPDP连接样品在37℃下用115当量TCEP孵育20min。将样品通过离心收集并且立即在冰上冷却。记录粗样品的UV/vis光谱，随后使用zeba脱盐柱在具有1mM EDTA作为洗脱剂的脱气PBS pH 7中使用3％DMSO/6％MeCN去除过量TCEP和吡啶-2-硫酮。
此时，测定SPDP共轭的效率。使用分光光度数据测定粗还原样品中所释放的吡啶-2-硫酮的量。吡啶-2-硫酮的λmax是343nm并且消光系数是8080M-1cm-1。280nm下的消光系数是5100M-1cm-1，用以校正280nm下的吸收。使用A343nm计算粗还原溶液中硫酮的浓度，并且使用此浓度校正280nm下的吸收以考虑硫酮吸收。计算抗体浓度，并且测定SPDP:Ab的比率。对预还原样品重复相同过程，并且从还原样品DAR减去此DAR以获得实际SPDP:Ab比率。
在纯化还原样品之后，获得以下共轭物(表6)，显示多达9个连接子可以共轭到scFv(TCT)：
表6.SPDP连接子共轭到赖氨酸优化的scFv和对照IgG的比率
在另一实例中，使用32当量SPDP并且随后用115当量TCEP还原样品，类似地执行以上程序。在此情况下，抗体回收率高得多(92％)。然后使经还原、纯化和定量的样品共轭到阿霉素。各自以2当量添加阿霉素马来酰亚胺和阿霉素-PEG-马来酰亚胺到抗体样品(于脱气PBS pH 7/1mM EDTA/3％DMSO/6％MeCN中)中。将样品在滚筒上在室温下孵育3hr，随后在4℃下孵育过夜。将样品通过离心回收并且通过SDS-PAGE凝胶(图9)和UV/Vis光谱法分析。
从粗样品使用UV/Vis光谱法和凝胶密度测定法计算Dox共轭物的DAR。根据光谱数据，使用488nm和280nm下的阿霉素ε和280nm下的抗体ε计算DAR(表7)。
表7.SPDP连接子共轭到赖氨酸优化的scFv和对照IgG、随后阿霉素衍生物共轭的比率
使用阿霉素药物(表7)和抗体的实验上测定的摩尔消光系数测定DAR，并且通过如上文所描述的质谱法证实。
高比率SPDP scFv共轭物的结合
如在实例30(b)中用16当量过量试剂使C6.5scFv共轭到SPDP，随后用115摩尔当量TCEP还原，以获得5.4的连接子与抗体比率(SPDP:scFv)。使用此样品以及未经修饰的对照和非SPDP修饰但还原的对照。
将九十六孔Immunosorb ELISA板用含于PBS中的10μg/ml HER2-Fc涂布，随后用测试样品抗myc IgG(西格玛)和抗小鼠过氧化酶共轭物(西格玛)涂布。大量PBS洗液在每一层中间，并且检测用BM-Blue底物进行。曲线图(图10)显示，Kd为25nM的未经修饰的抗体在还原后展示对HER2的亲和力的轻微降低，在42nM下，但当抗体首先与SPDP共轭以引入更多硫醇并且然后还原时，这得以恢复，Kd＝24.9nM。
实例31-P5和西马多丁衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链Fv抗体片段上的生物共轭
(A).ScFv(TCT)-西马多丁
使西马多丁-NHS(化合物2)共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物69)。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。最初，在各种缓冲液条件中测定纯经分离的西马多丁-NHS的水解速率。产生合理水解速率的条件，即不会太快而使得NHS在其与赖氨酸反应之前将水解为酸并且不会太慢而使得反应将花费太久来完成。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物于缓冲液中的浓度。后者是关键参数：药物于溶液中浓度更大，水解速率将降低更多。因此，浓度需要被控制以允许高效的水解速率。所鉴别和执行的条件是：
●缓冲液-具有20％DMSO的在pH 8.8下的具有NaCl的碳酸氢盐缓冲液；
●温度：20℃；
●混合条件-热混合器1000rpm；
●抗体在1mg/ml下；
●西马多丁/西马多丁-C5和P5C5，都与NHS(16当量添加份)；和
●NHS-药物添加速率(每隔70-90min)。
典型地，将scFv(TCT)在热混合器上在4℃下解冻，然后使等分试样的温度缓慢升高到20℃。在使用之前使等分试样下旋以收集任何沉淀物。
在无水经过滤的DMSO中制得西马多丁-NHS 100mM储备溶液。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在艾本德微管中与经过滤的DMSO组合，并且使缓冲液在热混合器上平衡(在于1000rpm下混合的同时，温度从4℃升高到20℃)。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后添加西马多丁-NHS。这通过以下方式来执行：每隔70min添加16当量NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在20℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr。然后通过离心(2.5min，11k rpm)收集样品。唯一可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中并且非常低。
将所有样品在HPLC-SEC上用10％IPA/PBS pH 7，20℃由粗物质纯化，并且通过SDS-PAGE(图11)、HPLC-SEC(图12)、氨基酸分析(表8A-8C)、质谱法(图13A-C、14A-C、15A-C、16A-C、17、18、19、20，表9和10)和结合ELISA(图21)分析。在此实例中，设置是：
反应1-scFv-TCT-西马多丁16当量；
反应2-scFv-TCT-西马多丁48当量；和
反应3-scFv-TCT-西马多丁112当量。
通过HPLC尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间是15.5-16min，与约30kDa的MW相关。三种共轭物都洗脱得稍微地并且逐渐地更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图12A-C)。
在剑桥大学(Cambridge University)的蛋白质与核酸化学工厂(Protein andNucleicAcid Chemistry Facility)通过氨基酸分析(AAA)准确地测定DAR。根据AAA(表7A-C)，可以得出蛋白质和药物两者的mol量(归因于4-氨基甲基苯甲酸的药物指纹释放)并且计算DAR(药物mol数/蛋白质mol数)。可以通过首先基于DAR计算共轭物分子量，并且然后随后将获自AAA的浓度转化为mg/ml蛋白质，来计算溶液中蛋白质的浓度。举例来说，在样品1中：scFv(TCT)是28162(MS)，DAR是3.9，并且每个西马多丁分子向抗体上增添667。因此，共轭物MW＝28162+(3.9×667)＝30763。浓度是9.02nmol/ml，其等于277μg/ml蛋白质。
表8A-C.展示三种共轭反应1-3的DAR 3.9、8.2和11的AAA结果的概述
通过SGS M-Scan执行质谱分析。将样品1-3以及ScFv-TCT(对照)通过MALDI-MS分析，并且然后通过LC-MS进一步分析。所有样品都产生很好分辨的峰，并且在下文对其求和。
电喷雾电离，质谱法(ESI-MS)
设备：使用与戴安(Dionex)Ultimate 3000MDLC系统(SOP MS900到MS905和HPLC012和HPLC019)耦接的沃特世(Waters)Xevo Q-TOF(四极-飞行时间(Q-TOF))质谱仪执行分析。
缓冲液交换：使用密理博(Millipore)Amicon Centrifugal过滤单元(10kDaMWCO)将样品缓冲液交换和浓缩到0.05％(v/v)甲酸中。
在线ESI-MS分析：如下使用在线HPLC/ES-MS分析来分析TCT-西马多丁样品的等分试样以提供涉及成分的完整质量的数据：
仪器：配备有戴安Ultimate 3000MDLC系统的沃特世Xevo Q-ToF(四极-飞行时间)G1质谱仪。柱：PLRP-S柱，温度：60℃，流速：0.2mL/min，UV检测：214nm和280nm，溶剂A：0.05％(v/v)甲酸，溶剂B：含有0.05％(v/v)甲酸的90％(aq)乙腈。
梯度：
使用Glu-血纤维蛋白肽B外部校准质谱仪，所述Glu-血纤维蛋白肽B还用作lockspray内部校准物。从m/z 200到4000扫描质谱仪。
TCT-西马多丁2样品的ESI-MS
使用在线HPLC/ES-MS分析来分析TCT-西马多丁2样品的等分试样以提供涉及成分的完整质量的数据。样品TCT-西马多丁2的总离子流(TIC)色谱图、光谱和转化数据在下文展示(图13A-C)。
在TCT-西马多丁2样品的TIC中观察到主峰，在35.9min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 32,164、32,831和33,498的主峰，其与scFv(TCT)分子的所提供理论质量以及6-8个西马多丁分子添加一致。这与DAR 8.21的AAA测定非常相关
样品1、3和TCT的ESI-MS
使用在线HPLC/ES-MS分析来分析样品TCT-西马多丁1、TCT-西马多丁3和scFv(TCT)对照的等分试样以提供涉及成分的完整质量的数据。样品的总离子流(TIC)色谱图、光谱和转化数据在下文展示(图14与15)。
在scFv(TCT)对照样品的TIC中观察到主峰，在33.2min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了单个在m/z 28162的主要组分，其与scFv(TCT)分子的理论质量一致(图16A-C)。
在TCT-西马多丁1的TIC中观察到主峰，在33.5min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 29495、30162和30829的主峰，其与scFv(TCT)分子的所提供理论质量以及2-4个西马多丁分子添加一致(图14A-C；表9)。
在TCT-西马多丁3样品的TIC中观察到主峰，在37.1min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 33496、34163和34830的主峰，其与scFv(TCT)分子的所提供理论质量以及8-10个西马多丁分子添加一致(图15A-C；表9)。
MALDI-质谱法
设备：使用以下设备执行分析：岛津科学仪器(Shimadzu ScientificInstruments)AXIMA Performance MALDI TOF-TOF质谱仪。
线性MALDI MS分析：肌红蛋白的样品用以按正和负离子高质量线性模式外部校准仪器。将TCT-西马多丁共轭物3、TCT-西马多丁共轭物1、TCT-西马多丁共轭物2、TCT-对照的样品1:1(v/v)稀释于50％(aq.)乙腈中，并且以1μl等分试样点样到钢的384斑点非涂布MALDI板上。制得每种MALDI基质的一式多份斑点：去甲哈尔满(Norharmane)、2',4',6'-三羟基苯乙酮单水合物(THAP)、去甲哈尔满:THAP(4:1，v/v)和芥子酸基质溶液。还使用非稀释样品制得芥子酸的斑点。使每个斑点与相应MALDI基质的1μL等分试样覆叠，并且使其在轻缓空气流下共结晶和干燥。以于1:1(v/v)0.1％三氟乙酸水溶液(TFA):乙腈中的饱和溶液形式制备芥子酸。以于1:1(v/v)0.1％三氟乙酸水溶液(TFA):乙腈中的10mg/mL溶液形式制备去甲哈尔满。
以于1:1(v/v)0.1％三氟乙酸水溶液(TFA):乙腈中的饱和溶液形式制备2',4',6'-三羟基苯乙酮单水合物(THAP)。以负离子高质量线性模式分析含有去甲哈尔满、2',4',6'-三羟基苯乙酮单水合物(THAP)和去甲哈尔满:THAP(4:1，v/v)的斑点；并且以正离子高质量线性模式分析含有芥子酸的斑点。收集适当质量范围内的质谱，并且改变激光功率以实现最优结果。
芥子酸中的scFv(TCT)(对照样品)的MALDI-MS
MALDI-MS数据获自非稀释scFv(TCT)的正离子线性模式分析。芥子酸基质中的对照展示于图17中。在m/z 28251观察到显著峰，其与scFv(TCT)的预期质量(28160Da)一致，在与仪器相关的误差内。
芥子酸中的TCT-西马多丁共轭物1的MALDI-MS
获自芥子酸基质中的TCT-西马多丁共轭物1的正离子线性模式分析的MALDI-MS数据展示于图18中。在m/z 29559、30223、30884和31531观察到分辨的峰，与分别携有约2、3、4和5个西马多丁分子的额外共轭质量(使用667Da的所提供增量质量)的所提供scFv(TCT)对照相当一致，表10。
芥子酸中的TCT-西马多丁共轭物2的MALDI-MS
获自芥子酸基质中的TCT-西马多丁共轭物2的正离子线性模式分析的MALDI-MS数据展示于图19中。在m/z 32293、32948和33588观察到分辨的峰，与分别携有约6、7和8个西马多丁分子的额外共轭质量(使用667Da的所提供增量质量)的所提供scFv(TCT)对照相当一致，表10。
芥子酸中的TCT-西马多丁共轭物3的MALDI-MS
获自芥子酸基质中的TCT-西马多丁共轭物3的正离子线性模式分析的MALDI-MS数据展示于图20中。在m/z 33809、34415和35057观察到分辨的峰，与分别携有约8、9和10个西马多丁分子的额外共轭质量(使用667Da的所提供增量质量)的所提供scFv(TCT)对照相当一致，表10。
表10.ScFv(TCT)-西马多丁ADC的MALDI分析的概述
scFv(TCT)-西马多丁共轭物的结合ELISA
如上文所描述制备和表征ScFv(TCT)-西马多丁ADC(化合物69)。通过ELISA测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力(图21)。使用C末端T7标签检测所有蛋白质，所述标签预期不化学修饰(无赖氨酸存在)。将96孔Immunosorb ELISA板用含于PBS中的10μg/ml HER2-Fc涂布，随后用测试样品抗T7过氧化酶共轭物涂布。大量PBS洗液在每一层中间，并且检测用BM-Blue底物进行。曲线图(图21)显示，负载3.9个药物(平均DAR)的ADC大体上保持其结合亲和力(Kd从2.5nM轻微降到3.3nM)，负载8.2个药物的ADC大体上保持其结合亲和力(Kd从2.5nM轻微降到15.5nM)。如果进一步推动共轭反应，共轭到除一个以外其余所有的表面赖氨酸残基(11/12)，那么scFv结合减少但未丧失(Kd＝27.5nM)。这显示，优化的scFv可以携有高载药量同时保持结合功能。
总体TCT-西马多丁结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了具有极高产率的低、中和高DAR共轭物的受控共轭反应。在任一共轭物中都未观察到抗体/共轭物的沉淀，因此回收率极高。在SECHPLC纯化之后，将所得共轭物浓缩到约500μg/ml，并且在缓冲液中稳定数周。在将其用于体外或体内测试之前，将这些共轭物缓冲液交换到PBS中并且无菌过滤。回收率再次极高。
通过还原SDS-PAGE、SEC-HPLC、AAA、MS和ELISA广泛地分析产物。
用于分析的技术一致并且支持如下论点：由TCT例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基负载有多个药物，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持结合亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。具有低DAR(样品1)的经纯化共轭物在凝胶上运行得更接近对照scFv(TCT)，并且多分散性比运行得略高并且多分散性更大的中DAR(样品2)更小，而对于高DAR(样品3)，在凝胶上存在明显迁移偏移，其中样品的尺寸明显大于对照未经修饰的TCT。这些观察结果进一步得到了HPLC的支持，其中样品归因于其增加的尺寸而比TCT滞留时间逐渐地更短、从SEC柱更快洗脱。氨基酸分析是用于进一步定量分析和补充MS数据的非常有用的工具。质谱法鉴别出同一样品内的高和低DAR两者，而AAA给出平均值。
对于样品1，DAR借助AAA是3.9，并且借助MS(ES和MALDI)是3.4和3
对于样品2，DAR借助AAA是8.2，并且借助MS(ES和MALDI)是7和7
对于样品3，DAR借助AAA是10.9，并且借助MS(ES和MALDI)是9.2和9
(B)ScFv(TCT)-P5C5
使用用于西马多丁-NHS的相同方法使ScFv-TCT共轭到P5C5-NHS(化合物6)。将HPLC纯化的P5C5-NHS溶解于经过滤的无水DMSO中以制得100mM储备溶液，并且下旋。当不使用时将其储存在-20℃下。在此实例中，设置是：
反应1-scFv-TCT-P5C5 30当量
反应2-scFv-TCT-P5C5 112当量
将抗体在4℃下解冻，并且在热混合器上将抗体的温度缓慢升高到20℃。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在1或5ml艾本德中与无水经过滤的DMSO组合，并且在热混合器上20℃，10min，1000rpm平衡，随后添加抗体，并且再平衡10min。通过添加溶液、倒置以混合和在热混合器上置换，对于反应2以16当量份并且对于反应1以10当量份添加P5C5-NHS。
每隔90min执行添加，在那之后使样品保持在热混合器上在4℃下在1000rpm下过夜。通过离心(2.5min，10k rpm)回收样品以获得澄清溶液。对于样品2观察到最少沉淀。
将样品在HPLC上通过SEC使用Tosoh TSKGel G2000、用10％IPA/PBS pH 7.3 20℃洗脱而由粗物质纯化(与先前相同的方法，负载约300μg/注射运行)，并且通过SDS-PAGE(图22)、HPLC-SEC(图23)和AAA(表11)分析。将样品收集、合并并且在vivaspin 20，10k MWCO(VS2002，10℃，4000rpm)上浓缩。使样品沉降1hr，随后将其转移到艾本德微管，用200μlPBS冲洗浓缩器。将样品使用Zeba柱缓冲液交换到PBS pH 7.3中，并且使用Nanodrop光谱仪再定量。读数是：
样品1A280＝1.46(3者的平均值)，650μg/ml
样品2A280＝1.32(3者的平均值)，590μg/ml
ADC(化合物71)以比未经修饰的抗体更快的滞留时间洗脱，指示更高分子量，但作为可溶单体共轭物，无可见凝集。
(C)scFv(TCT)-P5C5、scFv(TCT)-西马多丁-C5、曲妥珠单抗-P5C5和曲妥珠单抗-西马多丁-C5
根据与先前关于西马多丁(4)和P5C5(6)药物所描述相同的方法执行以下反应。简单地说，通过在20℃/1000rpm下孵育使抗体在缓冲液/DMSO中平衡，并且每隔90min以16当量份添加药物。将样品通过离心回收，并且通过SEC-HPLC(对于scFv(TCT)是G2000SWxl并且对于曲妥珠单抗是G3000SWxl)(10％IPA/PBS等度)纯化。然后将经纯化的洗脱份使用vivaspin 20旋转浓缩器5倍浓缩，并且使用zeba旋转柱(Pierce)缓冲液交换到PBS中。通过SDS-PAGE(图24)、HPLC-SEC(图25-27)和UV/Vis光谱法(图28与29)分析样品。
在合成这些共轭物之后，明显的是，三种基于P5的衍生物表现得非常类似于西马多丁-NHS衍生物(70)，产生非常可溶的、高度负载的单体共轭物(化合物71)。其尚未关于DAR定量，但当在SDS-PAGE上与先前样品(通过AAA和MS定量)相比和与scFv(TCT)对照相比时，明显的是，低、中和高DAR可以由scFv(TCT)和西马多丁、P5C5和西马多丁-C5形成。还使曲妥珠单抗IgG共轭到P5C5和西马多丁-C5，在凝胶上观察到偏移(尽管小于TCT)。这些观察结果得到了HPLC-SEC迹线的支持，其中样品对西马多丁、P5C5和西马多丁-C5的低、中和高DAR共轭物给出类似滞留时间。
(D)scFv(TCT)-P5C5ADC的结合亲和力
如以上实例中所描述制备和表征ScFv(TCT)-P5C5ADC。如前所述通过AAA测定DAR(表11A与B)，此时间在二-脯氨酸片段释放之后以鉴别和定量基于P5的药物。通过ELISA测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。使用C末端T7标签检测所有蛋白质，所述标签预期不化学修饰(无赖氨酸存在)。将96孔Immunosorb ELISA板用含于PBS中的10μg/ml HER2-Fc涂布，随后用测试样品抗T7过氧化酶共轭物涂布。大量PBS/tween-20和PBS洗液在每一层中间，并且检测用BM-Blue底物进行。曲线图(图30)显示，负载8个药物的ADC(scFv TCT-P5C5(1))大体上保持其结合亲和力(Kd从7nM轻微降到13nM)。如果全限度地推动共轭反应(scFv TCT-P5C5(2))，实际上共轭到所有表面赖氨酸残基(12)，那么scFv结合由于掩埋于结合位点中的关键赖氨酸残基变得药物修饰而显著丧失。通过AAA验证DAR(表11A和11B)。这显示，优化的scFv可以携有高载药量同时保持结合功能。
表11A&B.实例31D中所用的scFv(TCT)-P5C5(化合物71)借助AAA的DAR.
(E)scFv(TCT)-P5C5ADC与基于IgG的ADC相比的细胞杀伤效力
如上文(实例31B与31C)所描述制备和表征ScFv(TCT)-P5C5和曲妥珠单抗-P5C5ADC，其如前所述具有类似DAR。使SKBr3生长于DMEM中37℃，5％CO2下潮湿气氛中，SKBr3是人类乳癌细胞系、具有高HER2表达水平、多达1,000,000个受体/细胞[Lazar GA等人《美国国家科学院院刊》.2006,103:4005-10]。当汇合是70-80％时，将细胞用PBS(2×10ml)洗涤并且与胰蛋白酶一起孵育5-7min。添加完全培养基，并且将细胞通过移液而再悬浮。通过离心(2min，2000rpm)回收细胞，丢弃上清液，并且将细胞再悬浮于完全DMEM(5ml)中。然后将细胞使用血细胞计数器计数并且相应地稀释。将其使用连接因子以4500个细胞/孔(200μl)接种，并且在37℃，5％CO2下潮湿气氛中孵育过夜。U87是非HER2表达成胶质细胞瘤细胞系，并且使其以类似方式生长，以1000个细胞/孔接种。
使细胞在37℃，5％CO2下潮湿气氛中暴露于稀释于完全培养基中的各种ADC 96小时。根据制造商的说明书使用普洛麦格Aqueous Cell-titre-96TM aqueous单溶液细胞增殖试剂盒测量细胞活力。简单来说，去除培养基，并且添加100μl与MTS试剂预组合的不含酚红的完全培养基到细胞中(20μl试剂/100μl培养基)。在于暗处(5％CO2，37℃)孵育2hr之后，在490nm下在ELISA板读取器上对板读数。
通过使用未经处理的对照作为100％细胞存活和Triton X-100对照作为100％细胞死亡，将数据(吸收单位)转化为细胞存活％。从数据的所有其余部分减去后者的平均吸收值以便得到适合基线。对于每个n值，将平均值转化为存活率并且获得标准误差值(呈细胞存活％形式)。将数据绘制并且使用SigmaPlot 11.0使用方程式y＝y0+a/(1+(x/x0)b)(其中x0＝IC50并且x0>0并且a＝100)拟合为剂量反应S形逻辑3参数曲线。对于每种测试化合物重复实验至少3次，并且绘制和拟合一组数据或数据的平均值以获得剂量反应曲线。
数据(图31-33，表12)显示，scFv(TCT)-ADC以mid-nM效力对HER2表达细胞特异性地有细胞毒性。游离药物自身归因于不良细胞透性而具有低效力。更高DAR ADC更有力，直到丧失结合活性的点。
实例32-其它有效负载(喜树碱、太平洋紫杉醇、MMAE、美登素)衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链抗体片段上的生物共轭
喜树碱
使喜树碱-NHS酯(化合物19)的水溶性衍生物共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。最初，在各种缓冲液条件中测定纯经分离的喜树碱-NHS的水解速率。产生合理水解速率的条件，即不会太快而使得NHS在其与赖氨酸反应之前将水解为酸并且不会太慢而使得反应将花费太久来完成。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物于缓冲液中的浓度。后者是关键参数；药物于溶液中浓度更大，水解速率将降低更多。因此，浓度需要被控制以允许高效的水解速率。所鉴别和执行的条件是：
●缓冲液-具有20％DMSO和30％甘油的在pH 8.8下的具有NaCl的碳酸氢盐缓冲液；
●温度-25℃；
●混合条件-热混合器1000rpm；
●抗体在1mg/ml下；
●喜树碱-NHS-8当量添加份；和
●NHS-药物添加速率-每隔70-90分钟。
典型地，将scFv(TCT)在热混合器上在4℃下解冻，然后使抗体等分试样的温度缓慢升高到20℃。在使用之前使等分试样下旋以收集任何沉淀物。
在无水经过滤的DMSO中制得喜树碱-NHS(化合物19)100mM储备溶液。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在艾本德微管中与经过滤的DMSO和甘油组合，并且使缓冲液在热混合器上在4℃下平衡，并且然后在于1000rpm下混合的同时使温度升高到20℃。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后开始添加喜树碱-NHS。
这通过以下方式来执行：每隔70min添加8当量NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在25℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr。然后通过离心(2.5min，11k rpm)收集样品。唯一可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中并且非常低。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
通过SGS M-Scan执行质谱分析。对共轭物以及ScFv-TCT(对照)通过MALDI-MS分析，并且然后通过LC-MS进一步分析。所有样品都产生很好分辨的峰。
太平洋紫杉醇
使太平洋紫杉醇-NHS酯(化合物44)的水溶性衍生物共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。最初，在各种缓冲液条件中测定纯经分离的太平洋紫杉醇-NHS的水解速率。产生合理水解速率的条件，即不会太快而使得NHS在其与赖氨酸反应之前将水解为酸并且不会太慢而使得反应将花费太久来完成。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物于缓冲液中的浓度。后者是关键参数；药物于溶液中浓度更大，水解速率将降低更多。因此，浓度需要被控制以允许高效的水解速率。所鉴别和执行的条件是：
●缓冲液-具有20％DMSO和30％甘油的在pH 8.8下的具有NaCl的碳酸氢盐缓冲液；
●温度-25℃；
●混合条件-热混合器1000rpm；
●抗体在1mg/ml下；
●太平洋紫杉醇-NHS-8当量添加份；和
●NHS-药物添加速率-每隔70-90分钟。
典型地，将scFv(TCT)在热混合器上在4℃下解冻，然后使抗体等分试样的温度缓慢升高到20℃。在使用之前使等分试样下旋以收集任何沉淀物。
在无水经过滤的DMSO中制得太平洋紫杉醇-NHS 100mM储备溶液。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在艾本德微管中与经过滤的DMSO和甘油组合，并且使缓冲液在热混合器上在4℃下平衡，并且然后在于1000rpm下混合的同时使温度升高到20℃。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后开始添加太平洋紫杉醇-NHS。
这通过以下方式来执行：每隔70min添加8当量NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在25℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr。然后通过离心(2.5min，11k rpm)收集样品。唯一可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中并且非常低。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
通过SGS M-Scan执行质谱分析。对共轭物以及ScFv-TCT(对照)通过MALDI-MS分析，并且然后通过LC-MS进一步分析。所有样品都产生很好分辨的峰。
MMAE
使MMAE-NHS酯的水溶性衍生物共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。最初，在各种缓冲液条件中测定纯经分离的MMAE-NHS的水解速率。产生合理水解速率的条件，即不会太快而使得NHS在其与赖氨酸反应之前将水解为酸并且不会太慢而使得反应将花费太久来完成。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物于缓冲液中的浓度。后者是关键参数；药物于溶液中浓度更大，水解速率将降低更多。因此，浓度需要被控制以允许高效的水解速率。所鉴别和执行的条件是：
●缓冲液-具有20％DMSO和30％甘油的在pH 8.8下的具有NaCl的碳酸氢盐缓冲液；
●温度-25℃；
●混合条件-热混合器1000rpm；
●抗体在1mg/ml下；
●MMAE-NHS-8当量添加份；和
●NHS-药物添加速率-每隔70-90分钟。
典型地，将scFv(TCT)在热混合器上在4℃下解冻，然后使抗体等分试样的温度缓慢升高到20℃。在使用之前使等分试样下旋以收集任何沉淀物。
在无水经过滤的DMSO中制得MMAE-NHS 100mM储备溶液。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在艾本德微管中与经过滤的DMSO和甘油组合，并且使缓冲液在热混合器上在4℃下平衡，并且然后在于1000rpm下混合的同时使温度升高到20℃。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后开始添加MMAE-NHS。
这通过以下方式来执行：每隔70min添加8当量NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在25℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr。然后通过离心(2.5min，11k rpm)收集样品。唯一可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中并且其非常低。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
通过SGS M-Scan执行质谱分析。对共轭物以及ScFv-TCT(对照)通过MALDI-MS分析，并且然后通过LC-MS进一步分析。所有样品都产生很好分辨的峰。
美登素(DM4)
使美登素DM4-NHS酯(化合物68)的水溶性衍生物共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物74)。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。最初，在各种缓冲液条件中测定纯经分离的美登素DM4-NHS的水解速率。产生合理水解速率的条件，即不会太快而使得NHS在其与赖氨酸反应之前将水解为酸并且不会太慢而使得反应将花费太久来完成。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物于缓冲液中的浓度。后者是关键参数；药物于溶液中浓度更大，水解速率将降低更多。因此，浓度需要被控制以允许高效的水解速率。所鉴别和执行的条件是：
缓冲液(具有20％DMSO和30％甘油的在pH 8.8下的具有NaCl的碳酸氢盐缓冲液)，温度(25℃)，混合条件(热混合器1000rpm)，抗体在1mg/ml下，美登素DM4-NHS(8当量添加份)，NHS-药物添加速率(每隔70-90分钟)。
典型地，将scFv(TCT)在热混合器上在4℃下解冻，然后使抗体等分试样的温度缓慢升高到20℃。在使用之前下旋以收集任何沉淀物。
在无水经过滤的DMSO中制得美登素DM4-NHS 100mM储备溶液。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在艾本德微管中与经过滤的DMSO和甘油组合，并且使缓冲液在热混合器上在4℃下平衡，并且然后在于1000rpm下混合的同时使温度升高到20℃。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后开始添加美登素DM4-NHS。
这通过以下方式来执行：每隔70min添加8当量NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在25℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr。然后通过离心(2.5min，11k rpm)收集样品。唯一可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中并且其非常低。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
通过SGS M-Scan执行质谱分析。对共轭物以及ScFv-TCT(对照)通过MALDI-MS分析，并且然后通过LC-MS进一步分析。所有样品都产生很好分辨的峰。
美登素(DM1)，2步方法
使DM1药物共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物75)。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。用32当量SPDP处理scFv(TCT)并且随后用115当量TCEP还原样品，来执行程序。然后使经还原、纯化和定量的样品共轭到DM1。各自以2当量添加DM1到抗体样品(于脱气PBS pH 7/1mM EDTA/20％DMSO/10％丙二醇中)中。将样品在热混合器(25℃，1000rpm)上孵育，随后在4℃(1000rpm)下孵育过夜。通过离心回收样品并且通过SDS-PAGE凝胶和UV/Vis光谱法分析。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
吡咯并苯并二氮呯共轭，2步方法
使PBD衍生物，6-马来酰亚氨基己酰基-SGD-1910(化合物67)共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。用32当量SPDP处理scFv(TCT)并且随后用115当量TCEP还原样品，来执行程序。然后使经还原、纯化和定量的样品共轭到6-马来酰亚氨基己酰基-SGD-1910。各自以2当量添加6-马来酰亚氨基己酰基-SGD-1910到抗体样品(于脱气PBS pH 7/1mM EDTA/20％DMSO/20％丙二醇中)中。将样品在热混合器(25℃，1000rpm)上孵育3hr，随后在4℃(1000rpm)下孵育过夜。通过离心回收样品并且通过SDS-PAGE凝胶和UV/Vis光谱法分析。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
MMAE共轭，2步方法
使MMAE衍生物，6-马来酰亚氨基己酰基-MMAE(化合物37)共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。用32当量SPDP处理scFv(TCT)并且随后用115当量TCEP还原样品，来执行程序。然后使经还原、纯化和定量的样品共轭到6-马来酰亚氨基己酰基-MMAE。各自以2当量添加6-马来酰亚氨基己酰基-MMAE到抗体样品(于脱气PBS pH 7/1mM EDTA/20％DMSO中)中。将样品在热混合器(25℃，1000rpm)上孵育3hr，随后在4℃(1000rpm)下孵育过夜。通过离心回收样品并且通过SDS-PAGE凝胶和UV/Vis光谱法分析。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
多卡霉素共轭物
使断CBI-β-葡糖苷酸-NHS酯(化合物65)的水溶性衍生物共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物。控制反应以获得具有低、中和高DAR的产物。最初，在各种缓冲液条件中测定纯经分离的断CBI-β-葡糖苷酸-NHS酯的水解速率。产生合理水解速率的条件，即不会太快而使得NHS在其与赖氨酸反应之前将水解为酸并且不会太慢而使得反应将花费太久来完成。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物于缓冲液中的浓度。后者是关键参数；药物于溶液中浓度更大，水解速率将降低更多。因此，浓度需要被控制以允许高效的水解速率。所鉴别和执行的条件是：
缓冲液(具有20％DMSO和30％甘油的在pH 8.8下的具有NaCl的碳酸氢盐缓冲液)，温度(25℃)，混合条件(热混合器1000rpm)，抗体在1mg/ml下，断CBI-β-葡糖苷酸-NHS酯(当量添加份)，NHS-药物添加速率(每隔70-90分钟)。
典型地，将scFv(TCT)在热混合器上在4℃下解冻，然后使抗体等分试样的温度缓慢升高到20℃。在使用之前下旋以收集任何沉淀物。
在无水经过滤的DMSO中制得断CBI-β-葡糖苷酸-NHS酯100mM储备溶液。通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在艾本德微管中与经过滤的DMSO和甘油组合，并且使缓冲液在热混合器上在4℃下平衡，并且然后在于1000rpm下混合的同时使温度升高到20℃。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后开始添加断CBI-β-葡糖苷酸-NHS酯。
这通过以下方式来执行：每隔70min添加8当量NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在25℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr。然后通过离心(2.5min，11k rpm)收集样品。唯一可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中并且非常低。
最初使所有样品通过经10％IPA/PBS预平衡的Zeba柱(Pierce)，随后在HPLC-SEC上以20％IPA/PBS pH 7，25℃进一步纯化，并且通过如上文所描述的SDS-PAGE、HPLC-SEC、UV/Vis光谱法和质谱法分析。
通过HPLC-尺寸排阻色谱法使用Tosoh TSKGel G2000Wxl柱分析非共轭和共轭scFv(TCT)。ScFv的滞留时间与约30KDa的MW相关。共轭物都洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为主要单体峰，指示极少或无凝集。
实例33-培养抗西马多丁药物单克隆抗体和在检测scFv-西马多丁ADC中的使用
通过使西马多丁-NHS(化合物2)以摩尔过量共轭到1mg/ml KLH来制备钥孔贝血蓝蛋白(KLH)-西马多丁共轭物，并且通过脱盐而纯化。
由合同研究组织健能隆有限公司(Generon Ltd.)使用标准时程[参考：《泳道免疫学(Lane Immunology)书籍]使四只小鼠免疫。通过ELISA对scFv(TCT)-西马多丁和非共轭scFv(TCT)测试抗血清，并且四者都类似地响应(图34)。
小鼠4用以产生一组杂交瘤，其中11个克隆株鉴别为强结合剂。将这11个克隆株通过ELISA评级并且还通过蛋白质印迹测试结合到scFv(TCT)-西马多丁共轭物和不结合到游离组分的能力。
通过ELISA，克隆株11(GA6)呈现为最好的结合剂，而克隆株9(1E11)也表现得很强。克隆株5、3和6也展示可检测但较弱的活性。克隆株7和8非常弱，并且克隆株1、2、4和10呈现为非反应性(图35)。
通过蛋白质印迹测试杂交瘤的条件培养基的表达水平(图36)和针对scFv-西马多丁的免疫反应性(图37)。克隆株3、9、11都是良好表达者，而克隆株2、4、5、6、7、10是低/弱表达者。
强结合见于克隆株5、9和11中，获得肉眼不可见的较高MW物质。克隆株3和6次强，获得可能的降解产物，并且克隆株7与8更弱。克隆株1、2、4和10观察到极弱/无结合
选择克隆株9(1E11)。扩增、培养杂交瘤，并且通过蛋白A色谱法制备纯Mab。
实例34-测量scFv-西马多丁共轭物的药物动力学概况和血液清除
(A)放射性分析
如实例27或28中所描述制备关于赖氨酸共轭经优化的scFv，并且使其共轭(如实例31中所描述)到NHS衍生的西马多丁药物(化合物2)。如通过SDS-PAGE和IEF凝胶测定，平均DAR对于scFv-TCT-Cem-1是5并且对于scFv-TCT-Cem-2是4。将其根据制造商的说明书使用125-碘化钠(MP Biologicals)和IodogenTM管(赛默)用碘-125放射性标记。
在每个时间点将十微克放射性标记的scFv或共轭物静脉内注射到一组4只BALB/c雌性小鼠(哈兰(Harlan)，英国(UK))的尾静脉中。在每个时间点，从4只小鼠通过在末端麻醉下心脏穿刺而收集血液，并且通过解剖移出脾脏。使用γ计数器测量血液和脾脏组织的放射性，并且与注射剂量相比，针对组织重量校正。绘制每克组织注射剂量百分比相较于时间，并且通过拟合为双指数清除模型而测定药物动力学参数。为了研究体内血液清除药物动力学，使用SigmaPlot将数据值拟合到符合清除的二室静脉内模型的方程式，所述模型考虑了单一静脉内剂量的双指数清除期、分布期和消除期。这通过指数衰减、双重、四参数方程式y＝ae-bx+ce-dx描述，其中分布期清除速率(t1/2α)可以由ln 2/b确定，并且消除清除速率(t1/2β)可以由ln 2/d确定。
scFv-药物共轭物血液清除(图38)类似于未经修饰的scFv的血液清除(表13)。scFv-药物共轭物的脾吸收并不显著不同于未经修饰的scFv的脾吸收(图39)。这些数据都证实，此处描述的共轭技术不会导致任何有害凝集。
表13.小鼠中基于西马多丁的共轭物(化合物69)的药物动力学参数，血液清除.
(B)直接ADC/scFv检测分析
培养抗西马多丁MAb(实例33)，并且将其用以追踪小鼠血液中的ADC，以测定药物动力学特性。将6-8周大的正常BALB/c小鼠维持于经筛选的笼子中直到使用。如上(实例31)制备单批材料(scFv-TCT、scFv(TCT)-西马多丁，DAR＝5或8)，并且将0.1mg注射到20小鼠组中，在4个时间点处死所述小鼠(每个时间点分析5只小鼠)。通过心脏穿刺将约0.5ml全血移出到EDTA管中，并且通过离心收集血清。将血清适当地稀释到PBS中，并且通过ELISA在HER2涂布的微量滴定板上分析(实例11D)，通过抗T7标签(总抗体)或抗西马多丁(总ADC)检测。非注射参考样品用以产生ADC/ScFv血液浓度的直接读数的校准曲线。
展示总功能scFv(图40)和总功能ADC(图41)的结果。比较曲线图展示于图42中。
当直接测量时，游离scFv展现了双指数血液清除的典型α(分布)和β(消除)期(表14；Constantinou A等人(2009)《生物共轭化学》20:924-31)，所述清除归因于小尺寸而是快速血液清除。中DAR ADC(连接5个药物有效负载)就组织分布和消除来说都具有更慢的血液清除。这表明，略大的分子质量导致更慢清除，而非任何凝集导致经由网状内皮系统的快速清除。此效果在较高DAR共轭物(8个药物有效负载)的情况下甚至更显著。
当测量总ADC时，可见类似模式与类似药物动力学参数(表14)。比较曲线图说明了这点(图42)。这些数据表明，具有高负载量的基于scFv的ADC具有保持或甚至更慢的血液清除，这是低/无凝集和有利溶解度的指示。血液中的滞留长久得足以提供治疗效果。此外，总scFv与总ADC含量之间的类似性表明，ADC是稳定的并且一点不比scFv组分降解得更快[Lin与Tibbitts.《药学研究(Pharm.Res)》(2012)29:2354-66；Kaur等人《生物分析(Bioanalysis)》(2013)5:201-226]。
表14.药物动力学数据的概述
实例35-测量scFv-玫瑰树碱共轭物的药物动力学概况和血液清除
如上(例如实例33)培养抗玫瑰树碱MAb，并且将其用以追踪小鼠血液中的ADC，以测定药物动力学特性。将6-8周大的正常BALB/c小鼠维持于经筛选的笼子中直到使用。如上(化合物21，实例29)制备单批材料(scFv-TCT、scFv(TCT)-玫瑰树碱，DAR＝5或8)，并且将0.1mg注射到20小鼠组中，在4个时间点处死所述小鼠(每个时间点分析5只小鼠)。通过心脏穿刺将约0.5ml全血移出到EDTA管中，并且通过离心收集血清。将血清适当地稀释到PBS中，并且通过ELISA在HER2涂布的微量滴定板上分析(实例31D)，通过抗T7标签(总抗体)或抗玫瑰树碱(总ADC)检测。非注射参考样品用以产生ADC/ScFv血液浓度的直接读数的校准曲线。
当直接测量时，游离scFv展现了双指数血液清除的典型α(分布)和β(消除)期(Constantinou A等人(2009)《生物共轭化学》20:924-31)，所述清除归因于小尺寸而是快速血液清除。中DAR ADC(连接5个药物有效负载)就组织分布和消除来说都具有更慢的血液清除。这表明，略大的分子质量导致更慢清除，而非任何凝集导致经由网状内皮系统的快速清除。此效果在较高DAR共轭物(8个药物有效负载)的情况下甚至更显著。
实例36-测量scFv-阿霉素共轭物的药物动力学概况和血液清除
抗阿霉素MAb是可商购的，并且将其用以追踪小鼠血液中的ADC，以测定药物动力学特性。将6-8周大的正常BALB/c小鼠维持于经筛选的笼子中直到使用。如上(化合物72)制备单批材料(scFv-TCT、scFv(TCT)-阿霉素，DAR＝5或8)，并且将0.1mg注射到20小鼠组中，在4个时间点处死所述小鼠(每个时间点分析5只小鼠)。通过心脏穿刺将约0.5ml全血移出到EDTA管中，并且通过离心收集血清。将血清适当地稀释到PBS中，并且通过ELISA在HER2涂布的微量滴定板上分析(实例31D)，通过抗T7标签(总抗体)或抗阿霉素(总ADC)检测。非注射参考样品用以产生ADC/ScFv血液浓度的直接读数的校准曲线。
当直接测量时，游离scFv展现了双指数血液清除的典型α(分布)和β(消除)期(Constantinou A等人(2009)《生物共轭化学》20:924-31)，所述清除归因于小尺寸而是快速血液清除。中DAR ADC(连接5个药物有效负载)就组织分布和消除来说都具有更慢的血液清除。这表明，略大的分子质量导致更慢清除，而非任何凝集导致经由网状内皮系统的快速清除。此效果在较高DAR共轭物(8个药物有效负载)的情况下甚至更显著。
实例37-测量scFv-MMAE共轭物的药物动力学概况和血液清除
抗MMAE MAb是可商购的，并且将其用以追踪小鼠血液中的ADC，以测定药物动力学特性。将6-8周大的正常BALB/c小鼠维持于经筛选的笼子中直到使用。如上(实例32)制备单批材料(scFv-TCT、scFv(TCT)-MMAE，DAR＝5或8)，并且将0.1mg注射到20小鼠组中，在4个时间点处死所述小鼠(每个时间点分析5只小鼠)。通过心脏穿刺将约0.5ml全血移出到EDTA管中，并且通过离心收集血清。将血清适当地稀释到PBS中，并且通过ELISA在HER2涂布的微量滴定板上分析(实例31D)，通过抗T7标签(总抗体)或抗MMAE(总ADC)检测。非注射参考样品用以产生ADC/ScFv血液浓度的直接读数的校准曲线。
当直接测量时，游离scFv展现了双指数血液清除的典型α(分布)和β(消除)期(Constantinou A等人(2009)《生物共轭化学》20:924-31)，所述清除归因于小尺寸而是快速血液清除。中DAR ADC(连接5个药物有效负载)就组织分布和消除来说都具有更慢的血液清除。这表明，略大的分子质量导致更慢清除，而非任何凝集导致经由网状内皮系统的快速清除。此效果在较高DAR共轭物(8个药物有效负载)的情况下甚至更显著。
实例38-测量scFv-西马多丁共轭物的肿瘤吸收和肿瘤与正常组织比率
如实例27或28中所描述制备关于赖氨酸共轭经优化的scFv，并且使其共轭(如实例31中所描述)到NHS衍生的西马多丁药物(化合物2、69)。平均DAR在6-10之间。将其根据制造商的说明书使用125-碘化钠(MP Biologicals)和IodogenTM管(赛默)用碘-125放射性标记。
在每个时间点将十微克放射性标记的scFv或共轭物静脉内注射到一组4只生长有适当靶表达的皮下肿瘤(例如对于HER2表达的SKOV3)的BALB/c雌性裸小鼠(哈兰，英国)的尾静脉中。在每个时间点，从4只小鼠通过在末端麻醉下心脏穿刺而收集血液，并且通过解剖移出肿瘤和正常器官。使用γ计数器测量血液和组织的放射性，并且与所注射的剂量相比，针对组织重量校正。绘制每克组织注射剂量百分比相较于时间。
实例39-测量scFv-玫瑰树碱共轭物的肿瘤吸收和肿瘤与正常组织比率
如实例27或28中所描述制备关于赖氨酸共轭经优化的scFv，并且使其共轭(如实例29中所描述)到NHS衍生的玫瑰树碱药物(化合物23、73)。平均DAR在6-10之间。将其根据制造商的说明书使用125-碘化钠(MP Biologicals)和IodogenTM管(赛默)用碘-125放射性标记。
在每个时间点将十微克放射性标记的scFv或共轭物静脉内注射到一组4只生长有适当靶表达的皮下肿瘤(例如对于HER2表达的SKOV3)的BALB/c雌性裸小鼠(哈兰，英国)的尾静脉中。在每个时间点，从4只小鼠通过在末端麻醉下心脏穿刺而收集血液，并且通过解剖移出肿瘤和正常器官。使用γ计数器测量血液和组织的放射性，并且与所注射的剂量相比，针对组织重量校正。绘制每克组织注射剂量百分比相较于时间。
实例40-测量scFv-阿霉素共轭物的肿瘤吸收和肿瘤与正常组织比率
如实例27或28中所描述制备关于赖氨酸共轭经优化的scFv，并且使其共轭(如实例30中所描述)到NHS衍生的阿霉素药物(化合物7、72)。平均DAR在6-8之间。将其根据制造商的说明书使用125-碘化钠(MP Biologicals)和IodogenTM管(赛默)用碘-125放射性标记。
在每个时间点将十微克放射性标记的scFv或共轭物静脉内注射到一组4只生长有适当靶表达的皮下肿瘤(例如对于HER2表达的SKOV3)的BALB/c雌性裸小鼠(哈兰，英国)的尾静脉中。在每个时间点，从4只小鼠通过在末端麻醉下心脏穿刺而收集血液，并且通过解剖移出肿瘤和正常器官。使用γ计数器测量血液和组织的放射性，并且与所注射的剂量相比，针对组织重量校正。绘制每克组织注射剂量百分比相较于时间。
实例41-测量scFv-MMAE共轭物的肿瘤吸收和肿瘤与正常组织比率
如实例27或28中所描述制备关于赖氨酸共轭经优化的scFv，并且使其共轭(如实例32中所描述)到NHS衍生的MMAE药物。平均DAR在6-10之间。将其根据制造商的说明书使用125-碘化钠(MP Biologicals)和IodogenTM管(赛默)用碘-125放射性标记。
在每个时间点将十微克放射性标记的scFv或共轭物静脉内注射到一组4只生长有适当靶表达的皮下肿瘤(例如对于HER2表达的SKOV3)的BALB/c雌性裸小鼠(哈兰，英国)的尾静脉中。在每个时间点，从4只小鼠通过在末端麻醉下心脏穿刺而收集血液，并且通过解剖移出肿瘤和正常器官。使用γ计数器测量血液和组织的放射性，并且与所注射的剂量相比，针对组织重量校正。绘制每克组织注射剂量百分比相较于时间。
实例42-经两种scFv(TCT)-P5C5ADC DAR处理的携有SKBr3肿瘤异种移植物的裸小鼠中的肿瘤消退研究
将6-8周大的雌性裸BALB/c小鼠(哈兰，英国)用于体内研究。所有体内研究都在英国内政部(UK Home Office)项目许可PPL 70/5833下执行。通过用在50％基质胶中含有多达500万个SKBr3细胞的0.1mL向小鼠皮下注射到左侧腹中，设置人类肿瘤异种移植物。监测肿瘤生长，并且其耗时2-3周达到后续测试所需的3-5mm直径。当肿瘤是约100mm3时，在连续5天用scFv(TCT)-P5C5共轭物(如实例31中制备，化合物71)静脉内注射10mg/kg(0.25mg总剂量)(每只动物的总ADC剂量＝1.25mg)，并且监测肿瘤尺寸。绘制与起始体积相比的肿瘤体积(图43)，在肿瘤再次开始生长以前展示有约10天的消退。这等于约1个月的肿瘤生长延迟并且证实，scFv(TCT)-ADC在临床前动物模型中具有治疗功能。
实例43-scFv-MMAE共轭物的肿瘤疗法
将6-8周大的雌性裸BALB/c小鼠(哈兰，英国)用于体内研究。所有体内研究都在英国内政部的一个项目许可下执行。通过用在50％基质胶中含有多达500万个SKOV3细胞的0.1mL向小鼠皮下注射到左侧腹中，设置人类肿瘤异种移植物。监测肿瘤生长，并且其耗时2-3周达到后续测试所需的3-5mm直径。当肿瘤是约100mm3时，在连续5天用scFv(TCT)-MMAE共轭物(如实例32中制备)静脉内注射10mg/kg(0.25mg总剂量)(每只动物的总ADC剂量＝1.25mg)，并且监测肿瘤尺寸。绘制与起始体积相比的肿瘤体积。
实例44-药物配制品和投药.
本发明的另一方面提供了一种药物配制品，其包含根据本发明的第一方面的化合物，以及药学上或兽医学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂。
优选地，配制品是含有日剂量或单位、日亚剂量或其适当部分的活性成分的单位剂量。
本发明化合物通常将经口或通过任何肠胃外途径，以包含活性成分的药物配制品形式、任选地以无毒有机或无机酸或碱加成盐形式，以药学上可接受的剂型投与。取决于待治疗的病症和患者以及投药途径，可以以变化的剂量投与组合物。
在人类疗法中，本发明化合物可以单独投与，但通常将与关于预期投药途径和标准药物实践所选择的适合药物赋形剂、稀释剂或载剂混合投与。
举例来说，本发明化合物可以以可以含有调味剂或着色剂的片剂、胶囊、珠剂、酏剂、溶液或悬浮液形式经口、经颊或舌下投与用于立即、延迟或控制释放应用。本发明化合物还可以经由阴茎海绵体内注射投与。
此类片剂可以含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢二钙和甘氨酸，崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲纤维素钠和某些复合硅酸盐，和粒化粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
类似类型的固体组合物还可以用作明胶胶囊中的填充剂。就此而言的优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂，本发明化合物可以与以下各者组合：多种甜味剂或调味剂、着色物质或染料；乳化剂和/或悬浮剂；以及稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇和甘油，和其组合。
本发明化合物还可以肠胃外投与，例如静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、脑室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下投与，或其可以通过输注技术投与。其最好以无菌水溶液形式使用，其可以含有其它物质，例如足够的盐或葡萄糖以使得溶液与血液等渗。必要时，水溶液应经适当缓冲(优选缓冲到3到9的pH)。适合的肠胃外配制品在无菌条件下的制备易于由本领域的技术人员熟知的标准药物技术实现。
适用于肠胃外投与的配制品包括可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得配制品与既定接受者的血液等渗的溶质的水性和非水性无菌注射溶液；和可以包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。配制品可以呈现于单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用之前即刻添加无菌液体载剂(例如注射用水)。即用型注射溶液和悬浮液可以由先前所描述的种类的无菌散剂、颗粒和片剂来制备。
对于向人类患者经口和肠胃外投与，本发明化合物的日剂量水平通常将是1mg/kg到30mg/kg。因此，举例来说，本发明化合物的片剂或胶囊可以含有活性化合物剂量，适当时一次投与单个或两个或更多个。在任何情况下医生将确定最适合于任何个别患者的实际剂量，并且其将随特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是平均情形的例示。当然，可能存在应使用更高或更低剂量范围的个别情况，并且此类情况在本发明范围内。
本发明化合物还可以鼻内或通过吸入投与，并且宜在适合推进剂的使用下从加压容器、泵、喷雾器或雾化器以干粉吸入剂或气雾喷雾呈现形式递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)的氢氟烷烃、二氧化碳或其它适合气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供用于递送量定量的阀门来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可以另外含有润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如由明胶制得)可以经配制以含有本发明化合物与适合粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
气雾剂或干粉配制品优选经布置以使得每个定量剂量或“抽吸”递送适当剂量的本发明化合物以便递送到患者。应了解，气雾剂的总日剂量将在患者之间变化，并且可以以单次剂量或更通常遍及一整天的分次剂量投与。
或者，本发明化合物可以以栓剂或子宫托形式投与，或其可以以洗剂、溶液、乳膏、软膏或敷粉形式表面应用。本发明化合物还可以透皮投与，例如通过使用皮肤贴片投与。其还可以通过眼部途径投与，尤其用于治疗眼睛疾病。
对于眼用，本发明化合物可以配制成于等渗、pH经调节的无菌生理盐水中的微粉化悬浮液，或优选配制成于等渗、pH经调节的无菌生理盐水中的溶液，任选地与防腐剂(例如苯扎氯铵(benzylalkonium chloride))组合。或者，其可以配制成软膏，例如矿脂。
对于向皮肤的表面应用，本发明化合物可以配制成含有活性化合物悬浮或溶解于例如具有以下中的一者或多者的混合物中的适合软膏：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，其可以配制成悬浮或溶解于例如以下中的一者或多者的混合物中的适合洗剂或乳膏：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
适用于在口中表面投与的配制品包括在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性成分的口含片；在惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中包含活性成分的片剂；和在适合液体载剂中包含活性成分的漱口剂。
一般来说，在人类中，本发明化合物的经口或表面投与是优选途径，因为其是最便利的。在接受者罹患吞咽病症或在经口投与之后遭受药物吸收削弱的情形下，药物可以肠胃外投与，例如舌下或经颊投与。
对于兽用，本发明化合物根据正常兽医实践以适合可接受的配制品形式投与，并且外科兽医将决定最适合于特定动物的给药方案和投药途径。
实例45-制备MMAF-C5-NHS酯(78)
在室温下向MMAF(0.1g，0.177mmol)于DMF(4ml)中的溶液中添加DIPEA(0.12ml)和戊二酸酐(50.5mg，0.44mmol)。将反应混合物在N2气氛下搅拌16h。在真空中蒸发溶剂，并且将所获得的粗化合物在Prep HPLC上使用Phenomenex Synergi Polar-RP柱(洗脱剂：A＝0.1％TFA/水，B＝MeCN)，梯度-0到11Min：15到40％B，11到24min：40到55％B，24到35min：55到85％B纯化。在tR 16.4min收集化合物，并且将其冻干以得到白色固体(81％)。HRMS:ESIm/z C44H72N5O11实验值846.5200[M+H]+计算值846.5228
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.22(s,1H),7.46-6.98(m,5H),4.93-4.38(m,3H),4.04(dd,J＝13.7,9.9Hz,2H),3.66(dq,J＝12.8,6.4Hz,4H),3.50-3.37(m,6H),3.29-3.15(m,9H),3.15-3.00(m,4H),2.94-2.65(m,12H),2.30(t,J＝7.4Hz,12H),1.94(p,J＝6.6Hz,3H),1.76(p,J＝7.4Hz,9H),1.51-1.22(m,28H),1.13(dt,J＝19.1,6.8Hz,6H),1.04-0.69(m,20H)。
在室温下向MMAF-C5(50mg，0.05mmol)于DMF(1ml)中的溶液中添加DIPEA(15μl)和TSTU(18mg，0.05mmol)。将反应混合物在N2气氛下搅拌4h。在真空中蒸发溶剂，并且将所获得的粗化合物在Prep HPLC上使用Phenomenex Synergi Polar-RP柱(洗脱剂：A＝0.1％TFA/水，B＝MeCN)，梯度-0到11Min：15到40％B，11到24min：40到55％B，24到35min：55到85％B纯化。在tR 20.4min收集所要化合物，并且将其冻干以得到白色固体(22mg，40％)。HRMS:ESI m/z C48H75N6O13实验值943.5416[M+H]+计算值943.5392
实例46-通过直接活化制备MMAF-C5-NHS酯
在室温下向MMAF(50mg，0.06mmol)于乙腈(5ml)中的溶液中添加DIPEA(0.1ml)和戊二酸二(N-琥珀酰亚胺基)酯(193mg，0.6mmol)。将反应混合物在N2气氛下搅拌72h。在真空中蒸发溶剂，并且将所获得的粗化合物在Prep HPLC上使用Phenomenex Synergi Polar-RP柱(洗脱剂：A＝0.1％TFA/水，B＝MeCN)，梯度-0到11Min：15到40％B，11到24min：40到55％B，24到35min：55到85％B纯化。在tR 20.4min收集所要化合物，并且将其冻干以得到白色固体(10mg，18％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.34(t,J＝7.6Hz,1H),7.14-6.90(m,5H),4.41(dt,J＝11.3,4.8Hz,1H),4.22(t,J＝8.1Hz,1H),3.74(dd,J＝10.0,4.4Hz,1H),3.10-2.90(m,8H),2.88-2.66(m,6H),2.54-2.41(m,2H),2.28(p,J＝1.8Hz,38H),2.07-1.90(m,3H),1.74-1.31(m,5H),1.14(d,J＝48.5Hz,3H),0.88-0.77(m,3H),0.77-0.47(m,20H)。
实例47-制备MMAE-PAB-Cit-Val-C5-NHS(82)
向MMAE(0.15g，0.18mmol)和Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP 13(0.152g，0.19mmol)于DMF(1.5ml)中的溶液中添加HOBt(58mg，0.36mmol)、吡啶(0.12ml)和DIPEA(31μl)。将反应混合物在室温下在N2气氛下搅拌24h。在真空中蒸发溶剂，并且将残余物用乙酸乙酯湿磨。将所得固体过滤、用乙酸乙酯洗涤、干燥，得到79。LC-MS ESIm/z 1367.7[M+Na]+此未经进一步纯化即直接使用。
将Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAE 79(0.3g，0.22mmol)于DMF(1.5ml)和二乙胺(1.12ml)中的溶液在室温下搅拌3小时。然后在真空中浓缩反应混合物。使产物在乙醚中沉淀并且过滤，得到0.15g呈灰白色粉末状的80，此未经进一步纯化即使用。LC-MS ESIm/z 1145.6[M+Na]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(d,J＝6.5Hz,1H),8.70(d,J＝7.6Hz,1H),8.07(d,J＝4.9Hz,4H),7.61(dd,J＝26.0,8.3Hz,2H),7.45-7.21(m,7H),7.18(dd,J＝8.9,6.3Hz,1H),6.04(s,1H),5.48(s,2H),5.21-4.88(m,2H),4.63-4.37(m,4H),4.26(t,J＝11.7Hz,1H),3.98(m,3H),3.33-3.08(m,12H),3.10-2.69(m,8H),2.27-1.88(m,5H),1.90-1.66(m,5H),1.64-1.19(m,7H),1.15-0.52(m,36H)。
在室温下向化合物H-Val-Cit-PAB-MMAE 80(0.1g，0.177mmol)于DMF(4ml)中的溶液中添加DIPEA(0.12ml)和戊二酸酐(50.5mg，0.44mmol)。将反应混合物在N2气氛下搅拌16h。在真空中蒸发溶剂，将所获得的粗化合物81用乙醚洗涤，并且直接用于下一步骤。HRMS:ESI m/z C63H101N10O15实验值1237.7526[M+Na]+计算值1237.7448
在室温下向MMAE-PAB-Cit-Val-C5 81(0.1g，0.08mmol)于DMF(2ml)中的溶液中添加DIPEA(29μl)和TSTU(38mg，0.12mmol)，并且将反应混合物在N2气氛下搅拌3h。在真空中蒸发溶剂，并且将所获得的产物在Prep HPLC上使用Phenomenex Synergi Polar-RP柱(洗脱剂：A＝0.1％TFA/水，B＝MeCN)，梯度-0到14Min：15到85％B纯化，在tR 10.1min收集所要化合物，并且将其冻干以得到白色粉末(40％)。HRMS:ESI m/z C67H103N11O17Na实验值1356.7623[M+Na]+计算值1356.7431
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.79(s,1H),8.05-7.79(m,2H),7.68(d,J＝8.6Hz,2H),7.37(d,J＝8.0Hz,3H),7.25-7.00(m,7H),6.96(t,J＝7.2Hz,1H),4.85(d,J＝15.3Hz,4H),4.55-4.09(m,10H),4.00-3.56(m,12H),3.13-2.85(m,12H),2.75(s,5H),2.67-2.58(m,7H),2.54-2.36(m,4H),2.28(p,J＝1.8Hz,88H),2.14-1.99(m,4H),1.95-1.67(m,5H),1.68-1.40(m,8H),1.39-0.93(m,7H),0.90-0.31(m,40H)。
实例48-制备MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG5-NHS酯(84)
在室温下向化合物H-Val-Cit-PAB-MMAE 80(0.2g，0.177mmol)于DMF(7ml)中的溶液中添加DIPEA(0.1ml)和酸-dPEG5-NHS(50.5mg，0.21mmol)。将反应混合物在N2气氛下搅拌16h。在真空中蒸发溶剂，将所获得的粗化合物83用乙醚洗涤，并且直接用于下一步骤。LC-MS ESI m/z 1466.6[M+Na]+
在室温下向酸-dPEG5-Val-Cit-PAB-MMAE 83(0.25g，0.17mmol)于DMF(7ml)中的溶液中添加DIPEA(0.15ml)和TSTU(120mg，0.39mmol)，并且将反应混合物在N2气氛下搅拌3h。在真空中蒸发溶剂，并且将粗产物在Biotage急骤纯化系统上使用C18柱纯化，在冻干之后得到呈白色固体状的化合物NHS-PEG5-Val-Cit-PAB-MMAE84，MS:ESI m/z 1562.9[M+Na]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.03-9.96(m,1H),8.12(dd,J＝19.3,7.8Hz,1H),7.90(t,J＝8.9Hz,1H),7.69-7.55(m,2H),7.38-7.23(m,5H),7.23-7.13(m,1H),5.11-4.93(m,2H),4.52-4.33(m,3H),4.32-4.19(m,2H),3.99(m,2H),3.83-3.68(m,2H),3.65-3.41(m,17H),3.22(dd,J＝19.9,8.6Hz,6H),3.12(s,1H),3.10-2.74(m,12H),2.42(m,12H),2.26(dd,J＝15.9,9.2Hz,1H),2.19-1.90(m,4H),1.79-1.65(m,3H),1.65-1.52(m,2H),1.52-1.31(m,3H),1.08-0.96(m,6H),0.96-0.71(m,23H)。
实例49-制备MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9-NHS酯(86)
如实例47通过使H-Val-Cit-PAB-MMAE 80与酸-dPEG9-NHS反应、随后用TSTU活化，来制备MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9-NHS酯86。将在蒸发之后获得的粗物质在Biotage急骤纯化系统上使用C18柱纯化，在冻干之后得到呈白色固体状的化合物MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9-NHS 86，MS:ESI m/z 1718.3093[M+H]+
实例50-制备奥瑞他汀F-C5-NHS酯(88)
将奥瑞他汀F(0.1g，0.116mmol)和HATU(40mg，0.104mmol)溶解于DMF(3ml)中，并且添加DIPEA(40μl)到其中。将反应混合物在室温下搅拌40min，并且然后逐滴添加到5-氨基戊酸(15mg，0.127mmol)于DMF(2ml)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌4h，并且在真空中蒸发。将粗产物在Biotage急骤纯化系统上使用C18柱纯化，得到呈白色固体状的化合物奥瑞他汀F-C5酸87(85mg，84％)。LC-MSESI m/z 867.5[M+Na]+
向奥瑞他汀F-C5酸87(70mg，0.08mmol)于DIPEA(72μl)和DMF(3ml)中的溶液中添加TSTU(57mg 0.19mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1h。在真空中蒸发溶剂，并且将粗化合物在Biotage急骤纯化系统上使用C18柱纯化，在冻干之后得到呈白色固体状的化合物奥瑞他汀F-C5-NHS酯88(46mg，59％)。LC-MS ESI m/z964.5[M+Na]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.57(s,1H),8.94(q,J＝7.9,7.2Hz,1H),8.05-7.84(m,1H),7.31-7.10(m,5H),4.60(m,2H),3.99(d,J＝7.5Hz,1H),3.84-3.73(m,2H),3.70(d,J＝7.6Hz,1H),3.50(td,J＝14.0,7.5Hz,1H),3.32-3.10(m,9H),2.99(m,6H),2.84-2.58(m,14H),2.45(dd,J＝14.9,5.0Hz,4H),2.37-2.22(m,3H),2.01(dd,J＝12.8,5.7Hz,1H),1.94-1.73(m,3H),1.59-1.36(m,5H),1.08-0.71(m,25H)。
实例51-制备美登醇DM1-dPEG4-NHS酯(89)
向DM1(0.1g，0.135mmol)于THF中的溶液中添加Et3N(18.9μl)，随后添加
Mal-dPEG4-NHS(77mg，0.15mmol)。将反应混合物在室温下在N2气氛下搅拌1h，并且在真空中去除溶剂。将粗产物在Biotage急骤纯化系统上使用C18柱纯化，在冻干之后得到呈白色固体状的化合物DM1-dPEG5-NHS(105mg，75％)。LC-MS ESI m/z1274.60[M+Na]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01(q,J＝5.6Hz,1H),7.17(dd,J＝8.1,1.8Hz,1H),6.90(s,1H),6.68-6.46(m,3H),5.55(dd,J＝12.8,8.9Hz,1H),5.31(q,J＝6.7Hz,1H),4.52(dd,J＝12.1,2.9Hz,1H),4.07(t,J＝10.8Hz,2H),3.93(d,J＝1.5Hz,4H),3.85(dd,J＝9.0,4.0Hz,1H),3.71(t,J＝6.0Hz,2H),3.63-3.41(m,18H),3.37(t,J＝5.9Hz,3H),3.32-3.07(m,11H),3.07-2.86(m,6H),2.79(d,J＝11.6Hz,7H),2.71(s,4H),2.25(m,4H),2.04(d,J＝14.4Hz,1H),1.59(s,4H),1.55-1.34(m,3H),1.33-1.03(m,8H),0.78(d,J＝2.1Hz,3H)。
实例52-制备美登醇DM1-dPEG12-NHS酯(90)
向DM1(0.05g，0.1678mmol)于THF(3ml)中的搅拌并且脱气的溶液中添加Et3N(9.45μl)，随后添加溶解于THF(4ml)中的Mal-dPEG9-NHS(58.7mg，0.1678mmol)。将反应混合物在室温下在N2气氛下搅拌3h，并且在真空中去除溶剂。将粗产物在Biotage急骤纯化系统上使用C18柱纯化，在冻干之后得到呈白色固体状的化合物DM1-dPEG12-NHS 90(31mg，28％)。LC-MS ESI m/z 1625.9[M+Na]+
实例53-制备玫瑰树碱-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG3-NHS酯(95)
在0℃下向N,N'-二甲基乙二胺(3.66mL，34mmol)于二氯甲烷(40mL)中的搅拌溶液中逐滴添加二碳酸二叔丁酯(2.4g，11mmol)于二氯甲烷(20mL)中的溶液，并且使其升温到室温过夜，在减压下浓缩，用EtOAc(100mL)稀释，用水(2×100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥，并且在减压下浓缩，得到呈无色油状的标题产物91(1.54g，74％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.26(t,J＝6.15Hz,2H),2.81(s,3H),2.66(t,J＝6.57Hz,2H),2.38(s,3H),9.28(s,9H)ppm。
在0℃下向9-羟基玫瑰树碱(80mg，0.27mmol)、DMAP(32mg，0.27mmol)和三乙胺(261μL，1.88mmol)于THF(2mL)中的搅拌溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(81mg，0.40mmol)于THF(1.5mL)中的溶液，经2h使其升温到室温，向其中添加BOC-二胺91(151mg，0.80mmol)于THF(0.5mL)中的溶液，在室温下搅拌过夜，在减压下浓缩，并且色谱分离(0-20％MeOH/CH2Cl2)，得到呈黄色固体状的BOC-胺-玫瑰树碱92(92mg，72％产率)。Rf＝0.47(10％MeOH/CH2Cl2)，IRνmax 3377,2976,2088,1701,1674,1601,1462,1397,1191,1144,1030,816,790,721cm-1；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.78(s,1H),9.88-9.75(d,J＝5.4Hz,1H),8.48-8.35(d,J＝6.4Hz,1H),8.13(s,1H),8.10(s,1H),7.64-7.54(dd,J＝8.7,3.9Hz,1H),7.42-7.25(m,1H),3.45(s,6H),2.85-2.82(m,4H),2.84(s,6H),1.41(s,9H)ppm；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ226.28,224.53,209.31,162.06,142.18,133.59,121.52,117.90,116.45,111.46,109.63,79.16,55.12,46.90,46.13,46.13,28.56,14.98,12.47,9.03ppm；MS(EI+)m/z 477[M+H]+；HRMS(EI+)m/z C27H33N4O4[M+H]+计算值477.2502，实验值477.2503。
将BOC-胺-玫瑰树碱92(93mg，0.19mmol)于三氟乙酸(2.5mL)中的溶液在室温下搅拌3h，并且在减压下浓缩，得到呈黄色固体状的所要脱除保护基的产物93(105mg，90％产率)。Rf＝0.14(20％MeOH/CH2Cl2)；IRνmax 2995,2821,1670,1473,1397,1174,1127,1021,813,795,721cm-1；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.03-8.72(d,J＝48.5Hz,2H),8.58-8.36(m,2H),8.86-8.69(m,1H),12.57-11.95(d,J＝2.7Hz,1H),10.18-9.85(d,J＝2.2Hz,1H),8.31-8.08(dd,J＝11.3,2.2Hz,1H),7.87-7.58(d,J＝8.6Hz,1H),7.54-7.37(dt,J＝8.8,2.3Hz,1H),3.35-3.26(d,J＝5.1Hz,3H),3.17(s,6H),3.15-3.06(qd,J＝7.3,4.7Hz,4H),2.87(s,3H)ppm；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ159.01,158.68,157.26,155.79,144.77,134.42,134.14,128.46,125.98,122.68,120.29,120.07,112.01,110.91,49.06,35.16,34.96,33.16,15.35,12.48ppm；MS(EI+)m/z 377[M]+；HRMS(EI+)m/zC22H25N4O2[M]+计算值377.1978，实验值377.1974。
在室温下向活化连接子30(60.7mg，0.08mmol)于DMF(3ml)中的搅拌溶液中添加玫瑰树碱胺93(48mg，0.10mmol)和DIPEA(40μL，0.23mmol)于DMF(1mL)中的溶液，搅拌过夜，在减压下浓缩，并且色谱分离(0-20％MeOH/CH2Cl2)，得到标题产物94(19mg，26％产率)。Rf＝0.30(10％MeOH/CH2Cl2)；IRνmax 3310,2935,2103,1650,1541,1466,1402,1202,1130,1027,823,800,756,720cm-1；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.79(s,1H),10.01(s,1H),9.82(s,1H),8.44(s,2H)8.39-8.30(d,J＝7.2Hz,1H),8.23-8.16(d,J＝6.3Hz,1H),8.15-8.11(d,J＝6.8Hz,1H),7.63-7.54(d,J＝6.8Hz,2H),2.05-1.96(m,1H),7.48-7.42(d,J＝8.9Hz,1H),7.32-7.27(d,J＝8.1Hz,3H),5.42(s,2H),5.10-5.00(d,J＝9.0Hz,2H),4.46-4.28(q,J＝8.0,7.3Hz,1H),3.95(s,2H),3.64-3.55(m,14H),6.03(s,1H),3.18-3.11(ddd,J＝10.8,7.3,3.7Hz,4H),3.05-2.88(m,2H),2.85(s,2H),2.10-1.91(dt,J＝13.5,7.2Hz,1H),1.75-1.53(m,2H),1.48-1.32(m,2H),1.27(s,6H),0.96-0.72(ddd,J＝22.7,6.3,3.2Hz,6H)ppm；13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ171.21,170.95,169.44,162.80,159.37,158.36,158.12,155.46,147.76,145.15,143.25,140.41,139.01,133.58,129.03,128.77,124.65,123.33,122.68,121.45,119.41,117.59,111.50,109.74,70.87,70.07,69.90,69.69,57.03,53.98,50.51,49.13,47.01,42.24,35.24,31.60,29.65,27.39,19.64,18.51,17.18,15.01,12.88ppm；MS(EI+)m/z 1019[M+Na]+；HRMS(EI+)m/z C49H64N12O11Na[M+Na]+计算值1019.4715，实验值1019.4722。
向叠氮化物94(2.5mg，0.003mmol)于DMF(1mL)中的搅拌溶液中添加碳酸(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲酯N-琥珀酰亚胺酯(0.7mg，0.003mmol)，在室温下搅拌3h，并且在减压下浓缩，得到呈黄色固体状的标题产物(3mg，93％产率)。IRνmax 3323,2924,1811,1786,1740,1664,1604,1537,1402,1199,1126,828,799,718cm-1；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.02(s,1H),10.10-9.97(m,1H),9.94-9.84(d,J＝8.6Hz,1H),8.49-8.41(d,J＝6.7Hz,2H),8.36-8.30(dd,J＝7.2,3.4Hz,1H),7.64-7.51(td,J＝12.0,9.0,4.7Hz,1H),7.56-7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.45-7.40(d,J＝8.6Hz,1H),7.38-7.21(m,3H),6.09-5.89(q,J＝5.5,5.0Hz,1H),5.42(s,2H),5.11-4.97(m,2H),4.53-4.45(t,J＝8.0Hz,2H),4.39-4.32(t,J＝5.4Hz,2H),3.96-3.91(d,J＝3.8Hz,2H),3.71-3.66(q,J＝5.7,4.2Hz,2H),3.65-3.55(dtt,J＝20.5,9.9,4.7Hz,10H),3.51-3.43(m,4H),3.18-3.08(qd,J＝7.3,4.1Hz,4H),2.91-2.87(s,4H),2.86-2.85(s,2H),2.292.18(m,2H),2.19-2.11(m,2H),2.00-1.93(d,J＝6.7Hz,2H),0.90-0.70(ddd,J＝29.9,6.9,4.3Hz,6H),2.32-1.89(m,6H),2.10-2.02(m,2H)ppm；13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ172.75,170.73,170.48,169.94,168.96,162.29,158.90,154.87,151.30,144.85,143.09,139.99,138.62,133.72,133.47,128.53,128.30,122.61,118.91,117.16,111.25,109.72,99.50,98.90,70.33,70.29,69.69,69.65,69.53,69.31,57.37,56.55,53.50,53.20,47.13,46.54,41.76,40.15,40.09,40.00,39.93,39.84,39.76,39.67,39.60,39.50,39.34,39.17,39.00,38.51,35.77,34.82,34.51,31.05,30.76,29.17,28.41,26.85,25.49,25.34,25.29,25.21,22.33,22.04,21.80,21.22,20.74,20.69,20.19,19.89,19.54,19.15,18.85,18.04,17.90,16.92,16.71,16.67,14.68,12.41,12.03ppm；MS(EI+)m/z 1288[M+H]+；HRMS(EI+)m/zC64H82N13O16[M+H]+计算值1288.5995，实验值1288.5625。
实例54-制备玫瑰树碱-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-BCN-dPEG4-NHS酯(96)
向叠氮化物94(2.5mg，0.003mmol)于DMF(1mL)中的搅拌溶液中添加BCN-PEG4-NHS(ConjuProbe)(0.7mg，0.003mmol)，在室温下搅拌3h，并且在减压下浓缩，得到呈黄色固体状的所要产物96(3mg，93％产率)。
实例55-制备SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-BCN-dPEG4-NHS酯(100)
在0℃下向光气于甲苯中的搅拌溶液(15重量％，0.36mL，0.55mmol)中逐滴添加BOC-二胺91(94mg，0.50mmol)和Et3N(77μL，0.55mmol)于甲苯(1.32mL)中的溶液，在0℃下搅拌2h，使其升温到室温过夜，过滤，用甲苯(5mL)洗涤，在减压下浓缩，并且将其溶解于吡啶(2.23mL，27.6mmol)中，向其中添加SN38(150mg，0.39mmol)，在室温下搅拌过夜，用EtOAc(100mL)稀释，用水(3×100mL)洗涤，干燥，在减压下浓缩，并且色谱分离(0-10％MeOH/CH2Cl2)，得到呈黄色固体状的标题产物(72mg，31％)。Rf＝0.57(10％MeOH/CH2Cl2)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(dd,J＝9.3,5.7Hz,1H),7.85-7.73(m,1H),7.64-7.61(m,1H,7.53-7.48(m,1H),5.64(d,J＝16.3Hz,1H),5.22(d,J＝16.3Hz,1H),5.18(s,2H),3.65-2.85(m,6H),2.82(s,6H),1.85(p,J＝7.1Hz,2H),1.40(s,9H),1.34(t,J＝7.8Hz,3H),0.94(t,J＝7.3Hz,3H)ppm；LCMStR＝2.10min m/z 607.3[M+H]+。
实例56-制备DM1-Mal-SO3H-NHS(102)
实例57-制备美登醇-PEG2-Glu-BCN-NHS酯(108)
实例58-制备美登醇-SO3H-BCN-dPEG4-NHS酯(110)
实例59-制备MMAE-β-葡糖苷酸-C5-NHS酯(113)
实例60-制备PBD-MMAF-二聚体-C5-NHS酯(116)
实例61-制备MMAF-四嗪(117)
实例62-用于共轭物的流程
MMAF-C5共轭物(118)
MMAE-PAB-Cit-Val-C5共轭物(119)
MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG5共轭物(120)
MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9共轭物(121)
奥瑞他汀F-C5共轭物(122)
美登醇DM1-dPEG4共轭物(123)
美登醇DM1-dPEG12共轭物(124)
玫瑰树碱-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG3共轭物(125)
玫瑰树碱-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-BCN-dPEG4共轭物(126)
SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-BCN-dPEG4共轭物(127)
DM1-Mal-SO3H共轭物(128)
美登醇-PEG2-Glu-BCN共轭物(129)
美登醇-SO3H-BCN-dPEG4共轭物(130)
MMAE-β-葡糖苷酸-C5共轭物(131)
PBD二聚体-MMAF-双-C5共轭物(132)
乙酸酯共轭物(133)
MMAF-dPEG4-TCO共轭物(135)
MMAF-C5/P5-C5双共轭物(136)
实例63.携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的高亲和力单链Fv抗体片段的表达和纯化
构筑高亲和力抗HER2细胞质表达scFv克隆株，TCT1067
通过诱变修饰实例27中的抗HER2scFv以使其结合亲和力增加超过1000倍[SchierR等人(1996)《分子生物学杂志》263,551-67]。此保持了多个充分间隔、最优定位的表面赖氨酸残基构形，并且如实例27中所描述表达和纯化。
所得蛋白质被称为scFv(TCT1067)。DNA和蛋白质序列如下：
裂解的TCT1067的DNA序列
GCGGTAGCGGAGGTAGCGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATTGCACCGATCGTACCTGCGCAGCGTGGCCTGAATGGCTGGGCGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTCACACCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAAGCTGGGATTATACCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTTGATGAGGCTCTAACTCTCCTCT[SEQ IDNO:3]
钥匙：
粗体＝在TEV裂解之后留下的残余Ser，加下划线的＝连接子区域(GSGGSG)
无格式的＝scFv序列，粗体斜体＝T7标签序列
裂解的scFv(TCT1067)的氨基酸序列
GSGGSGQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDVGYCTDRTCAAWPEWLGVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYGHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVL[SEQ ID NO:4]
氨基酸数目：272，分子量：28,219Da
理论PI：8.14，消光系数：70 735
实例64A.携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链Fv抗体片段与携有NHS的部分的生物共轭
使scFv共轭到有效负载-NHS的通用方法
最初，在所选缓冲液条件中检验纯有效负载-NHS的水解速率以便优化其可用性。考虑的其它因素有抗体于缓冲液中/pH/有机溶剂的稳定性、药物的稳定性和药物向反应中添加的量和速率。除非另外规定，否则始终鉴别和使用的条件是：
表15:
将scFv在4℃下解冻，并且通过离心(10min，10k rpm，4℃)收集形成的任何沉淀物。
在无水经过滤的DMSO中制得有效负载-NHS的储备溶液，并且通过离心收集任何沉淀物。将碳酸氢盐缓冲液pH 8.8在蛋白质低结合艾本德微管中与经过滤的无水DMSO组合，并且使混合物在热混合器上平衡(在于1000rpm下混合的同时，温度从4℃升高到20℃)。添加抗体，并且进一步平衡(20℃，1000rpm)10min，随后添加有效负载-NHS。这通过以下方式来执行：每隔70-120min添加x当量数(取决于有效负载)的NHS-药物DMSO储备液并且倒置以混合，随后在热混合器上置换并且在20℃，1000rpm下混合。所用的总当量数取决于所需DAR。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2-18hr。然后通过离心(2.5min，11krpm，4℃)收集样品。
使所有样品pH中和(通过添加0.1M NaH2PO4)，并且通过HPLC-SEC在TosohTSKGelG2000SWXL柱上、在pH 7，20℃下用10％IPA/PBS洗脱而纯化。始终保持样品和洗脱份为冷的(4℃)，将相关洗脱份合并并且在Vivaspin柱(HY或PES膜)(10,000MWCO)上浓缩。通过使用PBS旋转浓缩数次(至少500倍)去除IPA，通过0.2μm supor膜过滤，并且使用UV/Vis光谱法和氨基酸分析来定量。
通过以下各项来分析最终产物：
1.还原SDS-PAGE
预制还原SDS-PAGE凝胶(12％)常规地用于分析样品，并且经考马斯蓝染色。
2.氨基酸分析
在剑桥大学的蛋白质与核酸化学工厂通过氨基酸分析(AAA)准确地测定DAR和样品浓度。根据AAA，可以得出蛋白质和药物两者的mol量(归因于药物指纹释放，关于每种药物参看表16A)并且计算DAR(药物mol数/蛋白质mol数)。可以通过首先基于DAR计算共轭物分子量，并且然后随后将获自AAA的浓度转化为mg/ml蛋白质，来计算溶液中蛋白质的浓度。举例来说：scFv(TCT)是28162(MS)，DAR是‘X’，并且每个药物分子向抗体上增添‘XX’。因此，共轭物MW＝28162+(X×X)＝X。浓度是X nmol/ml，其等于Xμg/ml蛋白质。
表16A：使用氨基酸分析的定量
有效负载 释放并且用于定量的氨基酸
P5C5 5-氨基戊酸
西马多丁 4-氨基甲基苯甲酸
MMAF 无非典型者，使用计算的过量苯基丙氨酸
AF 5-氨基戊酸
MMAE 鸟氨酸(来自瓜氨酸)
DM1 无可鉴别的片段
3.HPLC-SEC
将样品在Tosoh TSKGel G2000SWXL或Sepax Zenix-C SEC-150，3μm，7.8×300mm上分析和/或纯化，在214和280nm，流速0.5ml/min，20℃下监测30min，样品在4℃下。典型地，注射20μg蛋白质用于分析运行和300μg用于半制备型运行。
4.质谱法
样品制备：通过在10.5g下离心在COSTAR(R)SPIN-X(R)(西格玛奥德里奇)上使游离抗体和共轭物(有效负载MMAF、P5C5、AuF和MMAE)脱盐2min。
典型地，对于游离抗体、P5、AF和MMAE共轭物，使用20-30μg蛋白质。对于MMAF，使用80μg蛋白质。
使用0.5mL zeba柱(赛默飞世尔(thermofisher))、注射30μg蛋白质来使DM1共轭物脱盐。
在连接到MSQ Plus Single Quad Detector(SQD)的安捷伦(Agilent)1100系统上执行液相色谱法实验。在0.5ml/min下，10min梯度从95％A到50％B然后在50％B下保持5min，使用XBridge柱BEH300C4 3.5μm 2.1×100mm，其中
A：H2O/0.1％FA
B：90％CH3CN/H2O(0.1％FA)
波长：254nm。
优化仪器的参数以使高分子量物质可稳定和传输。扫描范围：m/z＝500-2000。扫描时间：1.5s。数据以连续模式获得。MS的电喷雾源在4.2kV的毛细管电压和50V的锥电压下操作。氮气以600L/h的总流量用作雾化和去溶剂化气体。通过整合3.5-5.0min范围内的总离子色谱图(TIC)来生成离子系列。使用预安装的ProMass软件由离子系列重构蛋白质样品的总质谱。
5.借助Biacore表面等离子共振(SPR)的结合分析
通过Biacore SPR在Biacore T200上测定与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。如下，标准胺偶合方法用以制备所有Biacore表面(CM5或CM3)。通过以30μl/min注射0.2M EDC于0.05M NHS中的新鲜混合溶液独立地活化流动细胞。注射12.5μg/ml Her2，直到达到所要的固定水平(典型地约1500RU)。使用1M乙醇胺溶液使过量NHS酯去活化。为了在HER2芯片上测量抗体和共轭物的动力学，以30μl/min注射三倍连续稀释(典型地对于游离抗体在5、2.5、1.25、0.6μg/ml下或更低，并且对于共轭物在20、10、5、2.5μg/ml下)160s，提供900s的解离阶段。对于最高浓度，使解离时间延长到3600s。通过45s注射MgCl2 8M使表面再生。
为了评估结合能力，在30μl/min下以60s注射所要化合物、随后60s等待时间和45s在10μl/min下使用MgCl2 8M再生，来执行手动运行。所有数据都使用软件BIAEvaluation分析。
用于关于体内样品制备按比例扩大共轭的方法
将新鲜过滤的生物共轭缓冲液在50ml falcon管中与新鲜过滤的无水DMSO组合，并且在热混合器上平衡(在4℃，800rpm下12min，在20℃，500rpm下6min)。将scFv在4℃下解冻，并且通过离心(10min，10k rpm，4℃)收集形成的任何沉淀物。将有效负载-NHS的储备溶液溶解于无水经过滤的DMSO中，并且通过离心收集形成的任何沉淀物。将抗体添加到缓冲液混合物中，并且使其在热混合器上在20℃，350rpm下平衡10min，随后添加有效负载-NHS。这通过以下方式来执行：添加所需当量的有效负载-NHS DMSO储备液，随后在热混合器上置换并且在20℃，350rpm下混合。在最后一次添加之后使样品保持于热混合器上再2hr/18hr。然后除非另外陈述，否则将样品通过离心(20min，4k rpm，4℃)收集，并且通过SEC在AKTAAvant系统上使用Superdex 75，26/600柱、用10％IPA/PBS洗脱而纯化。在2.6ml/min，检测波长214和280nm下使用柱的最大流速。在纯化过程的始终保持粗样品和洗脱份为冷的。将洗脱份合并并且使用Vivacell 100 10kMWCO(PES膜)(赛多利斯(Sartorius))浓缩，随后使用相同工艺缓冲液交换到PBS中。将浓缩并且缓冲液交换的样品通过UV/Vis光谱法定量，通过无菌0.2μm supor膜过滤，再定量，相应地稀释，并且如前所述通过SDS-PAGE、HPLC-SEC、氨基酸分析、质谱法和借助Biacore SPR的结合分析来分析。
合成曲妥珠单抗-有效负载共轭物作为对照样品。如上文关于scFv所描述执行这些反应，应注意蛋白质浓度和有效负载NHS添加的变化：
表16B：曲妥珠单抗生物共轭的反应条件
使用以下反应条件制得以下曲妥珠单抗共轭物：
曲妥珠单抗-P5-C5；6当量，曲妥珠单抗-MMAF-C5；7当量，曲妥珠单抗-AF-C5；5.5当量，曲妥珠单抗-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9；6当量。
使用适当HPLC-SEC柱，Tosoh TSKGel G3000SWXL和AKTA Avant Superdex 200，26/600根据scFv加工共轭物。
实例64B.携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链Fv抗体片段与小的携有NHS的部分的生物共轭展现了完全OptiLinked共轭能力
使小分子乙酸酯-NHS(CH3-CO-NHS)共轭到scFv(TCT和TCT1067)以获得具有高DAR的共轭物(化合物133)(其中“药物”＝小分子乙酸酯有效负载)。所鉴别和执行的用于共轭的条件是：
表17：乙酸酯-NHS生物共轭的反应条件
类型 条件
缓冲液 在pH 8.8下的具有150mM NaCl的碳酸氢盐缓冲液
共溶剂 最终20％(v/v)浓度下的无水经过滤的DMSO
温度 20℃
搅动 热混合器1000rpm
抗体浓度 1mg/ml
乙酸酯-NHS处置 100mM于100％无水经过滤的DMSO中的溶液
乙酸酯-NHS添加速率 每隔90min
乙酸酯-NHS添加份 16当量
根据实例64A执行反应。
在此实例中，设置是：
反应1-scFv(TCT):Ac-NHS，110当量；
反应2-scFv(TCT1067):Ac-NHS，110当量
通过HPLC尺寸排阻色谱法分析非共轭和共轭scFv(TCT和TCT1067)。scFv(TCT1067)的滞留时间是7.53min，与约30kDa的MW相关。其共轭物在7.23min洗脱得更早，指示更大分子量，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图44)。ScFv(TCT)的滞留时间是7.36min，与约30kDa的MW相关。其共轭物在7.15min洗脱得更早，指示更大分子量(归因于变化的小分子负载量)，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图44)。
LC-MS方法和数据采集(变性、非共价条件)
scFv(TCT和TCT1067)-乙酸酯的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图45和46和表18中的概述中。
在scFv(TCT和TCT1067)-乙酸酯样品的TIC中观察到单一主峰。TCT-乙酸酯在10.1min洗脱并且TCT1067-乙酸酯在10.3min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了对于TCT-乙酸酯在m/z 28792并且对于TCT1067-乙酸酯在28891的主峰，其与scFv(TCT和TCT1067)分子的所提供理论质量以及分别15和16个小分子添加一致。
scFv(TCT和TCT1067)-乙酸酯共轭物的结合活性
如上文所描述制备和表征scFv(TCT和TCT1067)-乙酸酯共轭物。通过Biacore SPR测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。
scFv(TCT)-乙酸酯DAR 15的缔合速率是5.93×106M-1s-1并且解离速率是1.71×10-2s-1，得到2.9nM的总体结合Kd。这非常类似于未经修饰的scFv(TCT)，其缔合速率是2.8×106M-1s-1并且解离速率是4.17×10-3s-1，总体结合Kd是1.49nM，表明结合功能未损失。
scFv(TCT1067)-乙酸酯DAR 16的缔合速率是3.63×106M-1s-1并且解离速率是7.64×10-5s-1，得到21pM的总体结合Kd。这非常类似于未经修饰的scFv(TCT1067)，其缔合速率是3.9×106M-1s-1并且解离速率是3.7×10-5s-1，总体结合Kd是9.5pM，表明结合功能未损失。
总体小分子(乙酸酯)结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了具有极高产率的低、中和高DAR共轭物的受控共轭反应。在任一共轭物中都未观察到抗体/共轭物的沉淀，并且回收率总体极高。在SEC HPLC纯化之后，将所得共轭物浓缩到约1mg/ml。
用于分析的正交技术一致并且支持：由scFv(TCT或TCT1067)例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基满载有多个分子，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持结合功能和亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。得到HPLC SEC迹线支持的LCMS数据指示，两种抗体都可以有效地共轭到完全赖氨酸占用以获得单体共轭物。在两种情况下共轭物展示的SEC滞留时间都短于各别抗体对照。LCMS指示，在两种情况下共轭物的DAR都高于每种抗体的赖氨酸的总数目。当在高度碱性pH下以大量过量小NHS活化分子实施反应时，二级氨基酸将有可能开始共轭。在此情况下，我们推测主要是12个赖氨酸、1个末端胺被修饰。
实例65.具有短连接子的MMAF衍生物向两种携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链Fv抗体片段上的生物共轭
实例65A.具有C5连接子的ScFv(TCT)-MMAF
使MMAF-C5-NHS(化合物78)共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物118)。控制反应以获得具有中和高DAR的产物。所鉴别和执行的用于共轭的条件是：
表19：MMAFC5-NHS生物共轭的反应条件
类型 条件
缓冲液 在pH8.8下的具有150mMNaCl的碳酸氢盐缓冲液
共溶剂 最终20％(v/v)浓度下的无水经过滤的DMSO
温度 20℃
搅动 热混合器1000rpm
抗体浓度 1mg/ml
MMAF-C5-NHS处置 50mM于100％无水经过滤的DMSO中的溶液
MMAF-C5添加速率 每隔90min
MMAF-C5-NHS添加份 10当量
根据实例64A执行反应，应注意在样品纯化后分辨的粗样品中观察到一些微小凝集。回收率是约50％。此反应是可缩放的。
在此实例中，设置是：
反应1-scFv-TCT：MMAF-C5-NHS，60当量和
反应2-scFv-TCT：MMAF-C5-NHS，100当量
通过HPLC尺寸排阻色谱法分析非共轭和共轭scFv(TCT)。scFv的滞留时间是17.9min，与约30kDa的MW相关。两种共轭物洗脱得逐渐地更早，对于ADC 1在16.4min并且对于ADC 2在16.1min，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图47)。共轭反应2展示17％下的一些凝集，其可以被去除。反应2的SDS-PAGE凝胶展示了完全共轭和更高分子量(图48)。
在剑桥大学的蛋白质与核酸化学工厂通过氨基酸分析(AAA)测定DAR，以获得表20-21中展示的结果。
表20.展示反应1的DAR 6.6的AAA结果的概述
表21.展示反应2的DAR 8的AAA结果的概述
如实例64A中所描述执行LC-MS分析。
scFv(TCT)-C5-MMAF 1和2的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图49和50和表22中的概述中。
在scFv(TCT)-C5-MMAF 1样品的TIC中观察到主峰，在10.2min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 30645、31473、32301和33129的主峰，其与scFv(TCT)分子的所提供理论质量以及3-6次MMAF-C5分子添加一致。对于样品2，在TIC中在9.9-11.4min观察到主峰，对应于m/z 31474、32302、33130和33958下的零电荷去卷积质量，其与scFv(TCT)的所提供理论质量以及4-7次MMAF-C5添加一致。
因此，对于
反应1，DAR借助AAA是6.64，并且借助MS是4.5，平均值是5.6
反应2，DAR借助AAA是8.0，并且借助MS是5.5，平均值是6.8。
scFv(TCT)-MMAF-C5共轭物的结合活性
如上文所描述制备和表征ScFv(TCT)-MMAF-C5(化合物118)。如同在实例64A中，通过Biacore SPR测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。
scFv(TCT)-MMAF-C5 1DAR 5.6的缔合速率是7.7×105M-1s-1并且解离速率是4.2×10-3s-1，得到5.4nM的总体结合Kd。scFv(TCT)-MMAF-C5DAR 6.8的缔合速率是1.2×106M-1s-1并且解离速率是4.2×10-3s-1，得到3.6nM的总体结合Kd。这与未经修饰的scFv(TCT)相比基本上不变，未经修饰的scFv(TCT)的缔合速率是2.8×106M-1s-1并且解离速率是4.17×10-3s-1，总体结合Kd是1.49nM，表明结合功能未损失。
总体TCT-MMAF-C5结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了受控共轭反应以获得中和高DAR共轭物。在合成期间观察到抗体/共轭物的最少沉淀。在SEC HPLC纯化之后，将所得共轭物浓缩到约1.5mg/ml，并且在缓冲液中稳定数月。
用于分析的正交技术一致并且支持：由scFv(TCT)例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基负载有多个药物，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持结合功能和亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。在HPLC中，样品归因于其增加的尺寸而比scFv(TCT)滞留时间逐渐地更短、从SEC柱更快洗脱。氨基酸分析是用于进一步定量分析和补充MS数据的非常有用的工具。
实例65B.具有C5连接子的ScFv(TCT1067)-MMAF
使MMAF-C5-NHS(化合物78)共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物118)。所鉴别和执行的条件是：
表23：MMAF-C5-NHS生物共轭的反应条件
类型 条件
缓冲液 在pH8.8下的具有150mM NaCl的碳酸氢盐缓冲液
共溶剂 最终20％(v/v)浓度下的无水经过滤的DMSO
温度 20℃
搅动 热混合器1000rpm
抗体浓度 1mg/ml
MMAF-C5-NHS处置 0mM于100％无水经过滤的DMSO中的溶液
MMAF-C5添加速率 每隔90min
MMAF-C5-NHS添加份 10当量
根据实例64A执行反应，应注意在样品纯化后分辨的粗样品中观察到一些微小凝集。总回收率是约50-60％。这些反应是可缩放的。
在此实例中，设置是：
反应1-scFv-TCT1067：MMAF-C5-NHS，60当量和
反应2-scFv-TCT1067：MMAF-C5-NHS，100当量。
通过HPLC尺寸排阻色谱法分析非共轭和共轭scFv(TCT1067)。ScFv的滞留时间是18.1min，与约30kDa的MW相关。两种共轭物都洗脱得稍微地并且逐渐地更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图51)。
在剑桥大学的蛋白质与核酸化学工厂通过氨基酸分析(AAA)准确地测定DAR，如表24和25中所示。
表24.展示反应1的DAR 6.4的AAA结果的概述
表25.展示反应2的DAR 8.6的AAA结果的概述
如实例64A中所描述执行LC-MS分析。
scFv(TCT1067)-C5-MMAF 1和2的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图52和表26中的概述中。
在scFv(TCT1067)-C5-MMAF 1样品的TIC中观察到主峰，在10.1min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 29874、30702、31530、32358和33186的主峰，其与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量以及2-6次MMAF分子添加一致。对于样品2，TIC具有在9.3-12min洗脱的主峰。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z30703、31531、32358、33186、34015和34843的主峰，其与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量以及3-8次MMAF分子添加一致。
因此，
对于样品1，DAR借助AAA是6.4并且借助MS是4.0，平均值是5.2
对于样品2，DAR借助AAA是8.6并且借助MS是5.5，平均值是7.1。
scFv(TCT1067)-MMAF-C5共轭物的结合活性
如上文所描述制备和表征ScFv(TCT1067)-MMAF-C5(化合物118)。如实例64A中所描述，通过Biacore SPR测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。
scFv(TCT1067)-MMAF-C5DAR 5.2的缔合速率是1.8×106M-1s-1并且解离速率是3.4×10-5s-1，得到19.6pM的总体结合Kd。scFv(TCT)-MMAF-C5DAR 7.1的缔合速率是4.6×106M-1s-1并且解离速率是1.7×10-5s-1，得到3.8pM的总体结合Kd。这与未经修饰的scFv(TCT1067)相比基本上不变，未经修饰的scFv(TCT1067)的缔合速率是3.9×106M-1s-1并且解离速率是3.7×10-5s-1，总体结合Kd是9.5pM，表明结合功能未损失。
总体scFv(TCT1067)-MMAF-C5结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了受控共轭反应以获得中和高DAR共轭物。在纯化后分辨的高DAR共轭物中观察到抗体/共轭物的极少沉淀(中DAR观察到无沉淀)。在SEC HPLC纯化之后，将所得共轭物浓缩到约1-3mg/ml，并且在缓冲液中稳定数月。
用于分析的正交技术一致并且支持：由scFv(TCT1067)例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基负载有多个药物，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持结合功能和亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。在SDS凝胶(图53)上，具有中DAR(样品1)的经纯化共轭物运行得略高并且多分散性更大，而对于高DAR(样品2)，在凝胶上存在明显迁移偏移，其中样品的尺寸明显大于对照未经修饰的scFv(TCT1067)。这些观察结果进一步得到了HPLC的支持，其中样品归因于其增加的尺寸而比TCT1067滞留时间逐渐地更短、从SEC柱更快洗脱。氨基酸分析是用于进一步定量分析和补充MS数据的非常有用的工具。质谱法鉴别出同一样品内的高和低DAR两者，而AAA给出平均值。
实例66.P5-C5衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的高亲和力单链Fv抗体片段上的生物共轭
使P5-C5-NHS(化合物6)共轭到scFv(TCT1067)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物71)。控制反应以获得具有高DAR的产物。所鉴别和执行的用于共轭的条件是：
表27：P5-C5-NHS生物共轭的反应条件
如实例64A中所详述执行反应。
在此实例中，设置是：
反应1-scFv(TCT1067):P5-C5-NHS，60当量；
通过HPLC尺寸排阻色谱法分析非共轭和共轭scFv(TCT1067)。scFv的滞留时间是18.1min，与约30kDa的MW相关。共轭物在16.5min洗脱得稍微地更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图54)。与scFv相比，SDS-PAGE凝胶(图55)展示了具有低分散度和更大分子量的清洁共轭物。此反应是可缩放的。
还在剑桥大学的蛋白质与核酸化学工厂通过氨基酸分析(AAA)测定DAR，并且结果展示于表28中。
表28.展示DAR 10.4的AAA结果的概述
如实例64A中所描述执行质谱分析。
scFv(TCT1067)-P5-C5的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图56中。
在scFv(TCT1067)-P5-C5样品的TIC中观察到主峰，在7.8min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列如表29中所示的主峰，其与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量以及10-14个P5-C5分子添加一致，得到平均DAR 11.7。这与DAR 10.4的AAA测定非常相关。
总的来说，对于scFv(TCT1067)-P5-C5，DAR借助AAA是10.4并且借助MS是11.7，总体平均值是10.9。
scFv(TCT1067)-P5-C5共轭物的结合活性
如上文所描述制备和表征ScFv(TCT1067)-P5-C5(化合物71)。如实例64A中所描述，通过Biacore SPR测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。
scFv(TCT1067)-P5-C5DAR 10.9的缔合速率是2.36×105M-1s-1并且解离速率是7.13.×10-5s-1，得到302pM的总体结合Kd。与未经修饰的scFv(TCT1067)相比，缔合速率有中等降低(归因于抗体结合位点受高数目连接的有效负载的可逆空间位阻)，但在结合后，对解离速率有微不足道的效果，未经修饰的scFv(TCT1067)的缔合速率是3.9×106M-1s-1并且解离速率是3.7×10-5s-1，总体结合Kd是9.5pM。
总体scFv(TCT1067)-P5-C5结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了具有高产率的高DAR共轭物的受控共轭反应。在任一共轭物中都未观察到抗体/共轭物的沉淀，并且总回收率极高约60％。在SECHPLC纯化之后，将所得共轭物浓缩到约3mg/ml，并且在缓冲液中稳定数月。
用于分析的正交技术一致并且支持：由scFv(TCT1067)例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基负载有多个药物，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持结合亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。LCMS、SEC和AAA数据支持：制备了具有高DAR的单体共轭物。结合Biacore数据，此共轭物保持结合到HER2。质谱法鉴别出同一样品内的高和较低DAR两者，而AAA给出平均值。
实例67.具有短连接子的奥瑞他汀F衍生物向两种携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的单链Fv抗体片段上的生物共轭
实例67A.具有C5连接子的ScFv(TCT)-奥瑞他汀F
使奥瑞他汀F-C5-NHS(化合物88)共轭到scFv(TCT)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物122)。控制反应以获得具有高DAR的产物。所鉴别和执行的条件是：
表30：奥瑞他汀F-C5-NHS生物共轭的反应条件
类型 条件
缓冲液 在pH8.8下的具有150mM NaCl的碳酸氢盐缓冲液
共溶剂 最终20％(v/v)浓度下的无水经过滤的DMSO
温度 20℃
搅动 热混合器1000rpm
抗体浓度 1mg/ml
AF-C5-NHS处置 50mM于100％无水经过滤的DMSO中的溶液
AF-C5-NHS添加速率 每隔120min
AF-C5-NHS添加份 10当量
如实例64A中所详述执行反应。在此实例中，设置是：
反应1-scFv-TCT-奥瑞他汀F-C5-NHS，30当量；
通过HPLC尺寸排阻色谱法分析非共轭和共轭scFv(TCT)。scFv的滞留时间是7.4min，与约30kDa的MW相关。共轭物在7.2min洗脱得稍微地更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图57)。这些反应是可缩放的。
如实例64A中所描述执行LC-MS分析。
scFv(TCT)-奥瑞他汀F-C5的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图58和表31中的概述中。
在scFv(TCT)-奥瑞他汀F-C5样品的TIC中观察到主峰，在9.5min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 33125、33953、34780、35607、36435和37261的主峰，其与scFv(TCT)分子的所提供理论质量以及6-11次MMAF分子添加一致。
scFv(TCT)-C5-奥瑞他汀F共轭物的结合活性
如上文所描述制备和表征ScFv(TCT)-奥瑞他汀F-C5(化合物122)。如实例64A中所描述，验证其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合功能。
总体scFv(TCT)-奥瑞他汀F-C5结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了具有高产率的高DAR共轭物的受控共轭反应。在SEC HPLC纯化之后，将所得共轭物浓缩到约600μg/ml，并且在缓冲液中稳定数周。回收率再次很高，是约50％。
用于分析的技术支持：由TCT例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基负载有多个药物，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持结合亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。LCMS数据进一步得到了HPLC-SEC的支持，其中样品归因于其增加的尺寸而比TCT滞留时间更短、从SEC柱更快洗脱。
实例67B.具有C5连接子的ScFv(TCT1067)-奥瑞他汀
使奥瑞他汀F-C5-NHS(化合物88)共轭到scFv(TCT1067)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物122)。控制反应以获得具有中和高DAR的产物。所鉴别和执行的条件是：
表32：奥瑞他汀F-C5-NHS生物共轭的反应条件
类型 条件
缓冲液 在pH8.8下的具有150mM NaCl的碳酸氢盐缓冲液
共溶剂 最终20％(v/v)浓度下的无水经过滤的DMSO
温度 20℃
搅动 热混合器1000rpm
抗体浓度 1mg/ml
AF-C5-NHS处置 50mM于100％无水经过滤的DMSO中的溶液
AF-C5-NHS添加速率 每隔120min
AF-C5-NHS添加份 1×5当量(反应1)；2×10当量(反应2)；3×8.3当量(反应3)
根据实例64A执行反应，应注意，唯一微量可见的沉淀在具有最高药物当量数的样品中。这通过离心和后续纯化而分辨。
在此实例中，设置是：
反应1-scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5-NHS，5当量；
反应2-scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5-NHS，10当量；
反应3-scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5-NHS，25当量
还在剑桥大学的蛋白质与核酸化学工厂通过氨基酸分析(AAA)测定DAR，并且结果展示于表33-35中。
表33.展示DAR 3.64的AAA结果的概述
表34.展示DAR 6.31的AAA结果的概述
表35.展示DAR 13.4的AAA结果的概述
通过HPLC尺寸排阻色谱法分析非共轭和共轭scFv(TCT1067)。scFv的滞留时间是18.1min，与约30kDa的MW相关。三种共轭物都洗脱得稍微地并且逐渐地更早(在17.9min、17.92min和17.87min)，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图59)。
如实例64A中所描述执行LC-MS分析。
scFv(TCT1067)-C5-奥瑞他汀F的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图60和表36中的概述中。
在scFv(TCT1067)-C5-奥瑞他汀F反应1的TIC中观察到主峰，在8.19min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 29037、29865、30692、31519和32345的主峰，其与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量以及1-5个奥瑞他汀F分子添加一致，平均DAR是2.9。
在scFv(TCT1067)-C5-奥瑞他汀F反应2的TIC中观察到主峰，在9.47min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 29866、30692、31519、32347、33174和34001的主峰，其与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量以及2-7个奥瑞他汀F分子添加一致，平均DAR是4.98。
在scFv(TCT1067)-C5-奥瑞他汀F反应3的TIC中观察到主峰，在9.97min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 34826、35653、36480、37307、38134和38960的主峰，其与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量以及8-13个奥瑞他汀F分子添加一致，平均DAR是10.3。
因此，总的来说，
对于反应1，DAR借助AAA是3.64并且借助MS是2.9，平均DAR是3.3。
对于反应2，DAR借助AAA是6.31并且借助MS是4.98，平均DAR是5.65。
对于反应3，DAR借助AAA是13.4并且借助MS是10.4，平均DAR是11.9。
运行SDS-PAGE(图61)，其展示增加的共轭物分子量，但值得注意地，反应样品3的高DAR物质的高均质性。
scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物的结合活性
如上文所描述制备和表征ScFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5共轭物(化合物122)。如实例64A中所描述，通过Biacore SPR测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。
scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5DAR 3.3的缔合速率是5.56×105M-1s-1并且解离速率是1.82×10-5s-1，得到32.8pM的总体结合Kd。
scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5DAR 5.65的缔合速率是3.36×105M-1s-1并且解离速率是1.35×10-5s-1，得到40.3pM的总体结合Kd。
scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5DAR 11.9的缔合速率是2.17×104M-1s-1并且解离速率是1.76×10-5s-1，得到810pM的总体结合Kd。
低和中DAR样品的亲和力非常类似于未经修饰的scFv(TCT1067)，其缔合速率是3.9×106M-1s-1并且解离速率是3.7×10-5s-1，总体结合Kd是9.5pM，表明结合功能未损失。与未经修饰的scFv相比，高DAR样品的缔合速率有中等降低(归因于抗体结合位点受高数目连接的有效负载的可逆空间位阻)，但在结合后，对解离速率有微不足道的效果。
总体scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了具有高产率的低、中和高DAR共轭物的受控共轭反应。在纯化和加工之后，将共轭物浓缩到约9mg/ml，并且在缓冲液中稳定数月。
用于分析的正交技术一致并且支持：由scFv(TCT1067)例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基负载有多个药物，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持功能和结合亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。具有低DAR(反应1)的经纯化共轭物在凝胶上运行得更接近对照scFv(TCT)，并且多分散性比运行得略高并且多分散性更大的中DAR(反应2)更小，而对于高DAR(反应3)，在凝胶上存在明显迁移偏移，其中样品的尺寸明显大于对照未经修饰的scFv(TCT1067)。这些观察结果进一步得到了HPLC SEC的支持，其中样品归因于其增加的尺寸而比TCT滞留时间逐渐地更短、更快洗脱。氨基酸分析是用于进一步定量分析和支持LC-MS数据的非常有用的工具。
实例68.具有蛋白酶可裂解连接子的MMAE衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的高亲和力单链Fv抗体片段上的生物共轭
使细胞毒性药物MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9NHS(化合物86)共轭到scFv(TCT1067)以获得具有高DAR的共轭物(化合物121)。所鉴别和执行的条件是：
表37：MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9NHS生物共轭的反应条件
如实例64A中所详述执行反应，应注意，MMAE-PABA-vc-PEG9-NHS需要重复涡旋以完全可溶于DMSO中。在低盐缓冲液中执行反应。粗共轭物不具有可见沉淀，并且将其通过SEC在AKTA Avant系统上使用Superdex 75，26/600柱、用10％IPA/20mM NaCl磷酸盐缓冲液pH 7洗脱而纯化。将洗脱份合并并且使用Vivacell 100 10kMWCO(PES膜)(赛多利斯)浓缩，随后使用相同工艺缓冲液交换到20mM NaCl磷酸盐缓冲液pH 7中。HPLC-SEC运行(图62)展示单一单体峰，具有极低凝集。此反应是可缩放的。
反应1-scFv-TCT1067:MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9 30当量；
还在剑桥大学的蛋白质与核酸化学工厂通过氨基酸分析(AAA)测定DAR，并且结果展示于表38中。
表38.展示反应1的DAR 9.6的AAA结果的概述
如实例64A中所描述执行质谱分析。scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图63和表39中的概述中。
在样品的UV/TIC中观察到对应于各种DAR物质的数个峰，在10与12min之间洗脱。每个峰的零电荷去卷积质谱对应于一系列在m/z 37837、39439、41042和42644的主峰，其与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量与6-9个MMAE部分添加一致。
因此，总的来说，
对于scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9反应1，DAR借助AAA是9.6并且借助LC-MS是7.5，平均DAR是8.6。
运行SDS-PAGE(图64)，其展示增加的共轭物分子量，但值得注意地，反应样品1的高DAR物质的高均质性。
scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9共轭物的结合活性
如上文所描述制备和表征TCT(1067)-MMAE-PABA-vc-PEG9(化合物121)。如实例64A中所描述，通过Biacore SPR测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。
scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9共轭物DAR 8.6的缔合速率是2.21×104M-1s-1并且解离速率是2.23×10-5s-1，得到1nM的总体结合Kd。与未经修饰的scFv(TCT1067)相比，缔合速率有所降低(归因于抗体结合位点受高数目连接的有效负载的可逆空间位阻)，但在结合后，对解离速率有微不足道的效果，未经修饰的scFv(TCT1067)的缔合速率是3.88×106M-1s-1并且解离速率是3.69×10-5s-1，总体结合Kd是9.5pM。
总体scFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9结论
如上详述优化共轭条件，获得具有高DAR的共轭物。在纯化、浓缩和过滤之后，所得共轭物呈现为在缓冲液中稳定数周。
用于分析的正交技术一致并且支持：由TCT(1067)例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基负载有多个药物，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持结合亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。具有高DAR(反应1)的经纯化共轭物在凝胶上存在明显迁移偏移，其中样品的尺寸大于对照未经修饰的TCT1067。这些观察结果进一步得到了HPLC SEC的支持，其中样品归因于其增加的尺寸而滞留时间显著更短，在15.1min洗脱相较于对照在18.1min洗脱；从SEC柱更快洗脱。氨基酸分析是用于进一步定量分析和支持LC-MS数据的非常有用的工具。
实例69.两种不同有效负载类型向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的scFv抗体片段上的生物共轭
使细胞毒性药物P5-C5-NHS(化合物6)和MMAF-C5-NHS(化合物78)共轭到scFv(TCT1067)以获得具有高DAR的共轭物(化合物135)。所鉴别和执行的用于共轭的条件是：
表40：MMAF/P5C5双有效负载生物共轭的反应条件
根据实例64A执行反应，应注意，在首次添加期间添加MMAF-C5-NHS和并且后续两次添加执行添加P5-C5-NHS。所有其它处置和纯化过程都如同实例64A。
反应1-scFv-TCT1067:MMAF-C5-P5-C5；11当量MMAF-C5NHS和21当量P5-C5NHS；
通过HPLC尺寸排阻色谱法分析非共轭和共轭scFv(TCT1067)。scFv的滞留时间是18.1min，与约30kDa的MW相关。共轭物在17.8min洗脱得稍微地更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，但作为单一锐单体峰，指示无凝集(图65)。
还在剑桥大学的蛋白质与核酸化学工厂通过氨基酸分析(AAA)测定DAR，并且结果展示于表41中。
表41.展示双有效负载DAR的AAA结果的概述
如实例64A中所描述执行LC-MS分析。
scFv(TCT1067)-MMAF-C5/P5-C5的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图66和表42中的概述中。
在scFv(TCT1067)-MMAF-C5/P5-C5样品的TIC中观察到主峰，在8.7-10.5min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 31332、31964、32597、33230、33963、31135、31769、32499、30307、30940、31673、32306、30113、30746、31478、32109的主峰。
这些与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量以及MMAF-C5和P5-C5的数种组合一致，如表42中所指示。
总体scFv(TCT1067)-MMAF-C5/P5-C5结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了具有高产率的高DAR共轭物的受控共轭反应。将所得共轭物浓缩到约1.5g/ml，并且在缓冲液中稳定数周。
实例70.具有连接子的美登素-DM1衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的高亲和力单链Fv抗体片段上的生物共轭
使美登素DM1-dPEG12-NHS(化合物90)共轭到scFv(TCT1067)以获得具有各种DAR的共轭物(化合物124)。所鉴别和执行的条件是：
表43：DM1-dPEG12-NHS生物共轭的反应条件
类型 条件
缓冲液 在pH8.0下的PBS缓冲液和0.1％聚山梨醇酯-20
共溶剂 最终20％(v/v)浓度下的无水经过滤的DMSO
温度 20℃
搅动 热混合器1000rpm
抗体浓度 1mg/ml
美登素DM1-PEG(12)-NHS处置 100mM于100％无水经过滤的DMSO中的溶液
美登素DM1-PEG(12)-NHS添加速率 每隔120min
美登素DM1-PEG(12)-NHS添加份 8当量
根据表37和实例64A设置反应，应注意，在添加药物储备液到反应之前，将所需要的总量稀释于反应所需要的总DMSO体积的25％中。通过添加16当量NHS-药物DMSO执行药物添加，形成此新的储备溶液。在反应完成时沉淀可见，并且其随当量数增加而增加。
在此实例中，设置是：
反应1-scFv-TCT1067：DM1-dPEG12NHS，16当量；
反应2-scFv-TCT1067：DM1-dPEG12NHS，32当量
通过HPLC尺寸排阻色谱法分析非共轭和共轭scFv(TCT1067)(图67)。scFv的滞留时间是19min，与约30kDa的MW相关。两种共轭物都洗脱得稍微地并且逐渐地更早，指示更大分子量(归因于变化的载药量)，观察到一些凝集，如下：
反应1 1％凝集物
反应2 4％凝集物
如实例64A中所描述执行LC-MS分析。
scFv(TCT1067)-DM1-dPEG12的LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图68和表44中的概述中。
在样品1中，在scFv(TCT1067)-DM1-dPEG12样品的TIC中观察到主峰，在11min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了一系列在m/z 37144、38631和40079的主峰，其与scFv(TCT1067)分子的所提供理论质量以及6、7和8次美登素DM1分子添加一致。在样品2中，共轭物在11.5min洗脱，并且去卷积质量得到在m/z 40123的峰，其对应于scFv(TCT1067)以及8次美登素DM1添加。
运行SDS-PAGE(图69)，其展示增加的共轭物反应样品1和2分子量。
scFv(TCT1067)-DM1-dPEG12的结合活性
如上文所描述制备和表征ScFv(TCT1067)-DM1-dPEG12(化合物124)。如实例64A中所描述，通过Biacore SPR测定其与未经修饰的scFv相比针对固定的HER2靶抗原的结合亲和力。
scFv(TCT1067)-DM1-dPEG12DAR 8的缔合速率是1.32×104M-1s-1并且解离速率是3.28×10-5s-1，得到2.48nM的总体结合Kd。scFv(TCT1067)-DM1-dPEG12DAR 7的缔合速率是1.95×104M-1s-1并且解离速率是2.7×10-5s-1，得到1.39nM的总体结合Kd。与未经修饰的scFv(TCT1067)相比，两种共轭物的缔合速率都有中等降低
(归因于抗体结合位点受高数目连接的有效负载的可逆空间位阻)，
但在结合后，对解离速率有微不足道的效果，未经修饰的scFv(TCT1067)的缔合速率是3.9×106M-1s-1并且解离速率是3.7×10-5s-1，总体结合Kd是9.5pM。
总体scFv(TCT1067)-DM1-dPEG12结论，生物物理学数据
如上文所详述优化共轭条件。此优化提供了受控共轭反应以获得具有中和高DAR的共轭物。将经纯化共轭物浓缩到约500μg/ml于缓冲液中。
用于分析的正交技术一致并且支持：由scFv(TCT1067)例示的优化的scFv结构可以使用抗体上的赖氨酸残基负载有多个药物，并且共轭可以受控制以获得具有所要DAR同时保持结合亲和力的单体共轭物(如通过SEC-HPLC所展示)。在SDS凝胶上，具有中DAR(样品1)的经纯化共轭物运行得略高并且多分散性更大，而对于高DAR(样品2)，在凝胶上存在明显迁移偏移，其中样品的尺寸明显大于对照未经修饰的scFv(TCT1067)。这些观察结果进一步得到了HPLC的支持，其中样品归因于其增加的尺寸而比TCT滞留时间逐渐地更短、从SEC柱更快洗脱。
实例71.奥瑞他汀F与具有未最优分散的(‘非OptiLinked’)高赖氨酸含量的scFv的生物共轭产生凝集和低于所要的药物：抗体比率
基于帕尼单抗单克隆抗体[SEQ ID 5]的scFv具有高亲和力[US 8227580B2]并且具有8个赖氨酸残基，预计所述赖氨酸残基表面暴露、但不处于最优空间配置并且与仅具有4个类似位置的scFv(TCT1067)的实例相比不在优选位置(参看下文)。使用确定方法[Bhatti M等人(2008)122：1155]构筑、表达和纯化此帕尼单抗scFv(scFv(Pan))，并且在与scFv(TCT1067)相同的条件下使用有效负载奥瑞他汀F用于生物共轭反应中。所用的条件是：
表44A AF-C5-NHS生物共轭的反应条件
类型 条件
缓冲液 在pH8.8下的具有150mMNaCl的碳酸氢盐缓冲液
共溶剂 最终20％(v/v)浓度下的无水经过滤的DMSO
温度 20℃
搅动 热混合器1000rpm
抗体浓度 0.83mg/ml
AF-C5-NHS处置 50mM于100％无水经过滤的DMSO中的溶液
AF-C5-NHS添加速率 每隔120min
AF-C5-NHS添加份 5当量
帕尼单抗单链Fv的氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRTVITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIQNGSEQKLISEEDLAAA[SEQ ID NO.5]
scFv(TCT1067)，T针对scFv(帕尼单抗)，P的氨基酸序列比对.赖氨酸残基呈粗体，并且共同位置的赖氨酸残基加下划线。帕尼单抗具有8个赖氨酸，其与scFv(TCT1067)中存在的12个呈显著不同配置。
[T＝SEQ ID NO.6；P＝SEQ ID NO.7]
如实例67B中所描述设置低、中和高DAR共轭反应条件，并且通过SDS-PAGE(图70)、HPLC-SEC(图71)、Biacore SPR结合分析和LC-MS(图72)分析共轭物。结果概述于表45中。在每种情况下，显著更高分数的scFv(Pan)可见凝集，并且观察到会沉淀。在用于scFv(TCT1067)的类似反应条件下，帕尼单抗scFv仅观察到低DAR，并且尝试获得最大DAR 9会产生不可溶沉淀物。可溶共轭物保持其结合功能。scFv(TCT1067)保持其如还在奥瑞他汀F中所展示(实例67)的结合功能。表45显示，在类似共轭条件下OptiLinked scFv可以以更高产率获得更高平均DAR(DAR 3.5相较于DAR 5和无共轭物相较于DAR 9)。不同于非OptiLinkedscFv，OptiLinked scFv共轭物中不存在可观察的凝集物(图71，表45)。这证实，结构、最优间隔和优选位置是有效生物共轭的关键因素，并且高赖氨酸含量并不够。
*观察的沉淀
实例72.中和高亲和力scFv与中和高DAR有效负载共轭物的细胞杀伤效力和特异性
实例72A.scFv(TCT)-MMAF-C5、scFv(TCT1067)-MMAF-C5和曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(117)，DAR 6.5
如上文(如前所述具有类似DAR的实例65)所描述制备和表征ScFv(TCT)-MMAF-C5、ScFv(TCT1067)-MMAF-C5和曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(118)。使SKBr3生长于McCoy's 5A/10％FCS(完全培养基)中37℃，5％CO2下潮湿气氛中，SKBr3是人类乳癌细胞系、具有高HER2表达水平、多达1,000,000个受体/细胞[Lazar GA等人《美国国家科学院院刊》.2006,103:4005-10]。当汇合是70-80％时，将细胞用PBS(2×10ml)洗涤并且与胰蛋白酶一起孵育5-7min。添加完全McCoy's 5A，并且将细胞通过移液而再悬浮。通过离心(2min，2000rpm)回收细胞，丢弃上清液，并且将细胞再悬浮于完全McCoy's 5A(5ml)中。然后将细胞使用血细胞计数器计数并且相应地稀释。将其使用连接因子以5000个细胞/孔(200μl)接种，并且在37℃，5％CO2下潮湿气氛中孵育过夜。U87是非HER2表达成胶质细胞瘤细胞系[Zitron IM等人(2013)《BMC癌症(BMC Cancer)》13:83]，并且使其以类似方式生长，以1000个细胞/孔接种(使用DMEM培养基)。BT474是HER2表达乳癌细胞系[Brockhoff G等人(2007)《细胞增殖(Cell Prolif)》40:488-507]，并且使其以类似方式生长，以7500个细胞/孔接种(使用RPMI培养基)。NCI-N87是HER2表达胃癌细胞系[Yamashita-Kashima Y等人(2013)《肿瘤学报告(Oncol.Rep)》30:1087-93]，并且使其以类似方式生长，以7500个细胞/孔接种(使用RPMI培养基)。
使细胞在37℃，5％CO2下潮湿气氛中暴露于稀释于完全培养基中的各种ADC 96小时。根据制造商的说明书使用普洛麦格Aqueous Cell-titre-96TM aqueous单溶液细胞增殖试剂盒(MTS试剂)测量细胞活力。简单来说，去除培养基，并且添加100μl与MTS试剂预组合的不含酚红的完全培养基到细胞中(20μl试剂/100μl培养基)。在于暗处(5％CO2，37℃)孵育2hr之后，在490nm下在ELISA板读取器上对板读数。
通过使用未经处理的对照作为100％细胞存活和Triton X-100对照作为100％细胞死亡，将数据(吸收单位)转化为细胞存活％。从数据的所有其余部分减去后者的平均吸收值以便得到适合基线。对于每个n值，将平均值转化为存活率并且获得标准误差值(呈细胞存活％形式)。将数据绘制并且使用GraphPad Prism使用方程式y＝y0+a/(1+(x/x0)b)(其中x0＝IC50并且x0>0并且a＝100)拟合为剂量反应S形逻辑3参数曲线。对于每种测试化合物重复实验至少3次，并且绘制和拟合一组数据或数据的平均值以获得剂量反应曲线。
数据(图73-76，表46)显示，scFv(TCT或TCT1067)-ADC以nM到pM效力对HER2表达细胞特异性地有细胞毒性。高DAR产生高细胞杀伤效力。游离药物自身归因于不良细胞吸收而具有低效力和不良特异性(图73表46)，并且非共轭抗体自身不具有效力到具有低效力(图74-75，表46)
实例72B.scFv(TCT)-MMAF-C5、scFv(TCT1067)-MMAF-C5和曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(118)，DAR 8
如实例72A中所描述设置细胞杀伤分析
数据(图73-75与77，表47)显示，scFv(TCT或TCT1067)共轭物以nM到pM效力对HER2表达细胞特异性地有细胞毒性。高DAR产生高细胞杀伤效力。游离药物自身归因于不良细胞吸收而具有低效力和不良特异性(图73，表47)，并且非共轭抗体自身不具有效力到具有低效力(图74-75，表47)。
实例72C.scFv(TCT1067)-P5C5和曲妥珠单抗-P5C5共轭物(71)，DAR 10.6和12.5
如实例72A中所描述设置细胞杀伤分析。
数据(图78-80，表48)显示，scFv(TCT或TCT1067)共轭物以nM到pM效力对HER2表达细胞特异性地有细胞毒性。高DAR产生高细胞杀伤效力。游离药物自身归因于不良细胞吸收而具有低效力和不良特异性(图78-80，表48)，并且非共轭抗体自身不具有效力到具有低效力(图74-75，表48)。
实例72D.低、中和高DAR下的scFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5以及曲妥珠单抗-奥瑞他汀F-C5共轭物(122)
如实例72A中所描述设置细胞杀伤分析
数据(图74-75、81-82，表49)显示，scFv(TCT1067)-ADC以nM到pM效力对HER2表达细胞特异性地有细胞毒性。高DAR产生高细胞杀伤效力。游离药物自身归因于非特异性细胞吸收而具有一定效力但不良特异性(图81，表49)，并且非共轭抗体自身不具有效力到具有低效力(图74-75，表49)。
实例72E.ScFv(TCT1067)-DM1-(dPEG12)和曲妥珠单抗-DM1-(dPEG12)共轭物(124)，低、中和高DAR
如实例72A中所描述设置细胞杀伤分析
数据(图74-75、83-84，表50)显示，scFv(TCT或TCT1067)共轭物以nM到pM效力对HER2表达细胞特异性地有细胞毒性。高DAR产生高细胞杀伤效力。游离药物自身归因于非特异性细胞吸收而具有一定效力但不良特异性(图83，表50)，并且非共轭抗体自身不具有效力到具有低效力(图74-75，表50)。
实例72F.ScFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9和曲妥珠单抗-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9共轭物，DAR9(121)
如实例72A中所描述设置细胞杀伤分析。
数据(图74-75、85-86，表51)显示，scFv(TCT或TCT1067)-ADC以nM到pM效力对HER2表达细胞特异性地有细胞毒性。高DAR产生高细胞杀伤效力。高DAR产生高细胞杀伤效力。游离药物自身归因于非特异性细胞吸收而具有低效力但不良特异性(图85，表50)，并且非共轭抗体自身不具有效力到具有低效力(图74-75，表51)。
实例73.抗体片段ADC在较低孵育时间下高度有力的证实
如实例72A中所描述设置细胞杀伤分析，但孵育时间缩短到4小时以模拟基于抗体片段的ADC的预期体内暴露时间缩短。比较两种类似DAR(约5)的共轭物，(1)高亲和力scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物，DAR 5.3、(2)曲妥珠单抗-AF-C5共轭物，DAR4.8。结果展示于图87-88和表52中。scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物的暴露时间缩短24倍导致效力降低2.2倍，而曲妥珠单抗-AF-C5共轭物的暴露时间缩短24倍导致效力有4.8倍的更剧烈降低。这表明，较小尺寸的蛋白质的高DAR产生在较短肿瘤细胞接触条件下维持其效力的ADC。
实例74.OptiLinked scFv-药物共轭物比具有等效有效负载的全免疫球蛋白-药物共轭物更快穿透到人类肿瘤异种移植物中的证实
小鼠.在研究的第1天，雌性重度联合免疫缺陷小鼠(Fox ChaseCB-17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl，查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))是十二周大，体重(BW)范围是15.3到18.4克。动物被任意喂水(反渗透，1ppm Cl)和由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的NIH 31改变并且辐照过的Lab将小鼠在20-22℃(68-72℉)和40-60％湿度下以12小时光周期圈养于静态微型隔离笼中的辐照过的Enrich-o'cobsTM实验室动物寝具上。北卡罗莱纳州(North Carolina)的查尔斯河发现服务(CR发现服务，其实施此契约的研发)明确地遵守实验动物护理与使用指南(Guidefor Care andUse of Laboratory Animals)关于扣禁、饲养、外科手术、喂食和体液调节以及兽医护理的建议。CR发现服务的动物护理和使用程序得到了国际实验动物护理的评估和认可协会(AAALAC)的认可，其确保遵守实验动物护理和使用的公认标准。
体内植入和肿瘤生长.在SCID小鼠中通过连续皮下移植用维持在CR发现服务的BT474人类乳癌引发异种移植物。在肿瘤植入的当天，每只测试小鼠接受1mm3皮下植入于右侧腹中的BT474碎片，并且在平均大小接近400到600mm3的标靶范围时监测肿瘤生长。在肿瘤植入之后五十天，表示为研究的第1天，将动物再分选为各自由个别肿瘤体积为405到600mm3并且组平均肿瘤体积为466到503mm3的两只小鼠组成的群组。使用卡尺在两个维度中测量肿瘤，并且使用下式计算体积：
肿瘤体积(mm3)＝w2×l/2
其中w＝肿瘤的宽度并且l＝长度，以mm为单位。肿瘤重量可以用1mg相当于1mm3肿瘤体积的假设估算。
治疗(测试)药剂.所有测试药剂都制备为0.625mg/mL浓度的即给药型给药溶液。所有给药溶液都储存在4℃下直到给药。所有治疗都以根据个别动物的体重缩放的8mL/kg给药体积投与，得到5mg/kg的剂量。
治疗.在研究的第1天，根据表53中概述的治疗计划向携有确立的BT474异种移植物的雌性SCID小鼠给药。所有药剂都在第1天以单个剂量经由尾静脉注射静脉内(i.v.)投与。
终点.研究终点出现在第1天，给药后两小时。
治疗相关的副作用.在第1天对测试动物称重。频繁观察动物的任何治疗相关的不良副作用的明显迹象。每隔一天监测个别体重减轻，并且将体重超过可接受体重减轻的极限的任何动物处死。还根据方案监测组平均体重减轻。最大耐受剂量(MTD)的可接受毒性定义为在测试期间小于20％的组平均体重减轻。
取样.在研究中给药后两小时收集样品用于进一步分析。从所有动物经由在异氟烷麻醉下末端心脏穿刺而收集血液(全血量)。在收集后，将血液样品使用肝素锂作为抗凝血剂加工以获得血浆。然后将每个血浆样品冷冻并且储存在-80℃下用于分析。在收集血液之后立即收集肿瘤。将肿瘤在室温下放在福尔马林中约24小时，并且然后转移到70％乙醇。然后将肿瘤嵌入于石蜡块中，并且制得每个肿瘤的连续切片的多个载玻片。
免疫组织化学分析.将含有肿瘤切片的载玻片通过于二甲苯中孵育2×5分钟而脱蜡，通过于100％乙醇中孵育4×2分钟并且于蒸馏水中孵育2×5分钟而复水。将载玻片通过立于吸水纸上而短暂排水，并且将疏水性笔(‘PAP’笔)用以围绕每个切片画圆圈，注意不接触切片。将每个切片用100-400μl阻断溶液(1％BSA于TBS中)覆盖，并且将其于潮湿腔室中孵育1hr。拂去阻断溶液，并且将100-400μl于阻断缓冲液中的一级抗体(小鼠抗西马多丁单克隆抗体，实例33，5μg/ml)应用并且在4℃下潮湿腔室中孵育过夜。接着，去除抗体溶液，并且将切片于TBS缓冲液中洗涤三次每次5min，然后添加二级抗体(山羊抗小鼠FITC共轭物，赛默-飞世尔62-6511，1:50或抗人类FITC共轭物，赛默-飞世尔054211，1:20)溶液(于阻断缓冲液中)，并且将其在暗处在室温下孵育60min。去除抗体溶液，并且将切片于TBS缓冲液中洗涤三次每次5min。使用安装介质向切片安装盖玻片。使安装介质凝固，并且在荧光显微镜下观察载玻片，捕获数字图像。
图89展示了在给药后2hr肿瘤切片的代表性图像。中亲和力scFv(TCT)-P5C5和高亲和力scFv(TCT1067)-P5C5共轭物可以明显可见定位得遍及肿瘤，高亲和力样品中显而易见一定的血管周围染色。在2hr肿瘤中可见极少曲妥珠单抗ADC，如根据低荧光可见。这证实了当检测有效负载组分(总ADC)时，基于片断的ADC的更快肿瘤吸收。
实例75A.啮齿动物模型中OptiLinked scFv-药物共轭物的血浆药物动力学概况慢于未经修饰的scFv的血浆药物动力学概况的证实
小鼠.在研究开始时，雌性BALB/c小鼠(BALB/cAnNCrl，查尔斯河)是八周大，体重范围介于15.9到21.9克。动物被任意喂水(反渗透，1ppm Cl)和由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的NIH 31改变并且辐照过的Lab将小鼠在20-22℃(68-72℉)和在40-60％湿度下以12小时光周期圈养于静态微型隔离笼中的辐照过的Enrich-o'cobsTM实验室动物寝具上。北卡罗莱纳州的查尔斯河发现服务(CR发现服务，其实施此契约的研发)明确地遵守实验动物护理与使用指南关于扣禁、饲养、外科手术、喂食和体液调节以及兽医护理的建议。CR发现服务的动物护理和使用程序得到了国际实验动物护理的评估和认可协会的认可，其确保遵守实验动物护理和使用的公认标准。
大鼠.将雄性史泊格-多利大鼠(来源于查尔斯河，英国)分组圈养于温度和光受控制的设施中，在12小时光/暗周期下，食物和水可任意获得。将经选择用于研究纳入的大鼠独立地圈养直到完成研究。根据现场内政部注册兽医的指南使所有动物经历健康监测。所有动物实验都涵盖在英国动物(科学程序)法(UK Animals(Scientific Procedures)Act)(1986)和欧盟指令(EU directive)86/609/EEC下。所有此类研究都通过由现场兽医和英国内政部检查员定期检查程序和设施而监测。研究设计需要将导管手术植入到雄性史泊格-多利大鼠的颈静脉中。使用吸入麻醉异氟烷使大鼠麻醉并且将其背侧卧放置。使右颈静脉暴露，并且近尾地放置疏松结扎线，并且结扎静脉的颅端。在结扎线之间作小切口，导管(聚乙烯50管)插入到所述小切口中。通过围绕插导管的血管系结疏松结扎线来将导管固定就位。在肩胛区域中作小切口以充当导管的出口位点。使导管皮下凿隧道通过并且通过肩胛切口由腹取出。测试导管的开放，并且将导管用锁定溶液(肝素化生理盐水)填充并且用不锈钢针密封。根据内政部良好实践规范对动物执行手术后监测。静脉内给药是经由尾静脉。
治疗(测试)药剂.所有测试药剂都提供为即给药型给药溶液。所有给药溶液都储存在4℃下直到给药。所有治疗都以根据个别动物的体重缩放的给药体积投与，得到治疗表中描述的给药浓度。
治疗(小鼠).在研究的第1天，将小鼠分成各自由十八只小鼠组成的群组(每一所评估的测试药剂)，并且根据治疗表中概述的治疗计划开始给药。如下表中所描述，所有剂量都通过尾静脉注射静脉内(i.v.)投与。
治疗(大鼠).在研究的第1天，将大鼠分成三只动物的群组(每一所评估的测试药剂)，并且根据下表中概述的治疗计划开始给药
终点.研究终点出现在最后一次取样点之后，典型地在第2或4天，给药后二十四或七十二小时。
治疗相关的副作用.在第1天对测试动物称重两次。频繁观察动物的任何治疗相关的不良副作用的明显迹象。每隔一天监测个别体重减轻，并且将体重超过可接受体重减轻的极限的任何动物处死。还监测群平均体重减轻。最大耐受剂量(MTD)的可接受毒性定义为在测试期间小于20％的组平均体重减轻。
取样(小鼠).在每个时间点从每处理组的三只动物收集血液(全血量)。从所有动物经由在异氟烷麻醉下末端心脏穿刺而收集样品。在每个时间点在收集后，将血液样品收集到含有肝素锂或K2EDTA作为抗凝剂的收集管中并且加工以获得血浆。将每个血浆样品储存在-80℃下直到用于分析。
取样(大鼠).在指定时间点(给药后0.5到72小时)经由由腹取出的颈静脉导管收集连续静脉血液样品(约0.1-0.2ml)，并且将其放在肝素化容器中。在取血液样品之前，将导管排空肝素化生理盐水以防止稀释血液样品。在每个血液样品之后，将所去除的血液体积经由导管置换成等体积的肝素化生理盐水并且密封。对血液样品进行离心(5分钟，16,100g，4℃)以分离血浆。将血浆样品转移到新鲜容器并且迅速地冷冻并且储存在-20℃下直到用于分析。
定量血浆中的测试药剂.如实例31中所描述执行ELISA。检测抗体是(a)抗T7标签，用以检测scFv(总抗体)，(b)抗人类Fab特异性，用以检测曲妥珠单抗(总抗体)，(c)抗MMAF(康诺泰(Concortis))、抗MMAE(康诺泰)、抗DM1(康诺泰)和抗西马多丁(还识别P5C5和奥瑞他汀F的内部小鼠单克隆抗体，实例33)，总ADC。参考测试药剂用以构筑用于比较血浆样品以便定量所存在的量的校准曲线。绘制浓度相对于时间(三只动物的平均值与标准误差)，并且将其使用GraphPad Prism拟合为2相衰减曲线以导出动力学参数。
实例75B.小鼠中ScFv(TCT)-MMAF-C5、曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(118)和非共轭抗体的药物动力学分析
如实例75A中所描述制备、处理小鼠和进行血浆分析。给药和取样时程展示于表54中。
药物动力学曲线图展示于图90中，并且导出的药物动力学参数展示于表55中。scFv(TCT)从循环快速清除，而曲妥珠单抗IgG ADC清除得慢得多，两者都如所料。出乎意料地，尽管有效负载的负载量高，但scFv(TCT)-MMAF-C5共轭物清除得比未经修饰的片断更慢，表明由OptiLink共轭实现的高DAR不会导致体内凝集并且不会导致经由网状内皮系统的快速清除。scFv(TCT)-MMAF-C5共轭物的更慢清除引起显著血液暴露(如清除曲线下面积(AUC)所说明)，其又引起显著并且有效的肿瘤暴露。与未经修饰的scFv相比，MMAF共轭物还具有更低分布体积，其导致生物可用性高14倍。经由其T7标签(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的scFv(TCT)-MMAF-C5共轭物。使用抗人类Fab(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物。scFv(TCT)-MMAF共轭物的清除线非常类似，表明scFv(TCT)-MMAF-C5共轭物在血浆中稳定并且出现微不足道的脱共轭。
实例75C.小鼠中scFv(TCT1067)-MMAF-C5、曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(118)和非共轭抗体的药物动力学分析
如实例75A中所描述制备、处理小鼠和进行血浆分析。给药和取样时程展示于表56中。
药物动力学曲线图展示于图91中，并且导出的药物动力学参数展示于表57中。scFv(TCT1067)从循环快速清除，而曲妥珠单抗IgG ADC清除得慢得多，两者都如所料。出乎意料地，尽管有效负载的负载量高，但scFv(TCT1067)-MMAF-C5共轭物清除得比未经修饰的片断更慢，表明由OptiLink共轭实现的高DAR不会导致体内凝集并且不会导致经由网状内皮系统的快速清除。scFv(TCT1067)-MMAF-C5共轭物的更慢清除引起显著血液暴露(如清除曲线下面积(AUC)所说明)，展示生物可用性的15.5倍增加，其又引起显著并且有效的肿瘤暴露。与未经修饰的scFv相比，MMAF-C5共轭物还具有更低分布体积，其导致生物可用性更高。经由其T7标签(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的scFv(TCT1067)-MMAF-C5共轭物。使用抗人类Fab(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物。scFv(TCT1067)-MMAF-C5共轭物的清除线非常类似，表明scFv(TCT1067)-MMAF-C5共轭物在血浆中稳定并且出现微不足道的脱共轭。
实例75D.小鼠中scFv(TCT)-P5C5、曲妥珠单抗-P5C5共轭物(71)和非共轭抗体的药物动力学分析
如实例75A中所描述制备、处理小鼠和进行血浆分析。给药和取样时程展示于表58中。
药物动力学曲线图展示于图92中，并且导出的药物动力学参数展示于表59中。scFv(TCT)从循环快速清除，而曲妥珠单抗IgG ADC清除得慢得多，两者都如所料。出乎意料地，尽管有效负载的负载量高，但scFv(TCT)-P5C5共轭物清除得比未经修饰的片断更慢，表明由OptiLink共轭实现的高DAR不会导致体内凝集并且不会导致经由网状内皮系统的快速清除。scFv(TCT)-P5C5共轭物的更慢清除引起显著血液暴露(如清除曲线下面积(AUC)的74倍增加所说明)，其又引起显著并且有效的肿瘤暴露。与未经修饰的scFv相比，P5C5共轭物还具有更低分布体积，其导致生物可用性更高。经由其T7标签(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的scFv(TCT)-P5C5共轭物。使用抗人类Fab(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的曲妥珠单抗-P5C5共轭物。scFv(TCT)-P5C5共轭物的清除线非常类似，表明scFv(TCT)-P5C5共轭物在血浆中稳定并且出现微不足道的脱共轭。
实例75E.小鼠中的ScFv(TCT1067)-奥瑞他汀F-C5、曲妥珠单抗-奥瑞他汀F-C5共轭物(122)和非共轭抗体
如实例75A中所描述制备、处理小鼠和进行血浆分析。给药和取样时程展示于表60中。
药物动力学曲线图展示于图93中，并且导出的药物动力学参数展示于表61中。scFv(TCT1067)从循环快速清除。出乎意料地，尽管有效负载的负载量高，但scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物清除得比未经修饰的片断更慢，表明由OptiLink共轭实现的高DAR不会导致体内凝集并且不会导致经由网状内皮系统的快速清除。scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物的更慢清除引起显著血液暴露(如清除曲线下面积(AUC)所说明)，展示高3.5倍的生物可用性，其又引起显著并且有效的肿瘤暴露。与未经修饰的scFv相比，奥瑞他汀F共轭物还具有更低分布体积，其导致生物可用性更高。经由其T7标签(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物。scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物的清除线非常类似，表明scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物在血浆中稳定并且出现微不足道的脱共轭。
ND＝未测定
实例75F.小鼠中的ScFv(TCT1067)-DM1(PEG12)、曲妥珠单抗-DM1(PEG12)共轭物(124)和非共轭抗体
如实例75A中所描述制备、处理小鼠和进行血浆分析。给药和取样时程展示于表61中。
药物动力学曲线图展示于图94中，并且导出的药物动力学参数展示于表62中。scFv(TCT1067)从循环快速清除。出乎意料地，尽管有效负载的负载量高，但scFv(TCT1067)-DM1(dPEG12)共轭物清除得比未经修饰的片断更慢，表明由OptiLink共轭实现的高DAR不会导致体内凝集并且不会导致经由网状内皮系统的快速清除。scFv(TCT1067)-DM1(dPEG12)共轭物的更慢清除引起显著血液暴露(如清除曲线下面积(AUC)所说明)，展示高3倍的生物可用性，其又引起显著并且有效的肿瘤暴露。与未经修饰的scFv相比，DM1(dPEG12)共轭物还具有更低分布体积，其导致生物可用性更高。经由其T7标签(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的scFv(TCT1067)-DM1(dPEG12)共轭物。scFv(TCT1067)-DM1(dPEG12)共轭物的清除线非常类似，表明scFv(TCT1067)-DM1(dPEG12)共轭物在血浆中稳定并且出现微不足道的脱共轭。
实例75G.大鼠中的ScFv(TCT1067)-P5C5共轭物(71)和非共轭抗体
如实例75A中所描述制备、处理大鼠和进行血浆分析。给药和取样时程展示于表63中。
药物动力学曲线图展示于图95中，并且导出的药物动力学参数展示于表64中。scFv(TCT1067)从循环快速清除，而曲妥珠单抗IgG ADC清除得慢得多，两者都如所料。出乎意料地，尽管有效负载的负载量高，但scFv(TCT1067)-P5C5共轭物清除得比未经修饰的片断更慢，表明由OptiLink共轭实现的高DAR不会导致体内凝集并且不会导致经由网状内皮系统的快速清除。scFv(TCT1067)-P5C5共轭物的更慢清除引起显著血液暴露(如清除曲线下面积(AUC)所说明)，展示高4.5倍的生物可用性，其又引起显著并且有效的肿瘤暴露。与未经修饰的scFv相比，P5C5共轭物还具有更低分布体积，其导致生物可用性更高。经由其T7标签(检测总抗体)和经由有效负载(检测总ADC)检测血浆中的scFv(TCT1067)-P5C5共轭物。scFv(TCT1067)-P5C5共轭物的清除线非常类似，表明scFv(TCT1067)-P5C5共轭物在血浆中稳定并且出现微不足道的脱共轭。经24小时收集治疗动物的尿液，将其在旋转浓缩器(MWCO-10kDa)中浓缩10倍并且针对PBS透析。在Biacore SPR芯片上分析来自每组三只大鼠的这些样品。数据显示(图95B和C)，游离scFv样品与scFv-P5C5共轭物样品相比存在相当的结合活性，表明scFv和共轭物在一定程度上通过肾清除，这保留蛋白质和其共轭物完整。
实例76.人类肿瘤异种移植物模型中OptiLinked scFv-药物共轭物与携有等效有效负载的全免疫球蛋白-药物共轭物和对照相比的肿瘤消退或根除研究.
小鼠.在研究的第1天，雌性重度联合免疫缺陷小鼠(Fox ChaseCB-17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl，查尔斯河实验室)是十二周大，体重(BW)范围是15.3到18.4克。动物被任意喂水(反渗透，1ppm Cl)和由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的NIH 31改变并且辐照过的Lab将小鼠在20-22℃(68-72℉)和40-60％湿度下以12小时光周期圈养于静态微型隔离笼中的辐照过的Enrich-o'cobsTM实验室动物寝具上。北卡罗莱纳州的查尔斯河发现服务(CR发现服务，其实施此契约的研发)明确地遵守实验动物护理与使用指南关于扣禁、饲养、外科手术、喂食和体液调节以及兽医护理的建议。CR发现服务的动物护理和使用程序得到了国际实验动物护理的评估和认可协会(AAALAC)的认可，其确保遵守实验动物护理和使用的公认标准。
体内植入和肿瘤生长.在SCID小鼠中通过连续皮下移植用(a)维持在CR发现服务的BT474人类乳癌引发异种移植物。在肿瘤植入的当天，每只测试小鼠接受1mm3皮下植入于右侧腹中的BT474碎片，并且在平均大小接近110到144mm3的标靶范围时监测肿瘤生长。在肿瘤植入之后五十天，表示为研究的第1天，将动物再分选为各自由个别肿瘤体积为110到144mm3并且组平均肿瘤体积为115到118mm3的两只小鼠组成的六个群组。(b)用皮下植入于右侧腹中的NCI-N87肿瘤细胞的细胞悬浮液引发异种移植物，并且在平均大小接近110到144mm3的标靶范围时监测肿瘤生长。使用卡尺在两个维度中测量肿瘤，并且使用下式计算体积：
肿瘤体积(mm3)＝宽度2×长度/2
其中肿瘤的宽度和长度以mm为单位。肿瘤重量可以用1mg相当于1mm3肿瘤体积的假设估算。
治疗剂和治疗.所有测试药剂都提供为即给药型给药溶液并且储存在4℃下直到使用。所有治疗都以根据个别动物的体重缩放的给药体积投与，实现各别治疗表中描述的给药浓度。所有药剂都经由尾静脉注射静脉内(i.v.)投与。
终点.研究持续多达90天或直到肿瘤达到1000mm3的最大大小。
治疗相关的副作用.在第1天对测试动物称重。频繁观察动物的任何治疗相关的不良副作用的明显迹象。每隔一天监测个别体重减轻，并且将体重超过可接受体重减轻的极限的任何动物处死。还根据方案监测组平均体重减轻。最大耐受剂量(MTD)的可接受毒性定义为在测试期间小于20％的组平均体重减轻。
实例76A.BT474异种移植模型中经scFv(TCT1067)-MMAF-C5、曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(117)和游离MMAF治疗剂的肿瘤生长抑制或根除
如实例76中所描述设置BT474肿瘤。此实验的治疗计划描述于表65中
绘制肿瘤体积(mm3)相对于时间(图96)，并且绘制动物体重变化(％)相对于时间(图96)。以5mg/kg以及1mg/kg的较低剂量以每周一次时间间隔给予基准对照(曲妥珠单抗-MMAF-C5)。极类似ADC先前展示为高度有效[Zimmerman ES等人(2014)《生物共轭化学》25:351-61]。考虑更快药物动力学清除，以三种剂量更频繁给予高亲和力scFv(1067)-MMAF-C5共轭物。
结果显示，所有ADC与scFv(TCT1067)-MMAF-C5 2mg/kg给药方案存在明显剂量反应关系，导致到第30天完全(100％)治愈(持久到几乎90天)。scFv(TCT1067)-MMAF-C50.5mg/kg给药方案也导致完全(100％)治愈(到第90天达到)。类似反应可见，正如关于曲妥珠单抗-MMAF-C5 5mg/kg给药方案所料。然而，scFv(TCT1067)-MMAF-C5ADC得到更多有效负载的能力更频繁导致肿瘤缩小更快速，比曲妥珠单抗-MMAF-C5ADC快约两倍。生理盐水(媒剂)和游离有效负载治疗动物组肿瘤生长快速。如从增加的体重可见，scFv(TCT1067)-MMAF-C5治疗似乎更好地耐受，小鼠的抗体片段ADC组比小鼠的IgG-MMAF-C5ADC组重多达15％。与曲妥珠单抗ADC约为5的近似值相比，scFv(TCT1067)-MMAF-C5的治疗指数的估算是至少40(至少2mg/kg，最大耐受剂量/0.05mg/kg最小有效剂量)。
实例76B.BT474异种移植模型中经scFv(TCT)-MMAF-C5、曲妥珠单抗-MMAF-C5共轭物(化合物118)和游离MMAF治疗剂的肿瘤生长抑制或根除
如实例76中所描述设置BT474肿瘤。此实验的治疗计划描述于表66中。
绘制肿瘤体积(mm3)相对于时间(图97)，并且绘制动物体重变化(％)相对于时间(图97)。以先前已经展示为高度有效的5mg/kg以及1mg/kg的较低剂量以每周一次时间间隔给予基准对照(曲妥珠单抗-MMAF-C5)。考虑更快药物动力学清除，以三种较低剂量更频繁给予中亲和力scFv(TCT)-MMAF-C5共轭物。包括实例74A的数据作为比较。
结果显示，所有ADC与scFv(TCT)-MMAF-C5 2mg/kg给药方案存在明显剂量反应关系，导致到第30天完全(100％)治愈(持久到几乎90天)。类似反应可见，正如关于曲妥珠单抗-MMAF-C5 5mg/kg给药方案所料。然而，scFv(TCT)-MMAF-C5ADC得到更多有效负载的能力更频繁导致肿瘤缩小更快速。生理盐水(媒剂)和游离有效负载治疗动物组肿瘤生长快速。如从增加的体重可见，scFv(TCT)-MMAF-C5治疗似乎更好地耐受，小鼠的抗体片段ADC组比小鼠的曲妥珠单抗-MMAF-C5ADC组重多达20％。尽管两种抗体片段ADC之间结合亲和力有1000倍差异(实例63)，但2mg/kg给药方案导致类似并且快速的反应，表明结合亲和力并不是关键因素(尽管必须存在最小亲和力)，但高有效负载负载量和快速穿透导致高功效。在0.5mg/kg scFv(TCT)-MMAF-C5的较低剂量下，反应劣于较高亲和力scFv，其中肿瘤在第40天开始再生长，治愈率是50％
实例76C.BT474异种移植模型中经scFv(TCT1067)-P5C5和曲妥珠单抗-P5C5共轭物(化合物71)的肿瘤生长抑制或根除
如实例76中所描述设置BT474肿瘤。此实验的治疗计划描述于表67中。
绘制肿瘤体积(mm3)相对于时间(图98)，并且绘制动物体重变化(％)相对于时间(图98)。以先前已经展示为高度有效的5mg/kg以及1mg/kg的较低剂量以每周一次时间间隔给予基准对照(曲妥珠单抗-P5C5)。考虑更快药物动力学清除，以三种较低剂量更频繁给予高亲和力scFv(TCT1067)-P5-C5共轭物。
还展示导致完全(100％)治愈的scFv(TCT1067)-MMAF 2mg/kg给药方案用于比较。scFv(TCT1067)-P5C5 5mg/kg给药方案导致约20天的肿瘤生长延迟，然而曲妥珠单抗-P5C55mg/kg给药方案导致边缘性的微不足道的生长延迟。因此，scFv(TCT1067)-P5C5ADC得到更多有效负载的能力更频繁比曲妥珠单抗-P5C5ADC更有效导致肿瘤缩小。生理盐水(媒剂)和游离有效负载治疗动物组肿瘤生长快速。如从增加的体重可见，scFv(TCT1067)-P5C5治疗似乎更好地耐受，小鼠的抗体片段ADC组比小鼠的曲妥珠单抗-P5-C5ADC组重多达20％。
实例76D.BT474人类乳癌异种移植模型中经两种不同DAR下的scFv(TCT1067)共轭物的肿瘤生长抑制或根除
如实例76中所描述设置BT474肿瘤。此实验的治疗计划描述于表68中。
绘制肿瘤体积(mm3)相对于时间(图99)，并且绘制动物体重变化(％)相对于时间(图99)。提供4个剂量的低(L)DAR(2.7)和中(M)DAR(5.7)下的高亲和力scFv(1067)-AF-C5共轭物。scFv(TCT1067)-AF 5mg/kg给药方案到第45天导致完全(100％)治愈，与实例76A和76B相比给药方案频次更小并且剂量更少。更高DAR共轭物更有效。生理盐水(媒剂)治疗动物组肿瘤生长快速。如从增加的体重可见，两种共轭物似乎都很好地耐受。
实例76E.BT474人类乳癌异种移植模型中经三种不同DAR下的scFv(TCT1067)-AF-C5共轭物的肿瘤生长抑制或根除
如实例76中所描述设置BT474肿瘤。此实验的治疗计划描述于表69中。
绘制肿瘤体积(mm3)相对于时间(图100)。提供2个剂量的低(L)DAR(2.7)、中(M)DAR(5.7)和高(H)DAR(11)下的高亲和力scFv(1067)-AF共轭物。在此应用时，更高DAR共轭物对引发肿瘤消退更有效。
实例76F.NCI-N87人类胃癌异种移植模型中的ScFv(TCT1067)-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9、曲妥珠单抗-MMAE-PAB-Cit-Val-dPEG9共轭物(121)和游离MMAE
如实例76中所描述设置NCI-N87肿瘤。此实验的治疗计划描述于表64中。
实例77TCO衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的高亲和力单链Fv抗体片段上的生物共轭用于2步四嗪点击反应
使TCO-PEG4-NHS(购自耶拿生物科学(Jena Biosciences))共轭到scFv(TCT)以获得1种具有中DAR的共轭物(化合物134)。所鉴别和执行的条件是：
根据实例64A执行反应。
在此实例中，设置是：
反应1-scFv(TCT):TCO-PEG4-NHS，16当量。
未可觉可见沉淀物并且样品回收率高。通过SDS-PAGE(图101)和LCMS(图102)分析样品。
LCMS、总离子流(TIC)色谱图和光谱和去卷积数据展示于图102中。
在scFv(TCT)-TCO-PEG4样品的TIC中观察到主峰，在12.3min洗脱。此峰的零电荷去卷积质谱产生了在m/z 30956和31372的峰，其对应于scFv的理论质量以及7和8次TCO-PEG4分子添加。因此，共轭物(化合物134)的平均DAR是7.5。
可以随后在第二步骤中使四嗪封端的连接子-有效负载，例如MMAF(117)共轭以形成抗体药物共轭物(135)。
实例78-制备SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG5-NHS酯(140)
向DNMEA-SN38 98(80mg，0.13mmol)和Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP 13(0.14g，0.19mmol)于DMF(2ml)中的搅拌溶液中添加HOBt(34mg，0.25mmol)、吡啶(52μl)和DIPEA(22μl)。将反应混合物在N2气氛下在室温下搅拌24h。在真空中蒸发溶剂，并且所得残余物直接用于下一步骤。HRMS:ESI m/z C61H68N9O13实验值1135.0803[M+H]+计算值1135.2650。
将Fmoc-Val-Cit-PAB-DNMEA-SN38 137(90mg，0.08mmol)于DMF(1.5ml)和二乙胺(0.4ml)中的溶液在室温下搅拌3小时。然后将反应混合物在真空中浓缩并且未经进一步纯化直接使用。HRMS:ESI m/z C46H58N9O11实验值913.0200[M+H]+计算值913.0220。
在室温下向H-Val-Cit-PAB-DNMEA-SN38 138(70mg，0.08mmol)于DMF(3ml)中的溶液中添加DIPEA(40μl)和酸-dPEG5-NHS(40mg，0.09mmol)。将反应混合物在N2气氛下搅拌16h。在真空中蒸发溶剂，所获得的粗化合物直接用于下一步骤。HRMS:ESI m/z C60H82N9O19实验值1233.2537[M+H]+计算值1233.3600。
在室温下向酸-dPEG5-Val-Cit-PAB-DNMEA-SN38(90mg，0.07mmol)于DMF(3ml)中的溶液中添加DIPEA(63μl)和TSTU(44mg，0.14mmol)，并且将反应混合物在N2气氛下搅拌3h。在真空中蒸发溶剂，并且将粗产物在拜泰齐快速纯化系统上使用C18柱纯化，得到所要化合物NHS-dPEG5-Val-Cit-PAB-DNMEA-SN38 140HRMS:ESIm/z C64H85N10O21实验值1330.3479[M+H]+计算值1330.4300
实例79具有蛋白酶可裂解连接子的SN-38衍生物向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的高亲和力单链Fv抗体片段上的生物共轭
使SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG5-NHS酯(140)共轭到scFv(TCT1067)以获得各种DAR的共轭物(141)。
用于共轭的条件是：
如实例64A中详述执行反应。
在此实例中，设置是：
反应1-scFv(TCT1067):SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG5-NHS，5当量
反应2-scFv(TCT1067):SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG5-NHS，10当量
反应3-scFv(TCT1067):SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG5-NHS，25当量
反应4-scFv(TCT1067):SN38-(DNMEA)-PAB-Cit-Val-dPEG5-NHS，35当量
通过HPLC尺寸排阻色谱法(图103)和SDS PAGE(图104)分析非共轭和共轭scFv(TCT1067)。scFv的滞留时间是18.4min，与约30kDa的MW相关。共轭物洗脱得稍微地更早，对于反应1在18.1min、对于反应2在17.8min、对于反应3在16.9min并且对于反应4在16.8min，指示更高分子量(归因于变化的载药量)。共轭物还展示(在相同滞留时间)在360nm下的显著吸收，这是药物的特征吸收峰，非共轭scFv对照不存在。可以去除形成的任何凝集物。通过UV/Vis吸收光谱法，在370nm(17000M-1cm-1)和280nm(4700M-1cm-1)下使用药物的消光系数并且在280nm(70735M-1cm-1)下使用抗体的消光系数，计算经纯化样品的DAR。样品1、2和3的计算DAR分别是2.9、4.6和6.4。对于样品1和2，SDS PAGE凝胶对scFv展示在较高分子量下的多分散条带。
实例80奥瑞他汀-C5-NHS向携有多个很好分散的表面赖氨酸残基的高亲和力双功能抗体片断上的生物共轭
使AF-C5-NHS酯(88)共轭到双功能抗体(TCT)并且作为对照共轭到scFv(TCT)以获得各种DAR的共轭物(化合物122)。
所用的反应条件如下：
类型 条件
缓冲液 在pH8.8下的具有150mMNaCl的碳酸氢盐缓冲液
共溶剂 最终20％(v/v)浓度下的无水经过滤的DMSO
温度 20℃
搅动 热混合器1000rpm
抗体浓度 0.71mg/ml
AF-C5-NHS处置 50mM于100％无水经过滤的DMSO中的溶液
AF-C5-NHS添加速率 每隔90min
AF-C5-NHS添加份 7.5当量
如实例64A中详述执行反应。
在此实例中，设置是：
反应1：双功能抗体(TCT)：AF-C5-NHS，30当量；
反应2：scFv(TCT)：AF-C5-NHS，15当量；
图105中的在还原条件下运行的SDS PAGE凝胶展示非共轭双功能抗体与非共轭scFv正如所料在相同分子量下运行。共轭物1和2运行得比非共轭抗体略高。两种共轭物在相同分子量下运行，表明两种抗体同样好地共轭。

Claims (54)

1.一种化合物，其包含以5∶1的最小偶合比偶合到载体分子的治疗剂；其中所述载体分子是(i)抗体片段或其衍生物或(ii)抗体模拟物或其衍生物；并且其中所述治疗剂偶合到赖氨酸氨基酸残基上；并且此外其中所述治疗剂不是光敏剂。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述治疗剂和所述载体分子在偶合形式下的功能和物理特性与非偶合形式下的特性相比定性地大体上不变。
3.根据权利要求1到2中任一项所述的化合物，其中所述化合物的IC50是100nM或更低。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的IC50比非共轭时的所述治疗剂低出至少10倍。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的血清半衰期是至少2小时，任选地，所述至少2小时的血清半衰期是在小鼠或人类中测量的。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的化合物，其中所述化合物的血清半衰期是非共轭时的所述游离抗体的血清半衰期的至少50％。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物在室温下在磷酸盐缓冲盐水中的溶解度是至少1mg/ml。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物在经FDA批准的浓度和类型的赋形剂存在下在室温下在磷酸盐缓冲盐水中的溶解度是至少1mg/ml。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中所述赋形剂是至多0.5％聚山梨醇酯、1％甘油、0.5％甘氨酸、0.1％组氨酸、0.5％氯丁醇、5％丙二醇、2％苯甲醇、0.05％辛酸和/或0.1％N-乙酰基色氨酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物在室温下在磷酸盐缓冲盐水中的凝集水平是至多5％。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述治疗剂当偶合到所述载体分子时隔离至少两个氨基酸(3.5到7.5埃)的距离。
12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述治疗剂当偶合到所述载体分子时隔离两个氨基酸(3.5到7.5埃)、三个氨基酸(9到12埃)、四个氨基酸(10到15埃)、五个氨基酸(15到20埃)或六个氨基酸(20到25埃)的距离。
13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述治疗剂在所述氨基酸处直接偶合到所述载体分子。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中与所述氨基酸的所述直接偶合是经由N羟基-琥珀酰胺酯。
15.根据权利要求1到12中任一项所述的化合物，其中所述治疗剂在所述氨基酸处间接偶合到所述载体分子。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中与所述氨基酸的所述间接偶合是经由硫醇或马来酰亚胺。
17.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述载体分子选择性结合到标靶。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中所述标靶是靶细胞或胞外靶分子。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中所述载体分子在结合靶细胞时内化到所述细胞中。
20.根据权利要求18所述的化合物，其中所述载体分子在结合所述靶细胞或胞外靶分子时不内化到所述细胞中。
21.根据权利要求17到20所述的化合物，其中所述载体分子在结合所述标靶之后与所述治疗剂解偶合。
22.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是不包括全抗体的CH2和CH3抗体区的抗体片段。
23.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是选自以下的抗体片段：scFv、Fv、Fab、F(ab’)2、Fab-SH、dsFv、bc-scFv、sdAb、di-scFvs(也称为bi-scFvs)、Fcabs、结构域抗体、纳米抗体、VHH结构域、双特异性形式例如双特异性T细胞啮合体、双功能抗体和tandabs。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是选自以下的抗体模拟物：DARPin、亲和抗体(affibody)、affitin、anticalin、avimer、kunitz结构域肽、adnectin、centyrin、Fynomer、IgNAR和单抗体(monobody)。
25.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是人类化或人类的。
26.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述载体分子特异性结合到HER2、EGFR、HER3、MUCl、EpCAM、CEA、纤维结合蛋白-EDB(Fibronectin-EDB)、CD19、CD20、CD22、LeY、CD30、CD33、CD79b、GPNMB、PSMA、CD56、CD37、叶酸受体、CA6、CD27L、MUC16、CD66e、CD74、Trop-2或鸟苷酸环化酶。
27.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
28.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述治疗剂选自细胞周期进程抑制剂、血管生成抑制剂、MAPK信号传导路径抑制剂、PI3K/m-TOR/AKT路径抑制剂、激酶抑制剂、HDAC抑制剂、蛋白质伴侣蛋白抑制剂、PARP抑制剂、Wnt/Hedgehog/Notch信号传导路径抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、DNA结合药物、DNA损害药物、DNA烷基化药物、微管稳定剂、微管去稳定剂、铂化合物、激酶抑制剂、吡啶并咔唑和其衍生物和拓扑异构酶I抑制剂。
29.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述治疗剂选自西马多丁(cemadotin)、P5、P5-C5、阿霉素(doxorubicin)、玫瑰树碱(ellipticine)、MMAE、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、奥瑞他汀(auristatin)、美登素(maytansine)、海兔毒素(dolostatin)、喜树碱(camptothecin)、SN-38和吡咯并苯并二氮呼二聚体(PBD)、PNU-159862、吲哚啉并苯并二氮呼二聚体(IGN)和MMAF。
30.根据权利要求1到23或25到29中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是西马多丁。
31.根据权利要求1到23或25到29中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是阿霉素。
32.根据权利要求1到23或25到29中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是玫瑰树碱。
33.根据权利要求1到23或25到29中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是MMAE。
34.根据权利要求1到23或25到29中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是P5-C5。
35.根据权利要求1到23或25到29中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是美登素。
36.根据权利要求1到23或25到29中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是吡咯并苯并二氮呼二聚体(PBD)。
37.根据权利要求1到23或25到29中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是scFv并且所述治疗剂是MMAF。
38.根据权利要求30到37中任一项所述的化合物，其中所述8cFv特异性结合到HER2。
39.根据权利要求38所述的化合物，其中所述scFv具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的氨基酸序列。
40.一种药物组合物，其包含根据权利要求1到39中任一项所述的化合物和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
41.权利要求1到40中任一项所述的化合物或组合物，其用于诊断、治疗和/或预防疾病。
42.权利要求1到40中任一项所述的化合物或组合物，其用于诊断、治疗和/或预防选自以下的疾病：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；自身免疫疾病。
43.权利要求1到40中任一项所述的化合物或组合物，其用于制造供治疗和/或预防选自以下的疾病用的药剂：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；和自身免疫疾病。
44.根据权利要求1到43所述的供使用的化合物或组合物，其中所述疾病是结肠癌、肺癌、乳癌、头/颈癌、前列腺癌、皮肤癌、胃/胃肠癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肾癌、卵巢癌、甲状腺癌和骨癌。
45.一种制备根据权利要求1到40中任一项所述的化合物的方法，其包含以下步骤：
(i)提供治疗剂；
(ii)提供载体分子；
(iii)在至少一种极性非质子溶剂和水性缓冲剂存在下共轭所述治疗剂与所述载体分子。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述至少一种极性非质子溶剂选自由以下组成的群组：二甲亚砜(DMSO)；乙腈；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)；HMPA；二噁烷；四氢呋喃(THF)；二硫化碳；乙二醇二甲醚和二乙二醇二甲醚；2-丁酮(MEK)；环丁砜；硝基甲烷；N-甲基吡咯烷酮；吡啶；和丙酮。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中共轭所述治疗剂与所述载体分子的所述步骤在约0℃与约37℃之间的温度下执行。
48.根据权利要求45到47中任一项所述的方法，其中共轭所述治疗剂与所述载体分子的所述步骤在6.0与10.0之间的pH下执行。
49.根据权利要求45到48中任一项所述的方法，其中共轭所述治疗剂与所述载体分子的所述步骤执行了0.1小时与48小时之间。
50.根据权利要求45到49中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤：
(v)将所述化合物与药学上可接受的载剂组合以形成药物组合物。
51.一种化合物，其大体上如参看实例和图式在本文所述。
52.一种组合物，其大体上如参看实例和图式在本文所述。
53.一种供使用的化合物，其大体上如参看实例和图式在本文所述。
54.一种方法，其大体上如参看实例和图式在本文所述。
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