CN113583086A - 一种抗体偶联药物的中间体lnd1035的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗体偶联药物的中间体LND1035的合成方法。该合成方法包括：将Fmoc‑Val‑Cit、PABOH和EEDQ在第一溶剂中水浴0℃‑50℃下反应，得到VC1002；将VC1002在第二溶剂和第三溶剂的混合溶剂中0℃‑40℃反应，得到VC‑2；将VC‑2和Mc‑OSu在第二溶剂中0℃‑50℃下反应，过滤烘干得到VC‑3；将VC‑3、DNPC、DIPEA在第二溶剂中0℃‑40℃下反应，得到VC‑4；将Boc‑DMEA、三光气、三乙胺在溶剂四氢呋喃中反应，加入吡啶和SN38反应，过滤烘干得到LND1035‑1；将LND1035‑1在第六溶剂中0℃‑40℃反应，真空旋干除去溶剂，在甲基叔丁基醚中打浆纯化，过滤烘干得到LND1035‑2；将LND1035‑2、VC‑4、HOBt、DIPEA在第七溶剂中20℃‑60℃下反应，得到LND1035。本发明的合成方法收率高，易于放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种中间体的合成方法，尤其涉及一种抗体偶联药物的中间体LND1035的合成方法，属于药物化学合成技术领域。
背景技术
抗体药物偶联物(Antibody drug conjugate，简称ADC)是一类新型的抗肿瘤药物，其原理是将细胞毒素连接在抗体上，通过抗体对癌细胞表面特定抗原的识别，通过内吞作用进入癌细胞，从而将细胞毒素运输到靶点，达到靶向性治疗恶性肿瘤的目的。ADC与传统的小分子抗肿瘤药物相比，因能借助抗体的靶向识别性与毒素的高活性，故更具备特异性和有效性。
ADC包括三个不同的组成部分，即抗体、连接子和细胞毒素。抗体实现靶向性，连接子保证在ADC在血液转运过程中的稳定性，而到达作用靶点后，毒素发挥对癌细胞的杀伤作用。根据作用机制的不同，适用于ADC的毒素分为微管类抑制剂(Microtubuleinhibitors)，DNA损伤剂(DNA damaging agents)，RNA聚合酶抑制剂(RNA polymeraseinhibitors)等。
目前，市场上销售和临床试验中的ADC所采用的毒素主要为微管类抑制剂，主要包括基于海兔毒素(Dolastatin-based)设计的化合物，比如MMAE、MMAF和MMAD，以及基于美登素(Maytansine-based)设计的化合物，比如DM1和DM4。连接子方面，主要应用的为不可裂解型，如缬氨酸-瓜氨酸(Valine-Citriline)和环己基甲酸(MCC)，经过溶酶体水解后，药物仍然具有活性，并通过连接区与某个氨基酸残基结合在一起。
其中，LND1035的特点是结构稳定，在血液中不会断裂释放毒素分子，在肿瘤细胞内被酶切断，能够快速释放毒素分子杀死肿瘤细胞。因此具有体内毒性小，活性高的优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体偶联药物的中间体LND1035的合成方法。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种抗体偶联药物的中间体LND1035的合成方法，该合成方法包括：
将Fmoc-Val-Cit、PABOH和EEDQ在第一溶剂中水浴0℃-50℃下反应，反应液过滤，所得固体在第一溶剂中打浆，过滤烘干得到VC1002；
将所述VC1002在第二溶剂和第三溶剂的混合溶剂中0℃-40℃下反应，在第四溶剂中打浆纯化，过滤烘干得到VC-2；
将所述VC-2和Mc-OSu在第二溶剂中0℃-50℃下反应，在第四溶剂中打浆纯化，过滤烘干得到VC-3；
将所述VC-3、DNPC、DIPEA在第二溶剂中0℃-40℃下反应，在第四溶剂中打浆纯化，过滤烘干得到VC-4；
将Boc-DMEA、三光气、三乙胺在溶剂四氢呋喃中反应，过滤收集滤液，真空旋干除去溶剂，加入吡啶和SN38，20℃-60℃反应，待反应结束真空旋干除去溶剂，加入乙酸乙酯和水分液，收集上层溶液，真空旋干除去溶剂，固体在第五溶剂中打浆纯化，过滤烘干得到LND1035-1：
将LND1035-1在第六溶剂中0℃-40℃下反应，真空旋干除去溶剂，在甲基叔丁基醚中打浆纯化，过滤烘干得到LND1035-2；
将所述LND1035-2、VC-4、HOBt、DIPEA在第七溶剂中20℃-60℃反应，得到LND1035。
本发明的抗体偶联药物的中间体LND1035的合成方法包括以下步骤：
在本发明的合成方法中，包括由Fmoc-Val-Cit、PABOH和EEDQ制备VC1002的步骤。
在本发明的一具体实施方式中，制备VC1002时，Fmoc-Val-Cit、PABOH和EEDQ的混合摩尔比为1∶1.5∶1.5-1∶2∶2(优选1∶2∶2)。
在本发明的合成方法中，包括由VC1002制备VC-2的步骤。
在本发明的合成方法中，包括由VC-2和Mc-OSu制备VC-3的步骤。
在本发明的一具体实施方式中，制备VC-3时，VC-2和Mc-OSu的混合摩尔比为1∶1.1-1∶2(优选1∶1.1)。
在本发明的合成方法中，包括由VC-3制备VC-4的步骤。
在本发明的一具体实施方式中，制备VC-4时，VC-3、DNPC、DIPEA的混合摩尔比为1∶1.5∶0.1-1∶2∶0.1(优选1∶2∶0.1)。
在本发明的合成方法中，包括由Boc-DMEA、三光气、三乙胺和SN38制备LND1035-1的步骤。
在本发明的一具体实施方式中，制备LND1035-1时，Boc-DMEA、三光气、三乙胺、SN38的混合摩尔比为1∶0.3∶1.0∶0.3-1∶0.5∶1.2∶0.5(优选1∶0.5∶1.05∶0.3)。
在本发明的合成方法中，包括由LND1035-1制备LND1035-2的步骤。
在本发明的合成方法中，包括由LND1035-2、VC-4、HOBt制备LND1035的步骤。
在本发明的一具体实施方式中，制备LND1035时，LND1035-2、VC-4、HOBt、DIPEA的混合摩尔比为1.0∶1.0∶1.0∶1.5-1∶1.2∶1.2∶3.0(优选1.2∶1∶1∶1.5)。
在本发明的一具体实施方式中，其中，采用的第一溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(优选体积比为1∶1)；采用的第二溶剂为DMF或DMA；采用的第三溶剂为DEA或DIPA；采用的第四溶剂为甲基叔丁基醚和二氯甲烷的混合溶剂；采用的第五溶剂为石油醚和二氯甲烷的混合溶剂；采用的第六溶剂为二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶剂；采用的第七溶剂为DMF或DMSO。
本发明的抗体偶联药物的中间体LND1035的合成方法的操作简便，收率高，有利于放大生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中的LND1035的HNMR谱图。
图2为本发明实施例1中的LND1035的LC谱图。
图3为本发明实施例1中的LND1035的MS谱图。
具体实施方式
本发明中涉及的化合物中英文对照表如表1所示。
表1
实施例1
本实施例提供了一种抗体偶联药物的中间体LND1035的合成方法，具体包括以下步骤。
VC1002的制备
将Fmoc-Val-Cit(300.0g，0.6042mol，1eq)加入到10L四口瓶中，加入二氯甲烷3L，水浴30℃搅拌2小时。然后依次加入PABOH(149.0g，1.2083mol，2eq)、EEDQ(300.0g，1.2083mol，2eq)。二氯甲烷(3L)，甲醇(3L)，水浴30℃反应18小时.HPLC检查反应完全。
直接用滤袋压滤，滤饼倒入5L塑料烧杯中，加入二氯甲烷2L，甲醇500mL，机械搅拌打浆30分钟后压滤。滤饼再次转移入5L塑料烧杯中，加入二氯甲烷2L搅拌打浆后再次压滤。滤饼红外灯烘干得类白色固体195.0g，收率53.7％。
VC-2的制备：
将DMF(2500ml)加入到5L四口瓶中。分批加入VC1002(250.0g，0.416mol，1eq)，搅拌至澄清，向反应液中滴加DIPA(500mL，2V)。滴加完毕后，室温25℃反应16小时，HPLC检测反应完全。
反应液成浆糊状，将其转移至10L塑料桶中，用二氯甲烷7.5L分散反应液。搅拌30分钟后压滤。滤饼再用2L二氯甲烷打浆分散后压滤，滤饼再次用二氯甲烷1L打浆30分钟后加入甲基叔丁基醚1L压滤得滤饼。红外灯烘干打粉得类白色固体131g，收率83.7％。
VC-3的制备：
将VC-2(131g，0.345mol)加入到2L三口瓶中，加入DMF 1.5L，搅拌至澄清，滤液转移至2L反应瓶中，加入Mc-Osu(0.445mol)，搅拌一小时后HPLC检测反应液，反应结束，过滤除去不溶物，滤液转移至10L塑料桶中，加入二氯甲烷6L，搅拌30分钟后直接压滤，滤饼用二氯甲烷2L打浆后再次滤液。滤饼再次用二氯甲烷2L搅拌20分钟后加入甲基叔丁基醚2L。搅拌30分钟后压滤。红外灯烘干再用打粉机打粉得黄色固体135g，收率69.3％。
VC-4的制备：
将VC-3(150g，0.262mol)加入到2L三口瓶中，加入DMF 1.5L，搅拌至澄清，加入DNPC(159g，0.524mol)，用恒压滴液漏斗滴加DIPEA(3.386g，0.0262mol)，搅拌22小时后HPLC检测反应液，反应结束，过滤除去不溶物，滤液转移至10L塑料桶中，加入二氯甲烷6L，搅拌30分钟后直接压滤，滤饼用二氯甲烷2L打浆后再次滤液。滤饼再次用二氯甲烷2L搅拌20分钟后加入甲基叔丁基醚2L。搅拌30分钟后压滤。红外灯烘干再用打粉机打粉得黄色固体171g，收率88.6％。
LND1035-1的制备：
室温氮气保护下，用加料漏斗将三光气(59.28g，0.2mol)加入到三口圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃(1.5L)，充分搅拌至澄清，用冰盐浴将反应内温控制在-5至0℃，然后用恒压滴液漏斗滴加三乙胺(42.47g，0.417mol)，再用恒压滴液漏斗滴加Boc-DMEA(74.81g，0.397mol)。室温搅拌反应3小时。
将上述所得反应液用布氏漏斗减压过滤，滤饼用四氢呋喃(700ml)洗涤一次，滤液转移至单口圆底烧瓶，用旋转蒸发仪除去四氢呋喃。
在室温条件下，用加料漏斗向上述的单口圆底烧瓶中加入吡啶(1000mL)，然后加入SN38(51.68g，0.132mol)和DMAP(3.18g，0.026mol)。氮气保护下，50℃反应16小时。
用旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，向浓缩液中加入超纯水1L，用乙酸乙酯(1L)萃取三次，静置分层，收集合并上层，将上层溶液依次用饱和氯化铵水溶液1L和饱和食盐水1L分别洗涤一次，无水硫酸钠干燥30分钟，用布氏漏斗过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩。
向上述所得固体中加入二氯甲烷(100ml)溶解粗产品。在搅拌的条件下，加入石油醚(1L)，打浆一个小时，有固体析出。布氏漏斗减压过滤，得到滤饼，用石油醚冲洗滤饼一次，真空干燥得到白色固体(80.09g，纯度：98.4％，产率99.8％)。
合成LND1035-2：
用加料漏斗将LND1035-1(77.96g，0.128mol)加入到单口圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(390ml)，室温搅拌至澄清，然后用恒压滴液漏斗滴加三氟乙酸(390ml)，5-10分钟滴完，室温搅拌反应。用HPLC检测反应终点，1小时后，终止反应。
将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，再用二氯甲烷(100ml)溶解澄清后旋干，重复两次。
所得固体中加入甲基叔丁基醚(1200ml)，搅拌1小时。布氏漏斗减压过滤，得到滤饼，用甲基叔丁基醚(400ml)冲洗滤饼一次，真空干燥，得到黄色固体(80.6g，纯度：98.6％，产率：97％)。
合成LND1035：
室温氮气保护下，用加料漏斗将LND1035-2(60.56g，0.097mol)，VC-4(60.00g，0.081mol)，HOBt(11.00g，0.081mol)加入到三口圆底烧瓶中，加入DMSO(240ml)和DMF(120ml)，充分搅拌20min，将上述三口圆底烧瓶转移至冰水浴中，将反应内温控制在0-15℃，然后用恒压滴液漏斗滴加DIPEA(21.07g，0.163mol)。用油浴控制内温50℃反应3h。
向反应液中加入冰水3L，搅拌1小时，布氏漏斗减压过滤，所得固体用二氯甲烷：甲烷＝10∶1的混合溶剂1.2L溶解，用饱和氯化铵水溶液洗，收集下层溶液，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩得到固体粗品，粗品用100-200目硅胶分散，过硅胶柱纯化。洗脱液合并，用旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，得到白色固体(73.39g，纯度：95.3％，产率：81％)。
本实施例的LND1035的HNMR谱图如图1所示，1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ9.93(d，J＝16.8Hz，1H)，8.13(dt，J＝9.0，4.0Hz，1H)，8.05(d，J＝7.5Hz，1H)，7.91-7.85(m，1H)，7.76(d，J＝8.6Hz，1H)，7.54(dt，J＝16.4，8.5Hz，3H)，7.32-7.26(m，2H)，7.24(d，J＝8.2Hz，1H)，6.96(s，2H)，6.49(s，1H)，5.94(t，J＝5.8Hz，1H)，5.45-5.37(m，4H)，5.29(d，J＝5.9Hz，2H)，5.02(s，1H)，4.97(d，J＝7.8Hz，1H)，4.34(p，J＝6.6，5.9Hz，1H)，4.16(t，J＝7.7Hz，1H)，3.61(s，1H)，3.52(q，J＝9.8，5.2Hz，1H)，3.48-3.44(m，2H)，3.34(d，J＝7.0Hz，3H)，3.16-3.04(m，3H)，3.01(d，J＝5.8Hz，1H)，2.97(d，J＝26.8Hz，3H)，2.93(s，1H)，2.91-2.85(m，2H)，2.16(dt，J＝14.6，7.5Hz，1H)，2.09(dt，J＝14.3，7.1Hz，1H)，2.04(s，1H)，1.94(h，J＝7.9，7.3Hz，1H)，1.90-1.86(m，1H)，1.83(dt，J＝14.1，6.9Hz，2H)，1.66(tt，J＝10.2，5.3Hz，1H)，1.56(s，1H)，1.44(tq，J＝13.5，7.0Hz，5H)，1.37-1.30(m，1H)，1.24(dt，J＝19.9，8.0Hz，3H)，1.16(h，J＝7.7，6.8Hz，2H)，0.89-0.76(m，9H)。
本发明实施例1中的LND1035的LCMS谱图如图2、图3所示，M+1＝1105.44。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗体偶联药物的中间体LND1035的合成方法，该合成方法包括：
将Fmoc-Val-Cit、PABOH和EEDQ在第一溶剂中水浴0℃-50℃下反应，反应液过滤，所得固体在第一溶剂中打浆，过滤烘干得到VC1002；
将所述VC1002在第二溶剂和第三溶剂的混合溶剂中0℃-40℃下反应，在第四溶剂中打浆纯化，过滤烘干得到VC-2；
将所述VC-2和Mc-OSu在第二溶剂中0℃-50℃下反应，在第四溶剂中打浆纯化，过滤烘干得到VC-3；
将所述VC-3、DNPC、DIPEA在第二溶剂中0℃-40℃下反应，在第四溶剂中打浆纯化，过滤烘干得到VC-4；
将Boc-DMEA、三光气、三乙胺在溶剂四氢呋喃中反应，过滤收集滤液，真空旋干除去溶剂，加入吡啶和SN38，20℃-60℃反应，待反应结束真空旋干除去溶剂，加入乙酸乙酯和水分液，收集上层溶液，真空旋干除去溶剂，固体在第五溶剂中打浆纯化，过滤烘干得到LND1035-1；
将LND1035-1在第六溶剂中0℃-40℃下反应，真空旋干除去溶剂，在甲基叔丁基醚中打浆纯化，过滤烘干得到LND1035-2；
将所述LND1035-2、VC-4、HOBt、DIPEA在第七溶剂中20℃-60℃反应，得到LND1035。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备VC1002时，所述Fmoc-Val-Cit、PABOH和EEDQ的混合摩尔比为1∶1.5∶1.5-1∶2∶2。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备VC-3时，VC-2和Mc-OSu的混合摩尔比为1∶1.1-1∶2。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备VC-4时，VC-3、DNPC、DIPEA的混合摩尔比为1∶1.5∶0.1-1∶2∶0.1。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备LND1035-1时，Boc-DMEA、三光气、三乙胺、SN38的混合摩尔比为1∶0.3∶1.0∶0.3-1∶0.5∶1.2∶0.5。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备LND1035时，LND1035-2、VC-4、HOBt、DIPEA的混合摩尔比为1.0∶1.0∶1.0∶1.5-1∶1.2∶1.2∶3.0。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其中，所述第一溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；
所述第二溶剂为DMF或DMA。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其中，所述第三溶剂为DEA或DIPA；
所述第四溶剂为甲基叔丁基醚和二氯甲烷的混合溶剂。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其中，所述第五溶剂为石油醚和二氯甲烷的混合溶剂；
所述第六溶剂为二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶剂。
10.根据权利要求1所述的合成方法，其中，所述第七溶剂为DMF或DMSO。
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