CN113402584A - 一种抗体偶联药物连接子的中间体lnd1067-l1的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体偶联药物连接子的中间体LND1067‑L1的合成方法。该合成方法包括：LND1067‑L1‑0与四乙酸铅在第一溶剂中反应制备LND1067‑L1‑1；将LND1067‑L1‑1与乙醇酸苯甲酯在THF中反应制备LND1067‑L1‑3；将LND1067‑L1‑0与苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐在第二溶剂中反应，制备LND1067‑L1‑6；将LND1067‑L1‑6与三氟乙酸在第三溶剂中反应，制备LND1067‑L1‑7；将LND1067‑L1‑3与二乙胺在DMF中下反应，浓缩后，加入LND1067‑L1‑7、PyBop、二异丙基乙胺，在第四溶剂中反应，制备LND1067‑L1‑8；将LND1067‑L1‑8和钯碳在第五溶剂中反应，制备LND1067‑L1。本发明的合成方法解决了原研路线的量级小，生产难度高，难于放大的问题，通过工艺的优化改进，实现了LND1067‑L1的高效合成，易于放大，便于商业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种中间体的合成方法，尤其涉及一种抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法，属于药物化学技术领域。
背景技术
抗体药物偶联物(Antibody drug conjugate，简称ADC)是一类新型的抗肿瘤药物，其原理是将细胞毒素连接在抗体上，通过抗体对癌细胞表面特定抗原的识别，通过内吞作用进入癌细胞，从而将细胞毒素运输到靶点，达到靶向性治疗恶性肿瘤的目的。ADC与传统的小分子抗肿瘤药物相比，因能借助抗体的靶向识别性与毒素的高活性，故更具备特异性和有效性。
ADC包括三个不同的组成部分，即抗体、连接子和细胞毒素。连接子方面，主要应用的为不可裂解型，如甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-瓜氨酸(GGFG-Acid)，经过溶酶体水解后，药物仍然具有活性，并通过连接区与某个氨基酸残基结合在一起。
其中，现有的LND1067-L1作为重要的抗体偶联药物连接子的中间体，其现有的合成路线如下所示：
该合成方法中，存在以下问题：
1.第1步需要正相硅胶纯化，纯化困难，量级小；
2.第2步量级小，难于商业化生产；
3.第3步量级小，难于商业化生产；
4.第4步需要正相硅胶纯化，纯化困难，量级小；
5.第5步合成LND1067-L1-7需要正相硅胶纯化，纯化困难，量级小；
6.第6步需要反相制备纯化，纯化难度高，量级小；
7.第7步量级小，没有分离得到纯品。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种可以高效合成、且易于放大商业化生产的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法，该合成方法包括以下步骤：
LND1067-L1-0与四乙酸铅在第一溶剂中反应2h-4h，处理反应液，浓缩，结晶打浆，得到LND1067-L1-1；
将LND1067-L1-1与乙醇酸苯甲酯(LND1067-L1-2)在THF中反应1h-3h，处理反应液，浓缩，粗品正相快速纯化，纯化得到LND1067-L1-3；
将LND1067-L1-0与苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐(LND1067-L1-5)在第二溶剂中反应，处理反应液，打浆，抽滤，干燥，得到LND1067-L1-6；
将LND1067-L1-6与三氟乙酸在第三溶剂中反应4h-16h，反应液处理后，打浆，抽滤，干燥，得到LND1067-L1-7；
在0℃-5℃、氮气保护下，将LND1067-L1-3与二乙胺在DMF中下反应0.3h-1h，浓缩后，加入LND1067-L1-7、PyBop，降温至0℃-5℃加入二异丙基乙胺，在第四溶剂中室温下反应1h-5h，反应完全分液，萃取，干燥，浓缩，正相纯化得到LND1067-L1-8；
将LND1067-L1-8和钯碳在第五溶剂中，常压氢化反应1.5h-4h，过滤，浓缩，结晶打浆，得到抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1。
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法包括以下步骤：
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法，解决了原研路线的量级小，生产难度高，难于放大的问题，实现了LND1067-L1的高效合成，易于放大，便于商业化生产。
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法中包括制备LND1067-L1-1的步骤。包括以下流程：
在本发明的一具体实施方式中，制备LND1067-L1-1时，LND1067-L1-0与四乙酸铅的摩尔当量比为1.3eq-1.6eq∶1。其中，LND1067-L1-0与四乙酸铅的混合比可以为500g∶1085g。
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法中包括制备LND1067-L1-3的步骤。包括以下流程：
在本发明的-具体实施方式中，制备LND1067-L1-3时，LND1067-L1-1与乙醇酸苯甲酯的摩尔当量比1.5-2.5eq∶1。其中，LND1067-L1-1与LND1067-L1-2的混合比可以为400g∶360.95g。另外，还可以添加对甲苯磺酸-水合物，作为催化剂，用量为0.1-0.2摩尔当量。
在本发明的一具体实施方式中，制备LND1067-L1-3时，正相纯化的洗脱流速为3L/min-5L/min。
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法中包括制备LND1067-L1-6的步骤。包括以下流程：
在本发明的一具体实施方式中，制备LND1067-L1-6时，按照以下步骤进行：
将LND1067-L1-0溶于第二溶剂中，再加入HATU，室温搅拌5min-10min；
氮气保护，降温至0℃-5℃，加入LND1067-L1-5后滴加DIPEA，滴加过程保持内温小于10℃(优选0℃-10℃)，升温至室温搅拌反应0.5h-2h，在冰水中搅拌，得到所述LND1067-L1-6。
具体地，制备LND1067-L1-6时，LND1067-L1-0、HATU、LND1067-L1-5、DIPEA的摩尔当量比为1.0eq∶1.3eq-1.5eq∶1.0eq∶2.5eq-3.5eq。其中，LND1067-L1-0、HATU、LND1067-L1-5、DIPEA的混合比可以为300g∶139.5g∶218.22g∶328.27g。
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法中包括制备LND1067-L1-7的步骤。包括以下流程：
在本发明的-具体实施方式中，制备LND1067-L1-7时，LND1067-L1-6与三氟乙酸的摩尔当量比为7.0eq-9.0eq∶1。其中，LND1067-L1-6与三氟乙酸的混合反应比可以为475g∶475ml。
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法中包括制备LND1067-L1-8的步骤。包括以下流程：
在本发明的一具体实施方式中，制备LND1067-L1-8时，LND1067-L1-3、二乙胺、LND1067-L1-7、PyBop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、二异丙基乙胺的摩尔当量比为1.0eq∶4.0eq-6.0eq∶1.0eq∶1.5eq-2.5eq∶2.0eq-3.0eq；其中，LND1067-L1-3、二乙胺、LND1067-L1-7、PyBop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、二异丙基乙胺的混合比可以为200g∶200mL∶211.3g∶439g∶149.3g。
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法中包括制备LND1067-L1的步骤。包括以下流程：
在本发明的一具体实施方式中，制备抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1时，钯碳的用量是LND1067-L1-8质量的5％-15％；其中，LND1067-L1-8与钯碳的混合比可以为65g∶6.5g。
在本发明的一具体实施方式中，第一溶剂为THF或甲苯；第二溶剂为DMF、THF或DCM；第三溶剂为THF或DCM；第四溶剂为DMF、DMA、DCM。
在本发明的一具体实施方式中，第五溶剂为甲醇和THF的混合溶剂或甲醇与DCM的混合溶剂；其中，甲醇和THF的混合体积比为30V∶10V；甲醇与DCM的混合体积比为30V∶10V。
本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法，解决了原研路线的量级小，生产难度高，难于放大的问题；通过工艺的优化改进，实现了LND1067-L1的高效合成，易于放大，便于商业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例中的LND1067-L1-1的HPLC谱图。
图2为本发明实施例中的LND1067-L1-1的LCMS谱图。
图3为本发明实施例中的LND1067-L1-3的HPLC谱图。
图4为本发明实施例中的LND1067-L1-3的LCMS谱图。
图5为本发明实施例中的LND1067-L1-6的HPLC谱图。
图6为本发明实施例中的LND1067-L1-6的LCMS谱图。
图7为本发明实施例中的LND1067-L1-7的HPLC谱图。
图8为本发明实施例中的LND1067-L1-7的LCMS谱图。
图9为本发明实施例中的LND1067-L1-8的HPLC谱图。
图10为本发明实施例中的LND1067-L1-8的LCMS谱图。
图11为本发明实施例中的LND1067-L1的HPLC谱图。
图12为本发明实施例中的LND1067-L1的LCMS谱图。
图13为本发明实施例中的LND1067-L1的HNMR谱图。
具体实施方式
实施例
本实施例提供了一种抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法，具体包括以下步骤。
LND1067-L1-1的合成
将500g的LND1067-L1-0加入到10L反应釜，加入5L(10V)THF；四乙酸铅1085g(1.4eq)，吡啶174ml(1.2eq)加入体系，70℃-80℃回流反应2-4h；待反应完全后，后处理：体系全部倒出浓缩旋干，加入纯水(3L)EA(5L)萃取，水相中再加入2L的EA反萃，EA相合并，饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，砂芯漏斗过滤，滤液旋干，粗品中加入1L MTBE，打浆2h，布氏漏斗抽滤，滤饼用MTBE洗涤，产品晾干，得到纯品417.5g，收率：80.3％。6319HPLC：96.0％(HPLC谱图如图1所示)，LCMS谱图如图2所示。
LND1067-L1-3的合成
将400g的LND1067-L1-1加入到10L三口瓶中，再加入4L的THF，搅拌下再加入乙醇酸苯甲酯360.95g(2.0eq)，对甲苯磺酸-水合物41.32g(0.2eq)，室温搅拌反应1-3h；待反应完全，后处理：加入4L的EA，1.4L饱和碳酸氢钠，萃取分液；3L的EA反萃水相，EA相合并，无水硫酸钠干燥，砂芯漏斗过滤，浓缩得到粗品，正相纯化(PE/EA：1/2-/2/1)得到纯品267g，收率：51.8％。HPLC：95.1％(谱图如图3所示)，LCMS：475.34[M+H]+(谱图如图4所示)。
LND1067-L1-6的合成
将300g的LND1067-L1-0溶于1.5L DMF(5V)中，再加入HATU 139.5g(1.3eq)，室温搅拌5-10min，氮气保护，冰水浴降温；降至0-5度时，加入LND1067-L1-5 218.22g(1.0eq)，加完后开始滴加DIPEA 328.27g(3.0eq)，滴加过程保持内温小于10度，加完，升至室温搅拌反应0.5-2h。反应完全后，后处理：将反应体系倒入10L冰水中，机械搅拌，析出大量白色固体颗粒，搅拌过夜，抽滤，滤饼用纯水洗涤，烘干，得到白色固体，得到纯品475g，收率：100％。HPLC：98.3％(谱图如图5所示)，LCMS：558.50[M+H]+(谱图如图6所示)。
LND1067-L1-7的合成
将475g的LND1067-L1-6溶于1.9L(4V)DCM，再加入475ml TFA(1V)，氮气保护，室温搅拌4-16h；反应完全后，反应液直接旋干，加入2L的MTBE，机械搅拌打浆2h，抽滤，滤饼用MTBE洗涤，滤饼烘干，得到432g，收率：101％。HPLC：97.1％(如图7所示)，LCMS：502.36[M+H]+(如图8所示)。
LND1067-L1-8的合成
将200g的LND1067-L1-3，800ml DMF(4V)倒入3L单口瓶内，氮气保护，反应内温降至0-5℃，加入200ml(1V)二乙胺(DEA)，加完反应0.3-1h，TLC检测，反应体系浓缩后，直接进行下一步反应；
浓缩后的反应体系中，加入DMF 1000ml(5V)，LND1067-L1-7 211.3(1.0eq)，PyBop439g(2.0)，降温至0-5℃，加入DIPEA 149.3g(2.0eq)，升至室温反应1-5h。反应完全后处理：加入EA 4.6L和纯水(3L)，搅拌萃取分液，水相再加入3L的EA反萃，合并有机相，用饱和氯化钠洗涤有机相三次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品；正相纯化(DCM/MeOH：1/100-4/100)得到纯品207.9g，收率：67.1％。HPLC：95.3％(如图9所示)，LCMS：758.58[M+Na]+(如图10所示)。
LND1067-L1的合成
将65g的LND1067-L1-8，650ml DCM和1950ml MeOH加入到3L单口瓶中，搅拌加入6.5g 10％Pd/C，置换氢气，反应1.5h-4h。HPLC检测反应完全后处理：在砂芯漏斗垫硅藻土，抽滤，滤液旋蒸至大量白色块状固体析出时，抽滤，滤饼用MeOH洗涤，烘干，得到产品42.3g，收率：74.2％。
HPLC：95.4％(如图11所示)，LCMS：668.62[M+Na]+(如图12所示)。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.58(t，J＝6.5Hz，1H)，8.32(t，J＝5.7Hz，1H)，8.17(d，J＝8.0Hz，1H)，8.05(t，J＝5.4Hz，1H)，7.95(s，1H)，7.89(d，J＝7.5Hz，2H)，7.71(d，J＝7.4Hz，2H)，7.59(t，J＝6.0Hz，1H)，7.41(t，J＝7.4Hz，2H)，7.32(t，J＝7.4Hz，2H)，7.23(d，J＝6.0Hz，3H)，7.18(dd，J＝7.5，5.0Hz，1H)，4.62(d，J＝6.6Hz，2H)，4.51(dd，J＝13.0，8.9Hz，1H)，4.32-4.19(m，2H)，3.97(s，2H)，3.81-3.58(m，4H)，3.08(s，2H)，2.89(s，2H)，2.73(s，2H)(如图13所示)。
对比例
本对比例提供了一种抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法，具体包括以下步骤。
将500g的LND1067-L1-0加入到10L反应釜，加入5L(10V)THF；四乙酸铅1085g(1.4eq)，吡啶174ml(1.2eq)加入体系，开始升温回流反应6h；待反应完全后，后处理：体系全部倒出浓缩旋干，加入纯水(3L)EA(5L)萃取，水相中再加入2L的EA反萃，EA相合并，饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，砂芯漏斗过滤，滤液旋干，粗品中加入1L MTBE，打浆2h，布氏漏斗抽滤，滤饼用MTBE洗涤，产品晾干，得到纯品，收率：65％。
将400g的LND1067-L1-1加入到10L三口瓶中，再加入4L的THF，搅拌下再加入乙醇酸苯甲酯360.95g(2.0eq)，对甲苯磺酸-水合物41.32g(0.2eq)，室温搅拌反应0.5h；待反应完全，后处理：加入4L的EA，1.4L饱和碳酸氢钠，萃取分液；3L的EA反萃水相，EA相合并，无水硫酸钠干燥，砂芯漏斗过滤，浓缩得到粗品，正相纯化(PE/EA：1/2-/2/1)得到纯品，收率：42％。
将300g的LND1067-L1-0溶于1.5L DMF(5V)中，再加入HATU 139.5g(1.3eq)，室温搅拌5-10min，氮气保护，冰水浴降温；降至-5度时，加入LND1067-L1-5 218.22g(1.0eq)，加完后开始滴加DIPEA 328.27g(3.0eq)，滴加过程保持内温为10度，加完，升至室温搅拌反应3h。反应完全后，后处理：将反应体系倒入10L冰水中，机械搅拌，析出大量白色固体颗粒，搅拌过夜，抽滤，滤饼用纯水洗涤，烘干，得到白色固体，得到纯品，收率：85％。
将475g的LND1067-L1-6溶于1.9L(4V)DCM，再加入475ml TFA(1V)，氮气保护，室温搅拌35h；反应完全后，反应液直接旋干，加入2L的MTBE，机械搅拌打浆2h，抽滤，滤饼用MTBE洗涤，滤饼烘干，得到纯品，收率：80％。
将200g的LND1067-L1-3，800ml DMF(4V)倒入3L单口瓶内，氮气保护，反应内温降至-5℃，加入200ml(1V)二乙胺(DEA)，加完反应5h，TLC检测，反应体系浓缩后，直接进行下一步反应；浓缩后的反应体系中，加入DMF 1000ml(5V)，LND1067-L1-7211.3(1.0eq)，PyBop800g，降温至0-5℃，加入DIPEA 149.3g(2.0eq)，升至室温反应1-5h。反应完全后处理：加入EA 4.6L和纯水(3L)，搅拌萃取分液，水相再加入3L的EA反萃，合并有机相，用饱和氯化钠洗涤有机相三次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品；正相纯化(DCM/MeOH：1/100-4/100)得到纯品，收率：42％。
将65g的LND1067-L1-8，650ml DCM和1950ml MeOH加入到3L单口瓶中，搅拌加入1g10％的Pd/C，置换氢气，反应0.5h。HPLC检测反应完全后处理：在砂芯漏斗垫硅藻土，抽滤，滤液旋蒸至大量白色块状固体析出时，抽滤，滤饼用MeOH洗涤，烘干，得到产品，收率：47％。
以上实施例说明本发明的抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法，实现了LND1067-L1的高效合成，易于放大，便于商业化生产。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1的合成方法，该合成方法包括以下步骤：
LND1067-L1-0与四乙酸铅在第一溶剂中，在60℃-80℃下反应2h-4h，处理反应液，浓缩，结晶打浆，得到LND1067-L1-1；
将所述LND1067-L1-1与乙醇酸苯甲酯在THF中反应1h-3h，处理反应液，浓缩，粗品正相纯化，纯化得到LND1067-L1-3；
将LND1067-L1-0，苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐，HATU和DIPEA在第二溶剂中反应，处理反应液，打浆，抽滤，干燥，得到LND1067-L1-6；
将所述LND1067-L1-6与三氟乙酸在第三溶剂中反应4h-16h，反应液处理后，打浆，抽滤，干燥，得到LND1067-L1-7；
在0℃-5℃、氮气保护下，将所述LND1067-L1-3与二乙胺在DMF中下反应0.3h-1h，浓缩后，加入LND1067-L1-7、PyBop，降温至0℃-5℃加入二异丙基乙胺，在第四溶剂中室温下反应1h-5h，反应完全分液，萃取，干燥，浓缩，正相纯化得到LND1067-L1-8；
将所述LND1067-L1-8和钯碳在第五溶剂中，常压氢化反应1.5h-4h，过滤，浓缩，结晶打浆，得到所述抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备LND1067-L1-1时，所述LND1067-L1-0与四乙酸铅的摩尔当量比为1.3eq-1.6eq∶1。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备LND1067-L1-3时，所述LND1067-L1-1与乙醇酸苯甲酯的摩尔当量比1.5-2.5eq∶1；
优选地，制备LND1067-L1-3时，正相纯化的洗脱流速为3L/min-5L/min。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备LND1067-L1-6时，按照以下步骤进行：
将LND1067-L1-0溶于第二溶剂中，再加入HATU，室温搅拌5min-10min；
氮气保护，降温至0℃-5℃，加入苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐后滴加DIPEA，滴加过程保持内温0℃-10℃，升温至室温搅拌反应0.5h-2h，在冰水中搅拌，得到所述LND1067-L1-6。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其中，制备LND1067-L1-6时，LND1067-L1-0、HATU、苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐、DIPEA的摩尔当量比为1.0eq∶1.3eq-1.5eq∶1.0eq∶2.5eq-3.5eq。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备LND1067-L1-7时，LND1067-L1-6与三氟乙酸的摩尔当量比为7.0eq-9.0eq∶1。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备LND1067-L1-8时，LND1067-L1-3、二乙胺、LND1067-L1-7、PyBop、二异丙基乙胺的摩尔当量比为1.0eq∶4.0eq-6.0eq∶1.0eq∶1.5eq-2.5eq∶2.0eq-3.0eq。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备抗体偶联药物连接子的中间体LND1067-L1时，钯碳的用量是LND1067-L1-8质量的5％-15％。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其中，所述第一溶剂为THF或甲苯；
第二溶剂为DMF、THF或DCM；
第三溶剂为THF或DCM；
第四溶剂为DMF、DMA、DCM。
10.根据权利要求1所述的合成方法，其中，第五溶剂为甲醇和THF的混合溶剂或甲醇与DCM的混合溶剂；
优选地，所述甲醇和THF的混合体积比为30V∶10V；
所述甲醇与DCM的混合体积比为30V∶10V。
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