CN114605493A - 一种抗体偶联药物中间体set0526的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体偶联药物中间体SET0526的合成方法。该合成方法包括：以化合物MA‑PEG4‑C2H4COOH、HATU、VC‑PAB和DIPEA，制备MA‑PEG4‑VC‑PAB；以MA‑PEG4‑VC‑PAB、DNPC和DIPEA制备MA‑PEG4‑VC‑PAB‑PNP；以PNU‑TBS、TBAF和高碘酸钠，制备PNU‑Acid；以PNU‑Acid、HOAt、PrBrOP、EDA‑Fmoc和DIPEA，制备PNU‑EDA‑Fmoc；以PNU‑EDA‑Fmoc和DBU制备PNU‑EDA；以MA‑PEG4‑VC‑PAB‑PNP、PNU‑EDA、HOBt、DIPEA制备SET0526。本发明的SET0526的合成方法，产率和转化率高，易于放大，便于商业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物的合成方法，尤其涉及一种抗体偶联药物中间体SET0526的合成方法，属于小分子药物合成技术领域。
背景技术
抗体药物偶联物(Antibody drug conjugate，简称ADC)是一类新型的抗肿瘤药物，其原理是将细胞毒素连接在抗体上，通过抗体对癌细胞表面特定抗原的识别，通过内吞作用进入癌细胞，从而将细胞毒素运输到靶点，达到靶向性治疗恶性肿瘤的目的。ADC与传统的小分子抗肿瘤药物相比，因能借助抗体的靶向识别性与毒素的高活性，故更具备特异性和有效性。
ADC包括三个不同的组成部分，即抗体、连接子和细胞毒素。抗体实现靶向性，连接子保证在ADC在血液转运过程中的稳定性，而到达作用靶点后，毒素发挥对癌细胞的杀伤作用。根据作用机制的不同，适用于ADC的毒素分为微管类抑制剂(Microtubuleinhibitors)，DNA损伤剂(DNA damaging agents)，RNA聚合酶抑制剂(RNA polymeraseinhibitors)等。
目前，市场上销售和临床试验中的ADC所采用的毒素主要为微管类抑制剂，主要包括DNA拓扑异构酶I(topoisomerase I)抑制剂设计的化合物，比如Dxd，以及基于美登素(Maytansine-based)设计的化合物，比如DM1和DM4；DNA拓扑异构酶II(topoisomerase II)抑制剂设计的化合物，比如一种高效的蒽环类新霉素代谢产物PNU-159682具有出色的细胞毒性。连接子方面，主要应用的为不可裂解型，如缬氨酸-瓜氨酸(Valine-Citriline)和环己基甲酸(MCC)，经过溶酶体水解后，药物仍然具有活性，并通过连接区与某个氨基酸残基结合在一起。
抗体药物偶联物的形成方式有多种。既可以通过抗体上的氨基或巯基和药物连接子进行化学反应偶联，也可以对抗体进行修饰，在抗体上引入特定功能基后，再和药物连接子进行化学反应偶联或酶催化反应偶联。
其中，抗体药物毒素分子MA-PEG4-vc-PAB-EDA-PNU159682(SET0526，结构如下)是一种新型的用于抗体偶联药物的中间体。
我们开发的SET0526的合成方法包括以下三种路线。
路线一：
在路线一的开发中，化合物5的合成收率很低，反应有很多副反应发生，总的收率很低，难以放大生产。
路线二：
路线二：由于在路线一中化合物5的合成收率很低，反应有很多副反应发生，所以我们改变合成策略，用保护基团保护的乙二胺，再通过脱保护拿到高收率的化合物9。
在实际的合成中，Boc保护的9-1的反应转化率和收率很高，但是在脱保护阶段Boc保护的9-1尝试不同的脱保护试剂如：HCl/二氧六环、HCl/EtOAc、HCl/Et20、TFA、TosOH/THF-CH2Cl2、Me3SiI/CHCl3或者CH3CN，收率都偏低，并且有很多副反应(水解、断链等)发生，收率偏低；
将保护基团换成Fmoc后，Fmoc保护的9-1的反应转化率和收率同样很高，但是在脱保护阶段Fmoc保护的9-1尝试不同的脱保护试剂如：二乙胺、二异丙胺、1，8-二偶氮杂双螺环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)、哌啶、乙醇胺、环己胺、吗啡啉、吡咯烷酮2等反应收率很低，反应有很多副反应发生，收率依然偏低。
所以路线二最终的总收率依然很低，难以放大生产。
发明内容
为了解决上述开发的技术中存在的问题，我们开发了路线三，即本发明重点保护的路线方法；本发明的目的在于提供一种收率高，转化率高的高效SET0526的合成方法。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种抗体偶联药物中间体SET0526的合成方法，该合成方法包括以下步骤：
将化合物MA-PEG4-C2H4COOH和HATU在第一溶剂中搅拌，冰水降温至0-5℃，加入化合物VC-PAB和DIPEA，氮气保护下反应2h-3h，反应液过反相柱，纯化得到化合物MA-PEG4-VC-PAB；
将所述化合物MA-PEG4-VC-PAB溶于第一溶剂中，加入DNPC和DIPEA室温20-25℃反应14-16h，中压反相过柱纯化，得到化合物MA-PEG4-VC-PAB-PNP；
将化合物PNU-TBS溶于第二溶剂中，降温至-5-0℃加入TBAF，反应20-30min，加入水和三氟乙醇或甲醇乙醇，加入高碘酸钠，升温至0-5℃反应2-4h，检测原料反应完全，反应液直接浓缩冻干，得到粗品化合物PNU-Acid；
将所述粗品化合物PNU-Acid溶于第三溶剂中，依次加入HOAt、PrBrOP，冰浴降温0-5℃搅拌5-0min，加入EDA-Fmoc和DIPEA，自然升至室温20-25℃反应2-4h，后处理，中压反相过柱纯化，冻干，得到化合物PNU-EDA-Fmoc；
将化合物PNU-EDA-Fmoc加入第四溶剂中溶解，冰浴降温0-5℃搅拌5-0min，加入DBU，自然升至室温搅拌1-3h，后处理，反应液浓缩，中压反相过柱纯化冻干，得到化合物PNU-EDA；
将化合物MA-PEG4-VC-PAB-PNP和PNU-EDA溶于第三溶剂，加入HOBt、DIPEA，自然升至室温20-25℃反应2-4h，后处理，得到SET0526 MA-PEG4-vc-PAB-EDA-PNU159682。
该合成方法具体包括以下步骤：
在本发明的一具体实施方式中，制备MA-PEG4-VC-PAB时，MA-PEG4-C2H4COOH、HATU、第一溶剂、VC-PAB和DIPEA的混合摩尔比为1.0eq∶1.0eq-1.5eq∶10V-20V∶1.0eq∶2.0eq-2.5eq。
在本发明的一具体实施方式中，制备MA-PEG4-VC-PAB-PNP时，MA-PEG4-VC-PAB、第一溶剂中、DNPC和DIPEA的混合摩尔比为1.0eq∶10V-20V∶1.0eq-1.5eq∶2.0eq-2.5eq。
在本发明的一具体实施方式中，PNU-TBS、第二溶剂中、TBAF、水、三氟乙醇或甲醇乙醇、高碘酸钠的混合摩尔比为1.0eq∶10V-20V∶1.0eq-3.0eq∶10V-20V∶1.0eq-1.1eq。
在本发明的一具体实施方式中，制备PNU-EDA-Fmoc时，PNU-Acid、第三溶剂、HOAt、PrBrOP、EDA-Fmoc和DIPEA的混合摩尔比为1.0eq∶10V-20V∶1.0eq-2.0eq∶1.0eq-2.5eq∶1.0eq-2.5eq∶3.0eq-6.0eq。
在本发明的一具体实施方式中，PNU-EDA-Fmoc、第四溶剂、DBU的混合摩尔比为1.0eq∶10V-30V∶1.0eq-3.0eq。
在本发明的一具体实施方式中，MA-PEG4-VC-PAB-PNP、PNU-EDA、第三溶剂、HOBt、DIPEA的混合摩尔比为1.0eq∶1.0eq-2.0eq∶10V-30V∶1.0eq-2.0eq∶2.0eq-4.0eq。
在本发明的一具体实施方式中，制备SET0526时，后处理包括以下步骤：
高压液相制备，234nm，流速50mL/min，0.05％的NH4HCO3水/乙腈，冻干。
在本发明的一具体实施方式中，所述第一溶剂为DCM、THF或DMF。
在本发明的一具体实施方式中，所述第二溶剂为DCM或THF。
在本发明的一具体实施方式中，所述第三溶剂为DMF或DMA。
在本发明的一具体实施方式中，所述第四溶剂为DCM、THF或CAN。
本发明的SET0526的合成方法，产率和转化率高，易于放大，便于商业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例的MA-PEG4-VC-PAB的HPLC谱图。
图2为本发明实施例的MA-PEG4-VC-PAB的LCMS谱图。
图3为本发明实施例的MA-PEG4-VC-PAB-PNP的HPLC谱图。
图4为本发明实施例的PMA-PEG4-VC-PAB-PNP的LCMS谱图。
图5为本发明实施例的PNU-Acid的LCMS谱图。
图6为本发明实施例的PNU-EDA-Fmoc的HPLC谱图。
图7为本发明实施例的PNU-EDA-Fmoc的LCMS谱图。
图8为本发明实施例的PNU-EDA的HPLC谱图。
图9为本发明实施例的PNU-EDA的LCMS谱图。
图10为本发明实施例的SET0526的HPLC谱图。
图11为本发明实施例的SET0526的LCMS谱图。
图12为本发明实施例的SET0526的HNMR谱图。
具体实施方式
实施例1
化合物MA-PEG4-VC-PAB的合成
将MA-PEG4-C2H4COOH 222mg(1.2eq)，加入DMF 2mL氮气保护下室温搅拌溶解，加入HATU 384mg(1.9eq)，冰水降温0度左右，加入VC-PAB 200mg(1.0eq)，滴加DIPEA 170mg(2.5eq)氮气保护下自然升至室温反应2-3小时左右。LC-MS/HPLC检测，原料反应完毕。后处理：直接中压反相柱纯化(水/乙腈体系纯化，30％乙腈比例出产品)，冻干得到化合物MA-PEG4-VC-PAB 160mg，HPLC纯度97.1％，LCMS：707.74[M+H]+。MA-PEG4-VC-PAB的HPLC谱图如图1所示，LCMS谱图如图2所示。
化合物MA-PEG4-VC-PAB-PNP的合成
将MA-PEG4-VC-PAB 160mg(1.0eq)溶于2mL DMF，加入DNPC 83mg(1.2eq)，DIPEA59mg(2.0eq)室温搅拌反应16h。LC-MS/HPLC检测，原料基本反应完毕。后处理：直接中压反相过柱纯化(80g反相柱，220nm，水/乙腈体系纯化，50％乙腈比例出产品)。收集冻干，得到MA-PEG4-VC-PAB-PNP 144mg，HPLC(图3)：99.4％，LCMS(图4)：872.86[M+H]+。
化合物PNU-Acid的合成
取500mg(1.0eq)化合物6于50mL单口瓶，加入THF 5mL，降温至-5℃搅拌，取TBAF(1M in THF)0.86mL(1.3eq)滴加至反应瓶内，反应约20min，LCMS检测原料反应完全，加入水2.5mL及三氟乙醇5mL，加入高碘酸钠149mg(1.05eq)，升至0℃反应约2h，LCMS检测原料反应完全。后处理：加入5mL水，旋蒸除去THF，冻干得到粗品，直接用于下一步反应，LCMS如图5所示：628.43[M+H]+。
化合物PNU-EDA-Fmoc的合成
将上一步得到的PNU-Acid粗品(理论：415mg，1.0eq)加入5mDMF溶解，加入HOAt89.8mg(1.0eq)、PrBrOP 615mg(2.0eq)，冰浴降温至0-5℃搅拌5min，加入EDA-Fmoc 316mg(2.0eq)，DIPEA 427mg(5.0eq)，自然升至室温20-25℃反应2h左右，LC-MS/HPLC检测，原料反应完毕。后处理：中压反相过柱纯化(80g反相柱，234nm，水/乙腈体系纯化，700％乙腈比例出产品)。收集冻干，得到PNU-EDA-Fmoc 200mg，HPLC(图6)：94％，LCMS(图7)：892.69[M+H]+。
化合物PNU-EDA的合成
将214mg(1.0eq)PNU-EDA-Fmoc加入4mL DCM/1mL ACN溶解，冰浴降温至0-5℃搅拌5min，加入DBU(1M in ACN)0.48mL(2.0eq)，自然升至室温20-25℃搅拌1h。LC-MS/HPLC检测，原料反应完毕。后处理：加入1mL 0.05％碳酸氢铵水，快速旋蒸除去有机相后中压反相过柱纯化((80g反相柱，234nm，0.05％碳酸氢铵水/乙腈体系纯化，30％乙腈比例出产品)。收集冻干，得到PNU-EDA 80mg，HPLC如图8所示：94％，LCMS如图9所示：670.57[M+H]+。
SET0526(MA-PEG4-VC-PAB-EDA-PNU159682)的合成
将MA-PEG4-VC-PAB-PNP 39mg(1.0eq)，PNU-EDA 33mg(1.2eq)溶于1mL DMF，冰浴降温至0-5℃搅拌5min，加入HOBt 6.1mg(1.9eq)，DIPEA 12mg(2.5eq)，自然升温至20-25℃反应2h左右，LC-MS/HPLC检测，原料反应完毕。后处理：高压液相制备，234nm，流速50mL/min，0.05％NH4HCO3水/乙腈，60％乙腈比例出产品，收集产品，冻干得到SET0526 30mg，HPLC(如图10)：92.49％，LCMS(图11)：1403.16[M+H]+。
如图12所示的1H NMR(400MHz，DMSO)δ14.06(s，1H)，13.24(s，1H)，9.97(s，1H)，8.10(d，J＝6.9Hz，3H)，7.89(dd，J＝20.3，6.6Hz，4H)，7.71-7.57(m，4H)，7.32-7.22(m，4H)，7.02(s，2H)，5.98(t，J＝5.6Hz，1H)，5.40(s，2H)，5.27(dd，J＝11.7，7.3Hz，2H)，5.04-4.94(m，4H)，4.59(d，J＝2.0Hz，1H)，4.38(d，J＝5.4Hz，1H)，4.26-4.19(m，3H)，4.13(d，J＝7.2Hz，1H)，4.00(s，3H)，3.93(d，J＝7.6Hz，1H)，3.66(d，J＝10.3Hz，1H)，3.62-3.58(m，2H)，3.52(d，J＝5.0Hz，3H)，3.47(d，J＝5.8Hz，12H)，3.35(s，110H)，3.24-3.18(m，3H)，3.14-3.09(m，3H)，3.04-2.88(m，6H)，2.73-2.59(m，3H)，2.39(dd，J＝13.6，7.1Hz，2H)，2.16(d，J＝12.9Hz，1H)，2.03-1.92(m，2H)，1.78-1.55(m，6H)，1.46-1.34(m，3H)，1.26-1.18(m，6H)，1.13(d，J＝6.4Hz，1H)，0.85(dd，J＝12.8，6.8Hz，8H)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗体偶联药物中间体SET0526的合成方法，该合成方法包括以下步骤：
将化合物MA-PEG4-C2H4COOH和HATU在第一溶剂中搅拌，冰水降温至0～5℃，加入化合物VC-PAB和DIPEA，氮气保护下反应2h-3h，反应液过反相柱，纯化得到化合物MA-PEG4-VC-PAB；
将所述化合物MA-PEG4-VC-PAB溶于第一溶剂中，加入DNPC和DIPEA室温反应14-16h，中压反相过柱纯化，得到化合物MA-PEG4-VC-PAB-PNP；
将化合物PNU-TBS溶于第二溶剂中，降温至-5-0℃加入TBAF，反应20-40min，加入水和三氟乙醇或甲醇乙醇，加入高碘酸钠，升温至0-5℃反应2-4h，检测原料反应完全，反应液直接浓缩冻干，得到粗品化合物PNU-Acid；
将所述粗品化合物PNU-Acid溶于第三溶剂中，依次加入HOAt、PrBrOP，冰浴降温至0～5℃拌5-20min，加入EDA-Fmoc和DIPEA，自然升温至20～25℃反应2-4h，后处理，中压反相过柱纯化，冻干，得到化合物PNU-EDA-Fmoc；
将化合物PNU-EDA-Fmoc加入第四溶剂中溶解，冰浴至0～5℃拌5-20min，加入DBU，自然升至室温20～25℃搅拌1-2h，后处理，反应液浓缩，中压反相过柱纯化冻干，得到化合物PNU-EDA；
将化合物MA-PEG4-VC-PAB-PNP和PNU-EDA溶于第三溶剂，加入HOBt、DIPEA，自然升温至20～25℃反应2-4h，后处理，得到SET0526。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备MA-PEG4-VC-PAB时，MA-PEG4-C2H4COOH、HATU、第一溶剂、VC-PAB和DIPEA的混合摩尔比为1.0eq∶1.0eq-1.5eq∶10V-20V∶1.0eq∶2.0eq-2.5eq。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备MA-PEG4-VC-PAB-PNP时，MA-PEG4-VC-PAB、第一溶剂中、DNPC和DIPEA的混合摩尔比为1.0eq∶10V-20V∶1.0eq-1.5eq∶2.0eq-2.5eq。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其中，PNU-TBS、第二溶剂中、TBAF、水、三氟乙醇或甲醇乙醇、高碘酸钠的混合摩尔比为1.0eq∶10V-20V∶1.0eq-3.0eq∶10V-20V∶1.0eq-1.1eq。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备PNU-EDA-Fmoc时，PNU-Acid、第三溶剂、HOAt、PrBrOP、EDA-Fmoc和DIPEA的混合摩尔比为1.0eq∶10V-20V∶1.0eq-2.0eq∶1.0eq-2.5eq∶1.0eq-2.5eq∶3.0eq-6.0eq。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其中，PNU-EDA-Fmoc、第四溶剂、DBU的混合摩尔比为1.0eq∶10V-30V∶1.0eq-3.0eq。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其中，MA-PEG4-VC-PAB-PNP、PNU-EDA、第三溶剂、HOBt、DIPEA的混合摩尔比为1.0eq∶1.0eq-2.0eq∶10V-30V∶1.0eq-2.0eq∶2.0eq-4.0eq。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其中，制备SET0526时，后处理包括以下步骤：
高压液相制备，234nm，流速50mL/min，0.05％的NH4HCO3水/乙腈，冻干。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其中，所述第一溶剂为DCM、THF或DMF；
所述第二溶剂为DCM或THF。
10.根据权利要求1所述的合成方法，其中，所述第三溶剂为DMF或DMA；
所述第四溶剂为DCM、THF或CAN。
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