MXPA06004920A - Tratamiento de enfermedades proliferativas usando un olig??mero antisentido de iap y un agente quimioterapeutico. - Google Patents

Abstract

La invencion caracteriza el uso de un oligomero de contra-sentido para XIAP, HIAP-1 o HIAP-2 y un agente quimioterapeutico y composiciones y kits de los mismos para el tratamiento de enfermedades proliferativas.

Description

TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES PROLIFERATIVAS USANDO UN OLIGÓMERO ANTISENTIDO DE IAP Y UN AGENTE QUIMIOTERAPÉUTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el tratamiento del cáncer y otras enfermedades proliferativas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una forma de muerte celular es conocida como apoptosis, o muerte celular programada. La apoptosis comúnmente ocurre como una parte normal del desarrollo y el mantenimiento de los tejidos saludables. El proceso puede ocurrir tan rápidamente que es difícil de detectar. Se sabe que la vía de la apoptosis tiene una participación crítica en el desarrollo embrionario, la patogénesis viral, el cáncer, los trastornos autoinmunes y las enfermedades neurodegenerativas, y también en otros sucesos. Se ha implicado la falla de la respuesta apoptótica en el desarrollo del cáncer, en trastornos autoinmunes, tales como el lupus eritematoso, en la esclerosis múltiple, y en infecciones virales, incluyendo aquellas asociadas con virus de herpes , virus de viruela y adenovirus . La importancia de la apoptosis en el cáncer se ha aclarado en los años recientes .

La identificación de los oncogenes promotores del crecimiento hacia fines de la década de 1970 dio lugar a una atención casi universal en la proliferación celular, que dominó la investigación en biología de cáncer por muchos años . El dogma apoyado durante todo este tiempo sostenía que las terapias anti-cáncer preferiblemente deberían atacar las células cancerosas en división rápida en vez de las células "normales". Esta explicación no fue completamente satisfactoria, ya que los tumores de crecimiento lento se tratan con facilidad, mientras que muchos tipos tumorales con división rápida son extremadamente resistentes a las terapias anti-cáncer. En la actualidad, el progreso en el campo del cáncer ha conducido a un nuevo paradigma en la biología del cáncer, donde se contempla la neoplasia como una falla en la ejecución de las vías normales de muerte celular programada. Las células normales reciben una retroalimentación continua desde sus vecinas a través de diversos factores de crecimiento, y cometen "suicidio" si son retiradas de este contexto. Las células cancerosas ignoran de algún modo estas órdenes y continúan proliferando de forma inapropiada. En la actualidad se cree que muchas terapias contra el cáncer, incluyendo la radiación y muchos regímenes de quimioterapia, de los que previamente se creía que actuaban causando lesiones celulares, operan realmente desencadenando la ápoptosis .

Los tipos celulares normales y los tipos celulares cancerosos presentan un amplio rango de susceptibilidad a desencadenantes apoptóticos, aunque recién se están investigando los determinantes de esta resistencia en la actualidad. Muchos tipos celulares normales sufren una detención temporal del crecimiento en respuesta a una dosis sub-letal de radiación o sustancias químicas citotóxicas, al tiempo que las células cancerosas en las cercanías sufren apoptosis. Este efecto diferencial a una dosis dada provee la ventana de tratamiento crucial que permite el desarrollo de una terapia anticáncer exitosa. Por consiguiente, no es sorprendente que la resistencia de las células tumorales a la apoptosis emerja como una base importante para la falla de los tratamientos contra el cáncer. Se han identificado diversas proteínas endógenas potentes que inhiben la apoptosis, incluyendo las familias de proteínas Bcl-2 e IAP en mamíferos. Determinados miembros de la familia IAP inhiben directamente las caspasas efectoras terminales, es decir, casp-3 y casp-7, que participan en la ejecución de la muerte celular, así como la caspasa iniciadora mitocondrial clave, casp-9, importante para la mediación de la muerte celular inducida por la quimioterapia contra el cáncer. Las IAP son los únicos inhibidores de caspasas endógenos conocidos, por lo que tienen una participación central en la regulación de la apoptosis .

Se ha postulado que las IAP contribuyen al desarrollo de algunos cánceres, y se ha identificado una translocación cromosómica causal que comprende una IAP particular (CIAP2/HIAP1) en el linfoma MALT. Se ha demostrado una correlación reciente entre la XIAP elevada, la prognosis pobre y la supervivencia corta en pacientes con leucemia mielógena aguda. Además, la XIAP se sobreexpresó en gran medida en muchas líneas de células tumorales del panel NCI . Existe una necesidad de terapias contra el cáncer mejoradas, y en particular, de terapias que puedan inducir la apoptosis de las células cancerosas y anulen las señales anti-apoptóticas proporcionadas en dichas células .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En general, en la invención se proporcionan métodos útiles para inducir la apoptosis en una célula. Los métodos de la invención son útiles para tratar cánceres y otras enfermedades proliferativas. En la presente invención se proporciona un método para tratar un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, tal como cáncer, que comprende administrar un oligómero de nucleobases antisentido de IAP y un agente quimioterapéutico. El agente quimioterapéutico y el oligómero de nucleobases antisentido de I P se administran de forma simultánea o con una separación de 28 días (por ejemplo, con una separación de 21 días, 14, días, 7 días, 1 día o 1 hora) , en cantidades que combinadas son suficientes para tratar el paciente. Los oligómeros de nucleobases antisentido de IAP reducen la cantidad de una proteína IAP producida, por lo que permiten que la célula exprese normalmente la IAP para desencadenar la apoptosis. Esto se logra proporcionando oligómeros de nucleobases que hibridizan específicamente con uno o más polinucleótidos que codifican una IAP. La hibridización específica del oligómero de nucleobases con un polinucleótido IAP (por ejemplo, ARN, ADN) interfiere con la función normal de dicho polinucleótido IAP, reduciendo la cantidad de proteína IAP producida. Una molécula de ácido nucleico que modula la función de un ácido nucleico blanco hibridizando específicamente con el blanco se conoce en general como un "agente terapéutico antisentido" . Si bien puede usarse cualquier oligómero de nucleobases antisentido de IAP que reduzca los niveles de expresión de IAP, en un aspecto, el oligómero de nucleobases tiene entre ocho y trece de longitud, e incluye al menos ocho nucleobases consecutivas de una secuencia seleccionada entre SEQ ID N° 1-99, 143, 147, 151, 163-260, 287, 289 y 300-460. En determinadas realizaciones, el oligómero de nucleobases incluye una secuencia seleccionada entre SEQ ID N° 1-99, 143, 147, 151, 163-260, 287, 289 y 300-460. Es deseable que el oligómero de nucleobases consista en (o comprenda esencialmente) una o más de las siguientes SEQ ID N° . Por ejemplo, el oligómero de nucleobases puede incluir una secuencia seleccionada entre SEQ ID N° 97, 98, 99, 143, 147, 151, 287 y 289, SEQ ID N° 300-389, o SEQ ID N° 390-460. En una realización particularmente deseable, en la invención se proporciona un oligómero de nucleobases que tiene once residuos de ADN rodeados a cada lado por cuatro residuos de 2 ' -0-metil ARN, y consiste en una de las siguientes secuencias: 5 ' -AUUGGT TCCAATGTGUUCU-3 ' (SEQ ID N° 155); 5 ' -ACACGACCGCT AAGAAACA-3 ' (SEQ ID N° 16); 5'-ACAGGACTACCACTTGGAA-3 • (SEQ ID N° 157); 5 ' -UGCC AGTGTTGATGCUGAA-3 ' (SEQ ID N° 27); 5'-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3 • (SEQ ID N°141); 5 ' -UCGGGTATA TGGTGTCUGA-3 ' (SEQ ID N° 41); 5 ' -AAGC ACTGCACTTGGUCAC-3' (SEQ ID N° 47); 5 ' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3 ' (SEQ ID N° 51); 5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3 ' (SEQ ID N° 63); 5'-UGUCAGTACA TGTTGGCUC-3 ' (SEQ ID N° 161); y 5'-UGCACCCTGGATACCAUUU- 3' (SEQ ID N" 151). En otra realización, el oligómero de nucleobases antisentido de IAP tiene hasta 30 nucleobases de longitud, e incluye al menos ocho nucleobases consecutivas de una secuencia seleccionada entre SEQ ID N° 461-490. Otros oligómeros de nucleobases antisentido de IAP que pueden administrarse en combinación con un agente quimioterapéutico son aquellos que hibridizan bajo una severidad elevada con un polinucleótido que codifica el polipéptido IAP seleccionado entre NAIP (Bircl) , HIAP1 (cIAP2, API2, MIHC, hITA) , HIAP2 (clAPl, MIHB) , XIAP (hILP, lLPl, MIHA, API3), survivina (TIAP, MIHD,API4) , livina (KIAP, ML-IAP, cIAP3 , HIAP3) y hILP2 (Ts-IAP, TIAP) . Un oligómero de nucleobases usado en el método de la presente invención puede incluir al menos un enlace modificado (por ejemplo, un enlace fosforotioato, metilfosfonato, fosfotriéster, fosforoditioato, o fosfoselenato) , una nucleobase modificada (por ejemplo, una 5-metil citosina) , y/o una porción de azúcar modificada (por ejemplo, con un grupo 2 ' -O-metoxietilo o un grupo 2 ' -O-metilo) . En una realización, el oligómero es un oligómero quimérico (por ejemplo, un oligonucleótido cjue incluye residuos de ADN unidos entre sí por enlaces fosforotioato o fosfodiéster, rodeados a cada lado por al menos uno, dos, tres o cuatro residuos de 2 ' -O-metil ARN unidos por un enlace fosforotioato) . En otro aspecto, en la invención se proporciona un método para potenciar la apoptosis en una célula. Este método incluye el paso de administrar un oligómero de nucleobases antisentido de IAP y un agente quimioterapéutico a la célula, de forma simultánea o con una separación de 28 días, y en cantidades que combinadas son suficientes para potenciar la apoptosis. La célula puede estar ex vivo o in vivo. En una realización, la célula es una célula cancerosa (por ejemplo, una célula cancerosa humana) o una célula de origen linfoide o mieloide. El cáncer puede ser, por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, síndrome mielodisplástico, leucemia linfocítica crónica, policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endo eliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer de útero, cáncer de testículo, carcinoma pulmonar, carcinoma de células pulmonares pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealo a, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodenroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma o retinoblastoma. Cuando se trata un cáncer, también puede ser deseable administrar uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales, un agente modificador de la respuesta biológica y/o un sensibilizador químico. En términos deseables, la administración de uno o más de estos agentes se realiza con una separación máxima de 28 días de la administración del oligómero de nucleobases. El agente quimioterapéutico y el oligómero de nucleobases pueden administrarse por la misma ruta o por rutas diferentes. Si bien puede usarse cualquier ruta de administración que resulta en una cantidad efectiva en el sitio deseado, las rutas particularmente deseables incluyen la administración intravenosa e intratumoral . En otro aspecto, en la invención se proporciona una composición farmacéutica que incluye un agente quimioterapéutico y un oligómero de nucleobases antisentido de IAP, donde el agente quimioterapéutico y el oligómero de nucleobases antisentido de IAP se hallan en cantidades que combinadas son suficientes para tratar un paciente que tiene una enfermedad proliferativa (por ejemplo, cáncer) . Si se lo desea, la composición farmacéutica puede incluir componentes adicionales (por ejemplo, un sistema de dispersión coloidal) . En la invención también se proporciona un método para tratar un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, tal como un cáncer o un trastorno linfoproliferativo, que comprende administrar al paciente un agente quimioterapéutico y una molécula de ARN catalítica, o un vector de expresión que codifica dicha molécula de ARN catalítica, donde el agente quimioterapéutico y la molécula de ARN catalítica se administran en forma simultánea o con una separación de 28 días, en cantidades que combinadas son suficientes para tratar el paciente. En reali?iaciones deseables, la molécula de ARN catalítica incluye, en sus brazos de unión, al menos ocho nucleobases consecutivas que corresponden a un oligómero de nucleobases antisentido de IAP (por ejemplo, una secuencia de nucleobases de cualquiera de las Tablas 2, 3, 7, 8 y 9). En términos deseables, la molécula de ARN toma un motivo de cabeza de martillo, pero también puede tomar un motivo de horquilla, virus de hepatitis delta, intrón del grupo 1, ARN VS o ARNasaP. En la invención también se proporciona un método para tratar un paciente que tiene un cáncer o un trastorno linfoproliferativo, que comprende administrar al paciente un agente quimioterapéutico y una molécula de ARN de cadena doble que tiene entre 21 y 29 nucleobases, donde al menos ocho nucleobases consecutivas corresponden a un oligómero de nucleobases antisentido de IAP (por ejemplo, una secuencia de cualquiera de las Tablas 2, 3, 7, 8 y 9). El agente quimisterapéutíco y la molécula de ARN de cadena doble se administran en forma simultánea o con una separación de 28 días, en cantidades que combinadas son suficientes para tratar el paciente. En un aspecto relacionado, en la invención también se proporciona un método para tratar un paciente que tiene un cáncer o un trastorno linfoproliferativo, que comprende administrar al paciente un agente quimioterapéutico y una molécula de ARN de cadena doble que tiene entre 50 y 70 nucleobases, donde la molécula de ARN tiene un primer dominio de entre 21 y 29 nucleobases, que incluye al menos ocho nucleobases consecutivas que corresponden a un oligómero de nucleobases antisentido de IAP (por ejemplo, una secuencia de cualquiera de las Tablas 2, 3, 7, 8 y 9) ; un segundo dominio complementario con el primer dominio, y un dominio de rizo situado entre el primer y el segundo dominio, de modo que el primer y el segundo dominio pueden formar un doblete y conformar una molécula de ARN de cadena doble. El agente quimioterapéutico y la molécula de ARN de cadena doble se administran en forma simultánea o con una separación de 28 días, en cantidades que combinadas son suficientes para tratar el paciente.

En la invención también se proporcionan diversos conjuntos de elementos. Uno de estos conjuntos de elementos incluye (i) un oligómero de nucleobases antisentido de IAP de entre ocho y treinta nucleobases de longitud; (ii) un agente quimioterapéutico; y (iii) instrucciones para administrar el oligómero de nucleobases antisentido de IAP y el agente quimioterapéutico a un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, en cantidades suficientes para tratar la enfermedad proliferativa. Otro conjunto de elementos de la invención incluye (i) un oligómero de nucleobases antisentido de IAP de entre ocho y treinta nucleobases de longitud; y (ii) instrucciones para administrar el oligómero de nucleobases antisentido de IAP y un agente quimioterapéutico a un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, en cantidades suficientes para tratar la enfermedad proliferativa. Aún otro conjunto de elementos de la invención incluye (i) una composición de la invención (como se describió con anterioridad) ; y (ii) instrucciones para administrar la composición a un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad proliferativa. Un "oligómero de nucleobases" designa un compuesto que incluye una cadena de al menos ocho nucleobases unidas por grupos de enlace. En esta definición se incluyen los oligonucleótidos naturales y no naturales, modificados y no modificados, así como oligonucleótidos miméticos, tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , ácidos nucleicos trabados (LNA) y ácidos arabinonucleicos (ANA) . Pueden emplearse numerosas nucleobases y grupos de unión en los oligómeros de nucleobases de la invención, incluyendo aquellos descriptos con mayor detalle en la presente documentación, en la sección intitulada "Oligonucleótidos y sus oligómeros de nucleobases", presentada más adelante. "Proteína" o "polipéptido" o "fragmento de polipéptido" designa cualquier cadena de más de dos aminoácidos, sin tener en cuenta las modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, glicosilación o fosforilación) , que constituye la totalidad o una parte de un polipéptido o un péptido de ocurrencia natural, o que constituye la totalidad o una parte de un polipéptido o un péptido que no es de ocurrencia natural . La "apoptosis" designa el proceso de muerte celular en el que una célula moribunda presenta un conjunto de marcas distintivas bioquímicas bien caracterizadas que incluyen el abultamiento de la membrana, la reducción del soma celular, la condensación de la cromatina y el pliegue del ADN en escalera. Un "gen IAP" hace referencia a un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un dominio BIR y que es capaz de modular (inhibir o potenciar) la apoptosis en una célula o un tejido cuando se lo administra con otros métodos de administración intracelular o extracelular (véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 5919912) . En realizaciones preferidas, el gen IAP es un gen que tiene aproximadamente 50% o más identidad de secuencia de nucleótidos (por ejemplo, al menos 85%, 90% o 95%) con al menos uno de XIAP, HIAP1 o HIAP2 humano o murino (cada uno de los cuales se describe en la Patente de los EEUU N° 6156535) . Preferiblemente, la región de secuencia sobre la cual se mide la identidad es una región que codifica al menos un dominio BIR y un dominio de anillo de dedos de cinc. Los genes IAP de mamíferos incluyen secuencias de nucleótidos aisladas de cualquier mamífero fuente. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano. Una "proteína IAP" o un "polipéptido IAP" designa un polipéptido, o un fragmento de éste, codificado por un gen IAP. Los polipéptidos IAP incluyen NAIP(Bircl), HIAP1 (clAP2, API2, MIHC, hITA) , HIAP2 (clAPl, MIHB) , XIAP (hILP, hlLPl, MIHA, API3), survivina (TIAP, MIHD, API4) , livina (KIAP, ML-IAP, cIAP3 , H1AP3) y hlLP2 (Ts-IAP, TIAP) . Una "actividad biológica de IAP" representa cualquier actividad causada in vivo o in vitro por un polipéptido IAP. La "potenciación de la apoptosis" hace referencia al incremento en la cantidad de células que sufren apoptosis en una población celular dada (por ejemplo, células cancerosas, linfocitos, fibroblastos o cualquier otra célula) . Se apreciará que el grado de potenciación de la apoptosis proporcionado por el compuesto potenciador de la apoptosis en un ensayo dado variará, pero que aquellos entrenados en la técnica podrán determinar el cambio significativo desde el punto de vista estadístico en el nivel de apoptosis, con lo que será posible identificar un oligómero de nucleobases que potencie la apoptosis, limitada de otro modo por una IAP. Preferiblemente, la "potenciación de la apoptosis" denota que el incremento en la cantidad de células que sufren apoptosis es de al menos 10%, más preferiblemente el incremento es de 25% o aún 50%, y más preferiblemente el incremento es de la menos una vez, respecto de las células que no han recibido un oligómero de nucleobases de la invención, pero que han sido tratadas de una forma sustancialmente similar en los aspectos restantes. Preferiblemente, la muestra monitoreada es una muestra de células que normalmente sufren una apoptosis insuficiente (es decir, células cancerosas) . En la presente documentación se describen métodos para detectar cambios en el nivel de apoptosis (es decir, potenciación o reducción) . Un oligómero de nucleobases que "inhibe la expresión" de un gen blanco (por ejemplo, una IAP) designa uno que reduce la cantidad de un ARNm blanco, o una proteína codificada por dicho ARNm, al menos en aproximadamente 5%, más preferiblemente al menos en aproximadamente 10%, 25%, o aún 50%, respecto de un control sin tratar. En la técnica se conocen métodos para medir los niveles de ARNm y proteínas; en la presente documentación se describen ejemplos de estos métodos . La "hibridización" designa la unión hidrógeno, que puede ser una unión hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversa, entre nucleobases complementarias. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se aparean mediante la formación de uniones hidrógeno. Una "enfermedad proliferativa" hace referencia a una enfermedad que es causada o resulta en niveles inapropiadamente elevados de división celular, niveles de apoptosis inapropiadamente reducidos, o ambos. Por ejemplo, el cáncer es un ejemplo de una enfermedad proliferativa. Los ejemplos de cánceres incluyen, sin limitaciones, leucemias (por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocí ica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica) , policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin, enfermedad distinta de la de Hodgkin) , macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada, y tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer de útero, cáncer de testículo, carcinoma pulmonar, carcinoma de células pulmonares pequeñas , carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocito a, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodenroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma o retinoblastoma) . Los trastornos linfoproliferativos también se consideran enfermedades proliferativas. Preferiblemente, un oligómero de nucleobases usado en un método de la invención es capaz de potenciar la apoptosis y/o disminuir los niveles de ARNm o proteínas IAP, cuando está presente en una célula que normalmente no sufre suficiente apoptosís . Preferiblemente el incremento es de al menos 10% respecto de un control, más preferiblemente 25%, y más preferiblemente de una vez o más . Un oligómero de nucleobases usado en un método de la invención proteína incluye entre aproximadamente 8 y 30 nucleobases. En determinadas realizaciones, al menos ocho nucleobases consecutivas son de una secuencia seleccionada entre SEQ ID N° 1-99, 143, 147, 151, 163-260, 287, 289, 300-490. Un oligómero de nucleobases de la invención también puede contener, por ejemplo, otras 20, 40, 60, 85, 120 o más nucleobases consecutivas, que son complementarias con un polinucleótido que codifica un polipéptido IAP. El oligómero de nucleobases (o una porción de éste) puede contener un esqueleto modificado. En la técnica se conocen esqueletos de fosforotioato, fosforoditioato y otros esqueletos modificados. El oligómero de nucleobases también puede contener uno o más enlaces no naturales . Un "paciente" designa cualquier animal (por ejemplo, un ser humano) . Los pacientes no humanos que pueden tratarse usando los métodos, las composiciones y los conjuntos de elementos de la invención incluyen caballos, perros, gatos, cerdos, cabras, conejos, hámsters, monos, cerdos de Guinea, ratas, ratones, lagartos, serpientes, ovejas, ganado, peces y aves.

Un "agente quimioterapéutico" hace referencia a un agente que se usa para matar células cancerosas o demorar su crecimiento. Por consiguiente, tantos los agentes citotóxicos como los agentes citostáticos se consideran agentes cjuimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos son los taxanos (por ejemplo, paclitaxel, doxetaxel, RPR109881A, SB-T-1213, SB-T-1250, SB-T-101187, BMS-275183, BRT 216, DJ-927, MAC-321, IDN5109 y 1DN5390) , los vinca alcaloides (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, vinflunina, vinorelbina y anhidrovinblas ina) , las dolastatinas (dolastatina-10, dolastatina-15 , ILX651, TZT-1027, simplostatina 1, simplostatina 3 y LU103793) , las criptoficinas (por ejemplo, criptoficina 1 y criptoficina 52), las epotilonas (por ejemplo, epotilona A, epotilona B, deosxiepotilona B y lactama de epotilona B) , la eleuterobina, la discodermolida, la 2-epi-discodermolida, la 2-des-metildiscodermolida, la 5-hidroximetildiscoderniolida, la 19-des-aminocarbonildiscodermolida, la 9(13)-ciclodiscodermolida y la laulimalida. Se indican otros más adelante en la Tabla 1. Un "agente modificador de la respuesta biológica" es un agente que estimula o restaura la capacidad del sistema inmune para combatir la enfermedad. Algunos de los agentes modificadores de la respuesta biológica, pero no todos, demoran el crecimiento de las células cancerosas, por lo que también se consideran "agentes quimioterapéuticos". Los ejemplos de agentes modificadores de la respuesta biológica incluyen los interferones (alfa, beta, gamma), la interleuquina-2, el rituximab y el trastuzumab . Un "sensibilizador químico" hace referencia a un agente que las células tumorales sean más sensibles a los efectos de la quimioterapia. Un "trastorno linfoproliferativo" es un trastorno en el que hay una proliferación anormal de las células del sistema linfático (por ejemplo, las células T y las células B) . Una "ribozima" designa un ARN que tiene actividad enzimática, que posee especificidad por un sitio y capacidad de corte para una molécula de ARN blanco. Las ribozimas pueden usarse para reducir la expresión de un polipéptido. Se describen métodos para usar ribozimas para disminuir la expresión de polipéptidos, por ejemplo, en Turner et al. (Adv. Exp. Med. Biol. 465003018, 2000) y Norris et al., (Adv. Exp. Med. Biol. 465:293-301, 2000). Un "gen informante" designa un gen que codifica un polipéptido cuya expresión puede evaluarse; estos polipéptidos incluyen, sin limitaciones, glucuronidasa (GUS) , luciferasa, cloranfenicol transacetilasa (CAT) y beta-galactosidasa.

Un "promotor" hace referencia a un polinucleótido suficiente para dirigir la transcripción. "Unido operativamente" denota que un primer polinucleótido está localizado en una posición adyacente a un segundo polinucleótido, que dirige la transcripción del primer polinucleótido cuando se unen moléculas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) al segundo polinucleótido. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas, y de las reivindicaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1L son gráficos en los que se indica el efecto de oligonucleótidos antisentido de XIAP sobre la expresión de proteínas XIAP, respecto de las proteínas totales (Figuras ÍA, ÍC, ÍE, 1G, II y ÍK) . En las Figuras IB, ID, 1F, ÍH, 1J y ÍL se presentan los valores de concentración de proteínas totales para cada transfección de oligonucleótidos, en comparación con resultados de transfecciones simuladas, que se usaron para normalizar los resultados de las proteínas XIAP anteriores . Las Figuras 2A-2C son gráficos en los que se indican los efectos de diversos oligonucleótidos antisentido de XIAP, solos o combinados, sobre el ARN (Figura 2A) y la proteína XIAP (Figura 2B) . La Figura 2C es un gráfico de los valores de concentración de proteínas totales para cada transfección de oligonucleótidos, en comparación con resultados de transfecciones simuladas, que se usaron para normalizar los resultados de las proteínas XIAP anteriores indicados en la Figura 2B. Las Figuras 3 y 4 son gráficos en los que se ilustran los efectos de los oligonucleótidos de esqueleto mixto 4X4 (MBO) FG8 o E 12 en cantidades de 31 nM (Figura 3) o 63 nM (Figura 4) . Se transfectaron células de carcinoma de pulmón H460 por 18 horas en uno, dos o tres días consecutivos usando MBO 125 nM y Lipofectamina 2000. Las muestras para los análisis de Western se obtuvieron en el momento indicado. Se realizó un análisis de densitometría, se normalizaron los niveles de proteínas XIAP de acuerdo con aquellos de GAPDH, y realizó una comparación con un control simulado tomado como 100%. Los porcentajes indicados representan el % de eliminación de proteína XIAP versus los controles mezclados específicos. Las Figuras 5A-5D son gráficos de los efectos de los oligonucleótidos antisentido de XIAP sobre la viabilidad celular (Figuras 5A, 5C y 5D) , y la sensibilización química en presencia de adriamicina (Fiura 5B) .

La Figura 6 es un gráfico donde se ilustra la regulación negativa específica mediada por oligonucleótidos de ARNm de XIAP en células H460 in vitro. Se ilustran los niveles de ARNm de XIAP en células H460 tratadas con Lipofectamina 2000 sola (LFA) o Lipofectamina 2000, con 1,2 µM de los oligonucleótidos F3, G4, C5 , AB6, DE4 o D7 , o de un oligonucleótido control con una polaridad inversa respectiva (RP) o mezclado (SC) . La cuantificación por RT-PCR a tiempo real del ARNm de XIAP se realizó 6 horas después de la transfección. Todos los datos se presentan como el promedio de ± la desviación estándar (SD) de triplicados de un experimento representativo. Al nivel de ARNm de XIAP en células sin tratar (control) mantenidas bajo condiciones experimentales idénticas se le asignó un valor de 1. La Figura 7 es un gráfico en el que se indican los niveles de ARN de XIAP en células H460, después de una transfección con diversos oligonucleótidos PS-XIAP. Se transfectaron células cancerosas de pulmón humano H460 por 6 horas usando oligonucleótidos PS 1RM y Lipofectamina 2000. Luego se cosecharon las células para realizar un análisis Taqman. La Figura 8 es un gráfico en el que se indican los niveles de ARN de XIAP en células H460 9 horas después de una transfección con 4X4 MBO. Las células H460 se transfectaron por 9 horas usando 4X4 MBO entre 62,5 nM y 1 µM, y Lipofectamina 2000. Luego se cosecharon las células para realizar un análisis Taqman. La Figura 9 es un gráfico en el que se indica la eliminación de proteínas XIAP en células H460, 24 horas después de una transfección con 4X4 MBO. Las células H460 se transfectaron por 24 horas usando 1RM 4X4 MBO 1 µM y Lipofectamina 2000. Luego se cosecharon las células para realizar un análisis de Western blot. Se realizó un análisis de densitometría, se normalizaron los niveles de proteínas XIAP de acuerdo con los de la actina, y se realizó una comparación con controles mezclados específicos (sm, rm) , que se tomaron como 100%. Las Figuras 10A y 10B son ilustraciones esquemáticas donde se presenta la regulación negativa específica mediada por moléculas antisentido de proteínas XIAP en células H460 in vitro. Se ilustran los niveles de proteínas XIAP en células H460 tratadas con Lipofectamina 2000 sola (LFA) o LFA más 1,2 µM de los oligonucleótidos XIAP F3 , G4 o C5, o los oligonucleótidos de control respectivos (RP, SC) . Se analizaron los niveles de proteínas XIAP por Western blot (Figura 1 OA) , y se cuantificó la cantidad de proteínas pro densitometría (Figura 1 OB) . Se normalizaron los niveles de proteínas XIAP de acuerdo con los niveles de actina celular, y se los comparó con los niveles en el control (CNT) sin tratar.

Las Figuras HA y 11B son ilustraciones esquemáticas donde se presentan los efectos mediados por el oligonucleótido XIAP sobre la activación de la caspasa. Se ilustra el efecto de los oligonucleótidos XIAP F3, G4 o C5, o sus controles ODN respectivos, RP y SC, a una concentración de 1,2 µM, sobre los niveles de expresión de las proteínas pro-caspasa-3 , PARP (tanto completa (116 kDa) como procesada (85 kDa) ) (Figura 10A) y Bcl-2 y Bax (Figura 10B) en células H460 transfectadas, en comparación con un control. Se analizó la expresión de las proteínas por Western blot. Los niveles de las proteínas Bcl-2 y Bax se normalizaron de acuerdo con los niveles de actina celular, y se cuantificaron por densitometría. Se presenta la relación Bcl-2/Bax como el promedio de dos o tres experimentos independientes, y la relación en las células control (CNT) se tomó como 1. Las Figuras 12A y 12B son ilustraciones esquemáticas en las que se presenta la inducción de la apoptosis específica de los oligonucleótidos XIAP. La inducción de la apoptosis se midió en células H460 tratadas con oligonucleótido AS de XIAP G4 1,2 µM, oligonucleótido SC G4, o en controles sin tratar (CNT). En la Figura 12A se indica en porcentaje de células que tiene un contenido de ADN inferior al de GO/Gl (apoptótico) , medido a través de una coloración con ioduro de propidio (Pl) y citometría de flujo. En la Figura 12B se ilustra la morfología nuclear de células H460 tratadas con oligonucleótidos y coloreadas con DAPI . Las flechas indican las células que tienen la morfología apoptótica característica de la condensación o la fragmentación del ADN nuclear. La Figura 13A es un gráfico en el que se indica el efecto de un tratamiento con el oligonucleótido AS de XIAP G4 sobre la viabilidad de células H460. Las células se trataron con una concentración creciente de LFA sola, o de complejos LFA-oligonucleótido con oligonucleótidos AS G4 u oligonucleótidos SC G4, y se determinó la viabilidad celular con un ensayo MTT 24 horas después del tratamiento. Los datos representan la media ± la SD de tres experimentos independientes . La Figura 13B es un gráfico en el que se indica el porcentaje de células H460 muertas después de un tratamiento con LFA y complejos con oligonucleótidos AS G4 u oligonucleótidos SC G , con una dosis 0,4 µM en presencia o ausencia de doxorrubicina (DOX), taxol, vinorelbina (VNB) o etopósido (Etop) , determinado con un ensayo MTT. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes . La Figura 14 es un gráfico en el que se indica el crecimiento relativo de tumores H460 en ratones tratados con XIAP AS 2x2 MBO y vinorelbina. Se realizó una inyección intratumoral de oligonucleótidos, a razón de 50 µg/g de masa tumoral, en ratones SCID-RAG2 que contenían xenoinjertos subcutáneos de células H460.

Este tratamiento se combinó con una administración de vinorelbina . La Figura 15 es un gráfico en el que se indica el tamaño tumoral promedio de células H460 en ratones tratados en forma sistémica con oligonucleótidos AS PS de XIAP. La administración sistémica (i.p.) de oligonucleótidos AS PS de XIAP en ratones SCID-RAG2 implantados con xenoinjertos subcutáneos de células H460 redujo el tamaño de los tumores respecto del control . La Figura 16 es un gráfico en el que se indica el tamaño tumoral de células de carcinoma de mama humano MDA-MB-435/LCC6 (células LCC) en ratones tratados en forma sistémica con oligonucleótidos AS PS de XIAP. La administración sistémica (i.p.) de oligonucleótidos AS PS de XIAP en ratones SCID-RAG2 hembra implantados con xenoinjertos de células LCC6 en acumulaciones de grasa reduj o el tamaño de los tumores respecto del control . La Figura 17 es una ilustración esquemática en la que se indican los efectos in vivo de oligonucleótidos G4 sobre el crecimiento tumoral y los niveles de proteínas XIAP en tumores . Se indica la eficacia antitumoral de oligonucleótidos AS de XIAP G4 desnudos u oligonucleótidos SC G4 administrados en forma sistémica sobre el crecimiento de xenoinjertos subcutáneos de células H460 en ratones SCID-RAG2 macho. Todos los datos se expresan como media ± SEM (n = 6 ratones/grupo) .

Las Figuras 18A y 18B son ilustraciones esquemáticas en las que se ilustran los niveles de expresión de proteínas XIAP en xenoinjertos de tumores H460 implantados en ratones SCID-RAG2 después de 21 días de tratamiento con oligonucleótidos AS G4, oligonucleótidos SC G4 o vehículo solo (control) , analizados por Western blot y cuantificados por densitometría. Los niveles de XIAP se normalizaron de acuerdo con los niveles de actina celular. Todos los datos se expresan como media ± SD (n = 3) . Las Figuras 19A y 19B son fotomicrografías en las que se ilustran los efectos in vivo de los oligonucleótidos G4 sobre la histopatología de tumores H460, implantados en ratones SCID-RAG2 después de una dosificación sistémica de 15 mg/kg de oligonucleótidos AS de XIAP G4 u oligonucleótidos SC G4 durante 21 días. En la Figura 19A se ilustran secciones del tumor coloreadas con hematoxilina y eosina. En la Figura 19B se ilustra la inmunohistoquímica de la expresión de ubiquitina en secciones de tumores . Se presentan fotomicrografías representativas de los tumores . Loas marcadores de escala interna representan 100 µm. Las Figuras 20A y 20B son gráficos en los que se indica la eficacia in vivo incrementada de la vinorelbina (VNB) en combinación con oligonucleótidos XIAP. Se determinó la eficacia antitumoral de la VNB, con o sin oligonucleótidos AS de XIAP G4 u oligonucleótidos SC G4, contra xenoinjertos de tumores H460 en ratones SCID-RAG2. En la Figura 20A se ilustra la eficacia antitumoral de agentes individuales, mientras que en la Figura 20B se ilustra la eficacia antitumoral de VNB y oligonucleótidos G4 combinados . Todos los datos se expresan como media + SEM (n = 6 ratones/grupo) . La Figura 21 es un gráfico en el que se indican los efectos de oligonucleótidos HIAP1 sobre los niveles de ARN de HIAP1. Las Figuras 22A y 22B son ilustraciones esquemáticas en las que se presentan análisis densitométricos de Western blot en los que se ilustran los efectos de los oligonucleótidos HIAP1 sobre la capacidad de una célula de bloquear la regulación positiva inducida por cicloheximida de la proteína HIAP1. La Figura 23 es un gráfico en el que se indican los efectos de los oligonucleótidos HIAP1 sobre la citotoxicidad, medida a partir de las proteínas totales. La Figura 24 es un gráfico en el que se indica la convalidación de la especificidad de secuencia del oligonucleótido HIAP1 APO 2. La Figura 25 es un gráfico en el que se indica el efecto de oligonucleótidos HIAP 1 sobre la sensibilización química de glioblastomas SF295 resistentes a drogas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la invención se proporcionan métodos para potenciar la apoptosis en una célula, que comprenden administrar un oligómero de nucleobases de la invención en combinación con un agente quimioterapéutico, tal como un agente citostático, o un agente modificador de la respuesta biológica. Preferiblemente, los dos agentes se administran en forma simultánea o con una separación de 28 días. En determinadas realizaciones, el agente quimioterapéutico es uno que altera o estabiliza los microtúbulos . El agente quimioterapéutico puede ser, por ejemplo, un taxano o un vinca alcaloide. Si se lo desea, también puede administrarse un sensibilizador químico (es decir, un agente que torna las células en proliferación más sensibles a la quimioterapia) . También puede usarse cualquier combinación de los agentes anteriores para formar una composición farmacéutica. Estas composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratar una enfermedad proliferativa, por ejemplo, cáncer o un trastorno linfoproliferativo, o un síntoma de una enfermedad proliferativa. La combinación de oligómero de nucleobases/agente quimioterapéutico de la invención también puede usarse en combinación con radioterapia, para el tratamiento del cáncer o de otra enfermedad proliferativa . La activación de la apoptosis en las células cancerosas ofrece abordajes novedosos y potencialmente útiles para mejorar las respuestas de un paciente a la quimioterapia o la radioterapia convencional . XIAP es el miembro más de la familia de genes IAP, en términos de su capacidad de inhibir directamente las caspasas y suprimir la apoptosis. Se investigó el efecto de la regulación negativo de XIAP con oligonucleótidos antisentido (AS) en células pulmonares cancerosas no pequeñas humanas (NCI-H460) cultivadas in vitro e in vivo. En las células cancerosas pulmonares humanas H460 en cultivo, se identificó el oligonucleótido G4 AS como el compuesto más potente, que reguló efectivamente de forma negativa los niveles de ARNm de XIAP en 55% y proteínas hasta 60%, determinados por RT-PCR en tiempo real y Western blot, respectivamente, e indujo un 60% de muerte celular a concentraciones de 1,2 µM. En contraste, el oligonucleótido de control mezclado G4 provocó una pérdida escasa de XIAP y menos de 10% de muerte celular. El tratamiento con G4 AS indujo la apoptosis, como lo revela la degradación de las proteínas pro-caspasa-3 y PARP, con una condensación y una fragmentación de ADN nuclear significativa a concentraciones de 1,2 µM. Más aún, los oligonucleótidos XIAP AS sensibilizaron las células H460 a los efectos citotóxicos de la doxorrubicina, el taxol, la vinorelbina y el etopósido. En modelos animales, se demuestra que G4 AS, a razón de 15 mg/kg, tuvo efectos de inhibición del crecimiento específicos para determinadas secuencias sobre tumores humanos H460, en modelos de xenoinjerto de ratones inmunodeficientes SCID/RAG2 por administración sistémica intraperitoneal . La administración sistémica de AS ODN se asoció con una regulación negativa de 85% de la proteína XIAP en xenoinjertos de tumores. La combinación de 15 mg/kg de G4 AS con 5 mg/kg de vinorelbina inhibió significativamente el crecimiento tumoral, más que cada agente por separado. Estos estudios indican que la regulación negativa de XIAP es una señal de muerte celular potente en células de carcinoma pulmonar, y puede inducir la apoptosis in vitro e inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Estos estudios apoyan la teoría de que las IAP son blancos apropiados para la terapia contra el cáncer en cáncer de células pulmonares no pequeñas humanas, así como en otros tumores sólidos . Terapia Puede proporcionarse una terapia cuando normalmente no se realice una terapia contra el cáncer convencional: en el hogar, la oficina del médico, una clínica, el departamento de pacientes ambulatorios de un hospital, o un hospital. El tratamiento generalmente comienza en el hospital, de modo que el médico puede observar de cerca los efectos de la terapia y realizar los ajustes necesarios. La duración de la terapia depende del tipo de cáncer a tratar, la edad y la condición del paciente, la etapa y el tipo de enfermedad del paciente, y cómo responde el cuerpo del paciente al tratamiento. Es posible realizar la administración de drogas en distintos intervalos (por ejemplo, en forma diaria, semanal o mensual) . Es posible proporcionar la terapia en ciclos intermitentes, que incluyan períodos de descanso para que el cuerpo del paciente tenga la oportunidad de desarrollar nuevas celulares saludables y recuperar su fuerza. Dependiendo del tipo de cáncer y su etapa de desarrollo, la terapia puede usarse para demorar la dispersión del cáncer, para demorar el desarrollo del cáncer, para matar o arrestar las células cancerosas que pueden haberse dispersado a otras partes del cuerpo desde el tumor original, para aliviar los síntomas causados por el cáncer, o para prevenir el cáncer en primer lugar. Como se lo usa en la presente documentación, los términos "cáncer", "neoplasma" o "células neoplásticas" designan una colección de células que se multiplican de forma anormal . El crecimiento del cáncer es descontrolado y progresivo, y ocurre bajo condiciones que normalmente no provocarían o detendrían la multiplicación de las células normales. Puede recurrirse a la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones apropiadas para administrar los compuestos a los pacientes que sufren una enfermedad causada por una proliferación celular excesiva. La administración puede comenzar antes de que el paciente presente síntomas . Puede emplearse cualquier ruta de administración apropiada, por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intratumoral, intramuscular, intracraneal, intraorbital , oftálmica, intraventricular, intrahepática, intracapsular, intratecal, intracistérnica, intraperitoneal, intranasal, en aerosol, por supositorios u oral. Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas pueden tomar la forma de soluciones o suspensiones líquidas; para la administración oral, las formulaciones pueden tomar la forma de tabletas o cápsulas; y para formulaciones intranasales, pueden tomar la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles . Pueden hallarse métodos bien conocidos en la técnica para preparar formulaciones, por ejemplo, en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", editado por A.R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Filadelfia, PA, 2000. Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles, tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftálenos hidrogenados . Pueden usarse polímeros de láctido biocompatibles y biodegradables, copolímeros de láctido/glicólido, o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno para controlar la liberación de los compuestos. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para compuestos moduladores de IAP incluyen las partículas de copolímero de etilenvinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas . Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, éter de polioxietilen-9-laurilo, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para una administración bajo la forma de gotas nasales, o como un gel. Las formulaciones pueden administrarse a pacientes humanos en cantidades efectivas para el uso terapéutico (por ejemplo, cantidades que previenen, eliminan o reducen una condición patológica) , para proporcionar una terapia para una enfermedad o una condición. La dosificación preferida de un oligómero de nucleobases de la invención probablemente dependerá de variables tales como el tipo y la extensión del trastorno, el estado de salud general del paciente en particular, la formulación de los compuestos excipientes, y su ruta de administración. Como se describió con anterioridad, si se lo desea, el tratamiento con un oligómero de nucleobases de la invención puede combinarse con terapias para el tratamiento de enfermedades proliferativas (por ejemplo, radioterapia, cirugía o quimioterapia) . Para cualquiera de los métodos de aplicación descriptos previamente, un oligómero de nucleobases de la invención se administra preferiblemente por vía intravenosa, o se aplica en el sitio en el que se necesita provocar la apoptosis (por ejemplo, por inyección) . Oligonucleótidos y otros oligómeros de nucleobases Al menos dos tipos de oligonucleótidos inducen el corte del ARN por la ARNasa H: polidesoxinucleótidos con enlaces fosfodiéster (PO) o fosforotioato (PS) . Aunque las secuencias de 2 ' -OMe-ARN presentan una afinidad elevada por los blancos de ARN, estas secuencias no son sustratos de la ARNasa H. Un oligonucleótido deseado es uno basado en oligonucleótidos modificados 2 ' , que contiene espacios de oligodesoxinucleótidos con algunos o todos los enlaces internucleótidos modificados en fosforotioatos para obtener resistencia a las nucleasas . La presencia de modificaciones de metilfosfonato incrementa la afinidad del oligonucleótido por su ARN blanco, por lo que reduce la IC50. Esta modificación también incrementa la resistencia a las nucleasas del oligonucleótido modificado. Se comprenderá que los métodos y los reactivos de la presente invención pueden usarse en combinación con cualquier tecnología que pueda desarrollarse, incluyendo múltiples oligonucleótidos antisentido cerrados en forma covalente (CMAS) (Moon et al., Biochem J. 346: 295-303, 2000; Publicación PCT N° WO 00/61595), oligonucleótidos antisentido tipo lazo (RÍAS) (Moon et al., J. Biol. Chem. 275: 4647-4653, 2000; Publicación PCT N° WO 00/61595) , y oligonucleótidos antisentido circulares grandes (Publicación de Solicitud de Patente de los EEUU N° 2002/0168631A1) . Como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación de nucleobases-azúcares . La porción de base del nucleósido normalmente es una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de estas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen adicionalmente un grupo fosfato unido de forma covalente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido a la porción hidroxilo 21, 3' o 5' del azúcar. En la formación de oligonucleótidos, los grupos fosfato unen los nucleósidos adyacentes unos con otros de forma covalente para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de esta estructura polimérica lineal pueden unirse para formar una estructura circular; en general se prefieren las estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura del oligonucleótido, los grupos fosfato se conocen comúnmente como formadores del esqueleto del oligonucleótido. El enlace o el esqueleto normal del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster 3 ' a 5 ' . Los ejemplos específicos de oligómeros de nucleobases preferidos útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que contienen esqueletos modificados o enlaces entre nucleósidoss no naturales. Como se los define en esta memoria descriptiva, los oligómeros de nucleobases que tienen esqueletos modificados incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto, y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los propósitos de esta memoria descriptiva, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto internucleósido también se consideran oligómeros de nucleobases. Los oligómeros de nucleobases que tienen esqueletos de oligonucleótidos modificados incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquil-fosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos, incluyendo 3 '-alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos , tionoalquilfosfonatos , tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos que tienen enlaces 3' -5' normales, análogos de estos con enlaces 2 ' -5 ' , y aquellos que tienen una polaridad invertida, donde los pares de unidades de nucleósidos adyacentes presentan enlaces 3 '-5' a 5 ' -3 ' o 2 ' -5 ' a 5' -2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres. Las Patentes de los EEUU representativas en las que se describe la preparación de los enlaces que contienen fósforo mencionados previamente incluyen, sin limitaciones, las Patentes de los EEUU N° 3687808, 4469863, 4476301, 5023243, 5177196, 5188897, 5264423, 5276019, 5278302, 5286717, 5321131, 5399676, 5405939, 5453496, 5455233, 5466677, 5476925, 5519126, 5536821, 5541306, 5550111, 5563253, 5571799, 5587361 y 5625050, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Los oligómeros de nucleobases que tienen esqueletos de oligonucleótidos modificados que no incluyen un átomo de fósforo tienen esqueletos que están formados por enlaces entre nucleósidos con cadenas cortas de alquilo o cicloalquilo, heteroátomos mixtos y alquilo, o cicloalquilo, o uno o más enlaces entre nucleósidos con cadenas cortas heteroatómicas o heterocíclicas . Éstas incluyen las que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido) ; esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxudo y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilen formacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; escjueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes de componentes N, O, S y CH2 mixtos. Las Patentes de los EEUU representativas en las que se describe la preparación de los oligonucleótidos anteriores incluyen las Patentes de los EEUU N° 5034506, 5166315, 5185444, 5214134, 5216141, 5235033, 5264562, 5264564, 5405938, 5434257, 5466677, 5470967, 5489677, 5521063, 5506337, 5541307, 5561225, 5596086, 5602240, 5610289, 5602240, 5608046, 5610289, 5618704, 5623070, 5663312, 5633360, 5677437, 5677439, 5698685 y 6365577, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. En otros oligómeros de nucleobases, los enlaces de azúcares y entre los nucleósidos, es decir, el esqueleto, se reemplazan por grupos nuevos. Las unidades de nucleobases se mantienen para la hibridización con una IAP. Uno de estos oligómeros de nucleobases se conoce como un ácido nucleico peptídico (PNA) . En los compuestos de PNA, el esqueleto de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza por un esqueleto que contiene amida, en particular, un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y están unidas directa o indirectamente a átomos de aza nitrógeno de la porción de amida del esqueleto. Se describen métodos para preparar y usar estos oligómeros de nucleobases, por ejemplo, en "Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications", editado por P. E. Nielsen, Horizon Press, Norfolk, Reino Unido, 1999. Las Patentes de los EEUU representativas en las que se describe la preparación de PNA incluyen, sin limitaciones, las Patentes de los EEUU N° 5539082, 5714331 y 5719262, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Pueden hallarse otras descripciones de compuestos de PNA en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. En realizaciones particulares de la invención, los oligómeros de nucleobases tienen esqueletos de fosforotioato y nucleósidos con esqueletos de heteroátomos, y en particular, -CH2-NH-0-CH2-, -CH2- N(CH3) -0-CH2- (conocido como esqueleto de metileno (metilimino) o MMI) , -CH2-0-N (CH3) -CH2- , -CH2-N(CH3)- N(CH3)-CH2- y -0-N(CH3)-CH2-CH2-. En otras realizaciones, los oligonucleótidos tienen las estructuras de esqueletos de morfolino descriptas en la Patente de los EEUU N° 5034506. Los oligómeros de nucleobases también pueden contener una o más porciones de azúcares sustituidos . Los oligómeros de nucleobases comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, el alquenilo y el alquinilo pueden ser Cx a C?0 alquilos o C2 a C10 alquenilos y alquinilos sustituidos o no sustituidos. En particular, se prefieren los grupos O [ (CH2)nO]mCH3, 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2 y O (CH2)nON [nCH3) ] 2, donde n y m toman un valor entre 1 y aproximadamente 10. Otros oligómeros de nucleobases preferidos incluyen uno de los siguientes en la posición 2 ' : C-j. a Cxo alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, ON02, N02, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de corte de AKN, un grupo informante, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligómero de nucleobases, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligómero de nucleobases, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Las modificaciones preferidas son el 2 ' -O-metilo y el 2'- metoxietoxilo (2 ' -0-CH2CH2OCH3, también conocido como 2 ' -O- (2-metoxietilo) o 2 ' -MOE) . Otra modificación deseable es el 2 ' -dimetilaminooxietoxilo (es decir, O (CH2) 2ON(CH3) 2) , también conocido como 2'-DMAOE. Otras modificaciones incluyen 2 ' -aminopropoxilo (21-OCH2CH2CH2NH2) y 2 ' -fluoro (2 ' -F) . También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones en un oligonucleótido o en otro oligómero de nucleobases, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3 ' o en los oligonucleótidos conectados 2 ' -5 ' , y en la posición 5' del nucleótido terminal 5 ' . Los oligómeros de nucleobases también pueden tener azúcares miméticos, tales como porciones de ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Las Patentes de los EEUU representativas en las que se describe la preparación de estas estructuras de azúcares modificados incluyen, sin limitaciones, las Patentes de los EEUU N° 4981957, 5118800, 5319080, 5359044, 5393878, 5446137, 5466786, 5514785, 5519134, 5567811, 5576427, 5591722, 5597909, 5610300, 5627053, 5639873, 5646265, 5658873, 5670633 y 5700920, cada una de las cuales se incorpora por completo en la presente documentación a modo de referencia. Los oligómeros de nucleobases también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases . Como se las usa en la presente documentación, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases purinas adenina (A) y guanina (G) , y las bases pirimidinas timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales, tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5 -hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alquilos de adenina y guanina; derivados de 2-propilo y otros alquilos de adenina y guanina; 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina; 5-halouracilo y citosina; 5-propinil uracilo y citosina; 6-azo uracilo, citosina y timina; 5-uracilo (pseudouracilo) ; 4-tiouracilo; adeninas y guaninas 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil y 8 -hidroxil sustituidas, y otras 8-sustituidas; , uracilos y citosinas 5 -halo (por ejemplo, 5-bromo) y 5-trifluorometil sustituidos, y otros 5-sustituidos; 7-metilguanina y 7-metiladenina,- 8-azaguanina y 8-azaadenina; 7-deazaguanina y 7-deazaadenina; y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Otras nucleobases incluyen aquellas descriptas en la Patente de los EEUU N° 3687808, aquellas descriptas en la Enciclopedia Concisa Ciencia e Ingeniería de Polímeros, pp. 858-859, Kroschwitz, J. I., editor, John Wiley & Sons, 1990, aquellas descriptas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613, y aquellas descriptas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, pp . 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., editor, CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido de la invención. Éstas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas, y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan al estabilidad de los dobletes de ácidos nucleicos en 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., editores, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278), y son sustituciones de bases deseables, aún más particularmente cuando se las combina con modificaciones de 2 ' -O-metoxietil o 2 ' -0-metil azúcares . Las Patentes de los EEUU representativas en las que se detalla la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas previamente, así como otras nucleobases modificadas, incluyen las Patentes de los EEUU N° 4845205, 5130302, 5134066, 5175 273, 5367066, 5432272, 5457187, 5459255, 5484908, 5502177, 5525711, 5552540, 5587469, 5594121 5596091, 5614617, 5681941 y 5750692, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Otra modificación de un oligómero de nucleobases de la invención comprende unir por medios químicos al oligómero de nucleobases una o más porciones o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la asimilación celular del oligonucleótido. Estas porciones incluyen, sin limitaciones, porciones de lípidos, tales como una porción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556,1989), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let, 4: 1053-1060,1994), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309,1992; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770,1993), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res., 20: 533-538: 1992), una cadena alifática, por ejemplo, dodecandiol o residuos de undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 10: 1111-1118, 1991; Kabanov et al., FEBS Lett., 259: 327-330,1990; Svinarchuk et al., Biochimie, 75: 49-54, 1993), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1, 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36:3651-3654, 1995; Shea et al., Nucí. Acids Res., 18:3777-3783, 1990), una cadena de poliamina o polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973, 1995), o un ácido adamantan acético (Manoharan et al . , Tetrahedron Lett., 36:3651-3654, 1995), una porción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264:229-237, 1995) , o una porción de octadesilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:923-937, 1996. Las Patentes de los EEUU representativas donde se describe la preparación de estos oligómeros de nucleobases conjugadas son las Patentes de los EEUU N° 4587044, 4605735, 4667025, 4762779, 4789737, 4824941, 4828979, 4835263, 4876335, 4904582, 4948882, 4958013, 5082830, 5109124, 5112963, 5118802, 5138802, 5138045, 5214136, 5218105, 5245022, 5254469, 5258506, 5262536, 5272250, 5292873, 5317098, 53712415 391723, 5414077, 54162035 451463, 5486603, 5510475, 5512439, 5512667, 5514785, 5525465, 5541313, 5545730, 5552538, 5565552, 5567810, 5574142, 5578717, 5578718, 5580731, 5585481, 5587371, 5591584, 5595726, 5597696, 5599923, 5599928, 5608046 y 5688941, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia.

En la presente invención también se incluyen oligómeros de nucleobases que son compuestos quiméricos . Los oligómeros de nucleobases "quiméricos" son oligómeros de nucleobases, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones distintas desde el punto de vista químico, cada una compuesta por de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un oligonucleótido. Estos oligómeros de nucleobases típicamente contiene al menos una región donde el oligómero de nucleobases está modificado para conferir una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, una mayor asimilación celular y/o una mayor afinidad de unión por el ácido nucleico blanco al oligómero de nucleobases. Una región adicional del oligómero de nucleobases puede servir como sustrato para las enzimas capaces de cortar híbridos de ARN: ADN o ARN: ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que corta la cadena de ARN de un doblete de ARN: ADN. Por consiguiente, la activación de la ARNasa H resulta en el corte del ARN blanco, por lo que mejora en gran medida la eficiencia de la inhibición de la expresión genética mediada por el oligómero de nucleobases. En consecuencia, comúnmente pueden obtenerse resultados comparables con oligómeros de nucleobases más cortos cuando se usan oligómeros de nucleobases quiméricos, en comparación con los desoxioligonucleótidos de fosforotioato que hibridizan con la misma región blanco . Los oligómeros de nucleobases quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligómeros de nucleobases, como se describió con anterioridad. Estos oligómeros de nucleobases, cuando son oligonucleótidos, también se han conocido en la técnica como híbridos o polímeros con huecos . Las Patentes de los EEUU representativas en las que se describe la preparación de estas estructuras híbridas son las Patentes de los EEUU N° 5013830, 5149797, 5220007, 5256775, 5366878, 5403711, 5491133, 5565350, 5623065, 5652355, 5652356 y 5700922, cada una de las cuales se incorpora por completo en la presente documentación a modo de referencia. Los oligómeros de nucleobases usados de acuerdo con esta invención pueden prepararse conveniente y comúnmente empleando la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para esta síntesis es comercializado por diversos proveedores, incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA) . Adicionalmente o como alternativa, puede usarse cualquier otro medio para esta síntesis conocido en la técnica. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos, tales como los fosforotioatos y los derivados alquilados. Los oligómeros de nucleobases de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, tales como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptores, formulaciones orales, rectales, tópicas o de otro tipo, para asistir en la ingesta, la distribución y/o la absorción. Las Patentes de los EEUU representativas en las que se describe la preparación de estas formulaciones para asistir en la asimilación, la distribución y/o la absorción son las Patentes de los EEUU N° 5108921, 5354844, 5416016, 5459127, 5521291, 5543158, 5547932, 5583020, 5591721, 4426330, 4534899, 5013556, 5108921, 5213804, 5227170, 5264221, 5356633, 5395619, 5416016, 5417978, 5462854, 5469854, 5512295, 5527528, 5534259, 5543152, 5556948, 5580575 y 5595756, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia . Los oligómeros de nucleobases de la invención comprenden cualquier sal, éster o sal de estos esteres aceptable para el uso farmacéutico, o cualcjuier otro compuesto que, al administrarse a un paciente, puede proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o el residuo de este con actividad biológica. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se relaciona con prodrogas y sales aceptables para el uso farmacéutico de los compuestos de la invención, sales aceptables para el uso farmacéutico de estas prodrogas, y otros equivalentes biológicos.

El término "prodroga" indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva, que luego se convierte en una forma activa (es decir, una droga) dentro del cuerpo o las células de éste, debido a la acción de enzimas u otras sustancias químicas y/o condiciones endógenas. En particular, pueden prepararse versiones de prodrogas de los oligonucleótidos de la invención como derivados SATE [ (S-acetil-2-tioetil) fosfato] de acuerdo con los métodos descriptos en las Publicaciones PCT N° WO93/24510 o WO 94/26764. El término "sales aceptables para el uso farmacéutico" hace referencia a sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto original y no le imparten efectos toxicológicos indeseables . Las sales de adición básica aceptables para el uso farmacéutico se forman con metales o aminas, tales como metales alcalinos y alcalinos férreos, o con aminas orgánicas. Los ejemplos de metales usados como cationes son el sodio, el potasio, el magnesio, el calcio y semejantes. Los ejemplos de aminas apropiadas son la N,N' -dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína (véase, por ejemplo, Berge et al., J. Pharma Sci., 66 : 1-19, 1977). Las sales de adición básica de los compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada, para producir la sal de una forma convencional . La forma de ácido libre puede regenerarse poniendo en contacto la forma de sal con un ácido, y aislando el ácido libre de forma convencional . Las formas de ácidos libres difieren de sus formas de sales respectivas en determinadas propiedades químicas, tales como la solubilidad en solventes polares, pero en el resto de los aspectos, las sales son equivalentes a su ácido libre respectivo para los propósitos de la presente invención. Como se la usa en la presente documentación, una sal "de adición farmacéutica" incluye una sal aceptable para el uso farmacéutico de una forma acida de uno de los componentes de las composiciones de la invención. Éstas incluyen sales orgánicas o inorgánicas de las aminas . Las sales acidas preferidas son los clorhidratos, los acetatos, los salicilatos, los nitratos y los fosfatos. Otras sales apropiadas aceptables para el uso farmacéutico son bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica, e incluyen sales básicas de una variedad de ácidos inorgánicos y orgánicos, tales como, por ejemplo, con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos orgánicos carboxílicos, sulfónicos, sulfo o fosfoácidos, o ácidos sulfámicos N-sustituidos, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleici, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoici, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o ácido isonicotínico; y con aminoácidos, tales como los 20 alfa-aminoácidos que participan en la síntesis de proteínas en la naturaleza, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido 2-hidroxietansulfónico, ácido etan-1, 2-disulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 4-metilbencensulfónico, ácido naftalen-2-sulfónico, ácido naftalen-1, 5-disulfónico, 2 ó 3-fosfoglicerato, glucosa-6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos) , o con otros compuestos orgánicos ácidos, tales como ácido ascórbico, las sales aceptables para el uso farmacéutico de los compuestos también pueden prepararse con un catión aceptable para el uso farmacéutico. Los cationes apropiados aceptables para el uso farmacéutico son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica, e incluyen cationes alcalinos, alcalinos férreos, de amonio y amonio cuaternario. También son posibles los carbonatos o los bicarbonatos . Para los oligonucleótidos y otros oligómeros de nucleobases, las sales apropiadas aceptables para el uso farmacéutico incluyen (i) sales formadas con cationes, tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas, tales como espermina y espermidina, etcétera; (ii) sales de adición acida formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y semejantes; (iii) sales formadas con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfónico, ácido metansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalacturónico y semejantes; y (iv) sales formadas con aniones elementales, tales como cloro, bromo e iodo. En la presente invención también se incluyen composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los oligómeros de nucleobases de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de una cantidad de formas, dependiendo de si desea una administración local o sistémica, y del área a tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica y en membranas mucosas, administración vaginal y rectal) , pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizadores; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral, o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o la infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. Ácidos nucleicos trabados Los ácidos nucleicos trabados (LNA) son oligómeros de nucleobases que pueden emplearse en la presente invención. Los LNA contienen un puente 2' -O, 4'-C metileno para restringir la flexibilidad del anillo de ribofuranosa del análogo de nucleótido y lo traba en la conformación bícíclica tipo N rígida. Se ha demostrado que los LNA presentan una mayor resistencia a determinadas exo y endonucleasas, activan la ARNAsa H, y pueden incorporarse en casi cualquier oligómero de nucleobases. Más aún, los oligómeros de nucleobases que contienen LNA pueden prepararse usando protocolos de síntesis de fosforamidita convencionales . Pueden hallarse detalles adicionales sobre los LNA en la Publicación PCT N° WO 99/14226 y la Publicación de Solicitud de Patente de los EEUU N° US 2002/0094555 Al, cada una de las cuales se incorpora a modo de referencia . Ácidos arabinonucleicos También pueden emplearse ácidos arabinonucleicos (ANA) en los métodos y los reactivos de la presente invención. Los ANA son oligómeros de nucleobases basados en azúcares de D-arabinosa en lugar de los azúcares de D-2 ' -desoxirribosa naturales. Los análogos de ANA no derivatizados tienen una afinidad de unión similar por el ARN como los fosforotioatos. Cuando el azúcar de arabinosa se derivatiza con flúor (2'F-ANA), se obtiene una mejora en la afinidad de unión, y la hidrólisis selectiva del ARN unido ocurre de forma eficiente en los dobletes resultantes de ANA/ RN y F-ANA/ARN. Estos análogos pueden tornarse estables en medios celulares con una derivatización en sus extremos con azúcares L simples. Se describe el uso de ANA en terapia, por ejemplo, en Damha et al., Nuclepsides, Nucleotides & Nucleic Acids 20: 429- 440,2001. Administración de oligómeros de nucleobases En la presente documentación se demuestra que los oligonucleótidos desnudos pueden ingresar en las células tumorales e inhibir la expresión de IAP. Aún así, puede ser deseable utilizar una formulación que contribuya en la administración de los oligonucleótídos o de otros oligómeros de nucleobases a las células (véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 5656611, 57536135, 785992, 61207986, 221959, 6346613, y 6353055, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia) .

Ribozimas Las moléculas de ARN catalíticas, o ribozimas, que incluyen una secuencia antisentido de IAP de la presente invención pueden usarse para inhibir la expresión de una proteína IAP in vivo. La inclusión de las secuencias de ribozima en ARN antisentido les confiere actividad de corte de ARN, con lo que se incrementa la actividad de las construcciones. El diseño y el uso de ribozimas dirigidas a ARN específicos se describen en Haseloff et al . , Nature 334: 585-591, 1988, y la Publicación de Solicitud de Patente de los EEUU N° 2003/0003469 Al, cada una de las cuales se incorpora a modo de referencia. Por consiguiente, en la invención también se proporciona una molécula de ARN catalítica que incluye, en el brazo de unión, un ARN antisentido que tiene entre ocho y diecinueve nucleobases consecutivas que corresponden a una secuencia de cualquiera de las Tablas 1, 2, 6 y 7. En realizaciones preferidas de esta invención, la molécula de ácido nucleico catalítica tiene la forma de un motivo de cabeza de martillo u horquilla, pero también puede formarse con el motivo de un virus de hepatitis delta, un intrón del grupo I, ARN de ARNasaP (en asociación con una secuencia guía de ARN) o ARN de Neurospora VS . Se describen ejemplos de estos motivos de cabeza de martillo en Rossi et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 8: 183,1992. Se describen ejemplos de motivos de horquillas en las Patentes de los EEUU N° 5527895, 5856188 y 6221661, en Hampel y Tritz, Biochemistry, 28: 4929, 1989, y en Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990. Se describe un ejemplo de motivo de virus de hepatitis delta en Perrotta y Been, Biochemistry, 31: 16, 1992. Se describe el motivo de ARNasaP en Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849, 1983. Se describe el motivo de ARN de Neurospora VS en Collins et al. (Saville y Collins, Cell 61: 685-696, 1990; Saville y Collins, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8826-8830, 1991; Collins y Olive, Biochemistry 32: 2795-2799, 1993). Estos motivos específicos no limitan la invención, y aquellos entrenados en la técnica reconocerán que lo más importante en una molécula de ácido nucleico enzimático de esta invención es que tenga un sitio de unión para un sustrato específico que sea complementario con una o más de las regiones de ARN del gen blanco, y que tenga secuencias de nucleótidos dentro o en las cercanías de dicho sitio de unión, que confieran actividad de corte de ARN a la molécula. Interferencia de ARN Los oligómeros de nucleobases de la presente invención pueden emplearse en ARN de cadena doble para provocar la reducción de la expresión de IAP mediada por interferencia de ARN (ARNi) . La ARNi es un método para reducir la expresión celular de proteínas específicas de interés (revisado en Tuscl, Chembiochem 2: 239-245, 2001; Sharp, Genes & Devel. 15: 485-490, 2000; Hutvagner y Zamore, Curr. Opin. Genet. Devel. 12: 225-232, 2002; y Hannon, Nature 418:244-251, 2002). En la ARNi, el silenciamiento genético típicamente se desencadena después de la transcripción en presencia de ARN de cadena doble (ARNds) en una célula. Este ARNds se procesa dentro de la célula para obtener trozos más cortos, denominados ARN de interferencia (ARNsi) . La introducción de ARNsi en células mediante la transfección de ARNds o la expresión de ARNsi usando un sistema de expresión basado en plásmidos se usa cada vez más para crear fenotipos de pérdida de función en células de mamíferos. En una realización de la invención, se prepara una molécula de ARN de cadena doble (ARNds) que incluye entre ocho y diecinueve nucleobases consecutivas de un oligómero de nucleobases de la invención. El dsARN puede contener dos cadenas de ARN diferentes que hayan formado un doblete, o una única cadena de ARN que se ha duplicado (ARN(sh) en horquilla pequeño). Típicamente, los ARNds tienen aproximadamente 21 ó 22 pares de bases, pero pueden ser más cortos o más largos (de hasta aproximadamente 29 nucleobases) si se lo desea. El ARNds puede prepararse usando procedimientos convencionales (por ejemplo, síntesis química o transcripción in vitro) . Existen conjuntos de elementos disponibles, por ejemplo, en Ambion (Austin, TX) y Epicentre (Madison, Wl) . Se describen métodos para expresar ARNds en células de mamíferos en Brummelkamp et al. Science 296: 550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16: 948-958,2002; Paul et al. Nature Biotechnol. 20: 505-508, 2002; Sui et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99: 6047-6052, 2002; Miyagishi et al. Nature Biotechnol. 20: 497-500, 2002; y Lee et al. Nature Biotechnol. 20:500-505, 2002, cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. El ARN pequeño en horquilla consiste en una estructura de tallo-rizo con salientes UU 3 ' opcionales. Si bien puede haber una variación, los tallos puede tener una longitud de entre 21 y 31 bp (en términos deseables, entre 25 y 29 bp) , y los rizos pueden tener una longitud de entre 4 y 30 bp (en términos deseables, entre 4 y 23 bp) . Para expresar ARNsh en células, pueden emplearse plásmidos vectores que contienen un promotor de ARN polimerasa IIIH1, ARNt o U6, un sitio de clonación para el inserto de ARN con tillo y rizo, y una señal de terminación de la transcripción de 4 ó 5 timidinas . Los promotores de polimerasa III generalmente tienen sitios de inicio y detención bien definidos, y sus transcriptos carecen de colas de poli (A) . La señal de terminación de estos promotores se define a partir del tracto de politimidina, y el transcripto típicamente se cota después de la segunda uridina. El corte en esta posición genera una saliente UU 3 ' en el ARNsh expresado, que es similar a las salientes 3 ' de ARNsi sintéticos. Se describen métodos adicionales para expresar el ARNsh en células de mamíferos en las referencias citadas previamente . Agentes quimioterapéuticos El uso de un oligómero de nucleobases en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos que alteran o estabilizan los microtúbulos es particularmente efectivo para tratar el cáncer y otros neopolasmas . Los agentes que alteran los microtúbulos (por ejemplo, vinca alcaloides) y los agentes que estabilizan los microtúbulos (por ejemplo, taxanos) se describen con mayor detalle más adelante. Vinca alcaloides y compuestos relacionados Los vinca alcaloides que pueden usarse en combinación con los oligómeros de nucleobases de la invención para tratar el cáncer y otros neoplasmas incluyen vincristina, vinblastina, vindesina, vinflunina, vinorelbina y anhidrovinblastina. Las dolastatinas son oligopéptidos que interfieren primariamente con la tubulina en el dominio de unión con el vinca alcaloide. Estos compuestos también pueden usarse en combinación con los oligómeros de nucleobases de la invención para tratar el cáncer y otros neoplasmas. Las dolastatinas incluyen la dolastatina-10 (NCS 376128), la dolastatina-15 , ILX651, TZT-1027, la simplostatina 1, la simplostatina 3 y LU103793 (cemadotin) . Las criptoficinas (por ejemplo, la criptoficina 1 y la criptoficina 52 (LY355703)) se unen a la tubulina dentro de unión al dominio del vinca alcaloide e inducen la detención en G2/M y la apoptosis. Puede usarse cualquiera de estos compuestos en combinación con los oligómeros de nucleobases de la invención para tratar el cáncer y otros neoplasmas . Se describen otros compuestos que alteran los microtúbulos que pueden usarse en combinación con los oligómeros de nucleobases de la invención para tratar el cáncer y otros neoplasmas en las Patentes de los EEUU N° 6458765, 6433187, 6323315, 6258841, 6143721, 6127377, 6103698, 6023626, 5985837, 5965537, 5955423, 5952298, 5939527, 5886025, 5831002, 5741892, 5665860, 5654399, 5635483, 5599902, 5530097, 5521284, 5504191, 4879278 y 4816444, y en las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los EEUU N° 2003/0153505 Al; 2003/0083263 Al; y 2003/0055002 Al, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia . Taxanos y otros compuestos estabilizadores de microtúbulos Los taxanos, tales como el paclitaxel, el doxetaxel, el RPR109881A, SB-T-1213, SB- T-1250, SB-T-101187, BMS-275183, BRT 216, DJ-927, MAC-321, IDN5109 y IDN5390, pueden usarse en combinación con los oligómeros de nucleobases de la invención para tratar el cáncer y otros neoplasmas . Los análogos de taxanos (por ejemplo, BMS-184476, BMS-188797) , y los compuestos distintos de taxanos relacionados desde el punto de vista funcional (por ejemplo, epotilonas (por ejemplo, epotilona A, epotilona B (EP0906) , deoxiepotilona B, y lactama de epotilona B (BMS-247550) ) , eleuterobina, discodermolida, 2-epi-discodermolida, des-metildiscodermolida, 5 -hidroximetildiscodermolida, 19-des-aminocarbonildiscodermolida, 9(13)-ciclodiscodermolida, y laulimalida) , también pueden usarse en los métodos y las composiciones de la invención. Se describen otros compuestos que estabilizan los microtúbulso que pueden usarse en combinación con los oligómeros de nucleobases de la invención para tratar el cáncer y otros neoplasmas en las Patentes de los EEUU N° 6624317, 6610736, 6605599, 6589968, 6583290, 6576658, 6515017, 6531497, 6500858, 6498257, 6495594, 6498314, 6458976, 6441186, 6441025, 6414015, 6387927, 6380395, 6380394, 6362217, 6359140, 6306893, 6302838, 6300355, 6291690, 6291684, 6268381, 6262107, 6262094, 6147234, 6136808, 6127406, 6100411, 6096909, 6025385, 6011056, 5965718, 5955489, 5919815, 5912263, 5840750, 5821 263, 5767297, 5728725, 5721268, 5719177, 5714513, 5587489, 5473057, 5407674, 5250722, 5010099 y 4939168; y las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los EEUU N° 2003/0186965 Al, 2003/0176710 Al, 2003/0176473 Al, 2003/0144523 Al, 2003/0134883 Al, 2003/0087888 Al, 2003/0060623 Al, 2003/0045711 Al, 2003/0023082 Al, 2002/0198256 Al, 2002/0193361 Al, 2002/0188014 Al, 2002/0165257 Al, 2002/0156110 Al, 2002/0128471 Al, 2002/0045609 Al, 2002/0022651 Al, 2002/0016356 Al, 2002/0002292 Al, todas incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Se indican otros agentes quimioterapéuticos que pueden administrarse con los compuestos de nucleobases antisentido de IAP en la Tabla 1. Tabla 1 tocladesina (agonista de AMP ranpirnasa (estimulador de cíclico, Ribapharm) ribonucleasa, Alfacell) alvocidib (inhibidor de CDK, galarrubicina (inhibidor de la Aventis) síntesis de ARN, Dong-A) CV-247 (inhibidor de COX-2, Ivy tirapazamina (agente reductor, Medical) SRl International) P54 (inhibidor de COX-2, Phytopharm) N-acetilcisteín (agente CapCel™ (estimulador de CYP450, reductor, Zambón) Bavarian Nordic) GCS-100 R-flurbiprofeno (inhibidor de (antagonista de Gal3, GlicoGenesys) NF-kappaB, Encoré) Inmunógeno G17DT (inhibidor de 3CPA (inhibidor de NF-kappaB, gastrina, Aphton) Active Biotech) efaproxiral (oxigenador, Allos seocalcitol (agonista del Therapeutics) receptor de vitamina D, Leo) PI-88 (inhibidor de heparanasa, 131-I-TM-601 (antagonista de Progen) ADN, TransMolecular) tesmilifeno (antagonista de eflornitina (inhibidor de ODC, histamina, YM BioSciences) ILEX Oncology) histamina (agonista del receptor de ácido minodrónico (inhibidor de histamina H2 , Maxim) osteoclastos, Yamanouchi) tiazofurina (inhibidor de IMPDH, indisulam (p53 stimulant, Eisai) Ribapharm) aplidina (inhibidor de PPT, cilengitida (antagonista de PharmaMar) integrin , MerckKGaA) rituximab (anticuerpo CD20, SR-31747 (agonista de IL-1, Sanofi- Genentech) Synthelabo) gemtuzumab (anticuerpo CD33, CCI-779 (inhibidor de mTOR quinasa, Wyeth Ayerst) Wyeth) PG2 (potenciador de la exisulinda (inhibidor de PDE V, Cell hematopoyesis, Pharmagenesis) Pathways) Immunol™ (lavado oral de CP-461 (inhibidor de PDE V, Cell triclosan, Endo) Pathways) triacetiluridina (prodroga de AG-2037 (inhibidor de GART, Pfizer) uridina, Wellstat) WX-UKl (inhibidor del activador del SN-4071 (agente de sarcoma, plasminógeno, Wilex) Signature BioScience) PBI-140 (estimulador de PMN, TransMID-107™ (inmunotoxina, KS ProMetic LifeSciences) Biomedix) bortezomib (inhibidor de proteasoma, PCK-3145 (promotor de la Millennium) apoptosis, Procyon) SRL-172 (estimulador de células T, doranidazol (promotor de la SR Pharma) apoptosis. Pola) TLK-286 (inhibidor de glutatión S CHS-828 (agente citotóxico, Leo) transferasa, Telik) Ácido trans-retinoico PT-100 (agonista de factor de (diferenciador, NIH) crecimiento, Point Therapeutics) MX6 (promotor de la apoptosis, midostaurina (inhibidor de PKC, MAXIA) Novartis) apomine (promotor de la briostatina-1 (estimulador de PKC, apoptosis, ILEX Oncology) GPC Biotech) urocidina (promotor de la CDA-II (promotor de la apoptosis, apoptosis, Bioniche) Everlife) Ro-31-7453 (promotor de la SDX-101 (promotor de la apoptosis, apoptosis, La Roche) Salmedix) brostalicina (promotor de la ceflatonina (promotor de la apoptosis, Pharmacia) Los siguientes ejemplos tienen el objeto de ilustrar la invención. No pretenden limitar la invención de modo alguno. Ejemplo 1: Selección de oligómeros de nucleobases Se seleccionaron 96 y 98 secuencias de 19-meros de nucleobases, principalmente no superpuestos, de XIAP y HIAP1 humano, respectivamente, sobre la base de los criterios de selección indicados más adelante. En el caso de XIAP, se seleccionaron 96 secuencias (cada una con 19 nucleobases de longitud) (SEQ ID N° l a 96; Tabla 2) , de una región entre aproximadamente 1 kb río arriba del codón de inicio y aproximadamente 1 kb río abajo del codón de selección de la secuencia de ADNc. Esto abarcó aproximadamente 50% de la región codificante y las secuencias 5' y 3' inmediatas (es decir, 96 19-meros abarcan 1,8 kb de secuencia, mientras que la región blanco tiene a continuación 3,5 kb de longitud, e incluye una región codificante de 1,5 kb más 1 kb a cada lado de las secuencias UTR) . 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 Nótese que en cualquiera de los oligómeros de nucleobases anteriores, o cualquier otro oligómero de nucleobases descripto en la presente documentación, cada nucleobase puede ser independientemente un residuo de ADN o un residuo de ARN, tal como un residuo de 2 ' -O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN . La secuencia de nucleobases de SEQ ID ?° 3 puede ser, por ejemplo, 5 ' -CAGATATATATGTA ACACT-3', 5'-CAGATATATATGTAA CACU-3 ' , o 5'-mCmAGATATATATGTAACAmCmU-3 ' (donde mX representa un residuo de 2 ' -O-metil X) . En la técnica se conocen nucleobases modificadas adicionales. Los enlaces pueden ser enlaces fosfodiéster (PO) , fosforotioato (PS) o metilfosfonato (MP) , o pueden tener un esqueleto mixto (MB) . El esqueleto puede ser cualquier esqueleto apropiado que permita la hibridización del oligómero de nucleobases con el polinucleótido IAP blanco. En la presente documentación se describen ejemplos de esqueletos. En otras realizaciones, los oligómeros de nucleobases incluyen enlaces protegidos por acridina, componentes de colesterilo o psoralen, C5-propinil pirimidinas, o C5-metil pirimidinas. Las modificaciones apropiadas para los oligómeros de nucleobases de la invención incluyen aquellas descriptas previamente, así como aquellas indicadas en la Publicación de Solicitud de Patente de los EEUU ?° US 2002/0128216 Al, incorporada en la presente documentación a modo de referencia.

Se proporcionan ejemplos de oligómeros de nucleobases en la siguiente Tabla 3 (donde mX representa un residuo 2 '-O-metil X de ARN).

Se describe la penetratina y su uso para mediar la entrada de oligómeros de nucleobases en células en la Solicitud de Patente PCT N° FR 91/00444. Se realizó un abordaje de identificación similar para diseñar oligómeros de nucleobases contra HIAP1. Inicialmente se seleccionaron 98 oligómeros de nucleobases 19-meros (SEQ ID N° 163-260; Tabla 4) . De estos 98 oligómeros de nucleobases dirigidos contra la secuencia HIAP1, se seleccionaron quince (SEQ ID N° 163-170, 173, 179, 202, 222, 223, 247 y 259) para continuar la evaluación. Estos quince oligómeros de nucleobases candidatos incluyeron cuatro oligómeros de nucleobases dirigidos contra la secuencia codificante (SEQ ID N° 202, 222, 223 y 247), un oligómero de nucleobases dirigido contra la UTR 3' (SEQ ID ?° 259), siete oligómeros de nucleobases dirigidos contra la UTR 5' (SEQ ID ?° 166-170, 173 y 179; uno de los siete oligómeros de nucleobases se superponía con el codón inicial) , y tres otros oligonucleótidos (SEQ ID ?° 163-165) diseñados para que estuvieran dirigidos contra un segmento intrónico de la UTR 5 ' . Tabla 4 SEQ ID Nc Código Secuencia del oligómero de nucleobases Criterios de selección para los oligómeros de nucleobases Se usó el programa informático OLIGO (distribuido previamente por National Biosciences Inc.) para seleccionar oligómeros de nucleobases candidatos sobre la base de los siguientes criterios : 1) un contenido de GC de no más de 75%, y un contenido de AT de no más de 75%; . 2) preferiblemente, no se seleccionó ningún oligómero de nucleobases con cuatro o más residuos de G consecutivos (debido a los efectos tóxicos descriptos, aunque se seleccionó uno como control de toxicidad) ; 3) no se seleccionaron oligómeros de nucleobases con la capacidad de formar dímeros estables o estructuras en horquilla; y 4) las secuencias que rodean el sitio de inicio de la traducción constituyen una región preferida. Además, se predijeron regiones accesibles del ARNm blanco con la ayuda del programa de pliegue de la estructura secundaria del ARN MFOLD (M. Zuker, D. H. Mathews & D.H. Turner, Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide, en: R?A Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski & B. F. C. Clark, editor, NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, (1999) ) . Se predijeron pliegues sub-óptimos con un valor de energía libre dentro del 5% del pliegue más estable predicho para el ARNm usando una ventana de 200 bases, dentro de la cual un residuo pudiera hallar una base complementaria para formar un enlace de par de bases . Las regiones abiertas que no formaron un par de bases se sumaron con cada pliegue subóptimo, y las áreas predichas de forma consistente como abiertas fueron consideradas más accesibles para la unión con oligómeros de nucleobases. También se seleccionaron como candidatos posibles otros oligómeros de nucleobases que solamente satisficieron parcialmente algunos de los criterios de selección anteriores, si reconocieron una región abierta predicha del ARNm blanco. Ejemplo 2: Síntesis de oligonucleótidos Se evaluó la capacidad de los oligómeros de nucleobases de inhibir la expresión de IAP usando oligonucleótidos como ejemplos de oligómeros de nucleobases. Los oligonucleótidos fueron sintetizados por IDT (Integrated DNA Technologies, EEUU) como oligonucleótidos quiméricos de segunda generación, que consistieron en un núcleo de residuos de fosfodiéster de ADN rodeados a cada lado por dos residuos de 2 ' -O-metil ARN, con un enlace de fosforotioato entre los residuos de AR? circundantes . Los oligonucleótidos se colocaron en una placa de 96 cavidades, y también en tubos coincidentes, con un mínimo de 12 OD de oligómeros de nucleobases, con lo cual se proporcionó un material abundante para las transfecciones (más de cien ensayos en el formato de 96 cavidades) cuando el método de detección fue un método sensible, tal como TaqMan, PCR cuantitativa o un ELISA. Una vez que se identificaron los aciertos positivos (véase más adelante) , los oligonucleótidos se sintetizaron nuevamente con tres residuos de ARN circundantes, en vez de dos, para incrementar aún más la estabilidad/resistencia a la nucleasa. Además, con fines de convalidación, se sintetizaron controles apropiados (tales como oligonucleótidos mezclados, con faltas de coincidencia de 4 bases y con polaridad inversa) para algunos de los blancos que proporcionaron la mayor actividad. Ejemplo 3: Ensayos de análisis y optimización de los oligómeros de nucleobases El abordaje utilizado para identificar oligómeros de nucleobases capaces de inhibir la expresión de una IAP constituyó en analizar las bibliotecas de oligonucleótidos descriptas previamente para determinar disminuciones específicas (reducciones) del ARN y/o la proteína del gen de IAP específico deseado. Puede usarse cualquier cantidad de ensayos convencionales para detectar los niveles de ARN y proteínas en las células. Por ejemplo, pueden medirse los niveles de ARN usando análisis convencionales de Northern blot o técnicas de RT-PCR. Los niveles de proteínas pueden medirse, por ejemplo, con análisis convencionales de Western blot o técnicas de inmunoprecipitación. Como alternativa, pueden examinarse las células que recibieron un ácido nucleico antisentido de IAP para determinar la viabilidad celular, de acuerdo con los métodos descriptos, por ejemplo, en las Patentes de los EEUU N° 5919912, 6156535 y 6133437, incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Se usó PCR cuantitativa TaqMan (descripta más adelante) para evaluar los cambios en los niveles de ARNm después del tratamiento con oligonucleótidos. Se empleó un ELISA para determinar los niveles de proteínas de XIAP, y Western blot para determinar los niveles de proteínas HIAP1. las condiciones de transfección se optimizaron con Lipofectamina plus o Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Canadá) en células de carcinoma de vejiga T24 o células de carcinoma de células pulmonares no pequeñas H460, o lipofectina en células de glioblastoma SF-295, usando como control un oligonucleótido en el sentido del marco de lectura de XIAP marcado con fluoresceína (5'-mGmAGAAGATGACTGGTAAmCmA-3 ' ; SEQ ID N° 261), que abarcaba el codón inicial. Los resultados se visualizaron y calificaron por microscopía de epi-fluorescencia. En el caso de las células T24, las transfecciones se optimizaron adicionalmente sobre la base de la capacidad de un oligonucleótido publicado de regular negativamente la expresión de survivina (Li et al., Nat . Cell Biol. 1:461-466,1999) (5 ' -U/TGTGCTATTCTGTGAAU/TU/T-3 ' SEQ ID ?° 262) . Se optimizaron las condiciones de transfección sobre la base de los resultados de TaqMan de la reducción de AR? de survivina detectada con cebadores de PCR y sondas fluorescentes, tal como se describe con mayor detalle más adelante. Se estableció que las condiciones óptimas para que las células asimilaran los oligonucleótidos fueron oligonucleótido 940 nM, 4 µl de reactivo PLUS y 0,8 µl de lipofectamina, en un total de 70 µl por tres horas. Luego se aplicaron estas condiciones para analizar la reducción de las proteínas de XIAP usando la biblioteca de oligos contra células T24. Se estudió la reducción de HIAP1 en células SF-295, ya que estas células presentaron niveles detectables y discernibles de la proteína HIAP1 de 70 kDa, mientras que muchas líneas celulares no expresaron niveles elevados de la proteína, o no pudieron distinguirse de las grandes cantidades de la proteína HIAP2, con un tamaño similar de 68 kDa. PCR en tiempo real Se extrajo ARN de las células lisadas en amortiguador RLT (QIAGE?, Valencia, CA) , y se lo purificó usando columnas/conjuntos de elementos RNeasy de QIAGE?.

Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real en una máquina Perkin-Elmer ABl 7700 Prism PCR. El ARN se transcribió en forma inversa y se amplificó de acuerdo con el protocolo de mezcla maestra de PCR de TaqMan Universal PCR, PE Biosystems, usando cebadores y sondas diseñadas para reconocer específicamente XIAP, HIAP1, survivina o GAPDH. Para la survivina humana, el cebador directo fue 5 ' -TCTGCTTCAAG GAGCTGGAA-3 ' (SEQ ID N° 263), el cebador inverso fue 5 ' -GAAAGG AAAGCGCAACCG-3 ' (SEQID NO : 264), y la sonda fue 5'- (FAM) AGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATA (TAMRA) -3 ' (SEQ ID ?° 265) . Para HIAP1 humana, el cebador directo fue 5'-TGGAGATGATCCATG GGTTCA-3 ' (SEQ ID ?° 266), el cebador inverso fue 5 ' -GAACTCCTGTC CTTTAATTCTTATCAAGT-3 ' (SEQ ID ?° 267), y la sonda fue 5'- (FAM) CTCACACCTTGGAAACCACTTGGCATG (TAMRA) -3 ' (SEQ ID ?° 268). Para XIAP humana, el cebador directo fue 5 ' -GGTGATAAAGTA AAGTGCTTTCACTGT-3 ' (SEQ ID ?° 269), el cebador inverso fue 5'-TCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAA-3' (SEQ ID N° 270), y la sonda fue 5'- (FAM) CAACATGCTAAATGGTATCCAGGGTGCAAATATC (TAMRA) -3' (SEQ ID N° 271). Para GAPDH humano, el cebador directo fue 5 ' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ' (SEQ ID N° 272), el cebador inverso fue 5 ' -GAAGATGGTGATGGGATTC-3 ' (SEQ ID N° 273), y la sonda fue 5'- (JOE) CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC (TAMRA) -3 ' (SEQ ID N° 274). FAM es una 6-carboxifluorosceína, JOE es una 6-carboxi-4, 5-dicloro-2, 7-dimetoxifluorosceína, y TAMRA es una 6-carboxi-N, N, N J N ' -tetrametilrodamina. FAM y JOE son colorantes marcadores 5 ' , mientras que TAMRA es un colorante de fragua 3 ' . La cuantificación relativa de la expresión genética se realizó como se describe en el manual de PE Biosystems, usando GAPDH como referencia interna. Se usó el método de Ct (umbral de ciclo) comparativo para realizar la cuantificación relativa de los niveles de ARNm de IAP, en comparación con los niveles de AR?m de GAPDH. Brevemente, se tomaron mediciones de fluorescencia a tiempo real en cada ciclo de PCR, y se calculó el valor de umbral de ciclo (Ct) para cada muestra determinando el punto en el que la fluorescencia superaba un nivel umbral 30 superior a la desviación estándar basal. El valor basal promedio y la SD basal se calculan comenzando con el valor basal del tercer ciclo y terminando en el valor basal tres ciclos antes de que la señal comience a ascender de forma exponencial . Los cebadores y/o las sondas de PCR para los IAP específicos se diseñaron de modo que abarcaran al menos un límite exón-intrón, separados por 1 kb o más de AD? genómico, para reducir la posibilidad de amplificar y detectar contaminación con AD? genómico. Se verificó la especificidad de la señal, y la contaminación posible con AD?, tratando algunas muestras de ARN con AD?asa o ARNas , antes de realizar los pasos de transcripción inversa y la reacción de PCR. ELISA de XIAP e inmunotransferencias Western de HIAP1 Se realizó un ensayo de ELISA colorimétrico convencional para XIAP, usando un anticuerpo policlonal de conejo contra XIAP purificado por afinidad como anticuerpo de captura, y se realizó la detección con un anticuerpo monoclonal contra XIAP (MBL, Japón) y un anticuerpo anti-Ig de ratón biotinilado y conjugado con peroxidasa de rábano picante, y sustrato TMB. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo policlonal contra XIAP o HIAP1 para medir los niveles de las proteínas de XIAP o HIAP1, respectivamente. Se realizó la detección de HIAP1 en una inmunotransferencia Western usando un anticuerpo policlonal contra HIAP1 de rata purificado pro afinidad como anticuerpo primario, el cual se detectó por ECL (Amersham) en una película para rayos X con un anticuerpo anti-Ig de conejo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y un sustrato quimioluminescente. El anticuerpo policlonal anti-HIAPl está dirigido contra una fusión GST de IAP1 de rata. Este anticuerpo también reacciona contra HIAP1 y HIAP2 humana y murina. Ejemplo 4: Los oligonucleótidos antisentido de XIAP disminuyen la expresión de AR? y polipéptidos de XIAP Primero se analizó la biblioteca sintética de XIAP con 96 oligonucleótidos antisentido en busca de disminuciones en los niveles de proteínas de XIAP. Específicamente, se sembraron células T24 (1,5 x 104 células/cavidad) en las cavidades de una placa de 96 cavidades el día 1, y se las cultivó en un medio de McCoy libre de antibióticos por 24 horas. El día 2, las células se transfectaron con oligonucleótidos antisentido de XIAP como se describió con anterioridad (los oligonucleótidos se marcaron de acuerdo con su posición en la placa, es decir, Al a H12, e incluyeron dos repeticiones, Al3 y B13, que contenían precipitados de ADN liofilizados que se adhirieron a la membrana de sello) . Brevemente, los oligómeros de nucleobases se diluyeron en 10 µl/cavidad de medio de McCoy libre de antibióticos y libre de suero, y luego se agregó el reactivo PLUS. La Lipofectamina se diluyó en 10 µl/cavidad de medio de McCoy libre de antibióticos y libre de suero, y ambas mezclas se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente . Luego se combinaron las mezclas y se incubó por 15 minutos a temperatura ambiente . Entretanto, se retiró por completo el medio de las células y se agregaron 50 µl/cavidad de medio libre de antibióticos y libre de suero a las células. Las mezclas de transfección se agregaron a la cavidad, y las células se incubaron por tres horas. Luego se agregaron 30 µl/cavidad de medio libre de antibióticos y libre de suero y 100 µl/cavidad de un medio completo libre de antibióticos, que contenía 20% de suero fetal bovino, a cada cavidad. El día 3, se midieron los niveles de ARN de XIAP usando técnicas de PCR cuantitativa en tiempo real, como se describió con anterioridad. El día 4, se midieron los niveles de proteínas XIAP por ELISA (Figuras 1A, 1C, ÍE, 1G, II y ÍK) , y se midió la proteína celular total en forma bioquímica (Figuras IB, ID, 1F, 1H, 1J y ÍL; usadas para normalizar los niveles de proteínas de XIAP) . Los resultados se compararon con una muestra de transfección simulada (tratada con el agente de transfección pero sin la adición de oligonucleótido de ADN, y luego procesada como las otras muestras) . Los experimentos de transcurso de tiempo permitieron determinar que el tiempo óptimo para reducir los niveles de proteínas era de entre aproximadamente 12 y 24 horas. También se analizaron las disminuciones en los niveles de ARN en la biblioteca de oligonucleótidos usando cebadores de PCR específicos para TaqMan y sondas fluorescentes con el tiempo óptimo apropiado, con los cebadores y las sondas descriptas previamente. Los experimentos de transcurso de tiempo permitieron determinar que el ARNm se reduce en forma óptima en entre 6 y 9 horas . Estos resultados concuerdan apropiadamente con los resultados obtenidos para las proteínas . El primer análisis (aunque se realizó en un punto de tiempo subóptimo, cuando los niveles de XIAP estaban volviendo a la normalidad, posiblemente debido al crecimiento de las células no transfectadas) permitió identificar oligonucleótidos antisentido (Tabla 1: C2 , E2, E3, F3, C4, D4 , E4 , F4 , G4 , C5, D5 , B6, F6, D7, D8, F8) de los 96 oligómeros de nucleobases evaluados que presentaron algún grado de disminución en los niveles de proteínas XIAP respecto de las proteínas totales, en comparación con los niveles para la transfección simulada (sin oligómero de nucleobases) (Fig. ÍA, ÍC, ÍE, 1G, 11 y 1K) . Los niveles de proteínas totales se redujeron para cada uno de estos 16 oligómeros de nucleobases, lo que indica un efecto tóxico o citostático de estos oligómeros de nucleobases (Fig. IB, ID, 1F, 1H, 1J, ÍL) . Los oligómeros de nucleobases B9 y C9 presentaron una caída clara en las proteínas totales, pero ninguna caída relativa en los niveles de proteínas XIAP. Los 16 oligómeros de nucleobases antisentido que presentaron algún grado de disminución en los niveles relativos de proteínas de XIAP, respecto de la transfección simulada, se evaluaron nuevamente solos o combinados, con la inclusión de un oligómero de nucleobases control (D2) , en función de su capacidad de reducir las proteínas de XIAP hasta un punto de tiempo más óptimo (12 horas) , sobre la base de los estudios de transcurso de tiempo descriptos previamente (Figura 2B) . En estos oligómeros de nucleobases también se examinó la capacidad de reducir los niveles de ARNm de XIAP a las 12 horas, normalizados respecto de los niveles de GAPDH, y se realizó una comparación con la transfección simulada. También se determinaron las concentraciones de proteínas totales a las 12 horas (Figura 2C) . Se verificó una correlación buena entre la capacidad de un oligómero de nucleobases de disminuir los niveles de proteínas de XIAP (Figura 2B) con su capacidad de reducir los niveles de ARNm de XIAP (Figura 2A) . Además, no hay pérdidas importantes de proteínas totales en este punto de tiempo temprano, y la disminución en el ARNm y la proteína de XIAP precede la reducción en las proteínas totales observada en los puntos de tiempo tardíos . Los oligómeros de nucleobases que presentaron una pérdida de nivel de proteínas o ARNm de XIAP mayor que 50% solos, o en una combinación de dos oligómeros de nucleobases con una relación de 1:1, se identificaron como los mejores oligómeros de nucleobases y se sometieron a una convalidación adicional. De estos 16 oligonucleótidos, diez (E2, E3, F3 , E4, F4, G4, C5, B6, D7, F8) presentaron una capacidad consistente de disminuir los niveles de proteínas o ARN de XIAP en más de 50%, dependiendo de las condiciones de transfección usadas, o cuando se los usó combinación (como se realizó para C5 y G4) . Más aún, estos 16 oligonucleótidos que presentaron actividad antisentido se agruparon en cuatro regiones blanco diferentes del ARNm de XIAP, con oligómeros de nucleobases adyacentes que presentaron alguna actividad de reducción. Se observó una actividad antisentido escasa o nula con oligómeros de nucleobases dirigidos contra secuencias entre estas regiones o islas de sensibilidad. Se presume que estas regiones representan áreas abiertas en el ARNm que son accesibles para los oligómeros de nucleobases dentro de las células. Los oligómeros de nucleobases E3 y F3 están dirigidos hacia una región de XIAP justo río arriba del codón inicial en la región participante entre el IRES y el sitio de inicio de la traducción, y se superponen parcialmente con el extremo del elemento IRES . C2 , D2 y E2 están dirigidos hacia una región de XIAP río arriba del elemento IRES mínimo, con lo que se obtiene más evidencia de que la región de IRES mínima es una región de ARN altamente estructurada a la que no pueden acceder fácilmente los oligómeros de nucleobases in vivo. Todos los otros oligómeros de nucleobases son complementarios con una porción de la región codificante, incluyendo un conjunto de actividad en las posiciones 856-916 de la secuencia de XIAP (E4, F4 y G4) , y áreas más pequeñas separadas, tal como lo demuestran los oligómeros de nucleobases C5 y D5, por e emplo. Se analizó nuevamente una porción de los 96 oligómeros de nucleobases ilustrados en la Tabla 2 para determinar su capacidad de reducir el ARNm de XIAP en células NCI-H460, 9 horas después de la transfección. Los datos se resumen en la tabla 5 a continuación.

También se determinó si 4X4 MBO (la totalidad de PS, residuos de ADN rodeados a ambos lados por cuatro residuos de 2 ' -O-metil ARN) eran capaces de reducir las proteínas XIAP en células H460. Como se indica en las Figuras 3 y 4,4X4 MB de E12 y otro oligonucleótido, FG8, fueron efectivos en cantidades tan bajas como 31 nM. Ejemplo 5: Los oligómeros de nucleobases antisentido de XIAP incrementan la citotoxicidad y la sensibilización química Se investigó si los oligómeros de nucleobases antisentido de XIAP podían sensibilizar las células T24, que presentan una resistencia a drogas elevada, a los agentes quimioterapéuticos tradicionales, tales como la adriamicina o la cisplatina. Se seleccionaron oligonucleótidos antisentido para representar algunas de las distintas regiones blanco de XIAP, y se evaluaron sus efectos citotóxicos, solos o en combinación con otros oligonucleótidos o drogas. En cinco oligonucleótidos antisentido de XIAP se evaluó la capacidad de matar o incrementar la sensibilidad química de células de carcinoma de vejiga T24, y se realizó una comparación con los efectos de tres oligonucleótidos control mezclados correspondientes . Las células T24 se transfectaron con oligonucleótidos antisentido de XIAP, oligonucleótidos mezclados, no recibieron oligonucleótidos (transfecciones simuladas) o se dejaron sin tratar. Luego se evaluó la viabilidad de las células 20 horas después de la transfección (con la excepción del control sin tratar) usando el ensayo de coloración con tetrazolio WST-1, en el que se reduce colorante de tetrazolio WST-1 para obtener un producto de formazán coloreado en células con metabolismo activo (Fig. 5A) . La presencia de citoxicidad inducida por el oligonucleótido E4 se examinó inspeccionando en forma visual las células T24 sin tratar, sometidas a transfeciones simuladas o transfectadas con oligonucleótidos E4, E4 mezclados, E4 de polaridad inversa o E4 con faltas de coincidencia. Se examinó la morfología de las células veinte horas después de la transfección (Fig. 5D) . Solamente las células transfectadas con oligonucleótidos antisentido E4 presentaron señales de toxicidad. Para examinar los efectos de los oligómeros de nucleobases sobre la sensibilización química de las células T24 a cisplatina o adriamicina, se evaluó la capacidad de los oligonucleótidos de matar adicionalmente las células T24 en presencia de una dosis fija de adriamicina (0,5 µg/ml). Primero se transfectaron las células con un oligonucleótido, y se agregó adriamicina por otras 20 horas. Se midió la viabilidad con WST-1 al final del tratamiento con drogas por 20 horas (Fig. 5B) . Los resultados se ilustran en la Figura 5C, como porcentaje de viabilidad respecto del tratamiento con oligómero de nucleobases solo. La totalidad de los cinco oligómeros de nucleobases evaluados (F3, E4, G4 , C5 , D7) , así como combinaciones de E4+C5 y G4+C5, mataron las células T24, de las cuales subsistió solamente un 10-15% después de 24 horas, en comparación con las células que recibieron la transfección simulada (son oligonucleótido) o las células transfectadas con los tres controles mezclados correspondientes para F3 (5 ' -mCmAmGAGATTT CATTTAAmCmGmU-31; SEQ ID N° 275), E4 (5 ' -mCmUmACGCTCGCCATCGTmUmCmA-3 ' ; SEQ ID N° 276), y C5 (5 ' -mUmGmCCCAAGAATACTAGmUmCmA-3 ' ; SEQ ID N° 277) (Figuras 5A y 5C) . Por consiguiente, la toxicidad es específica para la secuencia de aquellos oligómeros de nucleobases que reducen los niveles de XIAP, y no es una toxicidad sin especificidad de secuencia, debido a la química de los oligómeros de nucleobases en general . Esta citotoxicidad puede ser el resultado del efecto combinado de la reducción de las proteínas XIAP (y la pérdida esperada de la protección anti-apoptótica proporcionada por XIAP) y la citotoxicidad de la transfección misma. La adición de una dosis fija de adriamicina o cisplatina al final del período de transfección de tres horas resultó en una disminución adicional en la supervivencia para algunos de los oligonucleótidos evaluados, una caída de 40% adicional en la supervivencia después de 20 horas para los oligómeros de nucleobases F3, D7 y la combinación G4+C5 (Fig. 5B) , en comparación con los valores correspondientes a las muestras tratadas con oligonucleótidos (Fig. 5C) . Los valores en la Figura 5B (oligonucleótido más droga) se comparan con los los valores de oligonucleótido solo en la Fig. 5C, que se fija en 100% para cada ODN. Solamente se presentan los resultados de la sensibilización química para adriamicina; se obtuvieron resultados similares cuando se realizó la sensibilización química de las células con cisplatina. A las dosis fijas empleadas, los controles con transfecciones simuladas y mezclados no presentaron mayores pérdidas de supervivencia cuando se los trató con adriamicina (Fig. 5B) . Solamente se observa sensibilización química cuando los niveles de XIAP son reducidos por un oligonucleótido antisentido específico. Ejemplo 6: Efectos de reducción de los oligonucleótidos antisentido sobre el ARNm de XIAP en células H460 Usando PCR en tiempo real, se examinaron los efectos de los oligonucleótidos antisentido (2x2 MBO, compuesto por dos residuos de 2 ' -O-metil ARN circundantes en cada extremo con enlaces de fosforotioato, y un núcleo central de 15 residuos de fosfodiéster de ADN) sobre el ARNm de XIAP en células H460. En esta configuración, los oligómeros de nucleobases F3, G4, C5, AB6 y DE4 redujeron el nivel de ARNm en 50-70%, en comparación con el control sin tratar, mientras que los oligómeros de nucleobases AS D7 redujeron el nivel de ARNm en 30% (Figura 6) . En contraste, los oligómeros de nucleobases control y el agente de transfección solo (LFA) redujeron cada uno el nivel de ARNm en menos de 20%, respecto del control sin tratar (Figura 6) . Se seleccionaron los oligómeros de nucleobases F3, G4 y C5 para realizar estudios in vitro e in vivo adicionales . La reducción adicional de ARNm de XIAP observada en el análisis de TaqMan se ilustra en las Figuras 7 y 8. Ejemplo 7: Efectos de reducción de los oligonucleótidos antisentido sobre la proteína XIAP Se caracterizó la potencia de los oligómeros de nucleobases F3 , G4 y C5 sobre la configuración de la expresión de proteínas XIAP en análisis de Western blot (Figuras 9, 10A y 10B) . Los oligonucleótidos AS G4 presentaron el efecto de reducción más marcado sobre las proteínas XIAP, ya que redujeron los niveles de proteínas XIAP en 62%, 24 horas después del final de la transfección, a una concentración de 1,2 µM (Figuras 10A y 10B) . Los oligonucleótidos AS F3 , a una concentración de 1,2 µM, redujeron los niveles de proteínas XIAP en 50%, mientras que los oligonucleótidos oligonucleótidos AS C5 no presentaron efectos específicos para la secuencia, en comparación con su control (Fig. 10B) . En estudios adicionales, los oligonucleótidos AS E12 y FG8 redujeron los niveles de proteínas XIAP (Figura 9) . Ejemplo 8: Inducción de la apoptosis por oligonucleótidos AS de XIAP Como se había demostrado que los oligómeros de nucleobases AS de XIAP eran capaces de reducir la viabilidad de las células H460 y las células de carcinoma de vejiga T24, se determinó posteriormente si la muerte celular se debía a la inducción de la apoptosis . Como se muestra en la Fig. HA, las células H460 tratadas con oligonucleótidos AS F3 o oligonucleótidos AS G4 a una concentración de 1,2 µM activaron y degradaron la proteína pro-caspasa-3 con una reducción de 40% o 60% en los niveles de proteínas, respectivamente, en comparación con las células control sin tratar. También lo hicieron sobre PARP con el fragmento generado por caspasa-3 predicho (Figura HA) . En contraste, los controles con oligonucleótidos SC F3 y G4 a una concentración de 1,2 µM no tuvieron efecto sobre la expresión de proteínas caspasa-3 o PARP (Figura HA) . La relación Bcl-2:Bax no se vio alterada en las células H460 tratadas con oligonucleótidos AS F3 y G4, y sus controles respectivos, a una concentración de 1,2 µM. Se usó una citometría de flujo para detectar el contenido de ADN hipo-diploide en células H460 tratadas con oligonucleótidos AS G4 y coloreadas con Pl (Figura 12A) . Cuando se trataron las células H460 con oligonucleótidos AS G4 u oligonucleótidos control mezclados a una concentración de 1,2 µM, el contenido de ADN hipo-diploide de las células fue 40,8 y 22,1%, respectivamente, en comparación con el 16,6% de las células control sin tratar. Se usó una coloración DAPI para detectar los cambios en la morfología nuclear de las células H460 tratadas con oligonucleótidos AS G4 u oligonucleótidos control mezclados a una concentración de 1,2 µM. Como se indica en la Figura 12B, las células tratadas con los oligonucleótidos AS G4 presentaron cambios morfológicos característicos de la apoptosis, incluyendo condensación de la cromatina y fragmentación del ADN nuclear. Pocas células presentaron estos cambios morfológicos en las células control tratadas con G4 SC. Ejemplo 9: Inhibición del crecimiento celular y sensibilización de las células H460 a agentes anti-cáncer por oligonucleótidos AS Para analizar los efectos biológicos de los oligómeros de nucleobases asociados con la regulación negativa de la expresión de XIAP y la apoptosis, se investigó el crecimiento de células H460 tratadas con oligonucleótidos AS G4 en un ensayo MTT. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, los oligonucleótidos AS G4 habían reducido el crecimiento de las células H460 de una forma dependiente de la dosificación, y habían presentado una reducción de 55% respecto de los niveles del control sin tratar a una concentración de 1,2 µM (Figura 13A) . En contraste, el efecto de inhibición del crecimiento de los oligonucleótidos SC G4 o el agente de transfección solo fue comparativamente bajo, solamente 10% del control sin tratar respectivo. Para investigar si la regulación negativa de la expresión de XIAP puede sensibilizar las células H460 a la quimioterapia, se realizaron tratamientos de combinación usando oligonucleótidos AS G4 y una de las siguientes drogas anti-cáncer: doxorrubicina (DOX) , taxol, vinorelbina (VNB) y etopósido (Etop) . En la Figura 13B se demuestra que cada una de las combinaciones resultó al menos en un efecto citotóxico aditivo sobre la muerte celular, en comparación con el tratamiento con cualquiera de los oligonucleótidos AS G4 o las drogas anti-cáncer por separado. Ejemplo 10: Eficacia antitumoral de los oligonucleótidos AS G4 sobre xenoinjertos de tumores H460 y LCCß Primero se determinó si la inyección intratumoral de 2x2 -MBO antisentido de XIAP en ratones SCID-RAG2 con xenoinjertos subcutáneos de carcinoma de pulmón humano H460 reducía la magnitud del crecimiento tumoral. El tratamiento comenzó 14 días después de la inoculación de las células tumorales (inyección s.c. en el hombro de 106 células) , con una inyección de MBO (50 µg de oligonucleótidos de 2 ' -O-metil ARN por g de tumor) en la masa tumoral palpable, tres veces por semana por dos semanas. Se inyectó vinorelbina (VNB; también conocida como navelbina (NVB) (15 mg/kg i.p.) los días 17 y 24. Se midió el tamaño de los tumores con calibres tres veces por semana. Al final del período de tratamiento (día 24) , el tamaño tumoral relativo promedio de los ratones tratados con una combinación de MBO AS C5+G4 y VNB se redujo aproximadamente 70%, en comparación con aquellos tratados con MBO control mezclados y VNB. Los tratamientos con MBO AS C5 y VNB resultaron en una reducción de aproximadamente 60% del tamaño de los tumores, en comparación con el control mezclado (Figura 14) . Se diseñaron estudios sistémicos iniciales con oligonucleótidos PS sin agentes quimioterapéuticos. Se inocularon ratones SCID-RAG2 con células de carcinoma de pulmón humano H460 (inyección s.c. en el hombro de 106 células) , y se iniciaron tratamientos con oligonucleótidos AS PS G4 y F3, y también con un control mezclado, tres días después de inocular el tumor. Las inyecciones de oligómeros de nucleobases se administraron por vía i.p. a razón de 12,5 mg/kg, tres veces por semana durante tres meses. Al final del período de tratamiento, los tamaños tumorales promedio en los grupos tratados con los oligonucleótidos AS G4 o F3 fueron aproximadamente 50% menores que en el grupo tratado con oligonucleótidos control mezclados (Figura 15) . Se empleó el mismo protocolo de tratamiento para evaluar ratones SCID-RAG2 hembra inoculados por vía ortotópica con células de carcinoma de mama humano MDA-MB-435/LCC6. Dos semanas después del último tratamiento (día 35) , los volúmenes de los tumores de los ratones tratados con oligonucleótidos AS F3, C5 o G4 fueron 70%, 60, y 45% menores, respectivamente, que los controles tratados con vehículo (Figura 16) . Se realizaron pruebas adicionales de los efectos antitumorales de los oligonucleótidos AS G4 en ratones SCID-RAG2 con xenoinjertos de tumores de células pulmonares no pequeñas humanas H460 implantados por vía subcutánea. Los tumores control tratados con solución salina se desarrollaron de igual modo hasta un tamaño de 0,75 cm3 aproximadamente en 24 días (Figura 17). Los tratamientos con oligonucleótidos se iniciaron tres días después de inocular las células tumorales . Los oligonucleótidos AS G4 (entre 5 y 15 mg/kg) se administraron usando un cronograma de tratamiento de inyecciones i.p. administradas una vez por día, los días 3-7, 10-14 y 17-21. El tratamiento con 5 ó 15 mg/kg de oligonucleótidos AS G4 demoró en gran medida el crecimiento tumoral: el día 24, los tamaños tumorales promedio fueron 0,75, 0,45 y 0,29 cm3 en los grupos control y tratados con 5 y 15 mg/kg, respectivamente (Figura 18A) . Se verificó una inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosificación. El tamaño de los tumores en ratones tratados con 15 mg/kg de oligonucleótidos AS G4 fue significativamente menor que en los grupos control, y representó 39% del tamaño tumoral promedio del control. En contraste, la administración de oligonucleótidos SC G4 a razón de 15 mg/kg no proporcionó eficacia terapéutica alguna (Figura 17) . Ninguno de los ratones tratados con oligonucleótidos presentó señales de toxicidad, y ambas dosis de los oligonucleótidos fueron bien toleradas. Se seleccionó una dosis de 15 mg/kg para los futuros regímenes de tratamiento de combinación con drogas anti-cáncer. Ejemplo 11: La expresión de XIAP se reduce en tumores H460 tratados con oligonucleótidos AS G4 Para correlacionar los efectos de inhibición del crecimiento tumoral de los oligonucleótidos AS G4 con la expresión de proteínas XIAP, se examinaron los cambios en la expresión de XIAP al final del tratamiento in vivo con 15 mg/kg de oligonucleótidos AS y SC G4. El día 21 ó 24 después de la inoculación de tumores, cuando los tumores habían alcanzado un tamaño de 1 cm3 (Figura 17) , se cosecharon los tumores y se usaron lisados de ho ogenatos de tumores para realizar análisis de Western blot. Se usaron XIAP y anticuerpos de ß-actina contra la proteína humana, lo que permitió determinar los niveles de XIAP humana obtenida a partir de los especímenes de células tumorales, sin contaminación con XIAP derivada de células de ratón. Los niveles de proteínas XIAP en tumores tratados con oligonucleótidos AS G4 se redujeron significativamente hasta aproximadamente 85% de los tumores control (P < 0,005) (Figuras 18A y 18B) . Los tumores tratados con oligonucleótidos SC G4 presentaron una reducción de tamaño en 24% de los tumores control . Estos resultados indicaron que la inhibición del crecimiento de tumores H460 por los oligonucleótidos AS G4 se correlacionó con la regulación negativa de la expresión de proteínas XIAP. Ejemplo 12: Histopathología de especímenes de tumores Para evaluar si la administración de oligonucleótidos AS de XIAP resulta en la muerte directa de las células tumorales, se examinó la histología de los tumores después del tratamiento, donde se analizó la morfología y se realizó una in unocoloración con ubiquitina (Figuras 19A y 19B) . El día 21 ó 24 después de la inoculación, los tumores tratados con 15 mg/kg de oligonucleótidos AS G4, oligonucleótidos SC, o los controles con solución salina, fueron extraídos, cortados en secciones y coloreados con hematoxilina y eosina. Los resultados demuestran que los tumores en los animales que recibieron un tratamiento con oligonucleótidos AS de XIAP presentaron una mayor cantidad de células muertes, identificadas en términos morfológicos por su carencia de forma y su material nuclear condensado (Fig. 19A) . La degradación de las proteínas depende en gran medida del sistema de ubiquitina-proteasomas . Se observó una mayor expresión de ubiquitina durante la apoptosis; por consiguiente, se examinó la expresión de ubiquitina en secciones de tumores con una coloración con hematoxilina y eosina. Como se indica en la Fig. 19B, los tumores en ratones que recibieron oligonucleótidos AS de XIAP presentaron una coloración inmunohistoquímica más intensa, en comparación con los tumores en los ratones control o tratados con ODN SC. Estos datos indican que hay más ubiquitina libre y/o proteínas unidas a ubiquitina en las células tumorales tratadas con oligonucleótidos de nucleobases AS de XIAP que en los tumores control . Ejemplo 13: Tratamiento combinado de oligonucleótidos AS G4 con vinorelbina Para evaluar si los tratamientos combinados de oligómeros de nucleobases AS G4 y vinorelbina (VNB) , un agente quimioterapéutico usado para el tratamiento del cáncer de pulmón, podría resultar en algún efecto cooperativo, se comparó la eficacia terapéutica de la VNB en presencia y ausencia de oligonucleótidos AS G4 u oligonucleótidos SC G . Los regímenes de tratamiento se iniciaron el día 3 después de la inoculación tumoral . En la Figura 20A se ilustran los resultados de eficacia in vivo para dosis de 5 mg/kg y 10 mg/kg de VNB, administradas a ratones que presentaban tumores H460, y la comparación con controles con solución salina. Cada uno de los dos regímenes indujo una supresión significativa del crecimiento tumoral de una forma dependiente de la dosificación, sin señales significativas de toxicidad indeseable (es decir, pérdida de peso corporal) . Cuando se combinó la administración de oligonucleótidos AS G4 (15 mg/kg) con VNB (5 mg/kg) para el tratamiento de tumores H460, se observó una demora aún más pronunciada del crecimiento de los tumores H460, en comparación con cualquier tratamiento administrado por separado (Figura 20B) . Nuevamente, los ratones no presentaron señales significativas de toxicidad (es decir, pérdida de peso corporal) . El día 29 se compararon los tamaños tumorales promedio en ratones tratados con 5 mg/kg de VNB, en presencia o ausencia de oligonucleótidos AS o SC G4 (Figuras 20A y 20B) . El tamaño tumoral promedio en el grupo de VNB y oligonucleótidos AS G4 fue de 0,22 ± 0,03 cm3 , que fue significativamente menor que el tamaño tumoral promedio en los animales tratados con 5 mg/kg de VNB sola o con una combinación de oligonucleótidos SC G4 de VNB (0,59 ± 0,04 y 0,48 ± 0,05 cm3, respectivamente) . Métodos Los resultados obtenidos en los Ejemplos 5-13 se obtuvieron usando los siguientes métodos . Síntesis de oligonucleótidos Se sintetizó una biblioteca de más de 96 oligonucleótidos 19-meros antisentido no superpuestos, quiméricos o de esqueleto mixto (MBO) , como oligonucleótidos 2x2 MBO compuestos por dos residuos de 2 ' -O-metil ARN circundantes en cada extremo con enlaces de fosforotioato, y un núcleo central de 15 residuos de fosfodiéster de ADN. Cada producto final se desaló por cromatografía en SephadexG-25 (IDT Inc., Coralville, IA) . Esta configuración polimérica quimérica, y una mezcla de enlaces de fosforotioato y fosfodiéster (conocida como 2x2 PS/PO) , proporcionó una estabilidad apropiada, y también redujo la toxicidad no específica asociada con los residuos de fosforotioato. Los oligonucleótidos antisentido completos, no quiméricos con fosforotioato (ADN) , para los estudios in vivo e in vitro, fueron sintetizados por Trilink Biotech, y se los purificó por RP-HPLC.

Análisis de oligonucleótidos antisentido Se evaluaron células de carcinoma de vejiga T24, transfectadas con complejos de oligonucleótidos-lipofectina 1-1,2 µM por 24-48 horas, para determinar la capacidad de cada oligonucleótido de reducir la proteína XIAP. Para los aciertos positivos, se confirmó nuevamente la capacidad de reducir (i) los niveles de proteína XIAP 12-18 horas de después de la transfección con análisis de Western, y (ii) los niveles de ARNm de XIAP 6-9 horas después de la transfección con RT-PCR cuantitativa (véase más adelante) en células de carcinoma de vejiga T24 y células de carcinoma de pulmón H460. Se identificaron oligonucleótidos candidatos, y se realizaron evaluaciones adicionales . Los oligonucleótidos quiméricos 2x2 PS/PO identificados presentaron una capacidad dependiente de la dosificación de reducir los niveles de ARNm de XIAP a las 6-9 horas, a concentraciones en el rango de 400-1200 nM. En la Tabla 6 se indican ejemplos de oligonucleótidos. Tabla 6 Residuos en negrita = Residuos de ADN con enlaces de fosforotioato Residuos subrayados = bases de 2 ' -O-metil ARN Tipo convencional = residuos de fosfodiéster de ADN Lineas de células tumorales y modelo de xenoinjertos en animales La línea de células pulmonares cancerosas no pequeñas humanas (tipo celular más grande) NCI-H460 (H460) se obtuvo en la ATCC y se mantuvo en RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS, a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de C02. Las células se usaron en una fase de crecimiento exponencial, hasta un máximo de 25 pasajes in vitro. Los ratones SCID-RAG2 macho (7-9 semanas de edad, 23-26 g) se obtuvieron en la colonia de cría de la Instalación Conjunta para Animales de la Agencia de Cáncer de Columbia Británica, y se los mantuvo en ambientes asépticos. Se estableció un modelo de tumor de células NCI-H460 en ratones SCID-RAG2 por medio de una implantación subcutánea de 1 x 10s células NCI-H460 en el dorso de los ratones. Tratamiento de las células con drogas antisentido y anticáncer Un día antes de la transfección, las células H460 se sembraron en placas de cultivo de tejido de 6 ó 96 cavidades. Se administraron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato a las células con Lipofectamina 2000 (Life Technologies) , bajo la forma de complejos de liposomas-oligonucleótidos. Después de una transfección de 4,5 ó 6 horas, se reemplazó el medio de transfección por un medio RPMI que contenía 10% de FBS y se incubaron las células por otras 24 ó 48 horas. RT-PCR cuantitativa a tiempo real Se aisló inmediatamente ARN total de las células H460 tratadas con complejos de liposomas-oligonucleótidos por 6 horas, usando columnas RNeasy mini spin y un tratamiento con ADNasa (QIAGEN, Valencia, CA) . Se midió el ARNm especñifico de XIAP usando un método de RT-PCR cuantitativa a tiempo real. Se diseñaron cebadores directos o inversos de XIAP (600 nM) , y la sonda (200 nM) (5 ' -GGTGATAAA GTAAAGTGCTTTCACTGT-3' (SEQ ID N° 293), 6FAM-CAACATGCTA AATGGTTCCAGGGTGCAAATATC-TAMRA (SEQ ID N° 294) y 5'-TCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAA-3 ' (SEQ ID N° 295) , para que abarcaran las uniones entre los exones 3-4 y 4-5. Uno de los cebadores, así como la sonda, estuvo diseñado para que se superpusiera con un límite intrón-exón, para bloquear la detección de cualquier contaminación de ADN genómico posible. El ARN se transcribió en forma inversa y se amplificó por PCR usando el conjunto de elementos de RT-PCR TaqMan EZ (PE/ABl, Foster City, CA) en el sistema de detección de secuencias ABl prism 7700 (PE/ABI) . Las condiciones de ciclado térmico para el paso de RT fueron 50 °C por 2 minutos, 60 °C por 30 minutos y 95 °C por 5 minutos, a lo que siguieron 45 ciclos de PCR (a 94 °C por 20 segundos y 60 °C por 1 minuto por ciclo) . Se calculó el nivel de ARNm de XIAP de cada muestra respecto de las células de control sin tratar. Se determinaron los niveles de ARNm de XIAP con el método de umbral de ciclo (Ct) , usando un umbral de 30X la SD basal, y se normalizaron los niveles de XIAP de acuerdo con el contenido de GAPDH, usando cebadores y sondas proporcionados por PE/ABI .

Análisis de Western blot Las células o las muestras de tej ido tumoral se usaron con un amortiguador de lisis helado (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2,5 M, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato de sodio, 1% de NP-40, 0,02% de azida de sodio) que contenía inhibidores de proteasas (tabletas de inhibidor de proteasa Complete-Mini; Boehringer Mannheim GmBH, Mannheim, Alemania) . Después de incubar por 30 minutos en hielo, se centrifugaron las muestras a 10000 rpm por 15 minutos y se almacenó a -20 °C. El contenido de proteínas en los extractos lisados se determinó usando un ensayo Bio-Rad compatible con detergente (Bio-Rad Labs, Hercules, CA) . Se separaron cantidades iguales de proteínas (40 µg/carril) en geles de SDS-poliacrilamida al 12%, o en un gradiente de entre 4 y 15% de geles de SDS-poliacrilamida preparados con anterioridad (Bio-Rad) , y se realizó una transferencia a membranas de nitrocelulosa. Se usaron anticuerpos primarios contra XIAP, Bel-2 (DAKO, Glostrup, Dinamarca), Bax (Sigma, St . Louis, MO) , ß-actina (Sigma) , caspasa-3 (BD PharMingen, San Diego, CA) y PARP (BD PharMingen) . El anticuerpo secundario fue la IgG anti-ratón o anti-conejo apropiada, conjugada con peroxidasa de rábano picante (Promega, Madison, Wl) . Las proteínas se detectaron por quimioluminiscencia mejorada (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) y se visualizaron después de una exposición a una película de autorradiografía Kodak. Se realizó un análisis de densitometría (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) para cuantificar las intensidades de las bandas a través de una integración de volumen/área. La cantidad de XIAP, caspasa-3, Bel-2 y Bax en las células se normalizó con los niveles de ß-actina en los carriles respectivos al realizar la separación y la unión con nuevas sondas . Medición del crecimiento y la viabilidad o la muerte celular Se determinó la inhibición del crecimiento de células H640 con el ensayo colorimétrico de viabilidad/proliferación celular MTT. Brevemente, se trataron las células con complejos de liposomas-oligonucleótidos por 4,5 horas, luego se incubó por otras 48 horas a 37°C, en un medio sin reactivo de transfección o con oligonucleótidos, en presencia o ausencia de drogas anti-cáncer. Se agregó MTT (25 µg/cavidad) a cada cavidad, y se incubaron las placas por 3 horas a 37°C. Después del paso de incubación, se disolvió el producto de formazán coloreado con la adición de 200 µl de DMSO. Las placas se leyeron usando el lector de placas de microtitulación (Dynex Technologies Inc., Chantilly, VA) a una longitud de onda de 570 nm. El porcentaje de células supervivencia en las cavidades tratadas con oligonucleótidos se normalizó de acuerdo con los controles sin tratar. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Ensayos de flujo citométrico apoptótico Las células se trataron con complejos de liposomas-oligonucleótidos por 4,5 horas, y se incubaron por oras 48 horas en el medio sin reactivo de transfección a 37°C. Se cosecharon las células después de la incubación, se lavó dos veces con amortiguador de muestreo (0,5% de glucosa en PBS sin Ca++ o Mg++) , y se fijó en etanol frío al 70% a 4°C por al menos 18 horas. Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm por 10 minutos, luego se suspendieron nuevamente en un amortiguador que contenía 50 µg/ml de ioduro de propidio (Pl) y 400 U/ml de ARNasa A. Las muestras se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente y por 30 minutos en hielo, a lo que siguió un análisis de citometría de flujo. Se usó el software EXPO (Applied Cytometry Systems, Sacramento, CA) para generar histogramas, que se usaron para determinar la distribución de fases del ciclo celular después de excluir los residuos. Se consideró la fracción celular Sub Gl/GO como representativa de las células apoptóticas. Morfología nuclear Se trataron las células con complejos de liposomas-oligonucleótidos por 4,5 horas, y se incubó por otras 48 horas a 37 °C en el medo sin reactivo de transfección u oligonucleótidos. Las células se cosecharon y colorearon con. 0,10 µg/ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-2-fenilindol) por 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se colocaron en un portaobjetos de vidrio, se centrifugaron y se observaron con un microscopio Leica con un lente objetivo 40X bajo iluminación fluorescente UV. Se capturaron imágenes digitales usando el software Imagedatabase V. 4.01 (Leica, Alemania) . Actividad antitumoral in vivo Se realizaron experimentos de eficacia en ratones RAG2 macho con inmunodeficiencia que presentaban tumores NCI-H460, o ratones RAG2 hembra con tumores LCC6. Los tratamientos comenzaron el día 3 después de la inoculación tumoral . Se administró solución salina (controles) , oligonucleótidos AS G4 (5 ó 15 mg/kg) , u oligonucleótidos SC G4 (5 ó 15 mg/kg) diariamente por vía i.p., con cinco dosis por semana para un régimen de tres semanas. Se administró vinorelbina (VNB, 5 ó 10 mg/kg) por vía i.v. a través de la vena caudal, sola o en combinación con los oligonucleótidos, los días 3, 7, 11 y 17 después de la inoculación tumoral. Cuando se administraron los oligonucleótidos en combinación con VNB, el tratamiento con droga se realizó cuatro horas después del tratamiento con ODN. 29 Los ratones se observaron en forma diaria. Se usaron mediciones de peso corporal y de las señales de estrés (por ejemplo, letargo, carácter mullido del pelaje, ataxia) para detectar las posibles toxicidades. Se sacrificaron los animales tumores ulcerados, o con volúmenes tumorales de 1 cm3 o mayores . Las mediciones con calibres digitales de los tumores se convirtieron en tamaños tumorales promedio (cm3) usando la fórmula: 1/2 [longitud (cm) ] x [ancho (cm)]2. Se usó el tamaño tumoral promedio por ratón para calcular el tamaño tumoral promedio por grupo ± SE (n = 6 ratones) a partir de al menos dos experimentes independientes por grupo . Procesamiento de tumores y tejidos Se recolectaron los tumores de los ratones el día 21 ó 24 después de la inoculación tumoral y el tratamiento. Se fijó una porción del tejido tumoral en formalina. Los tej idos embebidos en parafina se cortaron en secciones y se sometieron a un análisis de histopatología general, usando una coloración con hematoxilina y eosina, e inmunohistoquímica para la expresión de ubiquitina. Las otras porciones del tumor se homogenizaron en amortiguador de lisis para realizar un análisis de Western blot (véase lo descripto previamente) . Análisis estadísticos Se usó una prueba t de Student para medir la significación estadística entre dos grupos de tratamiento. Se realizaron comparaciones múltiples usando un ANOVA de una vía y una prueba post-hoc que permitió comparar distintos grupos de tratamiento de acuerdo con los criterios de la prueba de Shellé (Statistiea versión 4.5, StatSoft Inc., Tulsa, OK) . Los datos se consideraron significativos con un valor de P < 0,05. Ejemplo 14: Los oligonucleótidos antisentido de HIAP1 disminuyen la expresión de ARN y polipéptidos de HIAP1 Se analizó la reducción de las proteínas en una biblioteca de 15 oligómeros de nucleobases antisentido de HIAP1 como oligonucleótidos con un análisis de Western blot, y se analizó la reducción del ARN con TaqMan, usando los cebadores y las sondas descriptas anteriormente en el Ejemplo 3, bajo dos condiciones diferentes. Los niveles de ARN de HIAP1 pueden detectarse usando análisis de Northern blot o técnicas de RT-PCR. Los oligonucleótidos antisentido se administraron a las células bajo condiciones básales o condiciones de inducción con cicloheximida (tratamiento por 24 horas con dosis sub-tóxicas) . La cicloheximida (CHX) puede provocar una inducción de entre 10 y 200 veces del ARNm de HIAP1, dependiendo de la línea celular tratada. A su vez, esto resulta en un incremento en la proteína HIAP1, como se observa en un Western blot (banda de 70 kDa) . Este efecto de CHX se desarrolla a través de dos mecanismos de acción diferentes. Primero, CHX activa NFkB, un inductor de la transcripción conocido de HIAP1, mediante el bloqueo de la síntesis de novo de una proteína lábil, IkB, que es un inhibidor de NFkB. Este efecto es imitado por la puromicina, otro inhibidor de la síntesis de proteínas, y por TNF-alfa, que induce una cascada de señalización que conduce a la fosforilación, la unión a ubiquitina y la degradación de IkB. Solamente CHX conduce a una estabilización adicional del ARNm de HIAP1, como se observa a partir de la tasa de desaparición reducida de mensajero de HIAP1 en presencia de actinomicina D, para bloquear la transcripción de novo, y CHX, al contrario que la actinomicina D y puromicina o TNF-alfa combinados.

Las células de glioblastoma SF295 se transfectaron con lipofectina y oligonucleótido (survivina mezclada, son oligonucleótido, APO 1 a APO 15 antisentido) , o se dejaron sin tratar. Se aisló ARN a partir de las células seis horas después de la transfección, y se midió el nivel de ARNm de HIAP1 por PCR cuantitativa (análisis TaqMan) , se lo normalizó de acuerdo con el ARNm de GAPDH, con el valor de transfecció'n de oligonucleótido mezclado de survivina fijado en 1,0. En la Fig. 21 se presentan los resultados de este experimento, una compilación de tres experimentos separados . El oligonucleótido de survivina mezclado, la transfección simulada, y las células sin tratar (no transfectadas) presentaron todas niveles de ARNm de HIAP1 similares. De los 15 oligonucleótidos antisentido, siete (APO 1, 2, 7, 8, 9, 12, 15) provocaron una disminución de casi 50% respecto de la transfección simulada o la transfección con el oligonucleótido control de survivina mezclada (5 ' -mUmAmAGCTGTTCTATGTGmUmUmC-3 ' ; SEQ ID N° 296) (Fig. 21) . Algunos oligonucleótidos condujeron a una inducción del ARNm de HIAP1, que puede ser una respuesta al estrés ante un oligonucleótido tóxico no específico. Un oligonucleótido antisentido aún puede ser efectivo para reducir los niveles de proteínas HIAP1, aún si el mensajero aumenta, si el oligonucleótido puede interferir con el proceso de traducción. También se examinó el efecto de los oligómeros de nucleobases antisentido de HIAP1 sobre la expresión de proteínas y ARNm de HIAP1 en células inducidas para que expresaran HIAP1. Se transfectaron células SF295 con oligonucleótidos, o se les realizó transferencias simuladas. Luego se trataron las células transfectadas con 10 µg/ml de cicloheximida por 24 horas, para inducir el ARNM y la proteína de 70 kDa de HIAPl. Se midieron los niveles de proteínas mediante análisis de Western blot con un anticuerpo policlonal anti-HIAPl, y se los normalizó contra la proteína de actina en un nuevo análisis con sonda de las mismas transferencias. En la Figura 22A se presentan análisis de los resultados de Western blot. Los resultados del análisis de densitometría se representaron contra los resultados simulados (fijados en 100%) en la Figura 22B. Se traza una línea en el nivel de 50% para identificar fácilmente los oligonucleótidos antisentido más efectivos . El proceso de transfección en sí (por ejemplo, simulada o con survivina mezclada) induce la proteína HIAP1 en comparación con la muestra sin tratar, como se indica en la inmunotransferencia Western. De los 15 oligómeros de nucleobases evaluados, seis (APO 1, 2, 7, 8, 12 y 15) presentaron una actividad elevada o presentaron una actividad significativa en los ensayos con proteínas y ARNm, y no provocaron un incremento inducido por estrés en el ARNm de HIAP1, tal como aquél observado con APO 4, 6, 11, 13, 14 (Figura 21) , y con los oligonucleótidos control sobre APO 2 (con faltas de coincidencia o polaridad inversa, véase el texto más adelante y las Figuras 23 y 24) . Nótese que APO 6 también presentó evidencias de toxicidad, como se observa a partir del incremento general en las proteínas totales (Figura 23) . Para investigar adicionalmente la eficacia de los oligonucleótidos antisentido de HIAP1 bajo condiciones de inducción de cicloheximida, se midieron los cambios en el ARNm de HIAP1 con PCR TaqMan a tiempo real, 6 horas después de la transfección con APO 2 , que está dirigido contra una repetición Alu dentro de un intrón de HIAP1, y resulta en el mayor bloqueo de la regulación positiva inducida por CHX del ARNm y la proteína HIAP1. Los controles para este experimento fueron tres oligonucleótidos para APO 2: una secuencia mezclada (con la misma composición de bases, pero con un orden al azar, 5'-AAGGGCGGCGGAGTGAGAC-3 ' ; SEQ ID N° 297), una con polaridad inversa (la misma composición de bases, con la secuencia en el mismo orden, pero en la dirección opuesta, 5 ' -AGAGGACGGAGTCGGAGGC-3 ' ; SEQ ID N° 298), y una secuencia con faltas de coincidencia (que contenía cuatro faltas de coincidencia de bases sobre un total de 19 bases, 5 ' -CGGAGCGTGAGGATGAGA-3 ' ; SEQ ID N° 299). La transfección de APO 2 antisentido en las células resultó en un incremento de 50% del ARNm respecto de un control con survivina mezclada, con una coincidencia perfecta con los resultados de las proteínas, mientras que en el control mezclado de APO 2 (Hl sc apo 2 en la Figura 24) , no hubo cambios en los niveles de ARNm de HIAP1 en lo absoluto (repetido dos veces en este caso, y en dos experimentos diferentes) . Sin embargo, el control con faltas de coincidencia ODN (Hl mm apo 2) y el oligonucleótido control con polaridad inversa (Hl RV apo 2) produjeron una inducción de 6 ó 7 veces en el ARNm de HIAP1 a las 6 horas. De acuerdo con lo esperado, estos oligonucleótidos no están más dirigidos a HIAP1, pero aún pueden estar dirigidos a repeticiones Alu, debido a la degeneración y la naturaleza repetida de estas secuencias . Por consiguiente, es posible que estos dos controles sean tóxicos para la célula y provoquen una respuesta de estrés que conduzca a la inducción de HIAP1. Este efecto también puede ocurrir con el oligonucleótido antisentido APO 2, pero en este caso, APO 2 también provoca la degeneración del ARNm de HIAP1 inducido, que resulta en una disminución relativa del ARNm de HIAP1, en comparación con el control con survivina mezclada, así como una disminución de la inducción relativa en veces de la proteína HIAP1 después de la transfección y el tratamiento con CHX, en comparación con el oligonucleótido control de survivina mezclada. Los seis oligómeros de nucleobases antisentido de HIAP1 incluyen dos oligonucleótidos muy efectivos contra una secuencia de intrones (APO 1 y APO 2, de los cuales APO 2 presenta la mejor actividad) . Estos oligonucleótidos podrían usarse como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer o trastornos autoinmunes . Los oligonucleótidos contra una secuencia de intrón probablemente estén dirigidos solamente hacia el pre-ARNm blanco (un blanco con una vida muy corta) , y no hacia la forma madura y procesada de HIAPl. Típicamente, los intrones no están dirigidos a la forma antisentido, excepto cuando se desea alterar la separación mediante el direccionamiento hacia los límites intrón-exón o hacia el punto de ramificación. Comúnmente, esto resulta en el salto de un exón, en vez de una degradación mediada por ARNasa del mensajero. Ambos mecanismos probablemente sean favorables para la potenciación de la apoptosis, ya que el salto resultaría en la pérdida del exón que codifica los primeros dos dominios importantes BIR de HIAP1. El ODN antisentido APO 2 también está dirigido a un intrón de la survivina en 18 bases consecutivas, sobre un total de 19, pero no se observaron pérdidas de proteína survivina; solamente se redujo HIAP1 después del tratamiento con oligo, lo que demuestra la especificidad del oligonucleótido antisentido de HIAPl. Estos oligonucleótidos antisentido presentan aciertos en secuencias Alu en el intrón HIAP1, y potencialmente en muchos otros genes, e inducen la muerte de las células cancerosas (véase más adelante) , lo que puede ser un resultado de la regulación negativa de HIAP1 y algunos otros genes críticos, por lo que tienen valor terapéutico si no son demasiado tóxicos para las células normales . Se ha informado que las células cancerosas tienen más transcriptos que contienen Alu, por lo que pueden ser más sensibles a la inducción de la apoptosis con un oligómero de nucleobases dirigido hacia Alu. Además, este efecto de eliminación de los oligómeros de nucleobases APO 1 y APO 2 puede deberse al efecto combinado de ambas secuencias dirigidas a Alu y HIAP1 en forma simultánea. Este efecto doble resultaría en una forma efectiva para prevenir la respuesta de estrés normal de la inducción de HIAP 1 a través de la vía NFkB, cuando se expone la célula a determinados agentes tóxicos. Es muy probable que esta respuesta al estrés sea parte del programa anti-apoptótico de las células cancerosas. Al bloquear la expresión de HIAP1, se contrarresta esta respuesta anti-apoptótica al estrés y se precipita la muerte de las células cancerosas. Ejemplo 15: Los oligonucleótidos oligonucleótidos antisentido de HIAP1 incrementan la citotoxicídad y la sensibilización química También se evaluó el efecto de los oligómeros de nucleobases antisentido de HIAP1 sobre la sensibilización química de células SF295. Las células se transfectaron con uno de tres oligonucleótidos antisentido diferentes (APO 7, APO 15 y SCAPO 2 (control)). Veinticuatro horas después de la transfección con los oligonucleótidos, las células se incubaron con adriamicina por otras 24 horas, antes de evaluar la supervivencia celular a través de una determinación de WST-1. En la Figura 25 se presentan las curvas de supervivencia con WST-1 para las células SF295 transfectadas con los oligonucleótidos de HIAP1 descriptos previamente, y luego tratadas con concentraciones crecientes adriamicina. Los dos oligonucleótidos que resultaron en una disminución en el ARNm de HIAP1 también provocaron una disminución en la supervivencia cuando se realizó un tratamiento con adriamicina, en comparación con las células tratadas con un oligonucleótido que no redujo los niveles de ARNm de HIAPl. Por consiguiente, la reducción en los niveles HIAP1 por medios antisentido u otros puede provocar la sensibilización química de una línea celular de glioblastoma que es altamente resistente a la acción citotóxica de muchas drogas quimioterapéuticas . En la Tabla 7 se presentan otras 89 secuencias antisentido de HIAP1 que pueden emplearse en los métodos de la invención. Las secuencias que presentan un 100% de identidad entre HIAP1 humana y HIAP2 humana, o que tienen una o dos faltas de coincidencia, se indican en negrita.

Tabla 7 10 15 20 También se analizó HIAP2 humana en busca de secuencias apropiadas para usar como oligómeros de nucleobases antisentido. Las secuencias identificadas se presentan en la Tabla 8. Tabla 8 Otros oligómeros de nucleobases antisentido de IAP, incluyen aquellos descriptos en la Tabla 2 de la Patente de los EEUU N° 6087173 y también indicados a continuación en la Tabla 9. Tabla 9 Se describen otras secuencias de oligómeros de nucleobases antisentido de IAP útiles en los métodos de la invención, por ejemplo, en las Patentes de los EEUU N° 6355194, 6165788, 6077709, 5958772, 5958771; las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los EEUU N° 2003/0125287 Al y 2002/0137708; en Cárter et al., "Regulation and targeting of antiapoptotic XIAP in acute myeloid leukemia" (Leukemia advance online publication, 11 de septiembre de 2003; doi : 10.1038/sj . leu.2403113) ; y Bilim et al., Int. J. Cáncer 103: 29-37 (2003). Otras realizaciones Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan en la presente documentación a modo de referencia, en la misma extensión con que se indicó que se incorporaba cada publicación o solicitud de patente específica e individualmente a modo de referencia. Si bien se ha descripto la invención en conexión con realizaciones específicas, se comprenderá que pueden realizarse modificaciones adicionales, y que esta solicitud abarca cualquier variación, uso o adaptación de la invención, en general de acuerdo con los principios de la invención, incluyendo aquellos cambios de esta descripción conocidos o acordes a la práctica convencional en la técnica relacionada con la invención, y que estos cambios pueden aplicarse a las características esenciales detalladas previamente en la presente documentación.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, donde dicho método comprende administrar a dicho paciente: (i) un oligómero de nucleobases antisentido de IAP de entre ocho y treinta nucleobases de longitud; y (ii) un agente quimioterapéutico, en cantidades que combinadas son suficientes para tratar dicho paciente. 2. El método de la reivindicación 1, donde dicho oligómero de nucleobases antisentido de IAP y dicho agente quimioterapéutico se administran con una separación de 28 días. 3. El método de la reivindicación 2 , donde dicho oligómero de nucleobases antisentido de IAP y dicho agente quimioterapéutico se administran con una separación de 24 horas. 4. El método de la reivindicación 3 , donde dicho oligómero de nucleobases antisentido de IAP y dicho agente quimioterapéutico se administran con una separación de 1 hora . 5. El método de la reivindicación 4, donde dicho oligómero de nucleobases antisentido de IAP y dicho agente quimioterapéutico se administran en forma simultánea. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho oligómero de nucleobases comprende al menos ocho nucleobases consecutivas de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N° 1-99, 143, 147, 151, 163- 260, 287, 289 y 300-460. 7. El método de la reivindicación 6, donde dicho oligómero de nucleobases comprende al menos ocho nucleobases consecutivas de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N° 97, 98, 99, 143, 147, 151, 287, 289 y 300-460. 8. El método de la reivindicación 7, donde dicho oligómero de nucleobases consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N° 97, 98, 99, 143, 147, 151, 287, 289 y 300-460. 9. El método de la reivindicación 8 , donde dicho oligómero de nucleobases consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N° 97, 98, 99, 143, 147, 151, 287, 289 y 300-460. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde dicho oligómero de nucleobases es un oligonucleótido . 11. El método de la reivindicación 10, donde dicho oligonucleótido comprende al menos un enlace modificado. 12. El método de la reivindicación 11, donde dicho enlace modificado se selecciona del grupo que consiste en enlaces de fosforotioato, metilfosfonato, fosfotriéster, fosforoditioato y fosfoselenato . 13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde dicho oligómero de nucleobases comprende al menos una porción de azúcar modificado. 14. El método de la reivindicación 13 , donde dicha porción de azúcar modificado es un grupo 2 ' -O-metilo o un grupo 2 ' -O-metoxietilo . 15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde dicho oligómero de nucleobases comprende al menos una nucleobase modificada. 16. El método de la reivindicación 15, donde dicha nucleobase modificada es 5-metil citosina. 17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde dicho oligómero de nucleobases es un oligómero de nucleobases quimérico. 18. El método de la reivindicación 17, donde dicho oligómero de nucleobases comprende residuos de ADN unidos por enlaces de fosforotioato, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por al menos un residuo de 2' -O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN. 19. El método de la reivindicación 18, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por al menos tres residuos de 2 ' -O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN. 20. El método de la reivindicación 19, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por cuatro residuos de 2 ' -O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN. 21. El método de la reivindicación 18, donde dichos residuos de ARN están unidos entre sí por enlaces de fosforotioato, y dichos residuos de ARN están unidos a dichos residuos de ADN por enlaces de fosforotioato. 22. El método de la reivindicación 18, donde dicho oligómero de nucleobases comprende residuos de ADN unidos por enlaces de fosfodiéster, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por al menos dos residuos de 2 '-O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN unidos por enlaces de fosforotioato . 23. El método de la reivindicación 22, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por al menos tres residuos de 2 '-O-metil o 2' -O-metoxietil ARN. 24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho oligómero de nucleobases comprende once residuos de ADN rodeados a cada lado por cuatro residuos de 2 ' -O- metil ARN, donde dicho oligómero de nucleobases consiste en una de las siguientes secuencias: 5'-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3 ' (SEQ ID N° 155); 5 ' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3 ' (SEQ ID N° 16); 5'-ACAGGACTACCACTTGGAA-3' (SEQ ID N° 157); 5'-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3' (SEQ ID N° 27); 5'-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3' (SEQ ID N° 141); 5 ' -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3 ' (SEQ ID N° 41) 5'-AAGCACTGCACTTGGUCAC-3 ' (SEQ ID N° 47) S'-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-S' (SEQ ID N° 51) 5 ' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3 ' (SEQ ID N° 63) 5'-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3 ' (SEQ ID N° 161); y 5 ' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3 ' (SEQ ID N° 151), donde dichos residuos están unidos por enlaces de fosforotioato . 25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dicho agente quimioterapéutico altera los microtúbulos . 26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dicho agente quimioterapéutico estabiliza los microtúbulos . 27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dicho agente quimioterapéutico es un taxano. 28. El método de la reivindicación 27, donde dicho taxano es paclitaxel, doxetaxel, RPR109881A, SB-T-1213, SB-T-1250, SB-T-101187, BMS- 275183, BRT 216, DJ-927, MAC-321, IDN5109 o IDN5390. 29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dicho agente quimioterapéutico es un vinca alcaloide. 30. El método de la reivindicación 29, donde dicho vinca alcaloide es vincristina, vinblastina, vindesina, vinflunina, vinorelbina o anhidrovinblastina. 31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dicho agente quimioterapéutico es una dolastatina. 32. El método de la reivindicación 31, donde dicha dolastatina es dolastatina-10, dolastatina-15, ILX651, TZT-1027, simplostatina 1, simplostatina 3 o cemadotina. 33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 24 donde dicho agente quimioterapéutico es una criptoficina . 34 El método de la reivindicación 33, donde dicha criptoficina es criptoficina 1 o criptoficina 52. 35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-25, donde dicho agente quimioterapéutico es una epotilona. 36. El método de la reivindicación 35, donde dicha epotilona es epotilona A, epotilona B, deoxiepotilona B o lactama de epotilona B. 37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dicho agente quimioterapéutico es eleuterobina, discodermolida, 2-epi-discodermolide, 2-des-metildiscodermolida, 5-hidroximetildiscodermolida, 19-des- aminocarbonildiscodermolida, 9(13)-ciclodiscodermolida o laulimalida. 38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dicho agente quimioterapéutico es uno seleccionado entre aquellos indicados en la Tabla 1. 39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-38, donde dicha enfermedad proliferativa es cáncer. 40. El método de la reivindicación 39, donde dicho cáncer es leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, síndrome mielodisplástico, leucemia linfocítica crónica, policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer de útero, cáncer de testículo, carcinoma pulmonar, carcinoma de células pulmonares pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodenroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma o retinoblastoma . 41. El método de cualguiera de las reivindicaciones 1- 40, que comprende además administrar a dicho paciente un sensibilizador químico. 42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 41, que comprende además administrar a dicho paciente un agente modificador de la respuesta biológica. 43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 42 , que comprende además administrar a dicho paciente un segundo agente quimioterapéutico 44. Una composición que comprende: (i) un oligómero de nucleobases antisentido de IAP de entre ocho y treinta nucleobases de longitud; y (ii) un agente quimioterapéutico, en cantidades que combinadas son suficientes para tratar un paciente que tiene una enfermedad proliferativa . 45. La composición de la reivindicación 44, donde dicho oligómero de nucleobases comprende al menos ocho nucleobases consecutivas de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N° 1-99, 143, 147, 151, 163-260, 287, 289 y 300-460. 46. La composición de la reivindicación 45, donde dicho oligómero de nucleobases comprende al menos ocho nucleobases consecutivas de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N° 97, 98, 99, 143, 147, 151, 287, 289 y 300-460. 47. La composición de la reivindicación 46, donde dicho oligómero de nucleobases consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N° 97, 98, 99, 143, 147, 151, 287, 289 y 300-460. 48. La composición de la reivindicación 47, donde dicho oligómero de nucleobases consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N° 97, 98, 99, 143, 147, 151, 287, 289 y 300-460. 49. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-48, donde dicho oligómero de nucleobases es un oligonucleótido . 50. La composición de la reivindicación 49, donde dicho oligonucleótido comprende al menos un enlace modificado. 51. La composición de la reivindicación 50, donde dicho enlace modificado se selecciona del grupo que consiste en enlaces de fosforotioato, metilfosfonato, fosfotriéster, fosforoditioato y fosfoselenato. 52 52. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-48, donde dicho oligómero de nucleobases comprende al menos una porción de azúcar modificado. 53. La composición de la reivindicación 52, donde dicha porción de azúcar modificado es un grupo 2 ' -O-metilo o un grupo 2 ' -O-metoxietilo. 54. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-48, donde dicho oligómero de nucleobases comprende al menos una nucleobase modificada. 55. La composición de la reivindicación 54, donde dicha nucleobase modificada es 5-metil citosina. 56. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-48, donde dicho oligómero de nucleobases es un oligómero de nucleobases quimérico. 57. La composición de la reivindicación 56, donde dicho oligómero de nucleobases comprende residuos de ADN unidos por enlaces de fosforotioato, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por al menos un residuo de 2' -O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN. 58. La composición de la reivindicación 57, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por al menos three residuos de 2 '-O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN. 59. La composición de la reivindicación 58, donde dichos residuos de ADN are rodeados a cada lado por cuatro residuos de 2 '-O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN. 60. La composición de la reivindicación 57, donde dichos residuos de ARN están unidos entre sí por enlaces de fosforotioato, y dichos residuos de ARN están unidos a dichos residuos de ADN por enlaces de fosforotioato. 61. La composición de la reivindicación 57, donde dicho oligómero de nucleobases comprende residuos de ADN unidos por enlaces de fosfodiéster, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por al menos dos residuos de 2 ' -O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN unidos por enlaces de fosforotioato. 62. La composición de la reivindicación 61, donde dichos residuos de ADN están rodeados a cada lado por al menos tres residuos de 2 ' -O-metil o 2 ' -O-metoxietil ARN. 63. La composición de la reivindicación 44 , donde dicho oligómero de nucleobases comprende once residuos de ADN rodeados a cada lado por cuatro residuos de 2 ' -O-metil ARN, donde dicho oligómero de nucleobases consiste en una de las siguientes secuencias: S'-AAGCACTGCACTTGGUCAC-S' (SEQ ID N° 47) 5 ' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3 ' (SEQ ID N° 51) 5 ' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3 ' (SEQ ID N° 63) 5 ' -UGUCAGTACATGTTGGCUC-3 ' (SEQ ID N° 161); y 5 ' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3 ' (SEQ ID N° 151), donde dichos residuos están unidos por enlaces de fosforotioato. 64. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico altera los microtúbulos . 65. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico estabiliza los microtúbulos. 66. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico es un taxano. 67. La composición de la reivindicación 66, donde dicho taxano es paclitaxel, doxetaxel, RPR 109881A, SB-T-1213, SB-T-1250, SB-T-101187, BMS- 275183, BRT 216, DJ-927, MAC-321, IDN5109 o IDN5390. 68. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico es un vinca alcaloide . 69. La composición de la reivindicación 68, donde dicho vinca alcaloide es vincristina, vinblastina, vindesina, vinflunina, vinorelbina o anhidrovinblastina. 70. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico es una dolastatina. 71. La composición de la reivindicación 70, donde dicha dolastatina es dolastatina-10 , dolastatina-15, ILX651, TZT-1027, simplostatina 1, simplostatina 3 o cemadotina. 72. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico es una criptoficina. 73. La composición de la reivindicación 72 , donde dicha criptoficina es criptoficina 1 o criptoficina 52. 74. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico es una epotilona. 75. La composición de la reivindicación 74, donde dicha epotilona es epotilona A, epotilona B, deoxiepotilona B o lactama de epotilona B. 76. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico es eleuterobina, discodermolida, 2-epi-discodermolida, 2-des-metildiscodermolida, 5-hidroximetildiscodermolida, 19-des-aminocarbonildiscodermolida, 9 (13) -ciclodiscodermolida o laulimalida. 77. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-63, donde dicho agente quimioterapéutico es uno seleccionado entre aquellos indicados en la Tabla 1. 78. Un método para potenciar la apoptosis de una célula, donde dicho método comprende poner en contacto dicha célula con una composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-77. 79. El método de la reivindicación 78, donde dicha célula está in vivo . 80. El método de la reivindicación 78, donde dicha célula está ex vivo. 81. El método de cualquiera de las reivindicaciones 78-80, dicha célula es una célula cancerosa. 82. El método de la reivindicación 81, donde dicha célula cancerosa es una célula cancerosa humana. 83. Un conjunto de elementos que comprende: (i) un oligómero de nucleobases antisentido de IAP de entre ocho y treinta nucleobases de longitud; (ii) un agente quimioterapéutico; y (iii) instrucciones para administrar dicho oligómero de nucleobases antisentido de IAP y dicho agente quimioterapéutico a un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, en cantidades suficientes para tratar dicha enfermedad proliferativa. 84. Un conjunto de elementos que comprende: (i) un oligómero de nucleobases antisentido de IAP de entre ocho y treinta nucleobases de longitud; y (ii) instrucciones para administrar dicho oligómero de nucleobases antisentido de IAP y un agente quimioterapéutico a un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, en cantidades suficientes para tratar dicha enfermedad proliferativa. 85. Un conjunto de elementos que comprende: (i) una composición de cualquiera de las reivindicaciones 44-77; y (ii) instrucciones para administrar dicha composición a un paciente que tiene una enfermedad proliferativa, en una cantidad suficiente para tratar dicha enfermedad proliferativa.