JP2024514211A - 生物学的サンプルを保管するための組成物及び方法 - Google Patents

生物学的サンプルを保管するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、i)約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、ii)約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、iii)約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及びiv)第1の緩衝剤を含む第1成分を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物に関し、組成物は、水、第2の緩衝剤、輸送液、塩化ナトリウム(aq)、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される希釈性成分を更に含み、第1成分は、希釈性成分を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。

Description

本発明は、アニオン性界面活性剤、キレート剤、I族金属水酸化物及び緩衝剤を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物に関する。本発明の組成物は、a)サンプルの採取、b)核酸が、細胞残渣及び外来性生体分子を含まないようにするための、ウイルス、細胞又は組織の溶解、それによりもたらされるc)そのサンプル中に存在するウイルス、細菌、真菌、寄生生物及び他の微生物の不活性化、d)ヌクレアーゼ活性による分解からの核酸の保護、並びに後続の単離、検出、増幅、及び/又は分子分析のための核酸の保存を提供する。前記5種類の機能は、単一組成物を用いることにより、且つ単一反応容器中で達成することができ、得られるサンプルは、サンプル内に含有されるポリヌクレオチドの顕著な分解を伴わずに、延長された期間にわたって室温で保管することができる。
現在のCOVID-19パンデミックは、多数の個体におけるウイルス病原体の診断のための迅速且つ確実なプロトコールに対する緊急の必要性を生み出してきた。COVID-19は、プラス鎖一本鎖RNAウイルスであるSARS-CoV-2により引き起こされる。ウイルス及び他の病原体により引き起こされるこの疾患及び他の一般的な疾患の診断は、病原体の核酸の分析に基づく。リアルタイムPCR、転写媒介増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、マイクロアレイ、次世代シーケンシング(NSG)、及び病原体遺伝子チップ等の核酸に基づく検出プラットフォームの開発は、臨床分子診断の分野を大きく変化させてきた。しかしながら、生物学的サンプル中の核酸は、室温では迅速に分解及び/又は変性し、診断分析が行われる予定である場合、前記核酸を安定に維持する能力は、しばしば、核酸を上首尾に分析できるか否かを決定する。下流の分析に対して所望の核酸が、例えば、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性による分解に対して特に感受性であるリボ核酸(RNA)を含む場合、このことは更にまた重要である。
生物学的試料を用いる場合の別の顕著な懸念は、環境への試料からの生存感染性病原体又は生物学的物質の潜在的な接種、放出、又は播種である。試験のために、その完全性を保存するためにサンプルが生存可能及び/又は生物学的に完全であるように維持される場合、採取、移動、及び試験プロセスに従事する個体は、非常に危険な伝染に対して潜在的に曝露される。結果として、必要とされる安全性措置は、典型的には、ある場所から別の場所へとそのようなサンプルを移し、且つそれらの分析を完了するために必要とされる費用及び労力を増加させる。
したがって、従事者をリスクに曝露することなく、典型的には更なる分子分析又は診断試験のために、危険な生物学的試料についてさえ核酸の完全性を保存する、安全な採取、輸送及び保管組成物に対する必要性がある。
ウイルス又は細菌感染が疑われる個体由来の核酸を含有する生物学的サンプルを取り扱うための現行のプロトコールは、サンプルの採取及び診断又は分子生物学的試験が行われるまでの核酸の保存を可能にする採取媒体の使用を含む。
SARS-CoV-2及び他の呼吸器ウイルスの検出のために、生物学的サンプルの採取は、通常、スワブを用いることにより行われ、その後、スワブは、しばしばウイルス輸送液(VTM)と称される採取媒体が入った試験管に導入される。VTMは、典型的には、緩衝化タンパク質(血清、アルブミン又はゼラチン)並びに汚染細菌及び真菌の増殖を抑制するための抗生物質を含有する。例えば、CDCは、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、胎児ウシ血清(FBS)、ゲンタマイシン及びアムホテリシンBを含有するSARS-CoV-2に対するウイルス輸送液(VTM)を推奨した(米国疾病予防管理センターSOP#: DSR-052-05)。
商業的に製造されたVTMは、スクリューキャッププラスチック試験管中で入手可能である。鼻、鼻咽頭又は口腔咽頭スワブが、分子試験が行われるまで、VTM溶液が入った試験管へと直接導入される。続いて、試験管がボルテックスにかけられ、サンプルが、抽出バッファーを含む第2の試験管へと移される。前記抽出バッファーは、一般的に、ウイルスを不活性化し、核酸が細胞残渣及び他の生体分子を含まないようにするために細胞を溶解し、且つエンドヌクレアーゼ活性による分解から核酸を保護するために必要な試薬を含有する。前記移動は、ウイルスの拡散を回避するために安全キャビネット下で行わなければならず、このことは、分子試験前のステップを増やし、且つサンプルの調製を遅らせる。したがって、サンプルを採取及び処理するための現在利用可能なプロトコールは、パンデミック状況だけでなく、大量のサンプルを迅速に採取及び処理しなければならない他の状況の必要性を満たすためにも不十分であることが証明されている。
その上、抽出バッファーは、多くの場合に、巨大分子に対する変性剤として作用してウイルスを不活性化するグアニジンチオシアン酸塩等の有害なカオトロピック剤を含有する。グアニジンチオシアン酸塩は、RNアーゼを不活性化することにより、サンプル中のRNA分子の分解を減少させることができ、したがって、RNA完全性が必須である分子診断方法論における適用のために基本的である核酸の完全性を保存する。しかしながら、前記カオトロピック剤は、皮膚との接触時に有害であり、次亜塩素酸ナトリウム等の試験デバイス中で頻繁に用いられる他の試薬と更に相互作用して、毒性ガスを生成する場合がある。
したがって、病原体を含有することが疑われる多数のサンプルを迅速に採取、保存及び分析することが必要である場合、病原体が拡散するリスクを低減させながら、プロトコールのステップ数を低減することが非常に重要である。
本発明の発明者らは、更なる分子試験に対して核酸を保存しながら、サンプル中に存在するいかなる病原体をも驚く程に不活性化する新規組成物を開発した。加えて、組成物自体がウイルス及び細胞を溶解させ、且つ核酸の保存のためにエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを不活性化することもできるので、前記組成物は、第2の組成物又はバッファーへのいかなる移動も必要とせずに、サンプルを採取するために直接的に用いることができる。加えて、前記組成物は、核酸に基づく検出プラットフォームと、特に次亜塩素酸ナトリウム等の一般的に用いられる滅菌剤と適合性であり、且つサンプル操作に関連する健康リスクを低減させる。
本発明はまた、1つ又は複数の生物学的供給源からの核酸の調製のための慣用の採取、溶解、不活性化、保管及び保存方法を有利に改善することができる、前記組成物を利用する方法も包含する。
概要
本発明は、i)約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、ii)約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、iii)約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及びiv)第1の緩衝剤を含む第1成分を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物に関し、組成物は、水、第2の緩衝剤、輸送液(transport medium)、塩化ナトリウム(aq)、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される希釈性成分を更に含み、第1成分は、希釈性成分を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。
一部の実施形態では、本発明は、約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及び第1の緩衝剤を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物に関し、組成物は、水、第2の緩衝剤、輸送液及び塩化ナトリウム(aq)、又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される希釈性成分を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。
一部の実施形態では、希釈性成分は塩化ナトリウム(aq)である。一部の好ましい実施形態では、塩化ナトリウム(aq)は、0.9%(w/v)塩化ナトリウムである。
一部の実施形態では、アニオン性界面活性剤は、C5～C20アルキル硫酸アニオン、C5～C20アルケニル硫酸アニオン、C5～C20アルキニル硫酸アニオン、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の好ましい実施形態では、界面活性剤は、ラウリル硫酸アニオンを含む。
一部の実施形態では、第1の緩衝剤は、トリス、MES、ビス-トリス、HEPES、MOPS、クエン酸塩、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせから選択される。一部の好ましい実施形態では、第1の緩衝剤はHEPESを含む。一部の実施形態では、第1の緩衝剤は、約5%～30%(w/v)の量で存在する。一部の実施形態では、緩衝剤は、5～10のpHを維持するために十分な量で存在する。
一部の実施形態では、I族金属水酸化物は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及びそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、I族金属水酸化物は水酸化リチウムを含む。
一部の実施形態では、キレート剤は、EGTA、HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、コハク酸、無水クエン酸塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸第2鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、又はそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、キレート剤は、コハク酸、EGTA、EDTA、及びそれらの組み合わせから選択される。
本発明の水性組成物の一部の実施形態では、第1の緩衝剤は約10%～25%(w/v)の量で存在し、界面活性剤は約2%～15%(w/v)の量で存在し、キレート剤は約1%～4%(w/v)の量で存在し、且つ水酸化物は約1%～4%(w/v)の量で存在する。
一部の実施形態では、水性組成物のpHは、5～10である。一部の実施形態では、水性組成物のpHは、6～9である。
一部の実施形態では、本発明の水性組成物は、約50μL/L～750μL/Lの量で消泡剤を更に含む。一部の好ましい実施形態では、前記消泡剤は、シリコーンポリマー、ポリソルベート、有機ポリエーテル分散物又はそれらの組み合わせを含む。
一部の実施形態では、本発明の水性組成物は、RNA、DNA、又はそれらのいずれかの組み合わせを含むポリヌクレオチドの集団を更に含む。
一部の実施形態では、RNAは、インビトロ合成転写産物を含む。
別の態様では、本発明は、i)約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、ii)約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、iii)約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及びiv)第1の緩衝剤を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物に関し、組成物は、約50μL/L～750μL/Lの量で消泡剤を含む。
一部の実施形態では、消泡剤は、シリコーンポリマー、ポリソルベート、有機ポリエーテル分散物、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の実施形態では、アニオン性界面活性剤は、C5～C20アルキル硫酸アニオン、C5～C20アルケニル硫酸アニオン、C5～C20アルキニル硫酸アニオン、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の好ましい実施形態では、界面活性剤は、ラウリル硫酸アニオンを含む。
一部の実施形態では、第1の緩衝剤は、トリス、MES、ビス-トリス、HEPES、MOPS、クエン酸塩、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせから選択される。一部の好ましい実施形態では、第1の緩衝剤はHEPESを含む。
一部の実施形態では、第1の緩衝剤は、約5%～30%(w/v)の量で存在する。
一部の実施形態では、第1の緩衝剤は、5～10のpHを維持するために十分な量で存在する。
一部の実施形態では、I族金属水酸化物は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及びそれらの組み合わせから選択される。一部の好ましい実施形態では、I族金属水酸化物は水酸化リチウムを含む。
一部の実施形態では、キレート剤は、EGTA、HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、コハク酸、無水クエン酸塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸第2鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、及びそれらの組み合わせから選択される。一部の好ましい実施形態では、キレート剤は、コハク酸、EGTA、EDTA、及びそれらの組み合わせから選択される。
一部の実施形態では、第1の緩衝剤は約10%～25%(w/v)の量で存在し、アニオン性界面活性剤は約2%～15%(w/v)の量で存在し、キレート剤は約1%～4%(w/v)の量で存在し、且つI族金属水酸化物は約1%～4%(w/v)の量で存在する。
一部の実施形態では、水性組成物のpHは、5～10である。一部の好ましい実施形態では、水性組成物のpHは、6～9である。
一部の実施形態では、組成物は、水、第2の緩衝剤、輸送液、塩化ナトリウム(aq)、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される成分を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。一部の好ましい実施形態では、組成物は、塩化ナトリウム(aq)を用いて希釈されている。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、RNA、DNA、又はそれらのいずれかの組み合わせを含むポリヌクレオチドの集団を更に含む。一部の好ましい実施形態では、RNAは、インビトロ合成転写産物を含む。
本発明はまた、2℃～40℃の範囲の温度でサンプルを本発明の水性組成物と接触させるステップを含む、核酸を含有することが疑われるサンプルからポリヌクレオチドの集団を取得するための方法にも関する。
一部の実施形態では、サンプルは、生物学的サンプル又は環境サンプルである。一部の実施形態では、核酸は、RNA及び/又はDNAである。一部の好ましい実施形態では、RNAは、インビトロ合成転写産物を含む。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも1種の病原体に由来する。一部の好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体はウイルスである。好ましい実施形態では、ウイルスはSARS-CoV-2である。
一部の実施形態では、核酸を含有することが疑われるサンプルからポリヌクレオチドの集団を取得するための方法は、少なくとも標的核酸を増幅するための増幅反応及び得られる増幅生成物の少なくとも1種の標的の検出を更に含む。
本発明はまた、4℃～40℃の範囲の温度で、サンプルを本発明に従う水性組成物と接触させるステップを含む、サンプル中のポリヌクレオチドの集団の完全性を保存するための方法にも関する。一部の好ましい実施形態では、本発明の水性組成物と接触させた後のサンプルは、少なくとも1時間から最大6か月間、最大9か月間、最大12か月間、又は最大26か月間にわたって、-25℃～40℃の範囲の温度で保管される。一部の好ましい実施形態では、水性組成物と接触させた後のサンプルは、-20℃、4℃、RT又は30℃で保管される。
一部の実施形態では、サンプルは、生物学的サンプル又は環境サンプルである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの集団は、RNA及び/又はDNAの集団である。一部の好ましい実施形態では、RNAは、インビトロ合成転写産物を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの集団は、少なくとも1種の病原体に由来する。一部の好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体はウイルスである。好ましい実施形態では、ウイルスはSARS-CoV-2である。
本発明はまた、サンプルを本発明に従う水性組成物と接触させるステップを含む、少なくとも1種の病原体を含むサンプルを不活性化させるための方法にも関し、水性組成物は、得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)に相当する。一部の実施形態では、サンプルは、4℃、RT又は30℃で水性組成物と接触させられる。一部の実施形態では、サンプルは、生物学的サンプル又は環境サンプルである。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体はウイルスである。好ましい実施形態では、ウイルスはSARS-CoV-2である。
本発明はまた、サンプルを本発明に従う水性組成物と接触させるステップを含む、サンプルを採取するための方法にも関し、水性組成物は、得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)に相当する。一部の実施形態では、サンプルは、生物学的サンプル又は環境サンプルである。
一部の実施形態では、サンプルは、本発明に従う水性組成物を含む採取デバイス又は採取容器へと直接導入される。
他の実施形態では、サンプルは、スワブを用い、且つそれを本発明に従う水性組成物を含む採取デバイス又は採取容器へと導入して採取される。一部の好ましい実施形態では、スワブは、採取デバイス又は採取容器に対してこすり付けた後に廃棄される。
一部の実施形態では、サンプルは、少なくとも1種の病原体を含む。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体はウイルスである。好ましい実施形態では、ウイルスはSARS-CoV-2である。
本発明はまた、本発明に従う水性組成物を含む採取デバイス又は容器にも関する。
本発明はまた、採取デバイス又は採取容器及び本発明に従う水性組成物を含むサンプル採取キットにも関する。一部の実施形態では、前記サンプル採取キットは、スワブ、キュレット、又は培養ループを更に含む。
本発明はまた、標的核酸を含有することが疑われるサンプルを採取するための、本発明に従う水性組成物の使用にも関する。一部の実施形態では、サンプルは、生物学的サンプル又は環境サンプルである。一部の実施形態では、サンプルは、少なくとも1種の病原体を含む。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。好ましい実施形態では、少なくとも1種の病原体はウイルスである。好ましい実施形態では、ウイルスはSARS-CoV-2である。
クリスタルバイオレットを用いて染色されたSARS-CoV-2感染及び未感染Vero細胞を含む96ウェルプレートの写真を示す図である。 6か月間まで4℃又は30℃で保管された陽性SeraCare及びBEIサンプルの安定性を示す図である。図2は、反応性の%を示す。 6か月間まで4℃又は30℃で保管された陽性SeraCare及びBEIサンプルの安定性を示す図である。図3は、時間に対するアナライトRLU値を示す。 6か月間まで4℃又は30℃で保管された陽性SeraCare及びBEIサンプルの安定性を示す図である。図4は、時間に対する内部対照(IC)RLU値を示す。 6か月間まで4℃又は30℃で保管された陽性SeraCare及びBEIサンプルの安定性を示す図である。図5は、時間に対するアナライト-S/CO RLU値を示す。 12か月間まで5℃で保管されたバベシアIVTサンプル(500c/mL)の安定性を示す図である。 26か月間まで-20℃で保管されたバベシアIVTサンプル(100、30及び500c/mL)の安定性を示す図である。 26か月間まで-20℃で保管されたバベシアIVTサンプル(100、30及び500c/mL)の安定性を示す図である。
単語「含む/含むこと」及び単語「有すること/はじめとする」は、本発明を参照して本明細書中で用いる場合、明記される特徴、整数、ステップ又は成分の存在を特定するために用いられるが、1つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、成分又はそれらの群の存在又は付加を除外しない。
本明細書中に開示される具体的実施形態は別個に読み取られるべきではないこと、及び本明細書は開示される実施形態同士が個別とは対照的に互いに組み合わせて読み取られることを意図することが、当業者により理解されるはずである。それ故、各実施形態は、本明細書中に開示される他の実施形態を改変又は限定するための基礎として機能し得る。
濃度、量、及び他の数値データは、範囲の形式で本明細書中において表現又は提示される場合がある。そのような範囲の形式は、単に利便性及び簡潔さのために用いられ、したがって、範囲の限界として明記される数値のみを含むのではなく、各数値又は部分範囲が明記されているかの如く、当該範囲内に包含される全ての個別の数値及び部分範囲を含むものと柔軟に解釈されるべきである。例示として、「10～100」の数値範囲は、10～100の明記される値のみを含むのではなく、示される範囲内の個別の値及び部分範囲も含むものと解釈されるべきである。したがって、10、11、12、13...97、98、99、100等の個別の値並びに10～40、25～40及び50～60等の部分範囲等が、この数値範囲に含まれる。この同じ原理が、「少なくとも10」等の一方の数値のみが記載される範囲に対して適用される。更に、そのような解釈は、記載される範囲又は特徴の幅にかかわらず当てはまるはずである。
本発明の組成物
第1の態様では、本発明は、i)約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、ii)約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、iii)約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及びiv)第1の緩衝剤を含む第1成分を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物に関し、組成物は、水、第2の緩衝剤、輸送液、塩化ナトリウム(aq)、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される希釈性成分を更に含み、第1成分は、希釈性成分を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。
第2の態様では、本発明は、i)約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、ii)約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、iii)約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及びiv)第1の緩衝剤を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物に関し、組成物は、約50μL/L～750μL/Lの量で消泡剤を含む。
別の態様では、本発明は、約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及び第1の緩衝剤を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物に関し、組成物は、水、第2の緩衝剤、輸送液及び塩化ナトリウム(aq)、又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される希釈性成分を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。
一部の好ましい実施形態では、塩化ナトリウム(aq)は、0.9%(w/v)塩化ナトリウムである。
一部の実施形態では、アニオン性界面活性剤は、C5～C20アルキル硫酸アニオン、C5～C20アルケニル硫酸アニオン、C5～C20アルキニル硫酸アニオン、又はそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、ラウリル硫酸アニオンを含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、ラウリル硫酸リチウム(LLS)又はドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む。一部の実施形態では、界面活性剤はLLSを含む。
一部の実施形態では、本発明の水性組成物中のアニオン性界面活性剤の量は、約1%～20%(w/v)、約2%～20%(w/v)、約3%～20%(w/v)、約5%～20%(w/v)、約7%～20%(w/v)、約9%～20%(w/v)、約10%～20%(w/v)、約15%～20%(w/v)、約1%～15%(w/v)、約1%～12%(w/v)、約1%～10%(w/v)、約1%～9%(w/v)、約1%～7%(w/v)又は約1%～5%(w/v)である。一部の実施形態では、本発明の組成物中のアニオン性界面活性剤の量は、約2%～15%(w/v)、約3%～12%(w/v)、約5%～10%(w/v)又は約7%～9%(w/v)である。
用語「緩衝剤」とは、本明細書中で用いる場合、溶液のpHを維持するために用いられる弱酸又は弱塩基を意味する。一部の実施形態では、緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、1,3-ビス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)プロパン(ビス-トリス)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、クエン酸塩、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせから選択される。好ましい実施形態では、緩衝剤はHEPESを含む。
一部の実施形態では、本発明の水性組成物中の緩衝剤の量は、5%～30%(w/v)、5%～25%(w/v)、5%～20%(w/v)、5%～15%(w/v)、約5%～10%(w/v)、約10%～30%(w/v)、約15%～30%(w/v)又は約20%～30%(w/v)である。一部の実施形態では、本発明の組成物中の緩衝剤の量は、約10%～25%(w/v)、約10%～22%(w/v)、約12%～20%(w/v)又は約15%～18%(w/v)である。
一部の実施形態では、緩衝剤は、5～10のpHを維持するために十分な量で本発明の水性組成物中に存在する。より好ましくは、pHは、6～9、6.5～8.5、7～8、7.2～7.8である。他の実施形態では、pHは、6～10、7～10又は7.5～10である。他の実施形態では、pHは、5～9、5～8、5～7.8、5～7.5、又は5～7.2である。
一部の実施形態では、I族金属水酸化物は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及びそれらの組み合わせから選択される。より好ましい実施形態では、I族金属水酸化物は水酸化リチウムである。
一部の実施形態では、本発明の組成物中のI族金属水酸化物の量は、約1%～5%(w/v)、約1%～4.5%(w/v)、約1%～4%(w/v)、約1%～3.5%(w/v)、約1%～3%(w/v)、約1%～2.5%(w/v)、約1.5%～5%(w/v)、約2%～5%(w/v)、約2.5%～5%(w/v)、約3%～5%(w/v)又は約3.5%～5%(w/v)である。一部の実施形態では、本発明の組成物中の塩基の量は、約1.5%～4.5%(w/v)、約2%～4%(w/v)、約2.5%～3.5%(w/v)又は約2.5%～3%(w/v)である。
用語「キレート剤」とは、本明細書中で用いる場合、金属イオンと反応して、キレートと称される錯体環状構造を形成する化合物を意味する。一部の実施形態では、キレート剤は、エチレングリコール四酢酸(EGTA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、N,N-ビス(カルボキシメチル)グリシン(NTA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、コハク酸、無水クエン酸塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸第2鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、及びそれらの組み合わせから選択される。好ましい実施形態では、キレート剤は、コハク酸、EGTA、EDTA及びそれらの組み合わせから選択される。一部の好ましい実施形態では、キレート剤はコハク酸である。
一部の実施形態では、本発明の組成物中のキレート剤の量は、約0.5%～5%(w/v)、約0.5%～4.5%(w/v)、約0.5%～4%(w/v)、約0.5%～3.5%(w/v)、約0.5%～3%(w/v)、約0.5%～2.5%(w/v)、約0.5%～2%(w/v)、約0.5%～1.5%(w/v)、約1%～5%(w/v)、約1.5%～5%(w/v)、約2%～5%(w/v)、約2.5%～5%(w/v)、約3%～5%(w/v)、約3.5%～5%(w/v)又は約4%～5%(w/v)である。一部の実施形態では、本発明の組成物中のキレート剤の量は、約1%～4%(w/v)、約1.5%～4%(w/v)、約2%～3%(w/v)又は約2.5%～3%(w/v)である。
本発明の水性組成物の一部の実施形態では、緩衝剤は約10%～25%(w/v)の量で存在し、アニオン性界面活性剤は約2%～15%(w/v)の量で存在し、キレート剤は約1%～4%(w/v)の量で存在し、且つI族金属水酸化物は約1%～4%(w/v)の量で存在する。
本発明の水性組成物の一部の実施形態では、緩衝剤は約15%～20%(w/v)の量で存在し、アニオン性界面活性剤は約5%～10%(w/v)の量で存在し、キレート剤は約2%～3%(w/v)の量で存在し、且つI族金属水酸化物は約2%～3%(w/v)の量で存在する。
一部の実施形態では、本発明の水性組成物は、5～10のpHを有する。より好ましくは、本発明の水性組成物のpHは、6～9、6.5～8.5、7～8、7.2～7.8である。他の実施形態では、pHは、6～10、7～10又は7.5～10である。他の実施形態では、pHは、5～9、5～8、5～7.8、5～7.5、又は5～7.2である。
用語「消泡剤」又は「泡立ち防止剤」とは、本明細書中で用いる場合、液体組成物中の泡の形成を低減及び妨害する化学添加剤を意味する。本発明の文脈では、前記消泡剤は、典型的には製剤中の界面活性剤の存在により生じる気泡の形成を予防し、且つ/又は開示される組成物のピペッティング及び取り扱いを促進する。一部の実施形態では、本発明の組成物は、消泡剤を更に含む。一部の実施形態では、消泡剤の量は、50μL/L～750μL/L、50μL/L～600μL/L、50μL/L～500μL/L、50μL/L～400μL/L、50μL/L～300μL/L、50μL/L～250μL/L、50μL/L～200μL/L、50μL/L～150μL/L、75μL/L～750μL/L、100μL/L～750μL/L、150μL/L～750μL/L、200μL/L～750μL/L、250μL/L～750μL/L、300μL/L～750μL/L又は500μL/L～750μL/Lである。一部の好ましい実施形態では、消泡剤の量は、75μL/L～600μL/L、100μL/L～500μl/L、150μL/L～400μL/L、又は200μL/L～300μL/Lである。本発明のための例示的な消泡剤としては、限定するものではないが、ココアミドプロピルヒドロキシスルタイン(cocoamidopropyl hydroxysultaine)、アルキルアミノプロピオン酸、イミダゾリンカルボキシレート、スルホベタイン、スルタイン、アルキルフェノールエトキシレート、アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化メルカプタン、長鎖カルボン酸エステル、アルカノールアミド(alkonolamide)、第3級アセチレングリコール、ポリオキシエチレン化シリコーン、N-アルキルピロリドン、アルキルポリグリコシダーゼ、シリコーンポリマー、ポリソルベート、有機ポリエーテル分散物、又はそれらの組み合わせが挙げられる。一部の好ましい実施形態では、消泡剤は、シリコーンポリマー、ポリソルベート、有機ポリエーテル分散物又はそれらの組み合わせを含む。より好ましい実施形態では、消泡剤は、シリコーンポリマーを含む。また更に好ましい実施形態では、前記シリコーンポリマーは、3次元シロキサンである。更により好ましい実施形態では、消泡剤は、Foam Ban(登録商標)MS-575を含む。
例えば、サンプル中に気泡が存在する場合にエラーを生じ易いプラットフォームにおいてサンプルが分析される予定である際に、消泡剤を水性組成物中に含めることができる。
本発明の組成物は、水、緩衝剤、輸送液及び塩化ナトリウム(aq)、又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される成分を用いて、最大約50%(v/v)まで希釈されている。
一部の実施形態では、水性組成物は、水を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。一部の実施形態では、水性組成物は、最大約30%(v/v)まで、最大約40%(v/v)まで、最大約45%(v/v)まで、最大約55%(v/v)まで、最大約60%(v/v)まで、最大約75%(v/v)まで、最大約80%(v/v)又は最大約80%(v/v)まで希釈されている。
用語「輸送液」とは、本明細書中で用いる場合、生物学的試料の輸送のための、保護的タンパク質及び微生物増殖を回避するための抗微生物剤を含むいずれかの溶液を意味する。一部の実施形態では、水性組成物は、輸送液を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。一部の実施形態では、水性組成物は、最大約30%(v/v)まで、最大約40%(v/v)まで、最大約45%(v/v)まで、最大約55%(v/v)まで、最大約60%(v/v)まで、最大約75%(v/v)まで、最大約80%(v/v)又は最大約80%(v/v)まで希釈されている。
一部の実施形態では、水性組成物は、塩化ナトリウム(aq)を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。一部の好ましい実施形態では、塩化ナトリウム(aq)は、0.9%(w/v)塩化ナトリウムである。一部の実施形態では、水性組成物は、最大約30%(v/v)まで、最大約40%(v/v)まで、最大約45%(v/v)まで、最大約55%(v/v)まで、最大約60%(v/v)まで、最大約75%(v/v)まで、最大約80%(v/v)又は最大約80%(v/v)まで希釈されている。
一部の実施形態では、水性組成物は、水、緩衝剤、輸送液及び0.9%(w/v)塩化ナトリウムのいずれかの組み合わせを用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている。一部の実施形態では、水性組成物は、最大約30%(v/v)まで、最大約40%(v/v)まで、最大約45%(v/v)まで、最大約55%(v/v)まで、最大約60%(v/v)まで、最大約75%(v/v)まで、最大約80%(v/v)又は最大約80%(v/v)まで希釈されている。
一部の実施形態では、本発明の水性組成物は、RNA、DNA、又はそれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドの集団を更に含む。一部の実施形態では、RNAはインビトロ合成転写産物を含む。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドの集団は、プライマー、増幅オリゴマー、検出オリゴマー、プローブ保護オリゴマー、捕捉プローブオリゴマー又は標的核酸を増幅するための増幅反応を行うために、且つ/又は前記標的核酸を検出するために必要とされるいずれかの他のポリヌクレオチドを含むことができる。他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドの集団は、標的核酸である。
用語「核酸」とは、2個以上の共有結合されたヌクレオシド若しくは含窒素複素環式塩基を有するヌクレオシドアナログ、又は塩基アナログを含むマルチマー化合物を意味し、このとき、ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合又は他の連結により一緒に連結されて、ポリヌクレオチドを形成する。核酸としては、RNA、DNA、若しくはキメラDNA-RNAポリマー又はオリゴヌクレオチド、及びそれらのアナログが挙げられる。
「単離された」とは、標的核酸を含有するサンプルがその天然環境から取得されることを意味するが、この用語は、精製のいかなる度合いも含意しない。
本発明の方法
更なる態様では、本発明は、2℃～40℃の範囲の温度でサンプルを本発明に従う水性組成物と接触させるステップを含む、核酸を含有することが疑われるサンプルからポリヌクレオチドの集団を取得するための方法に関する。一部の実施形態では、前記接触は、2℃～40℃の範囲の温度で、より好ましくは4℃～35℃の範囲の温度で、より好ましくは4℃～30℃で行われる。一部の実施形態では、前記接触は、室温で行われる。用語「室温」(RT)とは、本明細書中で用いる場合、一般的に、15℃から30℃までの温度の範囲を意味する。
一部の実施形態では、サンプルは、好ましくは、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも3分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間又は少なくとも15分間にわたって、水性組成物と接触させられる。
一部の実施形態では、サンプルは、2℃～40℃の範囲の温度で、少なくとも1分間にわたって本発明に従う水性組成物と接触させられる。
サンプルは、単離されたサンプルであり得る。サンプルとしては、「生物学的サンプル」、「環境サンプル」、及び生物学的若しくは環境サンプル又は病原体核酸を含有することが疑われるいずれかの他のサンプル或いはそれらの成分と接触させられたサンプル採取デバイス(例えば、スワブ)が挙げられる。
「生物学的サンプル」としては、尿、血液、血漿、血清、末梢血等の体液、赤血球、リンパ節、胃腸組織、糞便、脳脊髄液(CSF)、精液、喀痰、唾液、又は他の体液若しくは材料並びに固形組織が挙げられる。生物学的サンプルとしてはまた、細胞(細胞株、単離された細胞が組織からの単離後に培養されるか否かにかかわらず、組織から単離された細胞、組織学及び/又は免疫組織化学分析のために固定された細胞等の固定された細胞等)、組織(生検材料等)、又は上気道組織から(鼻咽頭洗浄液、鼻咽頭吸引物、鼻咽頭スワブ、及び口腔咽頭スワブ等)、下気道組織から(気管支洗浄液、気管吸引物、胸膜穿刺、喀痰等)をはじめとする哺乳動物から取得される液体、並びに、限定するものではないが、肺、心臓、脾臓、肝臓、脳、腎臓、及び副腎等のいずれかの器官からの組織も挙げられる。細胞及び/又は組織から単離された核酸(例えば、DNA及びRNA)等もまた含められる。一部の好ましい実施形態では、生物学的サンプルとしては、前鼻及び中鼻甲介鼻スワブ、鼻咽頭(NP)及び口腔咽頭(OP)スワブ、鼻咽頭洗浄液/吸引物又は鼻吸引物、及び気管支肺胞洗浄(BAL)試料が挙げられる。より好ましい実施形態では、前記試料は、COVID-19が疑われる個体から取得される。
「環境サンプル」としては、表面物質、土壌、水、及び工業材料等の環境材料、並びに食品及び乳加工機器、装置、設備、ディスポーザブル、及び非ディスポーザブル物品から取得される材料が挙げられる。
核酸を含有することが疑われるサンプルからポリヌクレオチドの集団を取得するための方法の一部の実施形態では、サンプルは生物学的サンプルである。他の実施形態では、サンプルは環境サンプルである。一部の実施形態では、核酸は、RNA及び/又はDNAである。一部の実施形態では、RNAは、インビトロ合成転写産物を含む。
用語「サンプル」としては、核酸等の少なくとも1種の病原体若しくはその成分又は病原体核酸の断片を含有し得るか、又は含有することが疑われるいずれかの試料が挙げられる。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体はウイルスである。他の実施形態では、前記ウイルスは呼吸器ウイルスである。一部の実施形態では、前記呼吸器ウイルスは、コロナウイルス(coronaviridae)科由来である。より好ましい実施形態では、前記ウイルスはSARS-CoV-2である。とりわけ、HIV、HCV、HBV、HAV、HEV、パルボウイルス、ウエストナイルウイルス、ウスツウイルス、チクングニアウイルス、デングウイルス、又はジカウイルス等の他の非呼吸器ウイルスもまた意図される。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。したがって、バベシア又はマラリア原虫等の他の病原体もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
一部の実施形態では、核酸を含有することが疑われるサンプルからポリヌクレオチドの集団を取得するための方法は、少なくとも標的核酸を増幅するための増幅反応を更に含む。一部の実施形態では、前記方法は、得られる増幅生成物からの少なくとも標的を検出するステップを更に含む。一部の実施形態では、増幅反応は、等温増幅反応である。より好ましい実施形態では、増幅反応は、転写媒介増幅である。
用語「核酸に基づく検出」又は「核酸試験」とは、本明細書中で用いる場合、標的配列の検出のためのアッセイを意味する。特定の実施形態では、前記核酸に基づく検出アッセイは、他の配列からそれを区別することによる標的配列の検出を含む。例えば、配列決定によるか、又は標的配列に特異的にハイブリダイズする1つ若しくは複数のオリゴヌクレオチドを利用することによる。特定の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、「増幅に基づくアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するための1つ又は複数のステップを利用するアッセイである。明確性のために、増幅に基づくアッセイは、例えば、非増幅ベースアッセイ方法(例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は切断に基づくアッセイ)において用いられるステップ等の、標的配列を増幅しない1つ又は複数のステップを含むことができる。好適な増幅方法としては、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、定量的PCR(qPCT)、リアルタイムPCR(rt-PCT)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、転写媒介又は転写随伴増幅(TMA)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、ループ媒介等温増幅(LAMP)及びポリメラーゼスパイラル反応(PSR)が挙げられる。そのような増幅方法は、当技術分野で周知であり、且つ本開示の方法に従って容易に用いられる。全ゲノム増幅(WGA)とも称される鎖置換増幅等の当業者により公知の他の非標的増幅技術もまた、本発明の精神の範囲内に含まれる。他の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、「非増幅ベースアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するためのいかなるステップにも依存しないアッセイである。
「転写媒介増幅」(TMA)とも本明細書中で称される「転写随伴増幅」は、核酸鋳型から複数RNA転写産物を生成するためにRNAポリメラーゼを用いる核酸増幅を意味する、等温増幅反応である。TMAは、一般的に、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、及びプロモーター配列を含み、且つ任意により1つ又は複数の他のオリゴヌクレオチドを含むことができる鋳型相補的オリゴヌクレオチドを利用する。
更なる態様では、本発明は、4℃～40℃の範囲の温度でサンプルを本発明に従う水性組成物と接触させるステップを含む、サンプル中のポリヌクレオチドの集団の完全性を保存するための方法に関する。
一部の好ましい実施形態では、サンプルは、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも3分間、少なくとも5分間、又は少なくとも10分間にわたって、水性組成物と接触させられる。一部の実施形態では、サンプルは、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも5日間、少なくとも7日間、少なくとも15日間、少なくとも30日間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも9か月間、少なくとも12か月間、少なくとも24か月間又は少なくとも26か月間にわたって、水性組成物と接触させられる。
一部の実施形態では、前記接触は、4℃～40℃の範囲の温度で、より好ましくは4℃～35℃の範囲の温度で、より好ましくは4℃～30℃で行われる。一部の実施形態では、前記接触は、室温で行われる。用語「室温」とは、本明細書中で用いる場合、一般的に、15℃から30℃までの温度の範囲を意味する。一部の実施形態では、サンプルは、4℃～30℃の範囲の温度で、少なくとも2分間にわたって本発明に従う水性組成物と接触させられる。
サンプル中のポリヌクレオチドの集団の完全性を保存するための方法の一部の実施形態では、水性組成物と接触させた後のサンプルは、少なくとも1時間から最大6か月間、最大9か月間、最大12か月間、又は最大26か月間にわたって、-25℃～40℃の範囲の温度で保管される。より好ましい実施形態では、水性組成物と接触させた後のサンプルは、少なくとも少なくとも1時間から最大6か月間、最大12か月間、最大24か月間、又は最大26か月間にわたって、-20℃、4℃、RT又は30℃で保管される。一部の実施形態では、水性組成物と接触させた後のサンプルは、少なくとも1時間から最大9か月間にわたって、2℃～10℃の範囲の温度で保管される。一部の実施形態では、水性組成物と接触させた後のサンプルは、少なくとも1時間から最大26か月間にわたって、-25℃～-5℃の範囲の温度で保管される。
サンプル中のポリヌクレオチドの集団の完全性を保存するための方法の一部の実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りの生物学的サンプルである。一部の好ましい実施形態では、生物学的サンプルとしては、前鼻及び中鼻甲介鼻スワブ、鼻咽頭(NP)及び口腔咽頭(OP)スワブ、鼻咽頭洗浄液/吸引物又は鼻吸引物、及び気管支肺胞洗浄(BAL)試料が挙げられる。より好ましい実施形態では、前記試料は、COVID-19が疑われる個体から取得される。他の実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りの環境サンプルである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの集団は、RNA及び/又はDNAの集団である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの集団は、少なくとも1種の病原体に由来する。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体はウイルスである。他の実施形態では、前記ウイルスは呼吸器ウイルスである。一部の実施形態では、前記呼吸器ウイルスは、コロナウイルス科由来である。より好ましい実施形態では、前記ウイルスはSARS-CoV-2である。とりわけ、HIV、HCV、HBV、HAV、HEV、パルボウイルス、ウエストナイルウイルス、ウスツウイルス、チクングニアウイルス、デングウイルス、又はジカウイルス等の他の非呼吸器ウイルスもまた意図される。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。したがって、バベシア又はマラリア原虫等の他の病原体もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
更なる態様では、本発明は、サンプルを本発明に従う水性組成物と接触させるステップを含む、少なくとも1種の病原体を含むサンプルを不活性化するための方法に関し、このとき、水性組成物は、得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)に相当する。
一部の実施形態では、前記水性組成物は、得られる混合物のうちの少なくとも2%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも5%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも10%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも20%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも35%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも40%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも50%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも60%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも70%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも80%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも85%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも90%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも95%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも98%(v/v)、より好ましくは得られる混合物のうちの少なくとも99%(v/v)に相当する。
一部の実施形態では、サンプルは、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも3分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも15分間、又は少なくとも30分間にわたって、水性組成物と接触させられる。一部の実施形態では、前記接触は、2℃～40℃の範囲の温度で、より好ましくは4℃～35℃の範囲の温度で、より好ましくは4℃～30℃で行われる。一部の実施形態では、前記接触は、室温で行われる。用語「室温」とは、本明細書中で用いる場合、一般的に、15℃から30℃までの温度の範囲を意味する。一部の好ましい実施形態では、サンプルは、4℃、RT又は30℃で水性組成物と接触させられる。
一部の実施形態では、サンプルは、4℃～30℃の範囲の温度で、少なくとも1分間にわたって本発明に従う水性組成物と接触させられる。
本発明の1つ又は複数の病原体を含むサンプルを不活性化するための方法の一部の実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りである。一部の好ましい実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りの生物学的サンプルである。一部の好ましい実施形態では、生物学的サンプルとしては、前鼻及び中鼻甲介鼻スワブ、鼻咽頭(NP)及び口腔咽頭(OP)スワブ、鼻咽頭洗浄液/吸引物又は鼻吸引物、及び気管支肺胞洗浄(BAL)試料が挙げられる。より好ましい実施形態では、前記試料は、COVID-19が疑われる個体から取得される。他の実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りの環境サンプルである。
一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体はウイルスである。他の実施形態では、前記ウイルスは呼吸器ウイルスである。一部の実施形態では、前記呼吸器ウイルスは、コロナウイルス科由来である。より好ましい実施形態では、前記ウイルスはSARS-CoV-2である。とりわけ、HIV、HCV、HBV、HAV、HEV、パルボウイルス、ウエストナイルウイルス、ウスツウイルス、チクングニアウイルス、デングウイルス、又はジカウイルス等の他の非呼吸器ウイルスもまた意図される。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。したがって、バベシア又はマラリア原虫等の他の病原体もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
更なる態様では、本発明は、サンプルを本発明に従う水性組成物と接触させるステップを含む、サンプルを採取するための方法に関し、このとき、水性組成物は、得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)に相当する。一部の実施形態では、水性組成物は、サンプルを水性組成物と接触させるステップから得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)に相当する。一部の実施形態では、前記水性組成物は、得られる混合物のうちの少なくとも2%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも5%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも10%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも20%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも35%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも40%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも50%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも60%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも70%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも80%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも85%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも90%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも95%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも98%(v/v)、又は得られる混合物のうちの少なくとも99%(v/v)に相当する。
水性組成物とのサンプルの接触は、2℃～40℃、より好ましくは4℃～40℃の範囲の温度で、且つ少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、又は少なくとも15分間にわたって、行うことができる。
本発明のサンプルを採取するための方法の一部の実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りのサンプルである。一部の好ましい実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りの生物学的サンプルである。一部の好ましい実施形態では、生物学的サンプルとしては、前鼻及び中鼻甲介鼻スワブ、鼻咽頭(NP)及び口腔咽頭(OP)スワブ、鼻咽頭洗浄液/吸引物又は鼻吸引物、及び気管支肺胞洗浄(BAL)試料が挙げられる。より好ましい実施形態では、前記試料は、COVID-19が疑われる個体から取得される。他の実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りの環境サンプルである。
一部の好ましい実施形態では、サンプルは、本発明に従う組成物を含む採取デバイス又は採取容器へと直接導入される。
他の好ましい実施形態では、サンプルは、スワブを用い、且つそれを本発明に従う組成物を含む採取デバイス又は採取容器へと導入して採取される。より好ましい実施形態では、スワブは、採取デバイス又は採取容器に対してこすり付けた後に廃棄される。
一部の実施形態では、サンプルは少なくとも1種の病原体を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体はウイルスである。他の実施形態では、前記ウイルスは呼吸器ウイルスである。一部の実施形態では、前記呼吸器ウイルスは、コロナウイルス科由来である。より好ましい実施形態では、前記ウイルスはSARS-CoV-2である。とりわけ、HIV、HCV、HBV、HAV、HEV、パルボウイルス、ウエストナイルウイルス、ウスツウイルス、チクングニアウイルス、デングウイルス、又はジカウイルス等の他の非呼吸器ウイルスもまた意図される。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。したがって、バベシア又はマラリア原虫等の他の病原体もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
更なる態様では、本発明はまた、本明細書中に記載される通りの水性組成物を含む採取デバイス又は容器にも関する。本発明はまた、採取デバイス又は採取容器及び本明細書中に記載される通りの水性組成物を含むサンプル採取キットにも関する。一部の実施形態では、前記サンプル採取キットは、スワブ、キュレット、又は培養ループを更に含む。一部の好ましい実施形態では、サンプル採取キットは、採取デバイス又は採取容器、本明細書中に記載される水性組成物及びスワブを含む。
更なる態様では、本発明は、標的核酸を含有することが疑われるサンプルを採取するための、本明細書中に記載される通りの組成物の使用に関する。好ましい実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りである。一部の好ましい実施形態では、サンプルは、本明細書中に定義される通りの生物学的サンプルである。一部の好ましい実施形態では、生物学的サンプルとしては、前鼻及び中鼻甲介鼻スワブ、鼻咽頭(NP)及び口腔咽頭(OP)スワブ、鼻咽頭洗浄液/吸引物又は鼻吸引物、及び気管支肺胞洗浄(BAL)試料が挙げられる。より好ましい実施形態では、前記試料は、COVID-19が疑われる個体から取得される。
一部の実施形態では、サンプルは少なくとも1種の病原体を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体は、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の病原体はウイルスである。他の実施形態では、前記ウイルスは呼吸器ウイルスである。一部の実施形態では、前記呼吸器ウイルスは、コロナウイルス科由来である。より好ましい実施形態では、前記ウイルスはSARS-CoV-2である。とりわけ、HIV、HCV、HBV、HAV、HEV、パルボウイルス、ウエストナイルウイルス、ウスツウイルス、チクングニアウイルス、デングウイルス、又はジカウイルス等の他の非呼吸器ウイルスもまた意図される。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は細菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は真菌である。一部の実施形態では、少なくとも1種の病原体は寄生生物である。したがって、バベシア又はマラリア原虫等の他の病原体もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
以下で本明細書中に開示される実施例は一般化された例のみを表すこと、並びに本発明を再現することが可能な他の組成物及び方法が可能であり、且つ本発明により包含されることが、当業者には直ちに明らかであるはずである。
以下の表は、下記の実施例において用いられる本発明の例示的組成物を要約する。
本発明の実施例において分析されるサンプルは、有効/無効及び/又は反応性/非反応性であると見なすことができる。サンプルがProcleix Xpressシステムにより上首尾にピペッティングされ、Procleix Pantherシステムへと導入され、ここでRNAに基づく内部対照(IC)が添加され、Procleix SARS-CoV-2アッセイ又はいずれかの他のProcleixアッセイ(Grifols Diagnostic Solutions社、USA)を用いて分析され、それにより添加されたICに関する陽性結果が得られることを含む試験システムにより有効に処理される場合、サンプルは有効であると見なされる。有効サンプルは、目的の標的核酸の存在又は非存在に依存して、反応性(SARS-CoV-2又は他の病原体に関して陽性)又は反応性でない(SARS-CoV-2又は他の病原体に関して陰性)のいずれかであり得る。そのようにして正しく特定される真陽性の割合(例えば、感染を有すると正しく特定される感染患者のパーセンテージ)である感度もまた、重要である場合に示される。
(実施例1)
スワブサンプルの採取に関する本発明の組成物の比較
本発明の組成物の目的のうちの1つは、スワブ試料採取のために用いられることである。スワブサンプルは、一部の場合には、血清又は血漿等の他の生物学的液体サンプルに関するよりも試験システムによるその処理を困難にする、高い粘度を有する。そのような試料を採取し、且つ更に試験されることに対する本発明の組成物の好適性を調べるために、組成物C1及びC3(Table 1)中に健康ボランティア(SARS-CoV-2に関して陰性と検査された)から鼻スワブサンプルを採取し、続いて、製造業者の説明書に従って、Procleix SARS-CoV-2アッセイを用いてPantherシステム上で処理した。異なるLLS濃度(3%～10%(w/v)の範囲)を有する組成物C1及びC3もまた試験した。
したがって、Table 2に示される結果は、全てのサンプルが有効であるという結果であったので、組成物C1及びC3が、スワブサンプルの採取に対して好適であることを実証する。加えて、前記の結果はまた、試験された全ての組成物が試料の採取及びPantherにおける更なる分析に関して有効であるという結果であったので、界面活性剤及び組成物の他の成分、特にLiOHの異なる濃度が、採取媒体として用いられる前記組成物の能力に影響しないことも実証する。
更なる実験では、6%LLS C3による2種類の新規鼻スワブ採取サンプルに、既知の量の人工ウイルス(50μLのAccuPlex SARS-CoV-2(Seracare社、ref 0505-0129)(61コピー/mL))を添加し、Procleix SARS-CoV-2アッセイ説明書に従ってPantherシステムに供した。それらの両方に関して、反応性結果が得られた。
結論として、前記サンプルが鼻試料である場合でさえ、本発明の組成物が核酸を含む生物学的サンプルの採取に対して好適であり、且つ分子診断方法により試験され、目的の核酸を検出するために好適であると証明された。
(実施例2)
試料採取に関するVTM及び本発明の組成物の比較
本研究の目的は、本発明の組成物を用いる鼻試料の採取の感度及び経時的なそれらの安定性を評価することであった。スワブ採取に対する標準的媒体であるので、VTMを比較のために用いた。
VTMは、米国疾病予防管理センターの推奨に従って調製した(SOP#:DSR-052-05)。簡潔には、10mLの不活化胎児ウシ血清(FBS)を、500mLの滅菌ハンクス平衡塩溶液(HBSS)のボトルに添加し、続いて2mLのゲンタマイシン/アムホテリシンB混合物を添加した。このVTMを、行われる全ての実験に対して用いた。
第1の比較研究のために、鼻試料からのスワブを採取し、既知の量の人工ウイルスを添加し、その後、3mLのVTM又は3mLの組成物C2(Table 1)のいずれかを含む採取試験管へと導入した。詳細には、鼻試料からのスワブを、フロックスワブを用いて17名の健康ボランティア(SARS-CoV-2に関して陰性と検査された)から採取した。試料を含有する各スワブに、既知の濃度の人工ウイルス(3μL又は7.5μLのAccuPlex SARS-CoV-2(Seracare社、ref 0505-0129)のメンバー1(100コピー/μL))を添加し、0コピー/mL、100コピー/mL又は250コピー/mLを含有する添加スワブを得た。続いて、添加スワブを試験管中に浸し、15秒間にわたって試験管壁に対してこすり付け、その後、スワブを廃棄した。全てのサンプルを、採取の2時間後以内に3回反復で試験した。
VTM採取試料を、採取試験管をボルテックスにかけ、続いて抽出バッファーを含有する第2の試験管へと移し、その後、サンプルをPantherシステムへとロードすることを含むProcleix SARS-CoV-2アッセイ説明書(GDSS-IFU-000047-EN v.4.0)に従って処理し、一方で、組成物C2中に採取された試料は、キャップを外した直後に(内部にスワブなし)、Pantherシステムへと直接ロードした。
陰性対照(0コピー/mL)並びに100及び250コピー/mLを添加されたサンプルに関する結果を、Table 3に示す。SARS-CoV-2に関して陽性であるという結果であったサンプルを反応性と見なし、有効サンプルは、サンプルがPantherシステムによる処理に対して好適であったことを暗示する。
サンプル採取に対して組成物C2を用いての検出限界(LOD)は、現在標準的なVTM採取と同等であった。実際には、添加がVTMへと直接的に行われる場合にはLODが80コピー/mLであることを考慮して、100コピー/mLに対応する添加に関して、C2における%反応性はより高かった。LODは試験した濃度に関して同等であるという結果であったので、同じ濃度を用いて第2の実験を行った。
第2の実験では、経時的なサンプルの安定性を試験するために、鼻試料からのスワブを組成物C2へと採取し、750及び300コピーの人工ウイルスAccuplex SARS-CoV-2を添加し、それぞれ250コピー/mL及び100コピー/mLを得た。対照として、鼻試料からのスワブをVTMへも採取し、300コピーを添加した(100コピー/mL)。
詳細には、37名の健康ボランティア(SARS-CoV-2に関して陰性と検査された)からの鼻スワブを、フロックスワブを用いて採取した。これらから、VTM中に採取した10個のスワブ試料のセット(実験対照)に300コピーを添加し、100コピー/mLを取得した。他の27個のスワブ試料を組成物C2中に採取し、これらから、10個のスワブ試料に300コピーを添加して100コピー/mLを取得し、10個のスワブ試料に750コピーを添加して250コピー/mLを取得し、6個のスワブ試料に0コピーを添加した(陰性対照)。全てのサンプルを2回反復により採取(t0)から2～3時間後に試験し、追加の混合をせずに、もう一度再試験するためにRTで48時間保管した(T48)。サンプルを以前に説明した通りにPantherにおいて処理した。結果をTable 4に示す。
比較実験結果は、両方の採取方法に対する同等のLOD、及び現在標準的なVTMへと直接添加されたAccuplex(80コピー/mL)を用いる以前の研究に対して同等な感度をも確認した。
採取の48時間後、全ての反復物は反応性であった。したがって、現行法(VTM)との比較が同様の反応性パーセンテージを生じ、且つ全ての結果が同様のLODを示したことを考慮して、採取方法はSARS-CoV-2検出の感度を顕著に減少させないと結論付けることができる。しかしながら、本発明の組成物を用いる採取方法は、ステップの数を低減させ、且つ、Pantherシステムへのサンプルのロード前に抽出バッファーが入った第2の試験管へとサンプルを移すことはもはや必要でないので、サンプル調製中のサンプルトレーサビリティを改善する。したがって、本発明の組成物は、試料の採取及び分子試験までの核酸の保存の両方に対して好適である。
より長期間にわたる室温でのSARS-CoV-2 RNAの保存を評価するために、更なる実験を行った。特に、鼻試料からのスワブを、フロックスワブを用いて3名の健康ボランティア(SARS-CoV-2に関して陰性と検査された)から採取した。試料を含有する各スワブに、既知の量の人工ウイルス(100、250又は(y)500コピー/mlのAccuPlex(Seracare社))を添加した。続いて、添加スワブを3mLの組成物C2を含む試験管中に浸し、15秒間にわたって試験管壁及び底部に対してこすり付け、その後、スワブを廃棄した。全てのサンプルを、採取直後に3回反復で試験した。サンプルの試料をPantherシステムへと直接ロードするか、又は室温で7日間保管した。
結果は、全ての試験されたサンプルが、室温での7日間の保管後に反応性であったことを示し、このことは、本発明の組成物が、少なくとも7日間にわたって室温でもRNAを保存することを確認する。
(実施例3)
本発明の組成物によるウイルス不活性化の評価
SARS-CoV-2を不活性化する組成物C2の能力を、Vero細胞における力価決定アッセイにより評価した(Pasteur Institute. Simizu B. and Terasima T. 1988; Simizu B. et al., 1967)。
力価決定方法は、ウイルス力価測定が、特異的細胞変性(cytophatic)作用の観察による感染細胞におけるウイルス産生の検出に基づく定量的アッセイである。本発明の組成物の不活性化能を評価するために、前記組成物、特にC2に、室温で1/10比率のSARS-CoV-2を添加し、2分間、10分間又は30分間(それぞれ、試験サンプルT1、T2及びT3)インキュベートした。陽性対照として、ウイルスにストック媒体(V1)を添加した。
室温でのインキュベーション後、3回反復での0.5mLの各サンプルを、希釈媒体を用いて希釈し、超遠心分離した。ペレットを25mLの力価決定媒体中に再懸濁し、Vero細胞を用いて直ちに力価決定した。超遠心分離は、ウイルスに対して顕著な作用を有しないことが示された。
続いて、96ウェルプレート(「サンプル希釈プレート」)全体にわたる連続3倍希釈により、媒体を用いて試験サンプルを希釈した(各希釈に関して8回反復)。続いて、「サンプル希釈プレート」からの各ウェルを、新規プレート(「サンプル力価決定プレート」)の対応するウェルに接種した。「サンプル力価決定プレート」の各ウェルに細胞懸濁物を添加し、続いて、プレートを適切な温度でインキュベートした。ウイルス複製及び隣接細胞の感染を可能にするインキュベーション時間後、フォーカスを有するウェルを倒立光学顕微鏡下での観察により感染後に計数するか、又は染料オーバーレイ(クリスタルバイオレット)を添加し、細胞変性作用に関してウェルを調べた。感染したウェルは透明な領域として現れるが、非感染ウェルは染色される(図1)。
1ミリリットル当たりの50%組織培養感染用量(TCID50/mL)として表される感染力価[m(T)]を、Spearman-Karber式を用いて算出した。その平均値[m(L)]及びその信頼区間により規定されるウイルス量を、平均力価m(T)×Vtとして算出し、式中、Vtは、全ての場合に関して1mLであるサンプルの合計体積である。処理前材料(未処理)中のウイルス量(Li)と処理後材料中のウイルス量(Lf)との比率のLog10として規定されるウイルス減少係数(R)は、[m(R)]=Log10(V1)-Log10(LS)として算出され、LSは、各サンプルT1、T2又はT3のウイルス量である。結果をTable 5に示す。
本研究において試験された全ての時間(2分間、10分間及び30分間)に関する組成物C2に対する得られたウイルス減少係数(R)は、5.09よりも高かった。したがって、SARS-CoV-2の更に5Log(99.999%)の減少力価が、本発明の組成物に関して実証された。
(実施例4)
SARS-CoV-2以外のウイルスのウイルス核酸の不活性化
臨床HIV-1、HIV-2、HCV、HBV及びHEV血漿及び血清陽性試料(陽性の血清学的及び/又はNAT結果)を、米国赤十字社(Gaithersburg、MD)、日本赤十字社(Tokyo、Japan)、Boca Biolistics社(Pompano Beach、FL)、Medical Research Network(MRN)(New York、NY)、SlieaGen社(Austin、TX)、Bioreclamation社(Westbury、NY)、Cerba社(France)、Discovery Live Sciences社(Los Osos、CA)及びAccess Biologicals社(San Diego、CA)から取得した。
血漿サンプル:100個のHIV-1、HCV、及びHBV陽性血漿試料、100個のHEV陽性血漿試料、並びに37個のHIV-2陽性血漿試料を、Procleix UltrioPlex Eアッセイ(UPE)を用いて、希釈せずに1回反復で試験した。同じ試料のセットを、16個のプール及び96個のプールにおいて1回反復で試験した。プールしたサンプルは、1部の陽性試料を15個(16個のプールに関して)又は95個(96個のプールに関して)の異なる血漿正常ドナー試料からの1部と混合することにより作製した。
血清サンプル:25個のHIV-1、HIV-2、HCV、及びHBV陽性血清試料を、UPEアッセイを用いて1回反復で希釈せずに試験した。同じ試料のセットを、16個のプールにおいて1回反復で試験した。プールしたサンプルは、1部の陽性試料を15個の異なる血清正常ドナー試料からの1部と混合することにより作製した。
液体サンプルは、アッセイの最初のステップにおいて比率0.75:1(C1:サンプル)で組成物C1中に希釈した。
血清(table 6)及び血漿サンプル(table 7)に関して、得られた高感度(最大1コピーのウイルス/mL)は、ウイルスの検出に対して溶解が必要であるので、サンプルの溶解を実証した。このことは、本発明の組成物が、液体サンプルにおける他のウイルスの不活性化に対して好適であることを実証する。
(実施例5)
SARS-CoV-2 RNAの不活性化及び保存
第1の実験の目的は、本発明の組成物によるSARS-CoV-2の不活性化及び保管中の保存を評価することであった。そのために、以下のサンプルを調製した:
- 人為的SeraCare陽性サンプルを、CDC推奨ウイルス輸送液(VTM)へと123コピー/mLでSARS-CoV-2陽性材料を添加することにより調製した。添加された濃度は、スワブ試料タイプに対するSCV2アッセイに関する約3×LODに対応した。
- 人為的BEI SARS関連コロナウイルスサンプルを、CDC推奨ウイルス輸送液(VTM)へと63.87c/mLで熱不活性化陽性材料を添加することにより調製した。
続いて、液体サンプルを組成物C1と1:1で混合し、i)30℃で保管し、0時間、60時間、90時間、8日間及び17日間で試験するか、又はii)4℃で保管し、0時間、8日間及び17日間で試験した。i)及びii)に関する結果を、それぞれ、表Table 8及びTable 9に示す。
123コピー/mLのSARS-CoV-2陽性材料まで添加されたSeracare処理済みスワブ試料サンプルは、ベースライン並びに30℃±3℃での60時間、90時間、8日間、及び17日間の保管後に100%反応性であった。4℃±3℃で保管されたスワブ試料は、ベースライン並びに8日間後及び17日間後に100%反応性であった。
63.87コピー/mLのSARS-CoV-2陽性材料まで添加されたBEI熱不活性化処理済みスワブ試料サンプルは、ベースライン並びに30℃±3℃での60時間、90時間、及び8日間の保管後に100%反応性であった。4℃±3℃で保管されたスワブ試料は、ベースライン及び8日間後に100%反応性であった。
これらの実験において添加されたRNAは、人工カプシド(Seracareサンプル)又は実際のカプシド(BEI不活性化ウイルス)であるが、本発明の組成物がサンプルを溶解し、且つ30℃でさえもRNAを保存できることが実施例4で既に実証された。
第2の実験では、以前のサンプル(VTMにおける3×LODで添加されたSeraCare RNA(SC)又は熱不活性化ウイルス(BEI)、及びそれに続いて1:1でC1を添加)を、より長期間にわたって30℃又は4℃のいずれかで保管し、続いて、同じPantherプロトコールに従って、3か月間及び6か月間で再試験した。結果は、SeraCare RNAが、少なくとも6か月間の4℃及び30℃保管の両方で安定であり、一方で、BEIは少なくとも6か月間の4℃保管で安定であることを実証した。30℃保管でのBEIは、少なくとも3か月間安定であった。関連する結果を、図2～図5に示す。
別の実験では、実際のSARS-CoV-2陽性サンプルの保存もまた研究した。このために、SARS-CoV-2に関して陽性と検査されたボランティアから組成物C2中に採取した35個の鼻咽頭サンプルを、最大18日間にわたって2℃～8℃の温度で保管した後に再試験した。全ての試験されたサンプルが、Pantherにおける試験後に反応性(陽性)であり、このことは、RNAが、冷却温度でも18日間まで保存されることを実証する。
(実施例6)
病原体RNAの長期保存
この実験のために、以下のサンプルを調製した:
- 500、100又は30コピー/mLを取得するために組成物C1中に希釈された、500c/mLでのバベシア18sリボソームRNAに対するインビトロ合成転写産物(IVT)
- 対照:組成物C1中に希釈された、いかなる生物においても見出されないHIV-1スクランブルRNA配列に対するIVT
バベシアIVT及び対照を、異なる温度で保管し、続いて、バベシアProcleixアッセイ及びPantherシステム(Grifols Diagnostic Solutions社、USA)を用いて標的RNAの存在に関して試験した。
第1の実験では、-15℃～-35℃のそれらの意図される保管温度の代わりに、全てのサンプルを5℃±3℃で保管した。続いて、サンプルを、0、3、6、9、及び12か月間で試験した。図6に示される結果は、本発明の組成物が、5℃での少なくとも9か月間の病原体RNAの保存を可能にすることを実証する。
別の実験では、それらの意図される保管温度である-20℃±5℃でサンプルを保管した。続いて、サンプルを、0、3、6、9、12、18、24及び26か月間で試験した。各時点において、キットが開封された日及び72時間にわたってPantherシステム上に置かれた後に開封後36日間で、試験を行った(OBは搭載(on-board)を表す)。図7に示される結果は、本発明の組成物が、高含有量のRNAでさえも、-20℃での少なくとも26か月間の病原体RNAの保存を可能にすることを実証する。
結論として、本発明の組成物は、生物学的、環境又は廃棄物サンプル等のサンプルの採取に対して、特に、実施例1及び2において実証される通りの呼吸器スワブサンプル又は実施例4において実証される通りの液体サンプルの採取に対して好適である。前記組成物はまた、VTMを用いる現行のプロトコールの代わりに有効な採取媒体でもあり、潜在的な病原体を不活性化させて、サンプルを用いて作業する人物にとってサンプルをより安全にし(SARS-CoV-2のような病原体に対する安全キャビネットの使用を回避する)、同じ採取媒体がサンプル中に存在する病原体を溶解及び不活性化することができる(実施例3、4及び5に示される通り)ので、核酸試験に対するサンプルの調製のためのステップを低減させ、同時に、試験まで核酸の完全性を上首尾に保存する。特に、本発明の組成物は、4℃～30℃の範囲の温度で数時間から最大9か月間まで(実施例5及び6を参照されたい)、及び-20℃で保管される場合には最大26か月間まで(実施例6を参照されたい)の保管の間、核酸を含むサンプルを保存するために好適であることが証明されている。最後に、本発明の組成物は、多くの場合にグアニジンチオシアン酸塩に基づく他の利用可能な不活性化媒体よりも有害性が低く、且つその清浄化プロセス中に次亜塩素酸ナトリウムを用いる試験システムとも適合性である。
(実施例7)
スワブサンプルを採取するためのFoam Banを含む本発明の組成物の比較
異なる濃度のLLS(3%～9%(w/v)の範囲)を含み、且つ300μL/Lの濃度でFoam Banを含む組成物C1及びC3(Table 1)中に、健康ボランティア(SARS-CoV-2に関して陰性と検査された)から鼻スワブサンプルを採取し、続いて、製造業者の説明書に従って、Procleix SARS-CoV-2アッセイを用いてPantherシステム上で処理した。2種類の異なる市販スワブを用いてサンプルを採取した:Aptima(登録商標)Multitestスワブ試料採取キット(Hologic社、USA)及びViCUM(登録商標)フロック(Deltalab社、Spain)。
全てのサンプルが、Table 10に示される通りに有効に処理され、このことは、Foam Banを含む組成物C1及びC3が、スワブサンプルを採取するために好適であることを実証した。組成物が異なる濃度の界面活性剤及び組成物の他の成分、特にLiOHを含む場合、試料を採取し、且つPantherにおいて更に分析されることに関して、試験された全ての組成物が有効であるという結果であったので、前記組成物がいずれかの採取媒体として用いられる能力に影響しないこともまた実証された。
更なる実験では、異なる濃度のLLS(3%～10%(w/v)の範囲)を含み、且つ300μL/Lの濃度でFoam Banを含む組成物C1及びC3(Table 1)中に、健康ボランティア(SARS-CoV-2に関して陰性と検査された)から鼻スワブサンプルを採取した。サンプルを4℃で6日間維持し、その後、製造業者の説明書に従って、Procleix SARS-CoV-2アッセイを用いてPantherシステム上で処理した。2種類の異なる市販スワブを用いてサンプルを採取した:Aptima(登録商標)Multitestスワブ試料採取キット(Hologic社、USA)及びViCUM(登録商標)フロック(Deltalab社、Spain)。Table 11に示される通り、全てのサンプルが有効に処理され、このことは、Foam Banを含む本発明の組成物が、処理前に4℃で少なくとも6日間のサンプルの採取及び保管を可能にすることを実証した。この場合にはまた、異なる濃度の界面活性剤及び組成物の他の成分、特にLiOHが、前記組成物が採取媒体として用いられる能力に影響しないことも実証される。
(実施例8)
変化する保管温度条件下でのSARS-CoV-2 RNAの不活性化及び保存
温度変化保管条件下でのSARS-CoV-2 RNAの不活性化及び保存を試験するために、実験を行った。
健康ボランティア(SARS-CoV-2に関して陰性と検査された)から採取された鼻試料の余剰分をプールすることにより、臨床マトリックスを調製した。各試料は、0.9%(w/v)塩化ナトリウムを用いて50%(v/v)まで希釈された、300μL/Lの濃度でFoam Banを含む3mLの組成物C1を含む試験管中に鼻スワブを浸し、試験管に対してスワブをこすり付けて採取された。
2×LoD(低陽性、160コピー/mL)での3mLの20個の添加サンプル、5×LoD(高陽性、400コピー/mL)での10個の添加サンプル及び偽陽性をモニタリングするための10個の陰性サンプルを、臨床マトリックス上にSARS-CoV-2 RNAを含有する組み換えウイルス(AccuPlex SARS-CoV-2、LGC SeraCare社)を用いてウイルスを添加することにより調製した。
table 12におけるパネルに従う3mLのサンプルが入った準備された40個の試験管を、次のワークフローに従って温度及び時間を通してサイクルさせた:
・これらのサンプルを、最初に温度条件A(table 13)で維持した
・サイクルの終了時、これらのサンプルを、PantherシステムにおいてProcleix SARS-CoV-2アッセイを用いて分析した
・その後、同じサンプル(各2.5mL)を、温度条件B(table 14)で維持した
・且つ最後のサイクル後、サンプルを、PantherシステムにおいてProcleix SARS-CoV-2アッセイを用いて分析した。
全ての実験が有効であるという結果であり(Table 15)、このことは、本発明の組成物が、変化する保管温度条件下でさえも、サンプルを溶解させ、且つRNAを保存することができることを示した。
(実施例9)
試料由来標的核酸の検出
42名の健康ボランティアからの鼻試料を、フロックスワブを用い、且つ0.9%(w/v)塩化ナトリウムを用いて50%(v/v)まで希釈された、300μL/Lの濃度でFoam Banを含む3mLの組成物C1を含む試験管中に各スワブを浸して採取した。スワブを15秒間にわたって試験管壁及び底部に対してこすり付け、その後、スワブが廃棄されなかった1個の試験管を除いて、スワブを廃棄した。
全ての採取されたサンプルを24～72時間保管し、その後、ヒト含有物の存在を決定し、したがって、更なる核酸検出に対して試料の適正な採取を検証するために試験した。陰性対照サンプル中及び採取された臨床試料中でヒトRNアーゼP遺伝子を検出することにより、試験を行った。サンプルを、製造業者の説明書に従って、QIAamp(登録商標)MinElute(登録商標)ウイルススピンキットを用いて最初に抽出し、その後、Nanodropを用いて評価し、最後に、CDC 2019年新型コロナウイルス(2019-nCoV)リアルタイムRT-PCR診断パネル(IDT社)を用いてヒト含有物を検出するために試験した。このパネルは、SARS-CoV-2の特異的検出に対して設計され(2種類のプライマー/プローブセット)、このキットはまた、ヒトRNアーゼP遺伝子を検出するための追加のプライマー/プローブセットも含み、サンプル中のヒト含有物を検出するためにアッセイが行われた。
全てのサンプルが、他の媒体を用いて同じ性質の新鮮ヒトサンプルを分析した場合に取得されるものと同等のCtで、ヒトRNアーゼP遺伝子に関して陽性と検査され、このことは、本発明の組成物が、標的核酸が病原体由来核酸であるか又は試料由来標的核酸であるかにかかわらず、更なる核酸試験に対して標的核酸を含有することが疑われるサンプルを採取及び保管するために好適であることを示した。
(実施例10)
唾液試料採取及び保存のための本発明の組成物
本研究の目的は、唾液試料の採取及び保存のための媒体として、本発明の組成物を評価することであった。
第1の実験に関して、健康ボランティア(SARS-CoV-2に関して陰性と検査された)からの2.5mLの唾液試料を採取し、300μL/Lの濃度でFoam Banを含む2.5mLの組成物C1(Table 1)を含む採取試験管へと導入した。各採取試験管の内容物を、2.5mLの2つの等量アリコートへと分けた。アリコートのうちの一方に、既知の量の熱不活性化ウイルス(7.5μLのSARS関連コロナウイルス2、分離株USA-WA1/2020;カタログ番号NR-52286、BEI Resources)を添加し、30コピー/mLで添加サンプルを取得した。他方のアリコートは、陰性対照(0コピー/mL)として用いた。両方のアリコートを、キャップを取り外した直後にPantherシステムに対して各反復を直接ロードすることにより、採取後の次の2時間以内に4回反復で試験した。陰性対照(0コピー/mL)及び添加サンプル(30コピー/mL)に関する結果を、Table 16に示す。SARS-CoV-2に関して陽性結果を示すサンプルが反応性であると見なされ、有効サンプルは、サンプルがPantherシステムにより好適に処理されたことを暗示する。
この実験は、本発明の組成物が、唾液試料を採取するために好適であることを示す。
第2の実験に関して、35mLの唾液試料(ヒトドナー由来プール正常唾液、カタログ番号991-05-P;Lee Biosolutions社)。唾液に、既知の量の熱不活性化ウイルス(325μLのSARS関連コロナウイルス2、分離株USA-WA1/2020;カタログ番号NR-52286、BEI Resources)を添加し、約90コピー/mLで添加サンプルを取得した。続いて、添加サンプルを、等量の組成物C1(Table 1)と混合した。各1.5mLの6個のアリコートを30℃で保管し、1、2、3、5、7及び10日間の保管後にSARS-CoV-2に関して試験した。各1.5mLの8個のアリコートを4℃で保管し、1、2、3、5、7、10、13及び15日間の保管後にSARS-CoV-2に関して試験した。全てのアリコートを、以前に説明された通りにPantherシステムにおいて処理することにより、5回反復で試験した。1.5mLの1個のアリコートを、ベースラインとして0日目に試験した。結果をTable 17に示す。SARS-CoV-2に関して陽性結果を示すサンプルが反応性であると見なされ、有効サンプルは、サンプルがPantherシステムにより好適に処理されたことを暗示する。
この実験は、本発明の組成物が、30℃で少なくとも10日間及び4℃で少なくとも15日間にわたって、唾液試料のRNA含有物を保存することを示す。

Claims (96)

  1. i)約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、
    ii)約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、
    iii)約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及び
    iv)第1の緩衝剤
    を含む第1成分を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物であって、
    水、第2の緩衝剤、輸送液、塩化ナトリウム(aq)、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される希釈性成分を更に含み、
    第1成分は、希釈性成分を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている、水性組成物。
  2. 成分が塩化ナトリウム(aq)である、請求項1に記載の水性組成物。
  3. アニオン性界面活性剤が、C5～C20アルキル硫酸アニオン、C5～C20アルケニル硫酸アニオン、C5～C20アルキニル硫酸アニオン、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項1又は2に記載の水性組成物。
  4. 界面活性剤がラウリル硫酸アニオンを含む、請求項3に記載の水性組成物。
  5. 第1の緩衝剤が、トリス、MES、ビス-トリス、HEPES、MOPS、クエン酸塩、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の水性組成物。
  6. 第1の緩衝剤がHEPESを含む、請求項5に記載の水性組成物。
  7. 第1の緩衝剤が、約5%～30%(w/v)の量で存在する、請求項1から6のいずれか一項に記載の水性組成物。
  8. 第1の緩衝剤が、5～10のpHを維持するために十分な量で存在する、請求項1から6のいずれか一項に記載の水性組成物。
  9. I族金属水酸化物が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の水性組成物。
  10. I族金属水酸化物が水酸化リチウムを含む、請求項9に記載の水性組成物。
  11. キレート剤が、EGTA、HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、コハク酸、無水クエン酸塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸第2鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の水性組成物。
  12. キレート剤が、コハク酸、EGTA、EDTA、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項11に記載の水性組成物。
  13. 第1の緩衝剤が約10%～25%(w/v)の量で存在し、アニオン性界面活性剤が約2%～15%(w/v)の量で存在し、キレート剤が約1%～4%(w/v)の量で存在し、且つI族金属水酸化物が約1%～4%(w/v)の量で存在する、請求項1から12のいずれか一項に記載の水性組成物。
  14. 水性組成物のpHが5～10である、請求項1から13のいずれか一項に記載の水性組成物。
  15. 水性組成物のpHが6～9である、請求項14に記載の水性組成物。
  16. 約50μL/L～750μL/Lの量で消泡剤を更に含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の水性組成物。
  17. 消泡剤が、シリコーンポリマー、ポリソルベート、有機ポリエーテル分散物又はそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項16に記載の水性組成物。
  18. RNA、DNA、又はそれらのいずれかの組み合わせを含むポリヌクレオチドの集団を更に含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の水性組成物。
  19. RNAがインビトロ合成転写産物を含む、請求項18に記載の水性組成物。
  20. i)約1%～20%(w/v)の量でのアニオン性界面活性剤、
    ii)約1%～5%(w/v)の量でのI族金属水酸化物、
    iii)約0.5%～5%(w/v)の量でのキレート剤、及び
    iv)第1の緩衝剤
    を含む、後続の核酸試験のために生物学的サンプルを保管するための水性組成物であって、
    約50μL/L～750μL/Lの量で消泡剤を含む水性組成物。
  21. 消泡剤が、シリコーンポリマー、ポリソルベート、有機ポリエーテル分散物、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項20に記載の水性組成物。
  22. アニオン性界面活性剤が、C5～C20アルキル硫酸アニオン、C5～C20アルケニル硫酸アニオン、C5～C20アルキニル硫酸アニオン、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項20又は21に記載の水性組成物。
  23. 界面活性剤がラウリル硫酸アニオンを含む、請求項22に記載の水性組成物。
  24. 第1の緩衝剤が、トリス、MES、ビス-トリス、HEPES、MOPS、クエン酸塩、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項20から23のいずれか一項に記載の水性組成物。
  25. 第1の緩衝剤がHEPESを含む、請求項24に記載の水性組成物。
  26. 第1の緩衝剤が、約5%～30%(w/v)の量で存在する、請求項20から25のいずれか一項に記載の水性組成物。
  27. 第1の緩衝剤が、5～10のpHを維持するために十分な量で存在する、請求項20から25のいずれか一項に記載の水性組成物。
  28. I族金属水酸化物が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項20から27のいずれか一項に記載の水性組成物。
  29. I族金属水酸化物が水酸化リチウムを含む、請求項28に記載の水性組成物。
  30. キレート剤が、EGTA、HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、コハク酸、無水クエン酸塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸第2鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項20から29のいずれか一項に記載の水性組成物。
  31. キレート剤が、コハク酸、EGTA、EDTA、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項30に記載の水性組成物。
  32. 第1の緩衝剤が約10%～25%(w/v)の量で存在し、アニオン性界面活性剤が約2%～15%(w/v)の量で存在し、キレート剤が約1%～4%(w/v)の量で存在し、且つI族金属水酸化物が約1%～4%(w/v)の量で存在する、請求項20から31のいずれか一項に記載の水性組成物。
  33. 水性組成物のpHが5～10である、請求項20から32のいずれか一項に記載の水性組成物。
  34. 水性組成物のpHが6～9である、請求項33に記載の水性組成物。
  35. 水、第2の緩衝剤、輸送液、塩化ナトリウム(aq)、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される成分を用いて最大約50%(v/v)まで希釈されている、請求項20から34のいずれか一項に記載の水性組成物。
  36. 成分が塩化ナトリウム(aq)である、請求項35に記載の水性組成物。
  37. RNA、DNA、又はそれらのいずれかの組み合わせを含むポリヌクレオチドの集団を更に含む、請求項20から36のいずれか一項に記載の水性組成物。
  38. RNAがインビトロ合成転写産物を含む、請求項37に記載の水性組成物。
  39. 2℃～40℃の範囲の温度で、サンプルを請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物と接触させるステップを含む、核酸を含有することが疑われるサンプルからポリヌクレオチドの集団を取得するための方法。
  40. サンプルが生物学的サンプル又は環境サンプルである、請求項39に記載の方法。
  41. 核酸がRNA及び/又はDNAである、請求項39又は40に記載の方法。
  42. RNAがインビトロ合成転写産物を含む、請求項41に記載の方法。
  43. 核酸が少なくとも1種の病原体に由来する、請求項39から42のいずれか一項に記載の方法。
  44. 少なくとも1種の病原体が、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである、請求項43に記載の方法。
  45. 少なくとも1種の病原体が真菌である、請求項44に記載の方法。
  46. 少なくとも1種の病原体が細菌である、請求項44に記載の方法。
  47. 少なくとも1種の病原体が寄生生物である、請求項44に記載の方法。
  48. 少なくとも1種の病原体がウイルスである、請求項44に記載の方法。
  49. ウイルスがSARS-CoV-2である、請求項48に記載の方法。
  50. 少なくとも標的核酸を増幅するための増幅反応及び得られる増幅生成物の少なくとも1種の標的の検出を更に含む、請求項39から49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 4℃～40℃の範囲の温度で、サンプルを請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物と接触させるステップを含む、サンプル中のポリヌクレオチドの集団の完全性を保存するための方法。
  52. 水性組成物と接触させた後のサンプルが、少なくとも1時間から最大6か月間、最大9か月間、最大12か月間、又は最大26か月間にわたって、-25℃～40℃の範囲の温度で保管される、請求項51に記載の方法。
  53. 水性組成物と接触させた後のサンプルが、-20℃、4℃、RT又は30℃で保管される、請求項51に記載の方法。
  54. サンプルが、生物学的サンプル又は環境サンプルである、請求項51から53のいずれか一項に記載の方法。
  55. ポリヌクレオチドの集団がRNA及び/又はDNAの集団である、請求項51から54のいずれか一項に記載の方法。
  56. RNAがインビトロ合成転写産物を含む、請求項55に記載の方法。
  57. ポリヌクレオチドの集団が少なくとも1種の病原体に由来する、請求項51から56のいずれか一項に記載の方法。
  58. 少なくとも1種の病原体が、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである、請求項57に記載の方法。
  59. 少なくとも1種の病原体が真菌である、請求項58に記載の方法。
  60. 少なくとも1種の病原体が細菌である、請求項58に記載の方法。
  61. 少なくとも1種の病原体が寄生生物である、請求項58に記載の方法。
  62. 少なくとも1種の病原体がウイルスである、請求項58に記載の方法。
  63. ウイルスがSARS-CoV-2である、請求項62に記載の方法。
  64. サンプルを請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物と接触させるステップを含む、少なくとも1種の病原体を含むサンプルを不活性化するための方法であって、水性組成物が、得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)に相当する、方法。
  65. サンプルが、4℃、RT又は30℃で水性組成物と接触させられる、請求項64に記載の方法。
  66. サンプルが、生物学的サンプル又は環境サンプルである、請求項64又は65に記載の方法。
  67. 少なくとも1種の病原体が、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである、請求項64から66のいずれか一項に記載の方法。
  68. 少なくとも1種の病原体が真菌である、請求項67に記載の方法。
  69. 少なくとも1種の病原体が細菌である、請求項67に記載の方法。
  70. 少なくとも1種の病原体が寄生生物である、請求項67に記載の方法。
  71. 少なくとも1種の病原体がウイルスである、請求項67に記載の方法。
  72. ウイルスがSARS-CoV-2である、請求項71に記載の方法。
  73. サンプルを請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物と接触させるステップを含む、サンプルを採取するための方法であって、水性組成物が、得られる混合物のうちの少なくとも30%(v/v)に相当する、方法。
  74. サンプルが、生物学的サンプル又は環境サンプルである、請求項73に記載の方法。
  75. サンプルが、請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物を含む採取デバイス又は採取容器へと直接導入される、請求項73又は74に記載の方法。
  76. サンプルが、スワブを用い、且つそれを請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物を含む採取デバイス又は採取容器へと導入して採取される、請求項73又は74に記載の方法。
  77. スワブが、採取デバイス又は採取容器に対してこすり付けた後に廃棄される、請求項76に記載の方法。
  78. サンプルが少なくとも1種の病原体を含む、請求項73から77のいずれか一項に記載の方法。
  79. 少なくとも1種の病原体が、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである、請求項78に記載の方法。
  80. 少なくとも1種の病原体が真菌である、請求項79に記載の方法。
  81. 少なくとも1種の病原体が細菌である、請求項79に記載の方法。
  82. 少なくとも1種の病原体が寄生生物である、請求項79に記載の方法。
  83. 少なくとも1種の病原体がウイルスである、請求項79に記載の方法。
  84. ウイルスがSARS-CoV-2である、請求項83に記載の方法。
  85. 請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物を含む採取デバイス又は容器。
  86. 採取デバイス又は採取容器及び請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物を含むサンプル採取キット。
  87. スワブ、キュレット、又は培養ループを更に含む、請求項86に記載のサンプル採取キット。
  88. 標的核酸を含有することが疑われるサンプルを採取するための、請求項1から38のいずれか一項に記載の水性組成物の使用。
  89. サンプルが、生物学的サンプル又は環境サンプルである、請求項88に記載の使用。
  90. サンプルが少なくとも1種の病原体を含む、請求項88又は89に記載の使用。
  91. 少なくとも1種の病原体が、真菌、細菌、寄生生物又はウイルスである、請求項90に記載の使用。
  92. 少なくとも1種の病原体が真菌である、請求項91に記載の使用。
  93. 少なくとも1種の病原体が細菌である、請求項91に記載の使用。
  94. 少なくとも1種の病原体が寄生生物である、請求項91に記載の使用。
  95. 少なくとも1種の病原体がウイルスである、請求項91に記載の使用。
  96. ウイルスがSARS-CoV-2である、請求項95に記載の使用。
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