KR20230171989A - 생물학적 샘플을 저장하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 i) 약 1% 내지 20%(w/v) 양의 음이온성 세제, ii) 약 1% 내지 5%(w/v) 양의 I족 금속 수산화물, iii) 약 0.5% 내지 5%(w/v) 양의 킬레이트제 및 iv) 제1 완충제를 포함하는 제1 성분을 포함하고, 여기서 상기 조성물은 물, 제2 완충제, 수송 배지, 염화나트륨(aq) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 희석 성분을 추가로 포함하며, 상기 제1 성분은 희석 성분에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다.
Description
본 발명은 음이온성 세제, 킬레이트제, I족 금속 수산화물 및 완충제를 포함하는, 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 a) 샘플의 채취, b) 세포 잔사 및 외부 생체분자로부터 핵산을 유리시켜 c) 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 상기 샘플에 존재하는 기타 미생물의 불활성화를 초래하는, 바이러스, 세포 또는 조직의 용해 및 d) 뉴클레아제 활성에 의한 분해로부터 핵산의 보호 및 e) 후속 단리, 검출, 증폭 및/또는 분자 분석을 위한 핵산의 보존을 제공한다. 상기 5가지 기능은 단일 조성물을 사용하여 단일 반응 용기에서 달성될 수 있으며, 생성된 샘플은 샘플 내에 함유된 폴리뉴클레오티드의 현저한 분해 없이 실온에서 장기간 동안 저장될 수 있다.
현재의 COVID-19 팬데믹으로 인해 수많은 개체의 바이러스 병원체를 진단하기 위한 신속하고 안전한 프로토콜이 긴급히 필요해졌다. COVID-19는 포지티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스인 SARS-CoV-2에 의해 유발된다. 바이러스 및 기타 병원체에 의해 유발되는 이러한 질환과 다른 흔한 질환의 진단은 병원체의 핵산 분석에 기반한다. 실시간 PCR, 전사 매개 증폭(TMA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 마이크로어레이, 차세대 시퀀싱(NSG) 및 병원체 유전자 칩과 같은 핵산 기반 검출 플랫폼의 개발은 임상 분자 진단 분야에서 급격하게 변화되었다. 그러나, 생물학적 샘플 중의 핵산은 실온에서 빠르게 분해 및/또는 변성되고, 진단 분석이 수행되어야 하는 경우에는 핵산을 안정적으로 유지하는 능력이 종종 핵산이 성공적으로 분석될 수 있는지 여부를 결정한다. 이는 다운스트림 분석을 위한 원하는 핵산이, 특히 예를 들어 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 활성에 의한 분해에 취약한 리보핵산(RNA)을 포함하는 경우에 더욱 중요하다.
생물학적 표본을 이용하여 작업할 경우 또 다른 중요한 우려사항은 살아있는 감염성 병원체 또는 생물학적 제제(biological agent)가 표본으로부터 환경으로 접종, 방출 또는 전파될 수 있는 가능성이다. 샘플이 테스트를 위한 이의 완전성을 보존하기 위해 생존 가능하고/하거나 생물학적으로 온전한 상태로 유지되는 경우, 채취, 운송 및 테스트 과정에 관여하는 개체는 잠재적으로 매우 위험한 전염에 노출될 수 있다. 그 결과, 필요한 안전 조치는 전형적으로 이러한 샘플을 한 위치에서 다른 위치로 이동시키고 분석을 완료하는 데 필요한 비용 및 노력을 증가시킨다.
따라서, 작업자에게 위험을 초래하지 않으면서, 전형적으로 추가 분자 분석 또는 진단 테스트를 위한 위험한 생물학적 표본의 핵산 완전성을 보존하는 안전한 채취, 운송 및 저장 조성물이 요구된다.
바이러스 또는 박테리아 감염이 의심되는 개체로부터의 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 취급하기 위한 현행 프로토콜은 진단 또는 분자 생물학 테스트가 수행될 때까지 샘플을 채취하고 핵산을 보존할 수 있도록 하는 채취 배지(collecting medium)의 사용을 포함한다.
SARS-CoV-2 및 기타 호흡기 바이러스를 검출하기 위해, 생물학적 샘플의 채취는 일반적으로 스왑(swab)을 사용하여 수행되고, 상기 스왑은 그 후에 바이러스 수송 배지(Viral Transport Medium: VTM)라 불리는 채취 배지를 함유하는 튜브에 도입된다. VTM은 전형적으로 오염 박테리아 및 진균의 성장을 억제하기 위해 완충된 단백질(혈청, 알부민 또는 젤라틴) 및 항생제를 함유한다. 예를 들어, CDC는 행크스 균형 염 용액(Hanks Balanced Salt Solution), 소 태아 혈청(FBS), 겐타마이신 및 암포테리신 B를 함유하는 SARS-CoV-2용 바이러스 수송 배지(질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention) SOP#: DSR-052-05)를 권장하였다.
상업적으로 준비된 VTM은 나사 캡 플라스틱 튜브에서 이용 가능하다. 비강, 비인두 또는 구인두 스왑을 분자 테스트가 수행될 때까지 VTM 용액을 함유하는 튜브에 직접 도입한다. 그 다음, 튜브를 와동시키고 샘플을 추출 완충제를 함유하는 보조 튜브로 이전한다. 상기 추출 완충제는 일반적으로 바이러스를 불활성화하고 세포를 용해시켜 세포 잔사 및 기타 생체분자로부터 핵산을 유리시키고 엔도뉴클레아제 활성에 의한 분해로부터 핵산을 보호하는 데 필요한 시약을 함유한다. 상기 이전은 바이러스 확산을 피하기 위해 안전 캐비닛 하에 수행되어야 하는데, 이는 분자 테스트 전 단계를 증가시키고 샘플 준비 속도를 늦춘다. 따라서, 현재 이용 가능한 샘플 채취 및 처리를 위한 프로토콜은 팬데믹 시나리오뿐만 아니라, 대량의 샘플이 신속하게 채취되고 처리되어야 하는 다른 상황의 요구 사항을 충족하기에 불충분한 것으로 입증되었다.
게다가, 추출 완충제는 종종 거대분자의 변성제 역할을 하여 바이러스를 불활성화하는, 구아니딘 티오시아네이트와 같은 유해한 카오트로픽제를 함유한다. 구아니딘 티오시아네이트는 RNAse를 불활성화하여 샘플 중의 RNA 분자의 분해를 감소시킴으로써 핵산의 완전성을 보존할 수 있으며, 이는 RNA 완전성이 필수적인 분자 진단 방법론에 적용하는 데 있어 중요한 것이다. 그러나, 상기 카오트로픽제는 피부와 접촉하면 유해하고 차아염소산나트륨과 같이 테스트 장치에서 흔히 사용되는 다른 시약과 추가로 상호작용하여 독성 가스를 생성할 수 있다.
따라서, 병원체를 함유하는 것으로 의심되는 다수의 표본을 신속하게 채취하고 보존하는 것이 필요할 때, 병원체가 확산될 위험을 감소시키면서 프로토콜의 단계 수를 감소시키는 것이 매우 중요하다.
본 발명의 발명자들은 추가 분자 테스트를 위한 핵산을 보존하면서 샘플에 존재하는 임의의 병원체를 놀랍게도 불활성화하는 새로운 조성물을 개발하였다. 또한, 상기 조성물은, 조성물 자체가 바이러스와 세포를 용해시키고 핵산 보존을 위해 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제를 불활성화할 수 있기 때문에, 제2 조성물 또는 완충제로의 이전을 필요로 하지 않으면서 샘플을 채취하기 위해 직접 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 핵산 기반 검출 플랫폼, 특히 차아염소산나트륨과 같은 통상적으로 사용되는 멸균제와 양립 가능하며, 샘플 조작과 관련된 건강 위험을 감소시킨다.
본 발명은 또한 하나 이상의 생물학적 공급원으로부터 핵산을 준비하기 위한 종래의 채취, 용해, 불활성화, 저장 및 보존 방법을 유리하게 개선할 수 있는 상기 조성물의 사용 방법을 포함한다.
본 발명은 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 i) 약 1% 내지 20%(w/v) 양의 음이온성 세제, ii) 약 1% 내지 5%(w/v) 양의 I족 금속 수산화물, iii) 약 0.5% 내지 5%(w/v) 양의 킬레이트제, 및 iv) 제1 완충제를 포함하는 제1 성분을 포함하고, 여기서 상기 조성물은 물, 제2 완충제, 수송 배지, 염화나트륨(aq) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 희석 성분을 추가로 포함하며, 상기 제1 성분은 희석 성분에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 약 1% 내지 20%(w/v) 양의 음이온성 세제, 약 1% 내지 5%(w/v) 양의 I족 금속 수산화물, 약 0.5% 내지 5%(w/v) 양의 킬레이트제, 및 제1 완충제를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 물, 제2 완충제, 수송 배지 및 염화나트륨(aq), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 희석 성분에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다.
일부 실시양태에서, 희석 성분은 염화나트륨(aq)이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 염화나트륨(aq)은 0.9%(w/v) 염화나트륨이다.
일부 실시양태에서, 음이온성 세제는 C5-C20 알킬 설페이트 음이온, C5-C20 알케닐 설페이트 음이온, C5-C20 알키닐 설페이트 음이온, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 세제는 라우릴 설페이트 음이온을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 완충제는 Tris, MES, Bis-Tris, HEPES, MOPS, 시트레이트, 중탄산나트륨, 인산나트륨 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제1 완충제는 HEPES를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 완충제는 약 5% 내지 30%(w/v)의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 pH를 5 내지 10으로 유지하기에 충분한 양으로 존재한다.
일부 실시양태에서, I족 금속 수산화물은 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, I족 금속 수산화물은 수산화리튬을 포함한다.
일부 실시양태에서, 킬레이트제는 EGTA, HEDTA, DTPA, NTA, EDTA, 석신산, 무수 시트레이트, 나트륨 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 칼륨 시트레이트, 마그네슘 시트레이트, 제2철 암모늄 시트레이트, 리튬 시트레이트, 또는 이들의 조합로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 킬레이트제는 석신산, EGTA, EDTA 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 수성 조성물의 일부 실시양태에서, 제1 완충제는 약 10% 내지 25%(w/v)의 양으로 존재하고, 세제는 약 2% 내지 15%(w/v)의 양으로 존재하고, 킬레이트제는 약 1% 내지 4%(w/v)의 양으로 존재하고, 수산화물은 약 1% 내지 4%(w/v)의 양으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 수성 조성물의 pH는 5 내지 10이다. 일부 실시양태에서, 수성 조성물의 pH는 6 내지 9이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 수성 조성물은 약 50 μl/L 내지 750 μl/L 양의 소포제를 추가로 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 소포제는 실리콘 중합체, 폴리소르베이트, 유기 폴리에테르 분산액 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 수성 조성물은 RNA, DNA, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 집단을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA는 시험관내 합성된 전사체를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 i) 약 1% 내지 20%(w/v) 양의 음이온성 세제, ii) 약 1% 내지 5%(w/v) 양의 I족 금속 수산화물, iii) 약 0.5% 내지 5%(w/v) 양의 킬레이트제, 및 iv) 제1 완충제를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 약 50 μl/L 내지 750 μl/L의 양의 소포제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 소포제는 실리콘 중합체, 폴리소르베이트, 유기 폴리에테르 분산액, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 음이온성 세제는 C5-C20 알킬 설페이트 음이온, C5-C20 알케닐 설페이트 음이온, C5-C20 알키닐 설페이트 음이온, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서 세제는 라우릴 설페이트 음이온을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 완충제는 Tris, MES, Bis-Tris, HEPES, MOPS, 시트레이트, 중탄산나트륨, 인산나트륨 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제1 완충제는 HEPES를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 완충제는 약 5% 내지 30%(w/v)의 양으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 제1 완충제는 pH를 5 내지 10으로 유지하기에 충분한 양으로 존재한다.
일부 실시양태에서, I족 금속 수산화물은 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, I족 금속 수산화물은 수산화리튬을 포함한다.
일부 실시양태에서, 킬레이트제는 EGTA, HEDTA, DTPA, NTA, EDTA, 석신산, 무수 시트레이트, 나트륨 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 칼륨 시트레이트, 마그네슘 시트레이트, 제2철 암모늄 시트레이트, 리튬 시트레이트, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 킬레이트제는 석신산, EGTA, EDTA 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 완충제는 약 10% 내지 25%(w/v)의 양으로 존재하고, 음이온성 세제는 약 2% 내지 15%(w/v)의 양으로 존재하며, 킬레이트제는 약 1% 내지 4%(w/v)의 양으로 존재하고, I족 금속 수산화물은 약 1% 내지 4%(w/v)의 양으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 수성 조성물의 pH는 5 내지 10이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 수성 조성물의 pH는 6 내지 9이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 물, 제2 완충제, 수송 배지, 염화나트륨(aq) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 조성물은 염화나트륨(aq)으로 희석된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 RNA, DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 집단을 추가로 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, RNA는 시험관내 합성된 전사체를 포함한다.
본 발명은 또한 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 샘플로부터 폴리뉴클레오티드 집단을 얻는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 샘플을 2℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 본 발명의 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA 및/또는 DNA이다. 일부 바람직한 실시양태에서, RNA는 시험관내 합성된 전사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 적어도 하나의 병원체로부터 유래된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
일부 실시양태에서, 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 샘플로부터 폴리뉴클레오티드 집단을 얻는 방법은 적어도 표적 핵산을 증폭시키는 증폭 반응 및 생성된 증폭 산물 중 적어도 하나의 표적의 검출을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 샘플을 4℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 중의 폴리뉴클레오티드 집단의 완전성을 보존하는 방법에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 샘플은, 본 발명의 수성 조성물과 접촉된 후, -25℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 적어도 1시간 내지 최대 6개월, 최대 9개월, 최대 12개월 또는 최대 26개월 동안 저장된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 샘플은 수성 조성물과 접촉된 후 -20℃, 4℃, RT 또는 30℃에서 저장된다.
일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 집단은 RNA 및/또는 DNA 집단이다. 일부 바람직한 실시양태에서, RNA는 시험관내 합성된 전사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 집단은 적어도 하나의 병원체로부터 유래된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 병원체를 포함하는 샘플을 불활성화하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 샘플을 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 수성 조성물은 생성된 혼합물의 적어도 30%(v/v)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 샘플은 4℃, RT 또는 30℃에서 수성 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
본 발명은 또한 샘플을 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 샘플의 채취 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 수성 조성물은 생성된 혼합물의 적어도 30%(v/v)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플이다.
일부 실시양태에서, 샘플은 본 발명에 따른 수성 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 채취 용기에 직접 도입된다.
다른 실시양태에서, 샘플은 스왑을 사용하고 이를 본 발명에 따른 수성 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 채취 용기에 도입함으로써 채취된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 스왑은 이를 채취 장치 또는 채취 용기에 문지른 후 폐기된다.
일부 실시양태에서, 샘플은 적어도 하나의 병원체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 수성 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 용기에 관한 것이다.
본 발명은 또한 채취 장치 또는 채취 용기 및 본 발명에 따른 수성 조성물을 포함하는 샘플 채취 키트에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플 채취 키트는 스왑, 큐렛 또는 배양 루프를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 표적 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 채취하기 위한 본 발명에 따른 수성 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 적어도 하나의 병원체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
도 1은 크리스탈 바이올렛으로 염색된, SARS-CoV-2 감염된 및 감염되지 않은 Vero 세포를 갖는 96웰 플레이트의 사진을 도시한다.
도 2 내지 5는 4℃ 또는 30℃에서 최대 6개월 동안 저장된 양성 SeraCare 및 BEI 샘플의 안정성을 도시한다. 도 2는 반응성의 %를 도시하고; 도 3은 분석물 RLU 값 대 시간을 도시하고; 도 4는 내부 대조군(IC) RLU 값 대 시간을 도시하고, 도 5는 분석물-S/CO RLU 값 대 시간을 도시한다.
도 6은 5℃에서 최대 12개월 동안 저장된 바베시아(Babesia) IVT 샘플(500 c/mL)의 안정성을 도시한다.
도 7a 및 7b는 -20℃에서 최대 26개월 동안 저장된 바베시아 IVT 샘플(100, 30 및 500 c/mL)의 안정성을 도시한다.
도 2 내지 5는 4℃ 또는 30℃에서 최대 6개월 동안 저장된 양성 SeraCare 및 BEI 샘플의 안정성을 도시한다. 도 2는 반응성의 %를 도시하고; 도 3은 분석물 RLU 값 대 시간을 도시하고; 도 4는 내부 대조군(IC) RLU 값 대 시간을 도시하고, 도 5는 분석물-S/CO RLU 값 대 시간을 도시한다.
도 6은 5℃에서 최대 12개월 동안 저장된 바베시아(Babesia) IVT 샘플(500 c/mL)의 안정성을 도시한다.
도 7a 및 7b는 -20℃에서 최대 26개월 동안 저장된 바베시아 IVT 샘플(100, 30 및 500 c/mL)의 안정성을 도시한다.
본 발명과 관련하여 본원에서 사용될 때 용어 "포함하다/포함하는" 및 용어 "갖는/포함되는"은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 지정하는 데 사용되지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 이들의 그룹의 존재 또는 첨가를 배제하지 않는다.
당업자는 본원에 개시된 구체적 실시양태가 단독으로 판독되어서는 안 되며, 본 명세서는 개시된 실시양태가 개별적으로가 아니라 서로 함께 판독되도록 의도된다는 점을 이해해야 한다. 이와 같이, 각 실시양태는 본원에 개시된 다른 실시양태를 수정하거나 제한하기 위한 기초로서 역할을 할 수 있다.
농도, 양 및 기타 수치 데이터는 본원에서 범위 형식으로 표현되거나 제시될 수 있다. 이러한 범위 형식은 단지 편의성 및 간결성을 위해 사용된 것이므로 범위의 한계로서 명시적으로 언급된 수치 값을 포함할뿐만 아니라, 각 수치 값 및 하위범위가 명시적으로 언급된 것처럼 해당 범위 내에 포함되는 모든 개별 수치 값 또는 하위범위를 포함하도록 유연하게 해석되어야 한다는 것을 이해해야 한다. 예로서, "10 내지 100"의 수치 범위는 10 내지 100의 명시적으로 언급된 값을 포함할뿐만 아니라, 표시된 범위 내의 개별 값 및 하위범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이러한 수치 범위에는 10, 11, 12, 13...97, 98, 99, 100과 같은 개별 값 및 10 내지 40, 25 내지 40, 및 50 내지 60 등과 같은 하위범위가 포함된다. 이러한 동일한 원칙은 "적어도 10"과 같은 하나의 숫자 값만을 언급하는 범위에도 적용된다. 또한, 이러한 해석은 범위의 폭 또는 설명되는 특성에 관계없이 적용되어야 한다.
본 발명의 조성물
제1 양상에서, 본 발명은 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은:
i) 약 1% 내지 20%(w/v) 양의 음이온성 세제, ii) 약 1% 내지 5%(w/v) 양의 I족 금속 수산화물, iii) 약 0.5% 내지 5%(w/v) 양의 킬레이트제, 및 iv) 제1 완충제를 포함하는 제1 성분을 포함하고, 여기서 상기 조성물은 물, 제2 완충제, 수송 배지, 염화나트륨(aq) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 희석 성분을 추가로 포함하고, 상기 제1 성분은 희석 성분에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다.
제2 양상에서, 본 발명은 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 i) 약 1% 내지 20%(w/v) 양의 음이온성 세제, ii) 약 1% 내지 5%(w/v) 양의 I족 금속 수산화물, iii) 약 0.5% 내지 5%(w/v) 양의 킬레이트제, 및 iv) 제1 완충제를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 약 50 μl/L 내지 750 μl/L의 양의 소포제를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 약 1% 내지 20%(w/v) 양의 음이온성 세제, 약 1% 내지 5%(w/v) 양의 I족 금속 수산화물, 약 0.5% 내지 5%(w/v) 양의 킬레이트제, 및 제1 완충제를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 물, 제2 완충제, 수송 배지 및 염화나트륨(aq), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 희석 성분에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 염화나트륨(aq)은 0.9%(w/v) 염화나트륨이다.
일부 실시양태에서, 음이온성 세제는 C5-C20 알킬 설페이트 음이온, C5-C20 알케닐 설페이트 음이온, C5-C20 알키닐 설페이트 음이온, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서 세제는 라우릴 설페이트 음이온을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세제는 리튬 라우릴 설페이트(LLS) 또는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세제는 LLS를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 수성 조성물 중 음이온성 세제의 양은 약 1% 내지 20%(w/v), 약 2% 내지 20%(w/v), 약 3% 내지 20%(w/v)이다. %(w/v), 약 5% 내지 20%(w/v), 약 7% 내지 20%(w/v), 약 9% 내지 20%(w/v), 약 10% % 내지 20%(w/v), 약 15% 내지 20%(w/v), 약 1% 내지 15%(w/v), 약 1% 내지 12%(w/v), 약 1% 내지 10%(w/v), 약 1% 내지 9%(w/v), 약 1% 내지 7%(w/v) 또는 약 1% 내지 5%(w/v)이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 음이온성 세제의 양은 약 2% 내지 15%(w/v), 약 3% 내지 12%(w/v), 약 5% 내지 10%(w/v) 또는 약 7% 내지 9%(w/v)이다.
본원에서 사용된 용어 "완충제"는 용액의 pH를 유지하는 데 사용되는 약산 또는 약염기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 1,3-비스(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판(Bis-Tris), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), 시트레이트, 중탄산나트륨, 인산나트륨, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 완충제는 HEPES를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 수성 조성물 중의 완충제의 양은 5% 내지 30%(w/v), 5% 내지 25%(w/v), 5% 내지 20%(w/v), 5% 내지 15%(w/v), 약 5% 내지 10%(w/v), 약 10% 내지 30%(w/v), 약 15% 내지 30%(w/v) 또는 약 20% 내지 30%(w/v)이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 완충제의 양은 약 10% 내지 25%(w/v), 약 10% 내지 22%(w/v), 약 12% 내지 20%(w/v)이다( w/v) 또는 약 15% 내지 18%(w/v)이다.
일부 실시양태에서, 완충제는 pH를 5 내지 10으로 유지하기에 충분한 양으로 본 발명의 수성 조성물에 존재한다. 보다 바람직하게는, pH는 6 내지 9, 6.5 내지 8.5, 7 내지 8, 7.2 내지 7.8이다. 다른 실시양태에서, pH는 6 내지 10, 7 내지 10 또는 7.5 내지 10이다. 다른 실시양태에서, pH는 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7.8, 5 내지 7.5, 또는 5 내지 7.2이다.
일부 실시양태에서, I족 금속 수산화물은 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 보다 바람직한 실시양태에서, I족 금속 수산화물은 수산화리튬이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중의 I족 금속 수산화물의 양은 약 1% 내지 5%(w/v), 약 1% 내지 4.5%(w/v), 약 1% 내지 4%(w/v)이다. %(w/v), 약 1% 내지 3.5%(w/v), 약 1% 내지 3%(w/v), 약 1% 내지 2.5%(w/v), 약 1.5% 약 2% 내지 5%(w/v), 약 2% 내지 5%(w/v), 약 2.5% 내지 5%(w/v), 약 3% 내지 5%(w/v) 또는 약 3.5% 내지 5%(w/v)이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 염기의 양은 약 1.5% 내지 4.5%(w/v), 약 2% 내지 4%(w/v), 약 2.5% 내지 3.5%(w/v) 또는 약 2.5% 내지 3%(w/v)이다.
본원에서 사용된 용어 "킬레이트제"는 금속 이온과 반응하여 킬레이트라 불리는 복잡한 고리 유사 구조를 형성하는 화학적 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 킬레이트제는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), N,N-비스(카르복시메틸)글리신(NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 석신산, 무수 시트레이트, 나트륨 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 칼륨 시트레이트, 마그네슘 시트레이트, 제2철 암모늄 시트레이트, 리튬 시트레이트 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 킬레이트제는 석신산, EGTA, EDTA 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 킬레이트제는 석신산이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중의 킬레이트제의 양은 약 0.5% 내지 5%(w/v), 약 0.5% 내지 4.5%(w/v), 약 0.5% 내지 4%(w/v), 약 0.5% 내지 3.5%(w/v), 약 0.5% 내지 3%(w/v), 약 0.5% 내지 2.5%(w/v), 약 0.5 % 내지 2%(w/v), 약 0.5% 내지 1.5%(w/v), 약 1% 내지 5%(w/v), 약 1.5% 내지 5%(w/v), 약 2% 내지 5%(w/v), 약 2.5% 내지 5%(w/v), 약 3% 내지 5%(w/v), 약 3.5% 내지 5%(w/v) 또는 약 4% 내지 5%(w/v)이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중의 킬레이트제의 양은 약 1% 내지 4%(w/v), 약 1.5% 내지 4%(w/v), 약 2% 내지 3%(w/v) 또는 약 2.5% 내지 3%(w/v)이다.
본 발명의 수성 조성물의 일부 실시양태에서, 완충제는 약 10% 내지 25%(w/v)의 양으로 존재하고, 음이온성 세제는 약 2% 내지 15%(w/v)의 양으로 존재하고, 킬레이트제는 약 1% 내지 4%(w/v)의 양으로 존재하고, I족 금속 수산화물은 약 1% 내지 4%(w/v)의 양으로 존재한다.
본 발명의 수성 조성물의 일부 실시양태에서, 완충제는 약 15% 내지 20%(w/v)의 양으로 존재하고, 음이온성 세제는 약 5% 내지 10%(w/v)의 양으로 존재하고, 킬레이트제는 약 2% 내지 3%(w/v)의 양으로 존재하고, I족 금속 수산화물은 약 2% 내지 3%(w/v)의 양으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 수성 조성물은 5 내지 10의 pH를 갖는다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 수성 조성물의 pH는 6 내지 9, 6.5 내지 8.5, 7 내지 8, 7.2 내지 7.8이다. 다른 실시양태에서, pH는 6 내지 10, 7 내지 10 또는 7.5 내지 10이다. 다른 실시양태에서, pH는 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7.8, 5 내지 7.5 , 또는 5 내지 7.2이다.
본원에서 사용된 용어 "소포제" 또는 "항기포제"는 액체 조성물에서 기포의 형성을 감소시키고 방해하는 화학적 첨가제를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 상기 소포제는 전형적으로 제형 중의 세제의 존재로 인해 초래되는 거품의 형성을 방지하고 개시된 조성물의 피펫팅 및 취급을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 소포제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 소포제의 양은 50 μl/L 내지 750 μl/L, 50 μl/L 내지 600 μl/L, 50 μl/L 내지 500 μl/L, 50 μl/L 내지 400 μl/L, 50 μl/L 내지 300 μl/L, 50 μl/L 내지 250 μl/L, 50 μl/L 내지 200 μl/L, 50 μl/L 내지 150 μl/L, 75 μl/L 내지 750 μl/L, 100 μl/L 내지 750 μl/L, 150 μl/L 내지 750 μl/L, 200 μl/L 내지 750 μl/L, 250 μl/L 내지 750 μl/L, 300 μl/L 내지 750 μl/L 또는 500 μl/L 내지 750 μl/L이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 소포제의 양은 75 μl/L 내지 600 μl/L, 100 μl/L 내지 500 μl/L, 150 μl/L 내지 400 μl/L, 또는 200 μl/L 내지 300 μl/L이다. 본 발명을 위한 예시적인 소포제는, 비제한적으로, 코코아미도프로필 하이드록시설타인, 알킬아미노프로피온산, 이미다졸린 카르복실레이트, 베타인, 설포베타인, 설타인, 알킬페놀 에톡실레이트, 알코올 에톡실레이트, 폴리옥시에틸렌화 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 머캅탄, 장쇄 카르복실산 에스테르, 알코놀아미드, 3급 아세틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 실리콘, N-알킬피롤리돈, 알킬폴리글리코시다제, 실리콘 중합체, 폴리소르베이트, 유기 폴리에테르 분산액, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 소포제는 실리콘 중합체, 폴리소르베이트, 유기 폴리에테르 분산액 또는 이들의 조합을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 소포제는 실리콘 중합체를 포함한다. 보다 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 실리콘 중합체는 3차원 실록산이다. 보다 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 소포제는 Foam Ban® MS-575를 포함한다.
예를 들어, 거품이 샘플에 존재하는 경우에 오류가 발생하기 쉬운 플랫폼에서 샘플이 분석될 때 소포제가 수성 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 물, 완충제, 수송 배지 및 염화나트륨(aq), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다.
일부 실시양태에서, 수성 조성물은 물에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다. 일부 실시양태에서, 수성 조성물은 최대 약 30%(v/v), 최대 약 40%(v/v), 최대 약 45%(v/v), 최대 약 55%(v/v), 최대 약 60%(v/v), 최대 약 75%(v/v), 최대 약 80%(v/v) 또는 최대 약 80%(v/v)까지 희석된다.
본원에 사용된 용어 "수송 배지"는 생물학적 표본의 수송을 위한, 미생물 성장을 피하기 위해 보호 단백질과 항미생물제를 포함하는 임의의 용액을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 수성 조성물은 수송 배지로 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다. 일부 실시양태에서, 수성 조성물은 최대 약 30%(v/v), 최대 약 40%(v/v), 최대 약 45%(v/v), 최대 약 55%(v/v), 최대 약 60%(v/v), 최대 약 75%(v/v), 최대 약 80%(v/v) 또는 최대 약 80%(v/v)까지 희석된다.
일부 실시양태에서, 수성 조성물은 염화나트륨(aq)에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 염화나트륨(aq)은 0.9%(w/v) 염화나트륨이다. 일부 실시양태에서, 수성 조성물은 최대 약 30%(v/v), 최대 약 40%(v/v), 최대 약 45%(v/v), 최대 약 55%(v/v), 최대 약 60%(v/v), 최대 약 75%(v/v), 최대 약 80%(v/v) 또는 최대 약 80%(v/v)까지 희석된다.
일부 실시양태에서, 수성 조성물은 물, 완충제, 수송 배지 및 0.9%(w/v) 염화나트륨의 임의의 조합에 의해 최대 약 50%(v/v)까지 희석된다. 일부 실시양태에서, 수성 조성물은 최대 약 30%(v/v), 최대 약 40%(v/v), 최대 약 45%(v/v), 최대 약 55%(v/v), 최대 약 60%(v/v), 최대 약 75%(v/v), 최대 약 80%(v/v) 또는 최대 약 80%(v/v)까지 희석된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 수성 조성물은 RNA, DNA 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 집단을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 시험관내 합성된 전사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 집단은 프라이머, 증폭 올리고머, 검출 올리고머, 프로브 보호 올리고머, 포획 프로브 올리고머, 또는 증폭 반응을 수행하여 표적 핵산을 증폭시키기 위해 및/또는 상기 표적 핵산을 검출하기 위해 필요한 임의의 기타 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 집단은 표적 핵산이다.
용어 "핵산"은 질소 헤테로사이클릭 염기 또는 염기 유사체를 갖는 2개 이상의 공유 결합된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 포함하고 뉴클레오시드가 포스포디에스테르 결합 또는 다른 연결에 의해 함께 연결되어 폴리뉴클레오티드를 형성하는 다량체 화합물을 지칭한다. 핵산에는 RNA, DNA 또는 키메라 DNA-RNA 중합체 또는 올리고뉴클레오티드 및 이들의 유사체가 포함된다.
"단리된"이란, 표적 핵산을 함유하는 샘플이 자연 환경으로부터 채취된다는 것을 의미하지만, 상기 용어는 임의의 정도의 정제도 내포하지 않는다.
본 발명의 방법
추가 양상에서, 본 발명은 핵산을 함유한 것으로 의심되는 샘플로부터 폴리뉴클레오티드 집단을 얻는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 샘플을 2℃ 내지 40℃℃ 범위의 온도에서 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉은 2℃ 내지 40℃ 범위의 온도, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 35℃ 범위의 온도, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉은 실온에서 수행된다. 본원에서 사용된 용어 "실온"(RT)은 일반적으로 15℃ 내지 30℃의 온도 범위를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 샘플은 바람직하게는 적어도 1분 동안, 적어도 2분 동안, 적어도 3분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안 또는 적어도 15분 동안 수성 조성물과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 샘플은 2℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 적어도 1분 동안 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉된다.
샘플은 단리된 샘플일 수 있다. 샘플에는 "생물학적 샘플", "환경 샘플", 및 생물학적 또는 환경 샘플 또는 병원체 핵산 또는 이의 성분을 함유하는 것으로 의심되는 기타 샘플과 접촉하는 샘플링 장치(예를 들어, 스왑)가 포함된다.
"생물학적 샘플"에는 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 말초 혈액, 적혈구, 림프절, 위장 조직, 대변, 뇌척수액(CSF), 정액, 가래, 타액 또는 기타 체액 또는 물질뿐만 아니라, 고형 조직이 포함된다. 생물학적 샘플에는 또한 세포(예컨대, 세포주, 단리된 세포가 조직으로부터 단리된 후 배양되는지 여부에 관계없이 조직으로부터 단리된 세포, 고정된 세포, 예컨대 조직학적 및/또는 면역조직화학적 분석을 위해 고정된 세포), 조직(예컨대, 생검 물질), 또는 상기도 조직(예컨대, 비인두 세척액, 비인두 흡인물, 비인두 스왑 및 구인두 스왑), 하기도 조직(예컨대, 기관지 세척액, 기관 흡인액, 흉막천자(pleural tap), 가래), 및 임의의 기관, 예컨대 비제한적으로 폐, 심장, 비장, 간, 뇌, 신장 및 부신의 조직으로부터 얻은 체액을 포함하여 포유동물로부터 얻은 체액이 포함된다. 세포 및/또는 조직으로부터 단리된 핵산(예를 들어, DNA 및 RNA) 등도 포함된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플에는 전방 비강 및 중비갑개 비강 스왑, 비인두(NP) 및 구인두(OP) 스왑, 비인두 세척액/흡인물 또는 비강 흡인물, 및 기관지 폐포 세척액(broncho alveolar lavage: BAL) 표본이 포함된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 표본은 COVID-19가 의심되는 개체로부터 얻어진다.
"환경 샘플"에는 표면 물질, 토양, 물, 산업 자재와 같은 환경 물질뿐만 아니라 식품 및 유제품 가공 기기, 기구, 장비, 일회용품 및 비일회용 품목으로부터 얻은 물질이 포함된다.
핵산을 함유하는 것으로 의심되는 샘플로부터 폴리뉴클레오티드 집단을 얻는 방법의 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 환경 샘플이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA 및/또는 DNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 시험관내 합성된 전사체를 포함한다.
용어 "샘플"은 핵산 또는 병원체 핵산의 단편과 같은 적어도 하나의 병원체 또는 이의 성분을 함유할 수 있거나 함유하는 것으로 의심되는 임의의 표본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 다른 실시양태에서, 상기 바이러스는 호흡기 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 호흡기 바이러스는 코로나비리다에(coronaviridae) 과로부터 유래된다. 보다 바람직한 실시양태에서 상기 바이러스는 SARS-CoV-2이다. 그 중에서도, HIV, HCV, HBV, HAV, HEV, 파보바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 우수투(Usutu), 치쿤구니아(Chikungunya), 뎅기(Dengue) 또는 지카(Zika)와 같은 다른 비호흡기 바이러스도 고려된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 따라서, 바베시아 또는 플라스모듐(Plasmodium)과 같은 다른 병원체도 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 핵산을 함유한 것으로 의심되는 샘플로부터 폴리뉴클레오티드 집단을 얻는 방법은 적어도 표적 핵산을 증폭시키는 증폭 반응을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생성된 증폭 산물로부터 적어도 표적을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 등온 증폭 반응이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 증폭 반응은 전사 매개 증폭이다.
본원에서 사용된 용어 "핵산 기반 검출" 또는 "핵산 테스트"는 표적 서열의 검출을 위한 분석을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상기 핵산 기반 검출 분석은 표적 서열을 다른 서열과 구별하여 표적 서열을 검출하는 것을 포함한다. 예를 들어, 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 시퀀싱하거나 이용함으로써. 특정 실시양태에서, 핵산 기반 검출 분석은 "증폭 기반 분석", 즉 핵산 표적 서열을 증폭시키기 위한 하나 이상의 단계를 이용하는 분석이다. 명확성을 위해, 증폭 기반 분석은 표적 서열을 증폭시키지 않는 하나 이상의 단계, 예를 들어 비증폭 기반 분석 방법(예를 들어, 혼성화 분석 또는 절단 기반 분석)에서 사용되는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 증폭 방법은, 예를 들어, 레플리카제 매개 증폭, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 정량적 PCR(qPCT), 실시간 PCR(rt-PCT), 리가제 연쇄 반응(LCR), 가닥 치환 증폭(strand-displacement amplification: SDA), 전사 매개 또는 전사 관련 증폭(TMA), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 및 폴리머라제 나선 반응(polymerase spiral reaction: PSR)을 포함한다. 이러한 증폭 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 본 개시내용의 방법에 따라 쉽게 사용된다. 당업자에게 공지된 다른 비표적 증폭 기술, 예컨대 전장 게놈 증폭(whole genome amplification: WGA)이라고도 불리는 가닥 치환 증폭도 본 발명의 취지 내에 있다. 다른 실시양태에서, 핵산 기반 검출 분석은 "비증폭 기반 분석", 즉 핵산 표적 서열을 증폭시키기 위한 임의의 단계에 의존하지 않는 분석이다.
본원에서 "전사 매개 증폭"(TMA)으로도 지칭되는 "전사 관련 증폭"은 RNA 폴리머라제를 사용하여 핵산 주형으로부터 다수의 RNA 전사체를 생성하는 핵산 증폭을 지칭하는 등온 증폭 반응이다. TMA는 일반적으로 RNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제, 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 프로모터 서열을 포함하고 임의로 하나 이상의 다른 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있는 주형 상보적 올리고뉴클레오티드를 사용한다.
추가 양상에서, 본 발명은 샘플을 4℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 중의 폴리뉴클레오티드 집단의 완전성을 보존하는 방법에 관한 것이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 샘플은 적어도 1분 동안, 적어도 2분 동안, 적어도 3분 동안, 적어도 5분 동안, 또는 적어도 10분 동안 수성 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 적어도 1일 동안, 적어도 2일 동안, 적어도 5일 동안, 적어도 7일 동안, 적어도 15일 동안, 적어도 30일 동안, 적어도 1개월 동안, 적어도 2개월 동안, 적어도 3개월 동안, 적어도 6개월 동안, 적어도 9개월 동안, 적어도 12개월 동안, 적어도 24개월 동안 또는 적어도 26개월 동안 수성 조성물과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 상기 접촉은 4℃ 내지 40℃ 범위의 온도, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 35℃ 범위의 온도, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉은 실온에서 수행된다. 본원에서 사용된 용어 "실온"은 일반적으로 15℃ 내지 30℃의 온도 범위를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 4℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 적어도 2분 동안 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉된다.
샘플 중의 폴리뉴클레오티드 집단의 완전성을 보존하기 위한 방법의 일부 실시양태에서, 샘플은 수성 조성물과 접촉된 후 -25℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 적어도 1시간 내지 최대 6개월, 최대 9개월, 최대 12개월 또는 최대 26개월 동안 저장된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 샘플은 수성 조성물과 접촉된 후 -20℃, 4℃, RT 또는 30℃에서 적어도 1시간 내지 최대 6개월, 최대 12개월, 최대 24개월 또는 최대 26개월 동안 저장된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 수성 조성물과 접촉된 후, 2℃ 내지 10℃ 범위의 온도에서 적어도 1시간 내지 최대 9개월 동안 저장된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 수성 조성물과 접촉된 후, -25℃ 내지 -5℃ 범위의 온도에서 적어도 1시간 내지 최대 26개월 동안 저장된다.
샘플 중의 폴리뉴클레오티드 집단의 완전성을 보존하기 위한 방법의 일부 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같은 생물학적 샘플이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전방 비강 및 중비갑개 비강 스왑, 비인두(NP) 및 구인두(OP) 스왑, 비인두 세척액/흡인물 또는 비강 흡인물, 및 기관지 폐포 세척액(BAL) 표본을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 표본은 COVID-19가 의심되는 개체로부터 얻어진다. 다른 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같은 환경 샘플이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 집단은 RNA 및/또는 DNA 집단이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 집단은 적어도 하나의 병원체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 다른 실시양태에서 상기 바이러스는 호흡기 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 호흡기 바이러스는 코로나비리다에 과로부터 유래된다. 보다 바람직한 실시형태에서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2이다. 그 중에서도, HIV, HCV, HBV, HAV, HEV, 파보바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 우수투, 치쿤구니아, 뎅기 또는 지카와 같은 다른 비호흡기 바이러스도 고려된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 따라서, 바베시아 또는 플라스모듐과 같은 다른 병원체도 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
추가 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 병원체를 포함하는 샘플을 불활성화하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 샘플을 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 수성 조성물은 생성된 조성물의 적어도 30%(v/v)를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 상기 수성 조성물은 생성된 혼합물의 적어도 2%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 5%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 10%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 20%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 30%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 35%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 40%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 50%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 60%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 70%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 80%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 85%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 90%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 95%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 98%(v/v), 보다 바람직하게는 생성된 혼합물의 적어도 99%(v/v)를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 샘플은 적어도 1분 동안, 적어도 2분 동안, 적어도 3분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 또는 적어도 30분 동안 수성 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉은 2℃ 내지 40℃ 범위의 온도, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 35℃ 범위의 온도, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉은 실온에서 수행된다. 본원에서 사용된 용어 "실온"은 일반적으로 15℃ 내지 30℃의 온도 범위를 지칭한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 샘플은 4℃, RT 또는 30℃에서 수성 조성물과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 샘플은 4℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 적어도 1분 동안 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉된다.
본 발명의 하나 이상의 병원체를 포함하는 샘플을 불활성화하는 방법의 일부 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같다. 일부 바람직한 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같은 생물학적 샘플이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전방 비강 및 중비갑개 비강 스왑, 비인두(NP) 및 구인두(OP) 스왑, 비인두 세척액/흡인물 또는 비강 흡인물, 및 기관지 폐포 세척액(BAL) 표본을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 표본은 COVID-19가 의심되는 개체로부터 얻어진다. 다른 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같은 환경 샘플이다.
일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 다른 실시양태에서 상기 바이러스는 호흡기 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 호흡기 바이러스는 코로나비리다에 과로부터 유래된다. 보다 바람직한 실시형태에서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2이다. 그 중에서도, HIV, HCV, HBV, HAV, HEV, 파보바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 우수투, 치쿤구니아, 뎅기 또는 지카와 같은 다른 비호흡기 바이러스도 고려된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 따라서, 바베시아 또는 플라스모듐과 같은 다른 병원체도 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
추가 양상에서, 본 발명은 샘플을 본 발명에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플의 채취 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 수성 조성물은 생성된 혼합물의 적어도 30%(v/v)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 수성 조성물은 샘플을 수성 조성물과 접촉시킴으로써 생성된 혼합물의 적어도 30%(v/v)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 수성 조성물은 생성된 혼합물의 적어도 2%(v/v), 생성된 혼합물의 적어도 5%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 10%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 20%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 30%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 35%(v/v), 또는 적어도 생성된 혼합물의 40%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 50%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 60%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 70%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 80%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 85%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 90%(v/v) 혼합물, 또는 생성된 혼합물의 적어도 95%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 98%(v/v), 또는 생성된 혼합물의 적어도 99%(v/v)를 나타낸다.
샘플과 수성 조성물의 접촉은 2℃ 내지 40℃, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 적어도 1분 동안, 적어도 2분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 또는 적어도 15분 동안 수행될 수 있다
본 발명의 샘플을 채취하는 방법의 일부 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같은 샘플이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같은 생물학적 샘플이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전방 비강 및 중비갑개 비강 스왑, 비인두(NP) 및 구인두(OP) 스왑, 비인두 세척액/흡인물 또는 비강 흡인물, 및 기관지 폐포 세척액(BAL) 표본을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 표본은 COVID-19가 의심되는 개체로부터 얻어진다. 다른 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같은 환경 샘플이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 샘플은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 채취 용기 내로 직접 도입된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 샘플은 스왑을 사용하고 이를 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 채취 용기 내로 도입함으로써 채취된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 스왑은 이를 채취 장치 또는 채취 용기에 문지른 후 폐기된다.
일부 실시양태에서, 샘플은 적어도 하나의 병원체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 다른 실시양태에서, 상기 바이러스는 호흡기 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 호흡기 바이러스는 코로나비리다에 과로부터 유래된다. 보다 바람직한 실시형태에서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2이다. 그 중에서도, HIV, HCV, HBV, HAV, HEV, 파보바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 우수투, 치쿤구니아, 뎅기 또는 지카와 같은 다른 비호흡기 바이러스도 고려된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 따라서, 바베시아 또는 플라스모듐과 같은 다른 병원체도 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
추가 양상에서, 본 발명은 또한 본원에 설명된 수성 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 용기에 관한 것이다. 본 발명은 또한 채취 장치 또는 채취 용기 및 본원에 설명된 수성 조성물을 포함하는 샘플 채취 키트에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플 채취 키트는 스왑, 큐렛 또는 배양 루프를 추가로 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 샘플 채취 키트는 채취 장치 또는 채취 용기, 본원에 설명된 수성 조성물 및 스왑을 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 표적 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 채취하기 위한 본원에 설명된 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같다. 일부 바람직한 실시양태에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같은 생물학적 샘플이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전방 비강 및 중비갑개 비강 스왑, 비인두(NP) 및 구인두(OP) 스왑, 비인두 세척액/흡인물 또는 비강 흡인물, 및 기관지 폐포 세척액(BAL) 표본을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 표본은 COVID-19가 의심되는 개체로부터 얻어진다.
일부 실시양태에서, 샘플은 적어도 하나의 병원체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 병원체는 바이러스이다. 다른 실시양태에서, 상기 바이러스는 호흡기 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 상기 호흡기 바이러스는 코로나비리다에 과로부터 유래된다. 보다 바람직한 실시형태에서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2이다. 그 중에서도, HIV, HCV, HBV, HAV, HEV, 파보바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 우수투, 치쿤구니아, 뎅기 또는 지카와 같은 다른 비호흡기 바이러스도 고려된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 진균이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 병원체는 기생충이다. 따라서, 바베시아 또는 플라스모듐과 같은 다른 병원체도 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
실시예
본원에서 하기 개시된 실시예가 단지 일반화된 실시예를 나타내고, 본 발명을 재현할 수 있는 다른 조성물 및 방법이 가능하고 본 발명에 포함된다는 것이 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
하기 표는 하기 실시예에서 사용된 본 발명의 예시적인 조성물을 요약한 것이다.
본 발명의 실시예에서 분석된 샘플은 유효/무효 및/또는 반응성/비반응성으로 간주될 수 있다. 샘플은 테스트 시스템에 의해 유효하게 처리될 때 유효한 것으로 간주되며, 상기 테스트 시스템은 샘플이 Procleix Xpress 시스템에 의해 성공적으로 피펫팅되고 RNA 기반 내부 대조(internal contol: IC)가 첨가된 Procleix Panther 시스템 내로 도입되고 Procleix SARS-CoV-2 분석 또는 첨가된 IC에 대한 양성 결과를 제공하는 임의의 기타 Procleix 분석(Grifols Diagnostic Solutions Inc., 미국)을 사용하여 분석되는 것을 포함한다. 유효한 샘플은 관심대상의 표적 핵산의 존재 또는 부재에 따라 반응성(SARS-CoV-2 또는 기타 병원체에 대해 양성)이거나 비반응성(SARS-CoV-2 또는 기타 병원체에 대해 음성)일 수 있다. 관련되는 경우에, 이와 같이 정확하게 식별된 진양성 비율(예를 들어, 감염을 갖는 것으로 정확하게 식별된 감염된 환자의 백분율)인 민감도가 또한 표시된다.
실시예 1: 스왑 샘플 채취를 위한 본 발명의 조성물들의 비교
본 발명의 조성물의 목적 중 하나는 스왑 표본 채취를 위해 사용하는 것이다. 스왑 샘플은 높은 점도를 갖고, 이로 인해 일부 경우에는 혈청 또는 혈장과 같은 다른 생물학적 액체 샘플보다 테스트 시스템에 의한 처리가 어렵다. 이러한 표본을 채취하고 추가 테스트하기 위한 본 발명의 조성물의 적합성을 조사하기 위해, 비강 스왑 샘플을 조성물 C1 및 C3(표 1)에서 건강한 지원자(SARS-CoV-2에 대해 음성인 것으로 테스트됨)로부터 채취한 다음, 제조업체의 지침에 따라 Procleix SARS-CoV-2 분석을 사용하여 Panther 시스템 상에서 처리하였다. 상이한 LLS 농도(3% 내지 10%(w/v) 범위)를 갖는 조성물 C1 및 C3를 또한 테스트하였다.
따라서, 표 2에 나타낸 결과는 모든 샘플이 유효한 결과를 생성하였기 때문에 조성물 C1 및 C3이 스왑 샘플의 채취에 적합하다는 것을 입증한다. 또한, 상기 결과는, 테스트된 모든 조성물이 표본을 채취하고 Panther에서 추가 분석되는 데 있어 유효한 결과를 생성하였기 때문에, 상이한 농도의 세제 및 조성물의 다른 성분, 특히 LiOH가 채취 배지로서 사용되는 상기 조성물의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 또한 입증한다.
N: 샘플 수
추가 실험에서는, 6%LLS C3에서 채취된 2가지의 새로운 비강 스왑 샘플에 기지의 양의 인공 바이러스(50μL의 AccuPlex SARS-CoV-2(Seracare, 참조번호 0505-0129)(61개 카피/ml))를 스파이킹(spiking)하고 Procleix SARS-CoV-2 분석 지침에 따라 Panther 시스템에 투입하였다. 2가지 모두, 반응성 결과가 얻어졌다.
결론적으로, 본 발명의 조성물은, 비록 상기 샘플이 비강 표본이더라도, 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 채취하는 데 적합하고, 분자 진단 방법에 의해 테스트하고 관심대상의 핵산을 검출하는 데 적합한 것으로 입증되었다.
실시예 2: 표본 채취를 위한 VTM과 본 발명의 조성물 비교
본 연구의 목적은 본 발명의 조성물을 사용하여 비강 표본 채취의 민감도 및 시간 경과에 따른 이의 안정성을 평가하는 것이었다. VTM은 스왑 채취를 위한 표준 배지이므로 비교용으로 사용하였다.
VTM은 질병통제예방센터(SOP#: DSR-052-05)의 권장사항에 따라 제조하였다. 간단히 말하면, 10ml의 불활성화된 소 태아 혈청(FBS)을 500ml의 멸균 행크스 균형 염 용액(HBSS)의 병에 첨가한 후, 2 mL의 겐타마이신/암포테리신 B 혼합물을 첨가하였다. 이 VTM은 수행된 모든 실험을 위해 사용하였다.
제1 비교 연구를 위해, 비강 표본의 스왑을 채취하고, 3 mL의 VTM 또는 3 mL의 조성물 C2(표 1)을 포함하는 채취 튜브에 도입하기 전에 기지의 양의 인공 바이러스를 스파이킹하였다. 특히, 플로킹 스왑(flocked swab)을 사용하여 17명의 건강한 지원자(SARS-CoV-2에 대해 음성인 것으로 테스트됨)로부터 비강 표본의 스왑을 채취하였다. 표본을 함유하는 각 스왑에 기지의 양의 인공 바이러스(AccuPlex SARS-CoV-2(Seracare, 참조 0505-0129)의 구성원 1(100개 카피/μl) 3 μL 또는 7.5 μL)을 스파이킹하여, 0개 카피/mL, 100개 카피/mL 또는 250개 카피/mL를 함유하는 스파이킹된 스왑을 얻었다. 그 다음, 스파이킹된 스왑을 튜브에 침지시키고 15초 동안 튜브 벽에 문지른 후, 스왑을 폐기하였다. 모든 샘플은 채취 후 다음 2시간 이내에 3반복으로 테스트하였다.
VTM 채취된 표본은, 채취 튜브를 와동시킨 후 샘플을 Panther 시스템에 로딩하기 전에 추출 완충제를 함유하는 제2 튜브로 이전시키는 것을 포함하는 Procleix SARS-CoV-2 분석 지침(GDSS-IFU-000047-EN v. 4.0)에 따라 처리한 반면, 조성물 C2에서 채취된 표본은 캡을 떼어낸 직후(내부에 스왑 없음) Panther 시스템에 직접 로딩하였다.
음성 대조군(0개 카피/mL) 및 100개 및 250개 카피/mL가 스파이킹된 샘플의 결과는 표 3에 나타낸다. SARS-CoV-2에 대해 양성인 결과를 생성한 샘플은 반응성인 것으로 간주된 한편, 유효한 샘플은 이 샘플이 Panther 시스템에 의해 적절하게 처리되었음을 암시한다.
샘플 채취를 위해 조성물 C2를 사용할 때의 검출 한계(LOD)는 현행 표준 VTM 채취와 유사하였다. 실제로, 스파이크가 VTM 내로 직접 수행될 때의 LOD가 80개 카피/mL라는 점을 고려하면, C2에서의 반응성 %는 100개 카피/mL에 상응하는 스파이크의 경우에 더 높았다. LOD가 테스트된 농도와 유사한 결과를 생성하였기 때문에, 제2 실험은 동일한 농도를 사용하여 수행하였다.
제2 실험에서는, 시간 경과에 따른 샘플의 안정성을 테스트하기 위해 비강 표본의 스왑을 조성물 C2 내로 채취한 다음, 여기에 750개 및 300개 카피의 인공 바이러스 Accuplex SARS-CoV-2를 스파이킹하여 각각 250개 카피/mL 및 100개 카피/mL를 얻었다. 대조군으로서, 비강 표본의 스왑을 또한 VTM 내로 채취하고 여기에 300개 카피(100개 카피/mL)를 스파이킹하였다.
특히, 37명의 건강한 지원자(SARS-CoV-2에 대해 음성으로 테스트됨)로부터의 비강 스왑을 플로킹 스왑을 사용하여 채취하였다. 이 중, VTM(실험 대조군)에 채취된 10개 스왑 표본의 세트에 300개 카피를 스파이킹하여 100개 카피/mL를 얻었다. 나머지 27개 스왑 표본은 조성물 C2에서 채취하였고, 이 중 10개 스왑 표본에 300개 카피를 스파이킹하여 100개 카피/mL을 얻었고, 10개 스왑 표본 표본에 750개 카피를 스파이킹하여 250개 카피/mL을 얻었으며, 6개 스왑 표본에 0개 카피를 스파이킹하였다(음성 대조군). 모든 샘플은 2반복으로 채취(t0)한지 2 내지 3시간 후에 테스트하였으며, 추가 혼합 없이 1회 더 재테스트하기 위해 RT에서 48시간(T48) 동안 저장하였다. 샘플은 이전에 설명한 바와 같이 Panther에서 처리하였다. 결과는 표 4에 나타낸다.
비교 실험 결과는 두 채취 방법 모두에 대해 유사한 LOD 및 또한 현행 표준 VTM(80개 카피/mL) 내로 직접 스파이킹된 Accuplex를 사용한 이전 연구와 유사한 민감도를 확인시켜 주었다.
채취 48시간 후, 모든 반복물(replicate)은 반응성이었다. 따라서, 현행 방법(VTM)과 비교한 결과, 반응성의 백분율이 유사하였고 모든 결과가 유사한 LOD를 보여주었다는 점을 고려하면, 채취 방법이 유의미한 방식으로 SARS-CoV-2 검출 민감도를 감소시키지 않는다는 결론을 내릴 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물을 이용한 채취 방법은 샘플을 Panther 시스템 내로 로딩하기 전에 추출 완충제를 함유한 제2 튜브로 샘플을 이전하는 것이 더 이상 필요하지 않기 때문에 단계 수를 감소시키고 샘플 준비 동안 샘플 추적성을 개선한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 표본의 채취와 분자 테스트까지의 핵산 보존 둘 다에 적합하다.
SARS-CoV-2 RNA를 실온에서 장기간 동안 보존하는 방법을 평가하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 특히, 비강 표본의 스왑을 플로킹 스왑을 사용하여 3명의 건강한 지원자(SARS-CoV-2에 대해 음성으로 테스트됨)로부터 채취하였다. 표본을 함유한 각 스왑에 기지의 양의 인공 바이러스(100, 250 및 500개 카피/ml의 Accuplex(Seacare))를 스파이킹하였다. 그 다음, 스파이킹된 스왑을 3 ml의 조성물 C2를 포함하는 튜브에 침지시키고 15초 동안 튜브 벽과 바닥에 문지른 후, 스왑을 폐기하였다. 모든 샘플은 채취 직후 3반복으로 테스트하였다. 표본은 샘플을 Panther 시스템 내로 직접 로딩하거나 실온에서 7일 동안 저장하였다.
본 결과는 테스트된 모든 샘플이 실온에서 7일 동안 저장한 후 반응성이었음을 보여주었고, 이는 본 발명의 조성물이 실온에서도 적어도 7일 동안 RNA를 보존한다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 3: 본 발명의 조성물에 의한 바이러스 불활성화의 평가
SARS-CoV-2를 불활성화하는 조성물 C2의 능력을 Vero 세포에서의 적정 분석에 의해 평가하였다(Pasteur Institute. Simizu B. and Terasima T. 1988; Simizu B. et al., 1967).
적정 방법은 바이러스 역가 측정이 특정 세포병변 효과의 관찰에 의해 감염된 세포에서 바이러스 생성을 검출하는 것에 기반하는 정량적 분석이다. 본 발명의 조성물의 불활성화 능력을 평가하기 위해, 상기 조성물, 특히 C2에 실온에서 1/10 비로 SARS-CoV-2를 스파이킹하고 2분, 10분 또는 30분(각각 테스트 샘플 T1, T2 및 T3) 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 바이러스를 스톡 배지(V1)에 스파이킹하였다.
실온에서 인큐베이션한 후, 0.5 mL의 각 샘플을 3반복으로 희석 배지로 희석하고 초원심분리하였다. 펠렛을 25 mL의 적정 배지에 재현탁시키고 즉시 Vero 세포로 적정하였다. 초원심분리는 바이러스에 유의미한 효과를 미치지 않는 것으로 나타났다.
그 다음, 테스트 샘플을 96웰 플레이트("샘플 희석 플레이트")에 걸쳐 연속 3배 희석(각 희석마다 8개의 반복물)에 의해 배지로 희석하였다. 그 다음, "샘플 희석 플레이트"의 각 웰을 새로운 플레이트("샘플 적정 플레이트")의 해당 웰에 접종하였다. 세포 현탁액을 "샘플 적정 플레이트"의 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 적절한 온도에서 인큐베이션하였다. 바이러스 복제 및 인접 세포의 감염을 허용하는 인큐베이션 기간 후, 감염된 후 군집물(foci)을 갖는 있는 웰을 도립 광학현미경 하에 관찰하여 계수하거나 염색 오버레이(크리스탈 바이올렛)를 첨가하고 웰을 세포병변 효과에 대해 검사한다. 감염된 웰은 투명한 영역으로 나타나는 반면, 감염되지 않은 웰은 염색된다(도 1).
밀리리터당 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50/mL)으로 표현되는 감염성 역가[m(T)]를 스피어만-카버(Spearman-Karber) 식을 사용하여 계산하였다. 평균값[m(L)] 및 신뢰 구간으로 정의되는 바이러스 존재량(virus load)은 평균 역가 m(T) x Vt로 계산하였으며, 여기서 Vt는 샘플의 총 용적, 즉 모든 경우에 1 ml이다. 처리-전 물질(미처리) 중의 바이러스 존재량(Li) 및 처리-후 물질 중의 바이러스 존재량(Lf)의 비의 Log10으로서 정의되는 바이러스 감소 계수(virus reduction factor)(R)는 [m(R)] = Log10 (V1) - Log10 (LS)로서 계산되며, 여기서 LS는 각 샘플 T1, T2 또는 T3의 바이러스 존재량이다. 결과는 표 5에 나타낸다.
본 연구에서 테스트된 모든 시간(2분, 10분 및 30분)에 대해, 조성물 C2의 경우에 생성된 바이러스 감소 계수(R)는 5.09보다 높았다. 따라서, 본 발명의 조성물의 경우 SARS-CoV-2의 감소 역가는 5 Log(99.999%) 초과인 것으로 입증되었다.
실시예 4. SARS-CoV-2 이외의 다른 바이러스의 바이러스 핵산의 불활성화
임상적 HIV-1, HIV-2, HCV, HBV 및 HEV 혈장 및 혈청 양성 표본(양성 혈청학적 및/또는 NAT 결과를 가짐)는 미국 적십자(메릴랜드주 게이더스버그), 일본 적십자(일본 도쿄), Boca Biolistics(플로리다주 폼파노 비치), Medical Research Network(MRN)(뉴욕주, 뉴욕), SlieaGen(텍사스주 오스틴), Bioreclaim(뉴욕주 웨스트베리), Cerba(프랑스), Discovery Live Sciences(캘리포니아주 로스오소스) 및 Access Biologicals(캘리포니아주 샌디에이고)로부터 입수하였다.
혈장 샘플: 100개의 HIV-1, HCV 및 HBV, 100개의 HEV 및 37개의 HIV-2 양성 혈장 표본을 Procleix UltrioPlex E 분석(UPE)을 사용하여 단일항으로 순수물 상태로 테스트하였다. 동일한 표본 세트를 16개의 풀(pool) 및 96개의 풀에서 단일항으로 순수물 상태로 테스트하였다. 양성 표본 1부와 15개(16개의 풀) 또는 95개(96개의 풀)의 상이한 혈장 정상 공여자 표본 1부를 혼합하여 풀링(pooling)된 샘플을 생성하였다.
혈청 샘플: 25개의 HIV-1, HIV-2, HCV 및 HBV 양성 혈청 표본을 UPE 분석을 사용하여 단일항으로 순수물 상태로 테스트하였다. 동일한 표본 세트를 16개의 풀에서 단일항으로 테스트하였다. 풀링된 샘플은 양성 표본 1부와 15개의 상이한 혈장 정상 공여자 표본 1부를 혼합하여 생성하였다.
액체 샘플을 분석의 제1 단계 동안 0.75:1(C1:샘플) 비로 조성물 C1에 희석하였다.
N = 표본 수, TP = 진양성, FN = 위음성, CI = 클로퍼-피어슨(Clopper-Pearson) 신뢰 구간
*N = 바이러스 존재량 5는 <20 c/mL로 표시되었다.
**1개의 HEV 양성 샘플은 1:16으로 희석하여 테스트하였을 때 HIV/HCV/HBV 반응성이었지만, 순수물로서 테스트하거나 1:96으로 희석하여 테스트하였을 때 HIV/HCV/HBV 비반응성이었다.
1정확한 상한 = 99.97
2민감도는 희석 후 100 c/mL 이상인 샘플의 경우 100%(1/1)였다.
3민감도는 희석 후 100 c/mL 이상인 샘플의 경우 100%(54/54)였다.
4민감도는 희석 후 100 c/mL 이상인 샘플의 경우 100%(40/40)였다.
N = 표본 수, TP = 진양성, FN = 위음성, CI = 클로퍼-피어슨 신뢰 구간
혈청(표 6) 및 혈장 샘플(표 7)의 경우, 바이러스 검출을 위해 용해가 필요하기 때문에, 획득된 높은 민감도(최대 1개 카피/바이러스 ml)는 샘플의 용해를 입증하였다. 이는 본 발명의 조성물이 액체 샘플 중의 다른 바이러스의 불활성화에 적합하다는 것을 입증한다.
실시예 5. SARS-CoV-2 RNA의 불활성화 및 보존
제1 실험의 목적은 본 발명의 조성물에 의한 SARS-CoV-2의 불활성화 및 저장 동안의 보존성을 평가하는 것이었다. 이를 위해, 하기 샘플을 준비하였다:
- 고안된 SeraCare 양성 샘플은 SARS-CoV-2 양성 물질을 123개 카피/mL로 CDC 권장 바이러스 수송 배지(VTM)에 스파이킹하여 준비하였다. 스파이킹된 농도는 스왑 표본 유형에 대한 SCV2 분석의 경우 약 3 x LOD에 상응한다.
- 고안된 BEI SARS 관련 코로나바이러스 샘플은 열 불활성화된 양성 물질을 63.87 c/mL로 CDC 권장 바이러스 수송 배지(VTM)에 스파이킹하여 준비하였다.
그 다음, 액체 샘플을 조성물 C1과 1:1 혼합하고 i) 30℃에서 저장하고 0시간, 60시간, 90시간 8일 및 17일차에 테스트하거나, ii) 4℃에서 저장하고 0시간, 8일 및 17일차에 테스트하였다. i) 및 ii)에 대한 결과는 각각 표 8 및 9에 나타낸다.
SD = 표준 편차, % CV = 변동 계수 퍼센트
123개 카피/mL의 SARS-CoV-2 양성 물질에 스파이킹된 Seracare 처리된 스왑 표본 샘플은 기준선 시점에서 및 30℃ ±3℃에서 60시간, 90시간, 8일, 17일 동안 저장한 후에 100% 반응성이었다. 4℃±3℃에서 저장된 스왑 표본은 기준선 시점에서 및 8일 및 17일 후에 100% 반응성이었다.
63.87개 카피/mL의 SARS-CoV-2 양성 물질에 스파이킹된 BEI 열 불활성화된 처리된 스왑 표본 샘플은 기준 시점에서 및 30℃ ±3℃에서 60시간, 90시간, 8일 동안 저장한 후에 100% 반응성이었다. 4℃±3℃에서 저장된 스왑 표본은 기준선 시점에서 및 8일 후에 100% 반응성이었다.
스파이킹된 RNA는 이들 실험에서 인공 캡시드(Seracare 샘플) 또는 실제 캡시드(BEI 불활성화 바이러스)이지만, 본 발명의 조성물이 샘플을 용해시키고 30℃에서도 RNA를 보존할 수 있음이 이미 실시예 4에서 입증되었다.
제2 실험에서는, 이전 샘플(SeraCare RNA(SC) 또는 열 불활성화된 바이러스(BEI)를 VTM 중에서 3xLOD에서 스파이크한 후 C1을 1:1로 첨가함)을 30℃ 또는 4℃에서 더 긴 시간 동안 저장한 다음, 동일한 Panther 프로토콜에 따라 3개월 및 6개월차에 재테스트하였다. 결과는, SeraCare RNA는 4℃ 및 30℃ 저장 둘 다에서 적어도 6개월 동안 안정한 반면, BEI는 4℃ 저장에서 적어도 6개월 동안 안정하다는 것을 입증한다. BEI는 30℃ 저장 시 적어도 3개월 동안 안정하였다. 관련 결과는 도 2 내지 5에 나타낸다.
또 다른 실험에서는, SARS-CoV-2 실제 양성 샘플의 보존을 또한 연구하였다. 이를 위해, SARS-CoV-2에 대해 양성인 것으로 테스트된 지원자로부터 조성물 C2에서 채취한 35개의 비인두 샘플을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 최대 18일 동안 저장한 후 재테스트하였다. 테스트된 모든 샘플은 Panther에서 테스트한 후 반응성(양성)이었는데, 이는 RNA가 저온에서도 최대 18일 동안 보존된다는 것을 입증한다.
실시예 6. 병원체 RNA의 장기간 보존
본 실험을 위해, 하기 샘플을 준비하였다:
- 500, 100 또는 30개 카피/mL를 얻기 위해 조성물 C1에 희석된 500 c/mL의 바베시아 18s 리보솜 RNA에 대한 시험관내 합성된 전사체(IVT)
- 대조군: 조성물 C1에 희석된 어떠한 유기체에서도 발견되지 않은 HIV-1 스크램블된 RNA 서열에 대한 IVT
바베시아 IVT 및 대조군을 상이한 온도에서 저장한 다음, 바베시아 Procleix 분석 및 Panther 시스템(Grifols Diagnostic Solutions Inc., 미국)을 사용하여 표적 RNA의 존재를 테스트하였다.
제1 실험에서는, 모든 샘플을 의도된 저장 온도인 -15℃ 내지 -35℃ 대신에 5℃ -/+ 3℃에서 저장하였다. 그 다음, 샘플을 0, 3, 6, 9 및 12개월차에 테스트하였다. 도 6에 도시된 결과는 본 발명의 조성물이 5℃에서 적어도 9개월 동안 병원체 RNA를 보존할 수 있음을 입증한다.
또 다른 실험에서는, 샘플을 의도된 저장 온도인 -20℃ -/+ 5℃에서 저장하였다. 그 다음, 샘플을 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24 및 26개월차에 테스트하였다. 각 시점에서, 키트를 개봉한 당일 및 72시간 동안 Panther 시스템에 배치한 후(온-보드(on-board)의 경우 OB) 개봉 후 36일차에 테스트를 수행하였다. 도 7a 및 7b에 도시된 결과는 본 발명의 조성물이 높은 함량의 RNA를 사용하더라도 20℃에서 적어도 26개월 동안 병원체 RNA를 보존할 수 있음을 입증한다.
결론적으로, 본 발명의 조성물은 생물학적 샘플, 환경 샘플 또는 폐기물 샘플과 같은 샘플의 채취에 적합하며, 특히 실시예 1 및 2에서 입증된 바와 같은 호흡기 스왑 샘플 또는 실시예 4에서 입증된 바와 같은 액체 샘플의 채취에 적합하다. 상기 조성물은 또한 VTM을 사용하는 현행 프로토콜 대신에 효과적인 채취 배지로서, 잠재적인 병원체를 불활성화하여 사람이 샘플로 작업할 때 샘플을 더욱 안전하게 만들고(SARS-CoV-2와 같은 병원체에 대한 안전 캐비닛 사용을 방지함), 동일한 채취 배지가 샘플에 존재하는 병원체를 용해시키고 불활성화할 수 있고(실시예 3, 4 및 5에 나타낸 바와 같음) 동시에 테스트할 때까지 핵산의 완전성을 성공적으로 보존할 수 있으므로 핵산 테스트를 위한 샘플의 준비 단계를 감소시킨다. 특히, 본 조성물은 4℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 수시간 내지 최대 9개월까지 저장하는 동안(실시예 5 및 6 참조) 및 -20℃에서 최대 26개월까지 저장할 때(실시예 6 참조) 핵산을 포함하는 샘플을 보존하는 데 적합한 것으로 입증되었다. 마지막으로, 본 발명의 조성물은 종종 구아니딘 티오시아네이트에 기반한 다른 이용 가능한 불활성화 배지보다 덜 유해하며, 세정 공정 동안 차아염소산나트륨을 사용하는 테스트 시스템과도 양립 가능하다.
실시예 7: 스왑 샘플을 채취하기 위한 Foam Ban을 포함하는 본 발명의 조성물들의 비교
비강 스왑 샘플을 상이한 농도의 LLS(3% 내지 9%(w/v) 범위)를 갖고 300 μl/L의 농도로 Foam Ban을 포함하는 조성물 C1 및 C3(표 1)에서 건강한 지원자(SARS-CoV-2에 대해 음성인 것으로 테스트됨)로부터 채취한 다음, 제조업체의 지침에 따라 Procleix SARS-CoV-2 분석을 사용하여 Panther 시스템에서 처리하였다. 샘플은 Aptima® Multitest Swab Specimen Collection Kit(Hologic Inc, 미국) 및 ViCUM® Flocked(Deltalab, 스페인)의 2가지 상이한 상업용 스왑을 사용하여 채취하였다.
모든 샘플은 표 10에 나타낸 바와 같이 유효하게 처리되었으며, 이는 Foam Ban을 포함하는 조성물 C1 및 C3이 스왑 샘플 채취에 적합하다는 것을 입증한다. 또한, 테스트된 모든 조성물이 표본을 채취하고 Panther에서 추가 분석하는 데 유효한 결과를 생성하였으므로, 조성물이 상이한 농도의 세제 및 조성물의 다른 성분, 특히 LiOH를 포함할 때 채취 배지로서 사용되는 상기 조성물의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것이 입증되었다.
추가 실험에서, 비강 스왑 샘플을 상이한 농도의 LLS(3% 내지 10%(w/v) 범위)를 갖고 300 μl/L의 농도로 Foam Ban을 포함하는 조성물 C1 및 C3(표 1)에서 건강한 지원자(SARS-CoV-2에 대해 음성인 것으로 테스트됨)로부터 채취하였다. 샘플은 제조업체의 지침에 따라 Procleix SARS-CoV-2 분석을 사용하여 Panther 시스템에서 처리하기 전에 4℃에서 6일 동안 저장하였다. 샘플은 Aptima® Multitest Swab Specimen Collection Kit(Hologic Inc, 미국) 및 ViCUM® Flocked(Deltalab, 스페인)의 2가지 상이한 상업용 스왑을 사용하여 채취하였다. 표 11에 나타낸 바와 같이, 모든 샘플은 유효하게 처리되었으며, 이는 Foam Ban을 포함하는 본 발명의 조성물이 처리 전에 샘플을 채취하고 4℃에서 적어도 6일 동안 저장할 수 있게 한다는 것을 입증한다. 또한 이러한 경우에, 상이한 농도의 세제 및 조성물의 다른 성분, 특히 LiOH가 채취 배지로서 사용되는 상기 조성물의 능력에 영향을 미치지 않는 것이 입증된다.
실시예 8: 저장 온도 조건의 변화에 따른 SARS-CoV-2 RNA의 불활성화 및 보존.
온도 변화 저장 조건 하에 SARS-CoV-2 RNA의 불활성화 및 보존을 테스트하기 위해 실험을 수행하였다.
건강한 지원자(SARS-CoV-2에 대한 음성인 것으로 테스트됨)로부터 채취된 나머지 비강 표본을 풀링하여 임상 대치(clinical matrix)를 준비하였다. 각 표본은 0.9%(w/v) 염화나트륨으로 50%(v/v)로 희석된 300 μl/L 농도의 Foam Ban을 포함하는 3 mL의 조성물 C1을 포함하는 튜브에 비강 스왑을 침지시키고 스왑을 튜브에 문질러서 채취하였다.
SARS-CoV-2 RNA를 함유하는 재조합 바이러스(LGC SeraCare로부터의 AccuPlex SARS-CoV-2)를 사용하여 바이러스를 임상 대치로 스파이킹하여, 2×LoD(낮은 양성, mL당 160개 카피)에서 3 mL의 스파이킹된 샘플 20개, 5× LoD(높은 양성, mL당 400개 카피)에서 스파이킹된 샘플 10개 및 위양성을 모니터링하기 위한 음성 샘플 10개를 준비하였다.
표 12의 패널에 따라 3 mL의 샘플을 함유하는 준비된 튜브 40개를 하기 작업흐름에 따라 온도 및 시간을 통해 순환시켰다:
ㆍ 이들 샘플을 처음에는 온도 조건 A(표 13)에서 보관하였고
ㆍ 주기가 종결되면, 이들 샘플을 Panther 시스템에서 Procleix SARS-CoV-2 분석을 사용하여 분석하였고
ㆍ 이후, 동일한 샘플(각각 2.5 mL)을 온도 조건 B(표 14)에서 보관하였고
ㆍ 마지막 주기 후, 샘플을 Panther 시스템에서 Procleix SARS-CoV-2 분석을 사용하여 분석하였다.
모든 실행은 유효한 결과를 생성하였고(표 15), 이는 본 발명의 조성물이 저장 온도 조건의 변화 하에서도 샘플을 용해시키고 RNA를 보존할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9: 표본 유래 표적 핵산의 검출.
플로킹 스왑을 사용하고 각 스왑을 0.9%(w/v) 염화나트륨으로 50%(v/v) 희석된 300 μl/L 농도의 Foam Ban을 포함하는 3 mL의 조성물 C1을 포함하는 튜브에 침지시켜 42명의 건강한 지원자로부터 비강 표본을 채취하였다. 스왑을 15초 동안 튜브 벽과 바닥에 문지른 후, 스왑을 폐기하지 않은 튜브 1개를 제외하고는 스왑을 폐기하였다.
채취된 모든 샘플은 테스트하여 인간 함량의 존재 여부를 결정함으로써 추가 핵산 검출을 위한 표본의 올바른 채취를 검증하기 전에 24시간 내지 72시간 동안 저장하였다. 테스트는 음성 대조 샘플 및 채취된 임상 표본에서 인간 RNase P 유전자를 검출하여 수행하였다. 제조업체 지침에 따라 QIAamp® MinElute® Virus Spin Kit를 사용하여 먼저 샘플을 추출한 다음, Nanodrop을 사용하여 평가하고 최종적으로 CDC 2019-신종 코로나바이러스(2019-nCoV) 실시간 RT-PCR 진단 패널(IDT)을 사용하여 인간 함량 검출에 대해 테스트하였다. 이 패널은 SARS-CoV-2(2개의 프라이머/프로브 세트)의 특이적 검출을 위해 설계되었으며 이 키트는 또한 인간 RNase P 유전자를 검출하기 위한 추가 프라이머/프로브 세트를 포함하고, 이 분석은 샘플에서 인간 함량을 검출하기 위해 수행하였다.
모든 샘플은, 다른 배지를 사용하여 동일한 성질의 신선한 인간 샘플을 분석할 때 얻은 것과 유사한 Ct에서 인간 RNase P 유전자에 대해 양성인 것으로 테스트되었으며, 이는 표적 핵산이 병원체 유래 핵산인지 또는 표본 유래 표적 핵산인지에 관계없이 본 발명의 조성물이 추가 핵산 테스트를 위한 표적 핵산을 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 채취하고 저장하는 데 적합하다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 타액 표본 채취 및 보존을 위한 본 발명의 조성물.
본 연구의 목적은 타액 표본의 채취 및 보존을 위한 배지로서 본 발명의 조성물을 평가하는 것이었다.
제1 실험에서, 건강한 지원자(SARS-CoV-2에 대해 음성인 것으로 테스트됨)로부터 2.5 mL의 타액 표본을 채취하고 300 μl/L의 농도로 Foam Ban을 포함하는 2.5 mL의 조성물 C1(표 1)을 포함하는 채취 튜브에 도입하였다. 각 채취 튜브의 내용물을 2.5 mL의 2개의 동일한 분취량으로 나누었다. 분취량 중 하나에 기지의 양의 열 불활성화된 바이러스(7.5 μL의 SARS 관련 코로나바이러스 2, Isolate USA-WA1/2020, 카탈로그 번호 NR-52286, BEI Resources)를 스파이킹하여 30개 카피//mL로 스파이킹된 샘플을 얻었다. 다른 분취량은 음성 대조군(0개 카피/mL)으로서 사용하였다. 캡을 제거한 직후, Panther 시스템에 각 반복물을 직접 로딩하여 채취한 후 다음 2시간 이내에 두 분취량 모두를 4개 반복물에서 테스트하였다. 음성 대조군(0개 카피/mL) 및 스파이킹된 샘플(30개 카피/mL)의 결과는 표 16에 나타낸다. SARS-CoV-2에 대해 양성 결과를 보여주는 샘플은 반응성인 것으로 간주된 한편, 유효한 샘플은 이 샘플이 Panther 시스템에 의해 적절하게 처리되었음을 암시한다.
본 실험은 본 발명의 조성물이 타액 표본 채취에 적합하다는 것을 보여준다.
제2 실험에서, 35 mL의 타액 표본(인간 공여자로부터 풀링된 정상 타액, 카탈로그 번호 991-05-P; Lee Biosolutions)을 사용하였다. 타액에 기지의 양의 열 불활성화된 바이러스(325 μL의 SARS 관련 코로나바이러스 2, Isolate USA-WA1/2020, 카탈로그 번호 NR-52286, BEI Resources)를 스파이킹하여 약 90개 카피/mL로 스파이크 샘플을 얻었다. 그 다음, 스파이킹된 샘플을 동일한 양의 조성물 C1(표 1)과 혼합하였다. 각각 1.5 mL의 6개 분취량을 30℃에서 저장하고 1일, 2일, 3일, 5일, 7일 및 10일간 저장한 후에 SARS-CoV-2에 대해 테스트하였다. 각각 1.5 mL의 8개 분취량을 4℃에 저장하고 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 10일, 13일 및 15일간 저장한 후에 SARS-CoV-2에 대해 테스트하였다. 모든 분취량은 이전에 설명한 바와 같이 Panther 시스템에서 처리하여 5개 반복물에서 테스트하였다. 1.5 mL의 하나의 분취량을 기준선으로서 0일차에 테스트하였다. 결과는 표 17에 나타낸다. SARS-CoV-2에 대해 양성 결과를 보여주는 샘플은 반응성인 것으로 간주되는 반면, 유효한 샘플은 이 샘플이 Panther 시스템에 의해 적절하게 처리되었음을 암시한다.
본 실험은 본 발명의 조성물이 30℃에서 적어도 10일 동안 및 4℃에서 적어도 15일 동안 타액 표본의 RNA 함량을 보존한다는 것을 보여준다.
Claims (96)
- 후속 핵산 테스트를 위해 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물로서, 상기 조성물이
i) 약 1 % 내지 20 %(w/v) 양의 음이온성 세제,
ii) 약 1 % 내지 5 %(w/v) 양의 I족 금속 수산화물,
iii) 약 0.5 % 내지 5 %(w/v) 양의 킬레이트제, 및
iv) 제1 완충제
를 포함하는 제1 성분을 포함하고,
상기 조성물이 물, 제2 완충제, 수송 배지(Transport Medium), 염화나트륨(aq) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 희석 성분을 추가로 포함하고,
상기 제1 성분이 희석 성분에 의해 최대 약 50 %(v/v)까지 희석되는 수성 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 성분이 염화나트륨(aq)인 수성 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 음이온성 세제가 C5-C20 알킬 설페이트 음이온, C5-C20 알케닐 설페이트 음이온, C5-C20 알키닐 설페이트 음이온, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 수성 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 세제가 라우릴 설페이트 음이온을 포함하는 수성 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충제가 Tris, MES, Bis-Tris, HEPES, MOPS, 시트레이트, 중탄산나트륨, 인산나트륨 및 이들의 조합으로부터 선택되는 수성 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 제1 완충제가 HEPES를 포함하는 수성 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충제가 약 5 % 내지 30 %(w/v)의 양으로 존재하는 수성 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충제가 pH를 5 내지 10으로 유지하기에 충분한 양으로 존재하는 수성 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 I족 금속 수산화물이 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이들의 조합으로부터 선택되는 수성 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 I족 금속 수산화물이 수산화리튬을 포함하는 수성 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 킬레이트제가 EGTA, HEDTA, DTPA, NTA, EDTA, 석신산, 무수 시트레이트, 나트륨 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 칼륨 시트레이트, 마그네슘 시트레이트, 제2철 암모늄 시트레이트, 리튬 시트레이트, 또는 이들의 조합로부터 선택되는 수성 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 킬레이트제가 석신산, EGTA, EDTA 및 이들의 조합으로부터 선택되는 수성 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충제가 약 10 % 내지 25 %(w/v)의 양으로 존재하고, 상기 음이온성 세제가 약 2 % 내지 15 %(w/v)의 양으로 존재하고, 상기 킬레이트제가 약 1 % 내지 4 %(w/v)의 양으로 존재하고, 상기 I족 금속 수산화물이 약 1 % 내지 4 %(w/v)의 양으로 존재하는 수성 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물의 pH가 5 내지 10인 수성 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 수성 조성물의 pH가 6 내지 9인 수성 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50 μl/L 내지 750 μl/L 양의 소포제를 추가로 포함하는 수성 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 소포제가 실리콘 중합체, 폴리소르베이트, 유기 폴리에테르 분산액 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 수성 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, RNA, DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 집단을 추가로 포함하는 수성 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 RNA가 시험관내 합성된 전사체를 포함하는 수성 조성물.
- 후속 핵산 테스트를 위한 생물학적 샘플을 저장하기 위한 수성 조성물로서, 상기 조성물은
i) 약 1 % 내지 20 %(w/v) 양의 음이온성 세제,
ii) 약 1 % 내지 5 %(w/v) 양의 I족 금속 수산화물,
iii) 약 0.5 % 내지 5 %(w/v) 양의 킬레이트제, 및
iv) 제1 완충제
를 포함하고,
상기 조성물이 약 50 μl/L 내지 750 μl/L의 양의 소포제를 포함하는 수성 조성물. - 제20항에 있어서, 상기 소포제가 실리콘 중합체, 폴리소르베이트, 유기 폴리에테르 분산액, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 수성 조성물.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 음이온성 세제가 C5-C20 알킬 설페이트 음이온, C5-C20 알케닐 설페이트 음이온, C5-C20 알키닐 설페이트 음이온, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 수성 조성물.
- 제22항에 있어서, 상기 세제가 라우릴 설페이트 음이온을 포함하는 수성 조성물.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충제가 Tris, MES, Bis-Tris, HEPES, MOPS, 시트레이트, 중탄산나트륨, 인산나트륨 및 이들의 조합으로부터 선택되는 수성 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 제1 완충제가 HEPES를 포함하는 수성 조성물.
- 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충제가 약 5 % 내지 30 %(w/v)의 양으로 존재하는 수성 조성물.
- 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충제가 pH를 5 내지 10으로 유지하기에 충분한 양으로 존재하는 수성 조성물.
- 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 I족 금속 수산화물이 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이들의 조합으로부터 선택되는 수성 조성물.
- 제28항에 있어서, 상기 I족 금속 수산화물이 수산화리튬을 포함하는 수성 조성물.
- 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 킬레이트제가 EGTA, HEDTA, DTPA, NTA, EDTA, 석신산, 무수 시트레이트, 나트륨 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 칼륨 시트레이트, 마그네슘 시트레이트, 제2철 암모늄 시트레이트, 리튬 시트레이트, 및 이들의 조합로부터 선택되는 수성 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 킬레이트제가 석신산, EGTA, EDTA 및 이들의 조합으로부터 선택되는 수성 조성물.
- 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충제가 약 10 % 내지 25 %(w/v)의 양으로 존재하고, 상기 음이온성 세제가 약 2 % 내지 15 %(w/v)의 양으로 존재하고, 상기 킬레이트제가 약 1 % 내지 4 %(w/v)의 양으로 존재하고, 상기 I족 금속 수산화물이 약 1 % 내지 4 %(w/v)의 양으로 존재하는 수성 조성물.
- 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물의 pH가 5 내지 10인 수성 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 수성 조성물의 pH가 6 내지 9인 수성 조성물.
- 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 물, 제2 완충제, 수송 배지, 염화나트륨(aq) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분에 의해 최대 약 50 %(w/v)까지 희석되는 수성 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 성분이 염화나트륨(aq)인 수성 조성물.
- 제20항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, RNA, DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 집단을 추가로 포함하는 수성 조성물.
- 제37항에 있어서, 상기 RNA가 시험관내 합성된 전사체를 포함하는 수성 조성물.
- 핵산을 함유한 것으로 의심되는 샘플로부터 폴리뉴클레오티드 집단을 얻는 방법으로서, 상기 방법이 샘플을 2 ℃ 내지 40 ℃ 범위의 온도에서 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 핵산이 RNA 및/또는 DNA인 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 RNA가 시험관내 합성된 전사체를 포함하는 방법.
- 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 적어도 하나의 병원체로부터 유래된 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 박테리아인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 기생충인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 바이러스인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 바이러스가 SARS-CoV-2인 방법.
- 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 표적 핵산을 증폭시키는 증폭 반응 및 생성된 증폭 산물 중 적어도 하나의 표적을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 샘플 중의 폴리뉴클레오티드 집단의 완전성을 보존하는 방법으로서, 샘플을 4 ℃ 내지 40 ℃ 범위의 온도에서 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 샘플이 수성 조성물과 접촉된 후 -25 ℃ 내지 40 ℃ 범위의 온도에서 적어도 1시간 내지 최대 6개월, 최대 9개월, 최대 12개월 또는 최대 26개월 동안 저장되는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 샘플이 수성 조성물과 접촉된 후 -20 ℃, 4 ℃, RT 또는 30 ℃에서 저장되는 방법.
- 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인 방법.
- 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 집단이 RNA 및/또는 DNA 집단인 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 RNA가 시험관내 합성된 전사체를 포함하는 방법.
- 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 집단이 적어도 하나의 병원체로부터 유래되는 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스인 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균인 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 박테리아인 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 기생충인 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 바이러스인 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 바이러스가 SARS-CoV-2인 방법.
- 적어도 하나의 병원체를 포함하는 샘플을 불활성화하는 방법으로서, 상기 방법이 샘플을 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 수성 조성물이 생성된 혼합물의 적어도 30 %(v/v)를 나타내는 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 샘플이 4 ℃, RT 또는 30 ℃에서 수성 조성물과 접촉되는 방법.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인 방법.
- 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스인 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균인 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 박테리아인 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 기생충인 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 바이러스인 방법.
- 제71항에 있어서, 상기 바이러스가 SARS-CoV-2인 방법.
- 샘플을 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 수성 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플의 채취 방법으로서, 상기 수성 조성물이 생성된 혼합물의 적어도 30 %(v/v)를 나타내는 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인 방법.
- 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 샘플이 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 수성 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 채취 용기 내로 직접 도입되는 방법.
- 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 샘플은, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 수성 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 채취 용기 내로 스왑(swab)을 사용하여 도입함으로써 채취되는 방법.
- 제76항에 있어서, 상기 스왑은 이를 채취 장치 또는 채취 용기에 문지른 후 폐기되는 방법.
- 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 적어도 하나의 병원체를 포함하는 방법.
- 제78항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스인 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균인 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 박테리아인 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 기생충인 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 바이러스인 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 바이러스가 SARS-CoV-2인 방법.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 수성 조성물을 포함하는 채취 장치 또는 용기.
- 채취 장치 또는 채취 용기 및 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 수성 조성물을 포함하는 샘플 채취 키트.
- 제86항에 있어서, 스왑, 큐렛(curette) 또는 배양 루프(culture loop)를 추가로 포함하는 샘플 채취 키트.
- 표적 핵산을 함유한 것으로 의심되는 샘플을 채취하기 위한 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 수성 조성물의 용도.
- 제88항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인 용도.
- 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 샘플이 적어도 하나의 병원체를 포함하는 용도.
- 제90항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균, 박테리아, 기생충 또는 바이러스인 용도.
- 제91항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 진균인 용도.
- 제91항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 박테리아인 용도.
- 제91항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 기생충인 용도.
- 제91항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체가 바이러스인 용도.
- 제95항에 있어서, 상기 바이러스가 SARS-CoV-2인 용도.
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