CN111254188A - 一种用于直接pcr扩增的组织液、扩增体系及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于直接PCR扩增的预处理组织液，具体由以下组分混合而成：浓度为0.4‑0.65mol/L的氯化镁，体积分数为1.5％‑3.6％的十二烷基磺酸钠，体积分数为26％‑32％的酒精，46‑60mg的Surfactin，体积分数为20％的tritonX‑100配置为体积为10毫升的组织液。以及扩增体系，用于提供PCR体系，将PCR扩增的样品进行预处理，使得样品中的DNA充分的释放，去除可能抑制PCR扩增反应的多余蛋白，为PCR扩增搭建稳定的内环境。同时，预处理组织液的处理过程时间只需要数分钟即可完成，用于替代现有的繁琐裂解和提纯过程，节省大量的实验时间，提高效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂领域，具体涉及用于直接PCR扩增对样品进行预处理的组织液、PCR扩增体系及试剂盒。
背景技术
PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性生成两条单链DNA，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。PCR技术通过现有的PCR仪能够准确的实现，基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
根据引入荧光标记的类型，常用的实时荧光定量PCR有如下几种：SYBR Green法、水解探针法(TaqMan法)、杂交探针法以及分子信标法等。PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：SYBR Green I检测模式、水解探针(Taqman HydrolysisProbes)模式和杂交探针模式；但是无论采用何种模式，其PCR的实质并没有变，都是通过温度的循环变化，通过DNA的重复性的解链和配对达到扩增的效果。但是无论采用何种PCR模式对目标物进行检测都需要将目标物从目标组织中进行释放和暴露，使得PCR能够正常进行。现有技术中通常都会采用对目标组织进行单独的破碎处理，并提纯DNA然后再进行PCR试验，这种方式需要的实验步骤多，耗时非常长。
发明内容
为了解决现有技术在进行PCR扩增前，需要对样本进行裂解、提纯处理带来的实验周期长，操作复杂，繁琐；以及因裂解、提纯步骤引入的化学试剂对后续PCR扩增造成抑制影响，甚至扩增无法进行，导致PCR扩增失败的技术问题，本申请提供一种用于直接PCR扩增的组织液、用于PCR扩增体系及试剂盒。
为了达到上述目的，本申请所采用的技术方案为：
一种用于直接PCR扩增的预处理组织液，用于将PCR扩增的样品进行预处理，使得样品中的DNA充分的释放，去除可能抑制PCR扩增反应的多余蛋白，为PCR扩增搭建稳定的内环境。同时，预处理组织液的处理过程时间只需要数分钟即可完成，用于替代现有的繁琐裂解和提纯过程，节省大量的实验时间，提高效率。具体地由以下组分混合而成：浓度为0.4-0.65mol/L的氯化镁，体积分数为1.5％-3.6％的十二烷基磺酸钠，体积分数为26％-32％的酒精，46-60mg的Surfactin，体积分数为20％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
作为本申请的优选配比方案，所述氯化镁的浓度为0.5-0.55mol/L，十二烷基磺酸钠的体积分数为2％-3％，酒精的体积分为28％-30％，tritonX-100的体积分数为20％。
作为本申请的又一优选配比方案，所述组织液还包括体积分数为5％-9.5％的异丙醇，体积分数为3％-6％的聚多卡醇，5％-8％的乙二胺四乙酸，以及4％-6％的二硫苏糖醇。
本申请还提供一种试剂盒，包括上述任一配比的组织液。作为试剂盒包括的优选方案还包括用于PCR扩增体系，所述PCR扩增体系由5ul的10X PCRmix溶液、4ul浓度为10mmol/l的dNTP mix溶液、1ul浓度为5U/mL的UNG酶、1ul2.5U/mL的TaqDNA聚合酶、浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针，1-5ul的模板和31-35ul的水配置成50ul的扩增体系。
具体地：所述10X PCRmix溶液具体由500mmol/l的KCl、100mmol/l且PH＝9.0的TRIS-HCl和1％Triton-X组成。
具体地：所述dNTPmix溶液具体由7.5mmol/l的dUTP、2.5mM/L的dTTP、10mM/L的dATP、dGTP和dCTP组成。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例9中1组PCR扩增曲线；
图2是实施例9中2组PCR扩增曲线；
图3是实施例9中3组PCR扩增曲线；
图4是实施例9中4组PCR扩增曲线；
图5是实施例9中5组PCR扩增曲线；
图6是实施例9中6组PCR扩增曲线；
图7是实施例9中7组PCR扩增曲线；
图8是实施例9中8组PCR扩增曲线；
图9是实施例9中9组PCR扩增曲线；
图10是实施例10中A-J组PCR扩增曲线。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的含量可以以不同的参数进行设计，作为优选范围值中的任一符合条件的点值均可实现对应技术效果。
因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
下述任一实施例进行荧光定量PCR实验的反应采用标准的两步法，
反应的条件设定为50℃UNG酶处理上一次扩增产物的污染，其次摄氏95℃的温度条件下进行预变性10min，再次95℃变性10s，而后进行摄氏60°延伸30秒，并重复45个循环，每次延伸结束采集荧光信号。
实施例1：
预处理组织液，由以下组分混合而成：浓度为0.1mol/L的氯化镁，体积分数为0.5％的十二烷基磺酸钠，体积分数为5％的酒精，6mg的Surfactin，体积分数为5％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
实施例2：
预处理组织液，由以下组分混合而成：浓度为0.2mol/L的氯化镁，体积分数为0.7％的十二烷基磺酸钠，体积分数为8％的酒精，10mg的Surfactin，体积分数为8％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
实施例3：
预处理组织液，由以下组分混合而成：浓度为0.4mol/L的氯化镁，体积分数为1.5％的十二烷基磺酸钠，体积分数为26％的酒精，46mg的Surfactin，体积分数为20％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
实施例4：
预处理组织液，由以下组分混合而成：浓度为0.45mol/L的氯化镁，体积分数为2％的十二烷基磺酸钠，体积分数为28％的酒精，50mg的Surfactin，体积分数为20％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
实施例5：
预处理组织液，由以下组分混合而成：浓度为0.5mol/L的氯化镁，体积分数为2.5％的十二烷基磺酸钠，体积分数为30％的酒精，55mg的Surfactin，体积分数为20％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
实施例6：
预处理组织液，由以下组分混合而成：浓度为0.65mol/L的氯化镁，体积分数为3.6％的十二烷基磺酸钠，体积分数为32％的酒精，60mg的Surfactin，体积分数为20％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
实施例7：
预处理组织液，由以下组分混合而成：浓度为1mol/L的氯化镁，体积分数为8％的十二烷基磺酸钠，体积分数为40％的酒精，80mg的Surfactin，体积分数为30％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
实施例8：
预处理组织液，由以下组分混合而成：浓度为0.5mol/L的氯化镁，体积分数为2％的十二烷基磺酸钠，体积分数为30％的酒精，50mg的Surfactin，体积分数为20％的tritonX-100，体积分数为5％-9.5％的异丙醇，体积分数为3％-6％的聚多卡醇，5％-8％的乙二胺四乙酸，以及4％-6％的二硫苏糖醇配置为体积为10毫升的组织液。
上述实施例中，经申请人经过反复的正交实验，其中组分氯化镁的作用是使得缓冲试剂中形成缓冲对，搭建相对稳定的内环境；酒精能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。氯化镁中的Mg2+离子能够与暴露出来的带负电荷的磷酸基团结合，降低多核苷酸链之间的排斥作用，加之DNA具有不溶于酒精的特性，从而更好的将DNA释放出来。Na+、Li+离子是现有技术中经常用的盐类，譬如将氯化镁替换成醋酸铵、氯化锂、氯化钠、醋酸钠等，在形成缓冲对方面可以达到相对等同的技术效果，但是，现有技术中的上述盐类的加入当盐浓度高，时间长后会导致大量盐沉淀，如此就需要70％的乙醇进行反复洗涤；经实验，采用氯化镁就不会存在上述盐沉淀的问题，进而就免去了乙醇反复洗涤的繁琐流程，再者，氯化镁的加入相较于现有技术还具有以下有益技术效果：其一、对酶具有催化作用，提高酶的活性；其二、可以有效调整细胞渗透压。
Surfactin本身是阴离子表面活性剂，可以促进核酸释放，在预处理和PCR过程中都能促进反应的进行。TritonX-100属于非离子表面活性剂，能够较好的溶解脂质，增加细胞膜的通透性。十二烷基磺酸钠是一种阴离子表面活性剂，具有双重作用：其一使细菌细胞裂解，释放DNA，同时又可以使因细胞裂解释放出来的部分蛋白质变性，降低因蛋白质导致对后续PCR扩增产生抑制作用。
特别地，本实施例加入了异丙醇和酒精同时作用能够有效的起到DNA沉淀的效果，同时也不会影响到后续PCR扩增的进行。现有技术中，酒精是生物领域实验人员大量采用的，其原因是酒精容易挥发，尽可能小的影响到下游实验的进行，从而并不常采用异丙醇，经本申请人反复实验，按照本实施例的酒精及异丙醇的配比，能够大大的提高DNA样品的沉淀速度，同时对于多糖物、5sRNA、tRNA不发生沉淀，且无需低温环境下沉淀，加之异丙醇具有较好的疏水性，能很好的沉淀核算，加入30％的酒精是利用酒精的亲水性，能够去除产生的盐，采用上述配比能够有效的实现现有技术不能达到的技术效果，实现了既省去了70％酒精进行反复洗涤的流程，同时又大大缩短了DNA释放和沉淀的周期，使得整体预处理的时间相对于现有技术而言，大大缩短。实现上述技术效果关键在于控制异丙醇的含量，当含量过低并不能起到快速沉淀的效果，含量过高又会因其不具有挥发性而对后续实验造成影响，故而异丙醇和酒精的配比是提高效率的关键。
实施例9：
本实施例是对预处理组织液的有效性和预处理组织液组织成分浓度高低对于处理后样品进行相同PCR反应后扩增效果的影响。
本实施例设定NO：1-8实验组和NO：9对照组；对照组试剂采用10毫升生理盐水。其中，
实施例1中的预处理组织液为NO：1组；
实施例2中的预处理组织液为NO：2组；
实施例3中的预处理组织液为NO：3组；
实施例4中的预处理组织液为NO：4组；
实施例5中的预处理组织液为NO：5组；
实施例6中的预处理组织液为NO：6组；
实施例7中的预处理组织液为NO：7组；
实施例8中的预处理组织液为NO：8组；
将采用生理盐水对照组设定为NO：9组；
将NO：1-8实验组和NO：9对照组均各自取两个20ul与80ul含有非洲猪瘟病毒感染样品混合，并置于85℃恒温金属浴10分钟，各组分别取样品混合液2份进行PCR：
反应的条件设定为50℃ UNG酶处理上一次扩增产物的污染，其次摄氏95℃的温度条件下进行预变性10min，再次95℃变性10s，而后进行摄氏60°延伸30秒，并重复45个循环，每次延伸结束采集荧光信号。
PCR的扩增体系如下：
所述PCR扩增体系由5ul的10X PCRmix溶液、4ul浓度为10mmol/l的dNTP mix溶液、1ul浓度为5U/mL的UNG酶、1ul2.5U/mL的TaqDNA聚合酶、浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针，1-5ul的模板和31-35ul的水配置成总量为50ul的扩增体系。
所述10X PCRmix溶液具体由500mmol/l的KCl、100mmol/l且PH＝9.0的TRIS-HCl和1％Triton-X组成。
所述dNTP mix溶液具体由7.5mmol/l的dUTP、2.5mM/L的dTTP、10mM/L的dATP、dGTP和dCTP组成。
值得说明的是，本实施例采用非洲猪瘟病毒进行检测是基于非洲猪瘟病毒全基因组序列为公知，并在美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,简称NCBI)中进行公开披露，其采用Taqman测定的方式对应的上游引物F和下游引物R，以及双标记探针均为申请人实验研发获得，具体采用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。为了进一步的避免因实验过程错误造成实验失败，本实施例所取非洲猪瘟病毒感染样品为确诊非洲猪瘟病毒的唾液分离而来用于阳性对照。
本实施例中所述引物具体如表1所示：
| 名称 | 引物碱基序列 | 长度 | 序列标识符 |
| ASFV-F | TTCCATCAAAGTTCTGCAGC | 20 | SEQ ID NO:1 |
| ASFV-R | TATTCCTCCCGTGGCTTCA | 19 | SEQ ID NO:2 |
表1
本实施例中探针具体如表2所示：
| 名称 | 5’ | 探针碱基序列 | 3’ | 长度 | 序列标识符 |
| ASFV-PROBE | FAM | ACATACCCTTCCACTACGGAGGC | MGB | 23 | SEQ ID NO:3 |
表2
有图2—8所示内容，除实施例5，即5组的PCR扩增曲线未呈现双一致性曲线，其余1-4组、6-9组均呈现双一致性曲线，说明5组导致的因素是PCR仪导致，图5中的扩增曲线已示出实施例5中的预处理组织液对非洲猪瘟感染样品裂解的有效性。采用双份样品进行双曲线验证的另一目的在于验证预处理组织液的有效性，采用双曲线验证的方式可以省去传统PCR加入内标进行反应的步骤。由于完成本发明的最终目的是通过预处理组织液的处理后能够直接释放样品中的DNA，在没有内标参与的前提下，若能进行PCR扩增，则足以证明预处理组织液对DNA释放的有效性；若加入内标，只要PCR扩增体系和反应条件适合，则依然可以检测到扩增曲线，但并不能够或者该扩增曲线是内标曲线还是目标DNA的扩增曲线，故而，单纯的采用样品进行PCR，只要扩增能够获取扩增曲线，则足以说明预处理组织液对样品DNA释放的必然关联性。值得的说明的是，本发明的目的是通过PCR扩增手段验证预处理组织液对于样本处理的有效性，置于PCR扩增产物的纯度并不是本发明考虑的范畴。
图1和图9并未成功呈现PCR扩增曲线，图1和图9呈现的双一致性曲线表面PCR仪并无异常；图1对应的是实施例1低浓度预处理组织液，从PCR扩增曲线线性可以看出，并没有成功对病毒进行裂解，DNA亦未进行有效释放，与图9中生理盐水对非洲猪瘟感染样品作用相当，均无法正常实现裂解，是导致图1和图9导致无法扩增的根本原因。
如图2-图8示出内容，均示出了实施例2-8中预处理组织液对样品的有效裂解，有效性达100％，足见本申请的预处理组织液在免去酒精洗涤步骤后，依然能够达到，甚至超过现有碱性裂解液的技术效果。但在处理时间上明显缩短，处理工艺明显简化，只需要将样品置入本申请所述预处理组织液中自然静置数分钟即可直接PCR。从扩增曲线可以看出，随着实施例2-8中的预处理组织液浓度逐渐增大，循环数逐渐减小。值得说明的是，本申请提供的预处理组织液解决的问题是为直接PCR提供条件，涉及PCR扩增自身因素(譬如：PCR扩增体系，模板浓度)导致的扩增效果不佳与本申请所述预处理组织液无关。
实施例10：
取10份非洲猪瘟感染样品分为A-J组，将实施例8中的预处理组织液分别对A、B、C、D、E、F、G、H、I、J组的非洲猪瘟感染样品进行预处理，并同时置于恒温摄氏85°的金属浴恒温环境下，其中每份样品处理的时间以1分钟为间隔停止预处理实验并按照下述方式和环境进行PCR，其中A组时间最短，预处理时间1分钟即开始进行PCR，同理，J组预处理时间为10分钟，再进行PCR。
反应的条件设定为50℃ UNG酶处理上一次扩增产物的污染，其次摄氏95℃的温度条件下进行预变性10min，再次95℃变性10s，而后进行摄氏60°延伸30秒，并重复45个循环，每次延伸结束采集荧光信号。
PCR的扩增体系如下：
所述PCR扩增体系由5ul的10X PCRmix溶液、4ul浓度为10mmol/l的dNTP mix溶液、1ul浓度为5U/mL的UNG酶、1ul2.5U/mL的TaqDNA聚合酶、浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针，1-5ul的模板和31-35ul的水。
所述10X PCRmix溶液具体由500mmol/l的KCl、100mmol/l且PH＝9.0的TRIS-HCl和1％Triton-X组成。
所述dNTP mix溶液具体由7.5mmol/l的dUTP、2.5mM/L的dTTP、10mM/L的dATP、dGTP和dCTP组成。
本实施例中所述引物具体如表3所示：
表3
本实施例中探针具体如表4所示：
| 名称 | 5’ | 探针碱基序列 | 3’ | 长度 | 序列标识符 |
| ASFV-PROBE | FAM | ACATACCCTTCCACTACGGAGGC | MGB | 23 | SEQ ID NO:3 |
表4
如图10所示A、B、C、D、E、F、G、H、I、J组的扩增曲线均采用相同的预处理组织液(本申请优选配比方案，实施例8示出)，区别仅在于预处理时间的不同，旨在探索预处理时间与DNA释放程度的关系。如图10示出内容，可见在预处理时间的长短与DNA释放程度成正相关，作为时间最长的J组的扩增峰值在I组之后，当超过10分钟后，预处理时间的延长并不能提高裂解程度的增加，本申请提供的预处理组织液最佳处理时间应为7-9分钟。上述表3中引物对扩增产物片段SEQ ID NO:4具体如序列表所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 成都导胜生物技术有限公司
<120> 一种用于直接PCR扩增的组织液、扩增体系及试剂盒
<130> 2020-01-15
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificeal Sequence)
<400> 1
ttccatcaaa gttctgcagc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificeal Sequence)
<400> 2
tattcctccc gtggcttca 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificeal Sequence)
<400> 3
acataccctt ccactacgga ggc 23
<210> 4
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificeal Sequence)
<400> 4
ttccatcaaa gttctgcagc tcttacatac ccttccacta cggaggcaat gcaattaaaa 60
cccccgatga tccgggtgcg atgatgatta cctttgcttt gaagccacgg gaggaata 118
Claims (7)
1.一种用于直接PCR扩增的预处理组织液，其特征在于：由以下组分混合而成：浓度为0.4-0.65mol/L的氯化镁，体积分数为1.5％-3.6％的十二烷基磺酸钠，体积分数为26％-32％的酒精，46-60mg的Surfactin，体积分数为20％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。
2.根据权利要求1所述的一种用于直接PCR扩增的预处理组织液，其特征在于：所述氯化镁的浓度为0.5-0.55mol/L，十二烷基磺酸钠的体积分数为2％-3％，酒精的体积分为28％-30％，tritonX-100的体积分数为20％。
3.根据权利要求2所述的一种用于直接PCR扩增的预处理组织液，其特征在于：还包括体积分数为5％-9.5％的异丙醇，体积分数为3％-6％的聚多卡醇，5％-8％的乙二胺四乙酸，以及4％-6％的二硫苏糖醇。
4.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3任一项所述的组织液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系由5ul的10X PCRmix溶液、4ul浓度为10mmol/l的dNTP mix溶液、1ul浓度为5U/mL的UNG酶、1ul2.5U/mL的TaqDNA聚合酶、浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针，1-5ul的模板和31-35ul的水配置成总量50ul的扩增体系。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述10X PCRmix溶液具体由500mmol/l的KCl、100mmol/l且PH＝9.0的TRIS-HCl和1％Triton-X组成。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述dNTP mix溶液具体由7.5mmol/l的dUTP、2.5mM/L的dTTP、10mM/L的dATP、dGTP和dCTP组成。
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2020
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