JPH06261762A

JPH06261762A - ヒト乳頭腫ウイルス検出のための方法及び生成物

Info

Publication number: JPH06261762A
Application number: JP19245692A
Authority: JP
Inventors: Garind-Castro Ivan; イバン・ガリンド−カストロ; Luis Ramirez Jose; ホセ・ルイス・ラミレス; Ramhel-Aldao Rafael; ラファエル・ランヘル−アルダオ
Original assignee: CENTRAL DE VENEZUELA, University of; CERVECERIA POLAR SA; Serubeseria Poraru C A; Universidad Central de Venezuela
Current assignee: CENTRAL DE VENEZUELA, University of; CERVECERIA POLAR SA; Serubeseria Poraru C A; Universidad Central de Venezuela
Priority date: 1992-07-20
Filing date: 1992-07-20
Publication date: 1994-09-20

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の遺伝配列を
含むか含むと予想される試料中のＨＰＶを検出する。【構成】試料と特定の配列を有する検出可能に標識さ
れたプローブとを該ぷを試料に安定にハイブリダイゼー
ションするに適したハイブリダイゼーション条件下に接
触させ、標識を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト乳頭腫ウイルスに対
する型特異的ウイルスプローブとして２つの人工合成コ
ンセンサスポリヌクレオチドを利用する。プローブは好
ましくは、プローブに特異的な酵素的に接合した抗体に
より免疫化学的に検出される。好ましい実施態様では、
本発明は、肛門性器路に感染するヒト乳頭腫ウイルス
(ＨＰＶs)の最も臨床的に重要な型の、頚のパパニコラ
ウスミアにおける非同位元素検出についてのインサイチ
ユ・ハイブリダイゼーション系に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＰＶとして広く知られたヒト乳頭腫ウ
イルスはヒト癌の発生に関連した。(ダルスト等、プロ
シーデイングス・オブ・ナショナル・アカデミィ・オブ
・サイエンス・ユーエスエイ(Ｐroc．Ｎatl．Ａced．Ｓ
ci．ＵＳＡ)８０、３８１２−３８１５(１９８３))、５
７以上の確認されたウイルスの型から、３分の１は肛門
性器路を内張りする粘膜上皮を優先的に感染するように
見え、このグループ内で、型１６、１８、３３及び３５
は高リスクで、前癌症状病巣である。型６及び１１は良
性のコンジローム・尖形(性病いぼ)を起こし低リスク感
染として処理される。

【０００３】ＨＰＶ関連病巣の分析についての共通試験
はパパニコラウ染色で、それは簡単と正確を結びつける
が、急性ウイルス感染は、確かな検出に通常必要である
ので不適当である。発明者ジョージ・パパニコラウ及び
グラススライド上の頚すり傷をスミアする技術後、パパ
ニコラウスミアとして広く知られたので、組織学的手段
は核染色ヘマトキシリンによる肛門性器路から得た細胞
の染色を含む。パパニコラウ、ジー．エヌ．サイエンス
(Ｓcience)９５、４３８−４３９(１９４２)。頚癌の検
出での開拓突破でも、組織学的染色手段は反復可能性の
欠如にかかり、結果は実験室から実験室で変りうる。染
色手段にさらに磨きをかける努力がなされた(シュル
テ、イー、スタンダーダイゼイション・オブ・ザ・パパ
ニコラウ・ステイン・Ｉ、ア・コンパリゾン・オブ・フ
ァイブ・ヌクレア・ステインス、アナリティカル・アン
ド・クァンティタテイブ・サイトロジィ・アンド・ヒス
トロジィ(Ａnalytical and Ｑuantitative Ｃytolog
y and Ｈistology)、１２(３)、１４９−１５６(１９
９０)が、標準結果はルールとなりえない。又、パパニ
コラウスミアは切迫したＨＰＶ誘導新形成の十分前兆と
ならない。事実、一研究において、発達したインサイチ
ユに癌を有する患者の２５％は診断前数年に正常なパパ
ニコラウスミアを表わしうる(ロリンツ等、ジャーナル
・オブ・パイロロジィ(Ｊ．Ｖirol．)５８、２２５−２
２９(１９８６))。従って、速やかな検出、好ましくは
ＨＰＶ型特異的手段を可能にする新しい診断上の手法を
早急に必要とする。理想の試験は、宿主細胞への損傷が
まだ明らかでない場合、早い段階で医師に高リスクＨＰ
Ｖ型の存在を明らかにする。高リスクウイルス型感染の
徴候を示す患者は次いでよりしばしばモニターされ、処
置がより早い段階で始まる。

【０００４】循環抗ＨＰＶ抗体を検出することをねらう
血清学的試験は、細胞培養がＨＰＶ抗原を大量に与えな
いので用途が限られ、実行するのが難かしい(タイクマ
ン等、ザ・サーチ・フォア・ア・カルチャー・システム
・フォア・パピロマウイルス．ジャーナル・オブ・イン
ベステイゲイテイブ・ダーマトロジィ(Ｊ．Ｉavest．Ｄ
ermatol．)８３、２５−６５(１９８４))。加えて、血
清学的試験はウイルス型間区別を可能にしない。

【０００５】標識抗体を用いる免疫細胞化学技術は、一
部、抗体の低親和のために、高検出限定を有する。明白
な形態学的変化を伴うバイオプシーの５７％のみが、こ
の型の試験に陰性であった(グプタ．ジエイ．等、「デテ
クション・オブ・ヒューマン・パリロマウイルス・イン
・セルビカル・スミアズ・ア・コンパリゾン・オブ・
「イン・シツ」ハイブリダイゼイション、イムノシトケミ
ストリィ、アンド・シトパソロジィ．」アクタ・シトロ
ジカ(Ａcta Ｃytol．)３１、３８７−３９１(１９８
７))。

【０００６】ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの使用はもしか
すると期待できる。１９８０年より１６以上のウイルス
性ゲノムがクローンされ、ＨＰＶの診断において、型特
異的プローブとして用いられた(ギスマン等、モレキュ
ラー・クローニング・アンド・キャラクタリゼイション
・オブ・ヒューマン・パピロマウイルスＤＮＡデライブ
ド・フロム・ア・ラリンギール・パピロマ、ジャーナル
・オブ・パイロロジィ(Ｊ．Ｖirol．)４４、３９３−４
００(１９８２)、ロリンツ等、キャラクタリゼイション
・オブ・ヒューマン・パピロマウイルセス・イン・サー
ビカル・ネオプラシアス・アンド・ゼア・デテクション
・イン・ルーチン・サービカル・スクリーニング、バン
ブリィ・レポート２１中、バイラル・エティオロジィ・
オブ・サービカル・キャンサー・pp、２２５−２３７、
ペト、アール等、編集、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリィ(１９８６))。即ち、ポリヌクレオチ
ドプローブの構成に必要なゲノム情報は入手しうる。こ
れらの公表されたウイルス性ゲノムは又既知のゲノムに
比べて新しく発見されたウイルス性ゲノムのパーセント
類似性に従って新しいＨＰＶウイルス性型の分類につい
て標準を与えた。

【０００７】ゲノムプローブ材料のＨＰＶ感染核細胞材
料とのインサイチユ・ハイブリダイゼーションは最近実
施された。ワグナー、ディ．、アイデンテイフィケイシ
ョン・オブ・ヒューマン・パピロマウイルス・イン・サ
ービカル・スフブス・バイ・デオキシリボヌクレイック
・アシッズ・イン・シツ・ハイブリダイゼイション、オ
ブステトリクス・アンド・ギネコロジィ、６４(６)、７
６７−７７２(１９８４)。この研究でワグナー等は、³²
Ｐ標識全ヒト乳頭腫ウイルス６、１１、１６及び１８を
用いる頚スワグ上のドットプロットハイブリダイゼーシ
ョンを行なう。高率の侵入癌は³²Ｐ標識ＨＰＶ型１６／
１８を含むそれらの組織試料の陽性標識に対応した。そ
れゆえに、インサイチユ標識は、用語が細胞中の適所に
通常に意味することを演じた手段と通常一致するので、
誤った方向に導く。この手段はニトロセルロース膜への
ドットプロッテイングを経て細胞含量の移転、ＮaＯＨ
誘導細胞溶解８０℃での焼き上げ、次いでハイブリダイ
ゼーション混合物への暴露を要する。オートラジオグラ
ムが１−５日後入手するまで入手できない。

【０００８】ＨＰＶＤＮＡプローブは異なるハイブリダ
イゼーションを基礎とするアッセー、例えばサザーン
(ラダー等、ア・ティピカル・スクアノウス・セル・ア
・ケースーシリーズ・スタディ・オブ・ジ・アソシエイ
ション・ビッウイーン・パパニコラウ・スミア・レザル
ツ・アンド・ヒューマン・パピロマウイルス・ゲノタイ
プ、ジャーナル・オブ・レプロダクテイブ．メデイシン
(Ｊ．Ｒeproductive Ｍedicine)３５(４)、２９１−２
９７(１９９１)及びハイブリッドドット／サザーン(ラ
コクジィ等、デテクション・オブ・ヒューマン・パピロ
マウイルス・イン・レプロセッスド・ルーチン・パパニ
コラウ・スミアズ・バイＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン、ダイアグノスティック・シトパソロジィ(Ｄiagnost
ic Ｃytopathology)６(３)、２１０−２１４(１９９
０))アッセーに用いられ、臨床的に誘導された組織試料
中のＨＰＶＤＮＡを検出する。加えて、精製バイオプシ
ーＤＮＡ(ハラン等、「デテクション・アンド・タイピン
グ・オブ・ヒューマン・パピロマウイルス・インフエク
ション・オブ・ザ・ウテリン・カービックス・バイ・ド
ット−ブロット・ハイブリダイゼイション、コンパリゾ
ン・オブ・スクレイプス・アンド・バイオプシーズ」ジ
ャーナル・オブ・メディカル・バイロロジイ(Ｊ．Ｍe
d．Ｖirol．)２７、３１７−３２１(１９８９))、及び
保存組織標本におけるインサイチユ・ハイブリダイゼー
ション、即ち、核酸プローブに相補のこれらの配列の無
傷の細胞内の直接局在を実施した(ヘイル等、「イン・シ
ツ」ハイブリダイゼーション・ウイズ・ジゴキシゲニン
−ラベルド・ＤＮＡオブ・ヒューマン・パピロマウイル
セス・ＨＰＶ１６／１８イン・ヘラ・アンド・シラ・セ
ルズ、バイオテクニクス(Ｂio Ｔechniques)６、９７
８−９８１(１９８８))。精製ＤＮＡのブロットアッセ
ーはコンプレックス実験プロトコールを含み、弱い感受
性を有し、細胞構造とウイルス性位置についての情報を
与えない。この情報は感染の型及び広がりを診断するの
に重要である。反対にインサイチユ・ハイブリダイゼー
ションはこの情報を与えるだけでなく、実験室プロトコ
ールは、伝統的なパパニコラウスミアに満足している細
胞学者及び組織学者によく知られるであろう。

【０００９】

【発明の要約】本発明は高及び低リスクヒト乳頭腫ウイ
ルスに対しての、及び良性の病巣(６／１１)と広く関連
するものから悪性の型(１６／１８)を区別するためのＤ
ＮＡＨＰＶウイルス性検定を提供する。本発明はウイル
ス性増進の初期の段階で患者におけるＨＰＶゲノムを特
に検出する方法を医師に提供する。

【００１０】インサイチユ・ハイブリダイゼーション方
法の利点と系は、非放射活性アッセーにおいて、ポリヌ
クレオチドプローブの強力な特異性を結び着ける。検出
は好ましくは、抗原標識ポリヌクレオチドプローブに発
色現像剤を添加することによって比色信号を生ずる酵素
標識抗体の特異的結合により与えられる。明るい顕微鏡
を通して核材料中の紫がかった着色の観察は、選択の検
出方法である。方法は、敏感で速く、ウイルスについて
の型特異性情報を提供する。慣行通りに訓練した組織学
者を含む使用者の広いスペクトルは、この手段が普通の
ものであることを知る。

【００１１】本発明は配列番号１を含む第１ポリヌクレ
オチド分子又はその安定なハイブリダイゼーション可能
切片及び配列番号２を含む第２ポリヌクレオチド分子又
はその安定なハイブリダイゼーション可能切片(式中、
Ｒ＝Ａ又はＧ)を含む。

【００１２】両プローブ(以下「統括的プローブ」という)
の組合せ使用は一般的ウイルス性発生の検出を可能に
し、パパニコラススミアとして同一方法における慣用の
スクリーニングに用いうる。２つのプローブを含む組成
物の同時使用は肛門性器路病巣と関連するＨＰＶ型６、
１１、１６及び１８の検出を可能にし、一方、プローブ
２のみの使用は、悪性、即ちＨＰＶ型１６及び１８と関
連したこれらのウイルスの検出を可能にする(図１参
照)。プローブ２のみの使用は悪性プローブと名付けら
れる。

【００１３】本発明は又、検出可能な形で、特に該ポリ
ヌクレオチド分子の３'末端に付着したジゴキシゲニンd
ＵＴＰ末尾に標識した第１及び第２ポリヌクレオチド分
子を含む。抗ジゴキシゲニン酵素結合抗体は、ジゴキシ
ゲニン標識プローブに局在し、Ｘ−リン酸塩／ＮＢＴと
の反応で紫がかった濃縮物を生ずる。

【００１４】本発明は、又、ＨＰＶ遺伝配列(例えば無
傷の核を伴う細胞)、ハイブリダイゼーション緩衝液、
及び請求項１又は２のポリヌクレオチドのいずれか一つ
又は両者の混合物の配列を有する検出可能に標識された
プローブを含む試料を含むハイブリダイゼーション混合
物を含む。

【００１５】本発明は又、ＨＰＶの遺伝配列を含むか含
むと予想される試料中のＨＰＶを検出する方法を含み、
それは試料を請求項１又は請求項２の配列を有する検出
可能に標識されたプローブと、又は両者の混合物と、適
当なハイブリダイゼーション条件下、接触させてプロー
ブ又はプローブ類を試料に安定にハイブリダイゼーショ
ンさせ、そして標識を検出することを含む。

【００１６】本発明は又、１又はそれ以上のコンテナー
を密閉監禁されるよう区分されたキットを含み、それ
は、請求項１又は２のポリヌクレオチド分子又はその混
合物を含む第１コンテナー、及びポリヌクレオチドの存
在を示す能力を有する１又はそれ以上の試薬を含む第２
コンテナーの組合せを含む。

【００１７】図１は万能及び悪性のプローブとの化学反
応産物ドットブロットハイブリダイゼーションのオート
ラジオグラムを示す。１００mgのクローン化ＨＰＶゲノ
ム(ＨＰＶ６、１１、１６及び１８)及び１０μgの非感
染ヒトＤＮＡをニトロセルロース膜上にブロットした。
ハイブリダイゼーション後、相補オリゴプローブを「ゲ
ニウスキット(商標)」製造者(ベーリンガー・マンハイム
・バイオケミカルス・インディアナポリス、インディア
ナ、ユーエスエイ)により推奨されたとして発色現象し
た。各ポリヌクレオチドプローブの特異性は明示され
る。ヒトＤＮＡは現実に存在するが両プローブに対し陰
性である。

【００１８】図２はＨＰＶ感染及び非感染組織のインサ
イチユ・ハイブリダイゼーションの陽性及び陰性反応の
顕微鏡写真の写真複写を示す。細胞の核における紫がか
った蓄積(又はその不存在)は細胞学者／組織学者により
評価されるべき基準である。図２は黒と白であり、染色
核間の対比は測定因子である。

【００１９】図３はインサイチユ・ハイブリダイゼーシ
ョンの結果を実施している顕微鏡写真の写真複写であり
図２のように行なわれたが完全ＨＰＶウイルス性ゲノム
はプローブとして用いた。図２における同一コントロー
ル間の明らかな対比に関連して図３の陽性及び陰性コン
トロール間の対比の損失に注意。

【００２０】図４は本発明に有用なハイブリダイゼーシ
ョン箱の概要の描写である。箱はハイブリダイゼーショ
ンに必要な加熱の間カラススライドと溶液を含む手段を
提供する。

【００２１】図５はエチジウムブロミドで染色後ＰＣＲ
アッセーの結果の典型的ポリアクリルアミド電気泳動６
バンドパターンを示す。各型−特異的逆プライマーの塩
基対サイズは左カラムに示される。ＰＣＲ増幅生成物の
存在又は不存在に従って、患者にＨＰＶに感染している
か、どの型(複数もあり)か測定がなされる。加えて、図
はプライマーが完全に適合し、同一反応に用いうること
を明らかにする。

【００２２】

【好ましい実施態様の詳細な説明】本発明のポリヌクレ
オチド分子は種々の形のヌクレオチド分子を含む。本出
願の目的のための用語「ポリヌクレオチド」は２−デオキ
シリボース及びリボース核酸を含む。それは又、交換で
きる種々のプリン及びピリミジン塩基を含む。用語「ポ
リデオキシヌクレオチド」は、５'−３'方法に結合した
２又はそれ以上の２−デオキシヌクレオチド分子を含
む。それらは又、一本鎖又は二本鎖でありうる。

【００２３】ポリヌクレオチド配列又はプローブは検出
されるべき配列と実質的に相補又は相同の少くとも単一
鎖塩基配列を含む。しかしながら、そのような塩基配列
は単一連続ポリヌクレオチド切片を必要としないが標的
配列に安定にハイブリダイゼーションする断片を含むこ
とができる。プローブとしてポリヌクレオチドを用いる
場合、ハイブリダイゼーション条件は、標的ゲノム配列
の成功した検定をコントロールするのが必要である。典
型的には短かい(２００bp以下)合成ポリヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションは厳格な条件下、典型的には
ハイブリッドの融点(Ｔm)下、わずかに５−１０℃で実
施する。これらの短かいハイブリッドはより長い２００
＋bpハイブリッドであるよりも自然的に解きやすく、洗
浄条件は、必然的により短かくハイブリダイゼーション
よりもより低い厳格な条件下に実施される。

【００２４】プローブの同一部分は非同一配列、例え
ば、同一配列が増殖用に挿入されたベクターのＤＮＡ又
はＲＮＡを含むものにより３'−及び５'−末端に隣接で
きる。どちらかの場合に分析試薬として示されたプロー
ブは、重要な試料核酸と１又はそれ以上の点で検出可能
なハイブリダイゼーションを示す。直鎖又は環状単一鎖
ポリヌクレオチドは、主な又は従の部分で相補ポリヌク
レオチド鎖又は鎖類と二重で、重要な同一配列又は配列
断片が単一鎖形で、試料ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダ
イゼーションに利用できる場合を除き、プローブ要素と
して用いることができる。特に好ましくは、直鎖又は環
状プローブで、同一プローブ配列は本質的に単一鎖形で
ある(特に７及びメッシング、ジーン(gene)１７、２７
１−２７７(１９８２)参照)。

【００２５】本発明のポリヌクレオチドプローブは、配
列番号１及びその安定なハイブリダイゼーション可能断
片及び配列番号２(Ｒはアデニン又はグアニン)及びその
安定なハイブリダイゼーション可能断片である。

【００２６】プローブ１は、塩基６３４１及び６３５５
を含む間のＨＰＶ６ゲノム内及び塩基６３２６及び６３
５０を含む間のＨＰＶ１１内の配列に安定にハイブリダ
イゼーションする。両部分は各ウイルスのＬ１オープン
リーディングフレームにある。プローブ２は、ＨＰＶ１
６の部分に塩基９６１から９８５に、そしてＨＰＶ１８
内で塩基１００７から１０３１にハイブリダイゼーショ
ンする。両部分は各ウイルスのＥＩＯＲＦに属する。

【００２７】本発明の分析方法の実施は如何なる特別な
ハイブリダイゼーションフォーマットにも限定されな
い。全ての慣用ハイブリダイゼーション技術を用いるこ
とができる。改良がなされ、概念上新しいフォーマット
が開発されるように本組成物及び方法を実施するのに容
易に適用できる。特に有用である慣用ハイブリダイゼー
ション形は試料核酸又はポリヌクレオチドプローブが固
体支持体上に固定される(固相ハイブリダイゼーション)
もの及びポリヌクレオチド種が全て溶液中にある(溶液
ハイブリダイゼーション)ものを含む。標的ウイルス性
核酸へのプローブのハイブリダイゼーションはサザー
ン、ドット又はスロットブロッティング技術又は他のよ
く知られたハイブリダイゼーション技術により達成しう
る。ＨＰＶＤＮＡプローブは、異なるアッセー、例えば
サザーン(ラダー等、エイテイピカル・スクアナス・セ
ルズ、ア・ケース−シリーズ・スタディ・オブ・ジ・ア
ソシエーション・ビツウーン・パパニコラウ・スミア・
レザルツ・アンド・ヒューマン・パピロナウイルス・ゲ
ノタイプ、ジャーナル・オブ・レプロダクティブ・メデ
ィシン(Ｊ．Ｒeproductiue Ｍedicine)３５(４)、２９
１−２９７(１９９１))及びハイブリッドドット／サザ
ーン(ラコクジイ等、デテクション・オブ・ヒューマン
・パピロマウイルス・イン・レプロセスド・ルーチン・
パパニコラウ・スミアズ・バイＤＮＡハイブリダイゼー
ション、ダイアグノスティック・サイトパソロジイ(Ｄc
agnostic Ｃytopathology)６(３)、２１０−２１４(１
９９０))アッセーに用いられ、臨床的に誘導された組織
試料中のＨＰＶＤＮＡを検出する。加えて、精製バイオ
プシーＤＮＡ(ハラン等、「デテクション・アンド・タイ
ピング・オブ・ヒューマン・パピロマウイルス・インフ
エクション・オブ・ザ・ウテン・カービックス・バイ・
ドット・プロット・ハイブリダイゼーション、コンパリ
ゾン・オブ・スクレイプス・アンド・バイオプシーズ」
ジャーナル・オブ・メディシナル・バイロロジィ、２
７、３１７−３２１(１９８９))は、ハイブリダイゼー
ション可能ＤＮＡの起原として用いうる。ハイブリダイ
ゼーションの特に好ましい方法はインサイチユ・ハイブ
リダイゼーション、即ち、核酸プローブに相補なこれら
の配列の無傷の細胞内での直接局在である。インサイチ
ユ・ハイブリダイゼーションはこの分野でよく知られて
いる、ヘイルス等、「インサイチユ」ハイブリダイゼーシ
ョン・ウイズ・ジゴキシゲニン−レイプルドＤＮＡオブ
・ヒューマン・パピロマウイルスズＨＰＶ１６／１８イ
ン・ヘラ・アンド・シラ・セルズ、バイオテクニクスズ
(Ｂio Ｔechnzues)６、９７８−９８１(１９８８)参
照、これを引用して明細書記載の一部とする。

【００２８】本発明においては、プローブ１及び２の長
さは２５塩基対である、即ち、厳格な条件が標的ＨＰＶ
配列を伴うインサイチユ・ハイブリダイゼーションに好
ましい。ハイブリダイゼーション条件は３５℃から３８
℃まで、４５分と４時間の間、変りうる。好ましくは、
ハイブリダイゼーションはＤＮＡの変性を助けるのに十
分な簡単な熱処理、例えば９２℃で１０分、そして次い
で３７℃で１時間、好ましくは２０％ホルムアミド中で
のハイブリダイゼーションで起きる。他の使用しうる条
件は当業者にとって知られているか明らかであろう。

【００２９】本発明は又、標的配列で安定にハイブリダ
イゼーションが可能であるプローブ１及び２の断片を含
む。用語「安定にハイブリダイゼーション可能なその断
片」は全てのハイブリダイゼーション条件下、ここに表
示した２５bp標的ゲノムに安定にハイブリダイゼーショ
ンする請求した配列の全ての断片を意味する。アッセー
は、本発明の配列の断片が標的ＨＰＶ配列に安定にハイ
ブリダイゼーションしうるか、又何度でかを測定するよ
う容易に工夫できる。当業者に知られるように、ポリヌ
クレオチドプローブが短かくなると、ハイブリダイゼー
ション条件はより厳格となる。より大きな厳格さがハイ
ブリダイゼーションが高温度下に起きることを要求する
とハイブリッドの融点(Ｔm)に近づく。１４から６０−
７０の高い塩基までのプローブの長さについてのＴmを
計算する便利な方法は、サンブルック等、コンデイショ
ンズ・フォア・ハイブリダイゼーション・オブ・ポリヌ
クレオチド・プローブス、イン・モレキュラー・クロー
ニング^-Ａラボ・マニュアル、第２版、p１１．４６、コ
ールド・スプリング・ハーバー・プレス(１９８９)に記
載される。以下の方程式は短かいポリヌクレオチドプロ
ーブについてのＴmを決定する。Ｔm＝８１.５−１６.６(log₁₀[Ｎa⁺])＋０.４１(％Ｇ＋
Ｃ)−(６００／Ｎ) 式中Ｎ＝鎖長この方程式は当業者にプローブ１又は２の全ての長さの
断片についてＴmを計算できるようにし、又、ハイブリ
ダイゼーション条件に合わせるようにしてハイブリダイ
ゼーションについての最適温度を見出す。ハイブリダイ
ゼーションの厳格さに貢献する他の因子はＧ／Ｃ量及び
塩濃度を含む。

【００３０】本発明のポリヌクレオチドプローブは幾つ
かの異なる型のＨＰＶにおけるＥＩＯＲＦの保存同一部
分にハイブリダイゼーションする。本発明の配列の計画
は、この観察を考慮に入れる。プローブ２は位置１６に
おいて退歩し、両ＨＰＶ型１６及び１８とハイブリダイ
ゼーションしうる。位置１６はアデニン(Ａ)又はグアニ
ン(Ｇ)であり得、配列表における「Ｒ」により示される。
プローブ２は、それが、多くの正確な配列が比較される
場合に各位置が最もしばしば見出されるヌクレオチドで
ある典型的な核酸であるので、「コンセンサスポリヌク
レオチド」と考えられる。(ローセン等、デイクショナリ
ィ・オブ・イムノロジイ(Ｄictionarg of Ｉmmunolog
y、５２頁、ストックトン・プレス、１９８９参照)。

【００３１】本質的にどの核酸ハイブリダイゼーション
フォーマットも、プローブと測定されるべき配列との間
に形成されるハイブリッド又は重要な配列とハイブリダ
イゼーションしないプローブが選択された標識と標識可
能である本発明の目的に従うことができる。この分野で
知られるように、かかるハイブリッド又はハイブリダイ
ゼーションされたプローブの標識化は現実のハイブリダ
イゼーション反応の前又は後に実施できる。通常プロー
ブは特異的結合反応を経て標識されるか標識可能であり
又は、形成されたハイブリッドは通常特異的結合反応を
経て実質的に標識される。本発明の中心の新しい特徴
は、核酸ハイブリダイゼーションの検出への二次標識化
の現象の有利な適用である。

【００３２】プローブはハイブリッドそのものが直接に
検出できる方法で直接に標識できる。これらの方法はよ
く知られており、放射能標識、化学ルミネッセント標
識、蛍光光度標識、発色団標識及び標識抗体結合を含
む。検出はプローブをリガンド、例えば蛋白ストレプタ
ビジンに特異的に結合するビオチンで直接標識化するこ
とにより達成され、その蛋白は、化学ルミネッセント反
応成分、例えばアルガホスファターゼ又は西洋ワサビペ
ルオキシダーゼに共有結合で結合したストレプタビジン
に対するキャリアーであることができる。これらの方法
は当業者によく知られ、ポリヌクレオチドを検出可能に
標識する。

【００３３】本発明のプローブの直接放射能標識は、放
射活性アイソトープ、例えば³²Ｐをプローブ分子のリン
酸エステル−糖バックボーンのリン酸エステル基に付す
ことにより可能である。当業者は他の放射活性標識、例
えば³Ｈ、又は¹²⁵Ｉも可能であることを識別する。プロ
ーブが放射活性に標識されると、検出はＸ線感受性写真
フィルムにさらすことにより達成される。フィルムの続
く現象によりハイブリダイゼーションの存在又は不存在
を視覚で検出できる。これらの方法は当業者によく知ら
れている。サンブルック等、ラベリング・オブ・シンセ
ティック・ポリヌクレオチド・バイ・ホスホリレーショ
ン・ウイズ・バクテリオファージＴ₄ポリヌクレオチド
・キナーゼ、イン・モレキュラー・クローニング、ア・
ラボ・マニュアル、２版、１１．３１−３２頁、コール
ド・スプリング・ハーパー・プレス(１９８９)参照)。

【００３４】酵素結合イムノアッセーは本発明のポリヌ
クレオチドプローブを標識するのに有用な他の技術であ
る。本発明の好ましい実施態様において、用いられる抗
体試薬は、検出的に標識されたポリヌクレオチドの結合
を経てプローブと相補試料核酸の間で形成されるハイブ
リッドに結合する能力により主として特徴づけられる。
抗体試薬は全抗体、抗体断片、多官能抗体集合体、モノ
クローナル抗体、単鎖抗原結合分子又は一般に抗ハイブ
リッド抗体からの１又はそれ以上の特異的結合部位を含
む全ての物質よりなることができる。全抗体の形におい
て、それは既知の免疫グロブリン、例えばＩgＧ、ＩgＭ
等のクラス及びサブクラスの全てに属することができ
る。ハイブリダイゼーションプローブへの特異的結合親
和性を保持する全ての抗体のどの断片も用いることがで
きる。例えばＦab、Ｆ(ab')及びＦ(ab')₂として慣用に
知られるＩgＧの断片。加えて、免疫グロブリン又はそ
の断片の集合体、ポリマー、誘導体及び接合体を適当に
用いることができる。

【００３５】抗体試薬についての免疫グロブリン起原は
全ての入手可能な手段、例えば慣用の抗血清、モノクロ
ーナル抗体技術、及び単鎖抗原結合分子の組換え遺伝手
術により得ることができる。抗血清は、動物、例えばマ
ウス、ウサギ、モルモット、ヒツジ又はヤギの適当な免
疫原での免疫を含むよく確立した技術により得ることが
できる。免疫グロブリンは又、その結果はモノクローナ
ル抗体に通常引用され、適当な免疫原の使用を含む体細
胞ハイブリダイゼーション技術により得ることもでき
る。単鎖抗原は、リンカーポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ切片のプラスミドへの挿入により、組換え手術さ
れ、リンカーが２つの抗原結合可変ドメインを結合する
のを発現する。

【００３６】抗体試薬が検出ハイブリッドに用いられる
と、それは通常酵素、例えばアルカリホスファターゼ、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、適当な合成手段により付
着されたグルタルアルデヒドで標識化される。別法とし
て抗体試薬は天然の性質、例えばそれ自身の抗原性に基
づいて検出できる。さらに抗体は補体結合又は標識プロ
テインＡ、及び抗体を検出するのにこの分野で知られた
他の技術により検出できる。

【００３７】好ましい実施態様では、抗体試薬は標識さ
れる。標識残基及び抗体試薬は直接化学リンケージ、例
えば共有結合を含むにより又は間抗リンケージ、例えば
交互に抗体に結合するマイクロカプセル又はリポソーム
中の標識の混入により、互いに結合又は連結する。標識
技術はこの分野でよく知られ、全ての慣用方法は本発明
において用いることができる。

【００３８】本発明のハイブリダイゼーションポリヌク
レオチドプローブを検出する好ましい方法は、ジゴキシ
ゲニン標識ポリペプチドプローブを抗ジゴキシゲニン発
色団抗体と接触させることである。特に、スペーサーア
ーム、５'−デオキシウリジン三リン酸塩をポリヌクレ
オチド３'−末端ラベリングキット、カタログ番号１３
６２−３７２、ベーリング−マンハイム・バイオケミカ
ルズ、インディアナポリス、インディアナに指定される
ように、末端転移酵素を用いてプローブの３'末端に化
学的に添加する。他のデオキシヌクレオシド三リン酸塩
(dＮＴＰs)を、dＡＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ又はdＴＴＰ
を含め用いうる。よりジゴキシゲニン標識が、増強され
た検出可能性のためにより長いスペーサーアームを作る
のに必要である場合、１以上のdＵＴＰを加えうる(シュ
ミッツ、ジー．ジー等、アナリテイカル・バイオケミス
トリイ(Ａnal．Ｂiochem．)１９２、２２２(１９９
１))。ジゴキシゲニン−dＵＴＰ標識ハイブリッドＮの
検出は重合アクリルホスファターゼで標識した抗ジゴキ
シゲニンポリクローナル抗体をプローブ上に位置するd
ＵＴＰ連結ジゴキシゲニンに接触させることにより達成
する。プローブ−抗体コンプレックスは、プローブがニ
トロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)との組合せで５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩(Ｘ−リン
酸塩)との接触でハイブリダイゼーションする所はどこ
でも、酵素的に連結した紫がかった色の沈澱を発達させ
る。当業者はＸ−リン酸塩／ＮＢＴの正確な濃度及び使
用量を理解する。サンブルック等、スクリーニング・オ
ブ・エクスプレッション・ライブテリーズ・ウイズ・ア
ンテイボディズ・アンド・ポリヌクレオチド・イン・モ
レキュラ・クローニング、ア・ラボ・マニュアル、第２
版、１２．２０頁、コールド・スプリング・ハーバー・
プレス(１９８９)参照。加えて「ゲニウス・キット(商
標)」(ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、
インディアナポリス、インディアナ)は色発達への全て
の方向を与える。この方法により達せられる強い色彩発
達は、分子への短かい２５−bpオリゴプローブの最適貫
通能と共に、ＨＰＶの比較的少しのコピーがゲノムに統
合された場合でも非常に強い発色信号を生ずる。

【００３９】当業者は、他の酵素が、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ及びグルタルアルデヒド及び適用した対応色
彩発達試薬を含めて、検出の目的のために結合抗体に連
結しうることを理解する。特に化学ルミネッセント試薬
「ルミーホス５３０(商標)」、ルミンゲン、インコーポレ
ーテッド、デトロイト、ミシガンは、慣用Ｘ線フィルム
上ハイブリッドの検出を可能にする。別法として、当業
者に示唆しうる他の抗ジゴキシゲニン接合体は、フルオ
レッサー抗−ジゴキシゲニン−ローダミン、及び抗−ジ
ゴキシゲニン−フルオレッセン及び電子顕微鏡法、抗−
ジゴキシゲニン−(金に接合した第２抗体)用を含む。

【００４０】発色団標識の使用は視覚により又は慣用手
段により、例えば光学顕微鏡により検出できる。記録は
慣用カラー顕微鏡写真による。蛍光又は化学ルミネッセ
ント標識は、視覚による又は光電子増倍管により検出し
うる光を発する。全接合標識は電子顕微鏡法に用いら
れ、ハイブリダイゼーションを検出し、感染細胞のより
大きな形態学的特徴を映像化する。放射標識プローブは
Ｘ線感受性フィルムにさらしうる。

【００４１】本発明において、検出可能に標識されたポ
リヌクレオチドプローブの明白な局面は免疫原性であ
る。例えば、以前の議論において、ギコキシゲキン−d
ＵＴＰスペーサーアームは、抗ジゴキシゲニン抗体又は
その断片により認識される。即ち、本発明の目的のため
そしてそれゆえに、ジゴキシゲニン−dＵＴＰ残基は抗
原である。同様にある状態ではdＮＴＰ末尾は抗原であ
ることができる。適当に活性化された宿主内に作られた
抗体が抗原のエピトープに特異的な抗体を生成すること
はよく知られる。dＮＴＰ末尾は十分な大きさに現れ抗
体により認識しうるエピトープを現わし、ハイブリッド
を標識する他の方法を提供する。

【００４２】本発明のハイブリダイゼーション混合物
は、ＨＰＶＤＮＡ又はＲＮＡ配列、ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液、プローブ１及び２の一方又は両方の配列を
有する検出可能に標識されたプローブを含むか含むと予
想される試料を含む。より特異的には、試料は、ＨＰＶ
を含みうる全ての領域から上皮のこすり落しを経て得ら
れる組織試料でありうる。婦人科学実験の間に得られた
頚又は陰門のそぎ落し、のどから得られた喉頭そぎ落と
し又は古い記録源から得られた細胞は必須の試料細胞を
提供しうる。

【００４３】本発明のハイブリダイゼーション緩衝液は
ポリヌクレオチドプローブの標的配列への結合を可能に
する全ての緩衝溶液を含む。かかる緩衝液の多くの変形
がある。適当な緩衝液を選択する場合に考慮すべき変数
は溶媒及び温度、溶媒の容量及びハイブリダイゼーショ
ン時間の長さ、ブロッキング剤(プローブの非特異的表
面への付着をブロックする)、プローブの濃度及びその
特異活性、溶液中のプローブの有効濃度を増加するため
のＰＥＧ又はデキストリン硫酸の使用、及び以下のハイ
ブリダイゼーションを洗浄することのきびしさである。
種々のガイドラインがハイブリダイゼーション溶液の構
成に公有ドメインにおいて利用しうる。例えばサンブル
ック等、ハイブリダイゼーション・オブ・ラジオラベル
ド・プローブス、イン・モレキュラー・クローニング−
Ａラブ・マニュアル、第２版９．４７−９．５１頁、コ
ールド・スプリング・ハーバー・プレス(１９８９)参
照。

【００４４】ＨＰＶを検出する好ましい方法は、試料を
プローブ１又は２の配列を有する検出可能に標識された
プローブ又はその安定にハイブリダイゼーション可能な
断片と又は両者の混合物と、適当なハイブリダイゼーシ
ョン条件下に接触させプローブ又はプローブ断片を試料
に安定にハイブリダイゼーションさせること続いて標識
を検出することを含む。標識は、本発明のユニーク配列
に直接取込まれうるか又は、標識化は、ハイブリダイゼ
ーション後起こりうる。両方法は本明細書中のどこかで
より詳細に概説する。標識の型も限定されず、多くの型
の標識がここで議論される。本発明の好ましい標識は、
ハイブリッドを抗ジゴキシゲニン−dＵＴＰで免疫標識
することを含み、抗体自身は酵素標識、特にアルカリホ
スファターゼに接合する。即ち、標識ハイブリッドの視
覚化は発色反応が、オキシダント又は他の反応物、特に
Ｘ−リン酸塩／ＮＢＴの抗体−局在ハイブリッドへの添
加により完了したときに起きる。

【００４５】本発明の他の好ましいモードはインサイチ
ュ・シトハイブリダイゼーションである。本発明の関係
で用いられるように、「インサイチュー」は、ハイブリダ
イゼーションが細胞核中にまだ存在するゲノム材料で実
施されることを意味する。ガラススライドに固定したス
ミア細胞は、溶液の系列と接触してプローブは細胞中の
(存在すれば)標的配列にハイブリダイゼーションする。
結果は直接可視化する。この方法はＨＰＶ感染細胞の全
体の形態学的特徴を保持し、細胞学者に感染の他の証明
表示をさせる。

【００４６】本発明はここに記載したアッセーを実施す
るのに必要な全ての要素を含むキットを含む、特にキッ
トは近くにとじこめられて、請求項１又は２のポリヌク
レオチド分子、又はその混合物を含む第１コンテナー及
びポリヌクレオチドの存在を示す能力を有する１又はそ
れ以上の試薬を含む第２コンテナーを含む１又はそれ以
上のコンテナーを含む。

【００４７】詳しくは、区分されたキットは、試薬が別
々のコンテナーに含まれた全てのキットを含む。このよ
うなコンテナーは小さなガラスコンテナー、プラスチッ
クコンテナー又はプラスチックス又は紙のストリップを
含む。かかるコンテナーは、試薬を１つの区画から他の
区画に効果的に移転させ、試料と試薬は交雑混合せず、
コンテナーの試薬又は溶液は、１つの区画から他の区画
に定量方式で加えることができる。このようなコンテナ
ーは、ポリヌクレオチド溶液用、抗体溶液用、放射標識
用、酵素、蛍光色素又は抗体に結合する化学ルミネッセ
ント試薬用、発色剤例えばＸ−リン酸／ＮＢＴ用のコン
テナー、及びリン酸緩衝食塩水、プレハイブリダイゼー
ション及びハイブリダイゼーション溶液及び他の緩衝液
用のコンテナーを含む。

【００４８】ポリメラーゼ鎖反応のＨＰＶ表示への適用
は数多くのＨＰＶ型にうまく適用されてきた。各ＨＰＶ
のそれぞれのゲノムはユニークであるが、それらはＤＮ
Ａ相同性の配列した部位、特にＥ１及びＬ１オープンリ
ーディングフレーム(ＯＲＦs)を分ける。多くのＨＰＶ
型が確認されたが５つの相補ＤＮＡ配列だけが報告され
た。生殖ＨＰＶ型６、１１、１６及び１８のＤＮＡ配列
を比較することにより相同性の部位を確認することが可
能である。かかる部位から、多くの生殖ＨＰＶから明ら
かな部位を増幅するコンセンサスＰＣＲプライマーのセ
ットを設計する。この方法は、最初１９８９年にマモス
等により報告され、ＰＣＲプロトコールス−Ａガイド・
ツー・メソーズ・アンド・アプリケーションズ、イニス
等版３５６−３６７頁、アガデミック・プレス・インコ
ーポレーテッド、サン・ジェゴ、カリホルニア(１９９
０)におけるデテクション・アンド・タイピング・オブ
・ゲニタル・ヒューマン・パリロマウイルスにおいてマ
モス及びテイングによりより完全に記録されている。

【００４９】本発明はインサイチュ・ハイブリダイゼー
ション結果と確立したＰＣＲ型感受性検出アッセーとを
相関するＰＣＲ基本アッセーを記録する。表Ｉ(実施例
３参照)はこの目的のために構成された順プライマーを
示す。表ＩＩは逆プライマーを示す。実施例３はアッセ
ーを実施するのに必要な段階を記載する。このアッセー
はＨＰＶウイルス性ゲノムの存在を検出するだけでな
く、増幅ＤＮＡ断片(図５参照)の大きさに従ってウイル
ス性型をも示すよう設計された。６つのポリヌクレオチ
ド(多重プライマー)をＰＣＲアッセーの間、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを用意するのに用い、各特異的増幅生成
物の大きさは表Ｉ及びＩＩに表示する。

【００５０】表Ｉ及び表ＩＩは、特異的増幅標的の重合
化を用意するのに用いたポリヌクレオチドプライマーの
セットを含め、ＰＣＲアッセーの主特徴を示す。１対の
順プライマーがあり１つはＨＰＶ６／ＨＰＶ１１用であ
り、他はＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８用である。ユニークな
逆プライマーは、各ＨＰＶ型に必要であり、４つの逆プ
ライマーが表ＩＩに示される。表は又、初めに報告され
た配列(シュクルツ等、エンボ・ジャーナル(ＥＭＢＯ
Ｊ．)２、２３４１−２３４８(１９８３)、ダートマン
等、バイロロジイ(Ｖirol．)１５１、１２４−１３０
(１９８６)、シードルフ等、バイロロジイ(Ｖirol．)１
４５、１８１−１８５(１９８５)及びコール等、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ(Ｊ．Ｍol．
Ｂiol．)１９３、５９９−６０８(１９８７))に定めら
れた塩基に従って標的ゲノム配列を示す。全てのプライ
マーは、Ｅ１及びＥ２ＯＲＦs内の部位を的とし、２２
２bpから８０９bpの範囲の断片の大きさを生ずる。

【００５１】以下の実施例は本発明の組成物及び方法の
例示であり限定するものではない。発明の他の適当な修
飾及び適用及び臨床アッセー設計において通常出合う条
件及びパラメーターの変化は、当業者にとって明らかで
あり、本発明の精神及び範囲内にある。明細書中に示し
た引例は引用して本明細書記載の一部とする。

【００５２】実施例１インサイチュ・ハイブリダイゼーション本発明のプローブを使用して、インサイチュ・ハイブリ
ダイゼーションの詳細なプロトコールを以下に記載す
る。１）標本のスライドガラス上の限界域（２５×２５ｍ
ｍ）に鞘、外陰部または陰茎細胞性スワップを塗布し、
ヘアスプレイで固定する（ヘアスプレイの内容物は、一
般に、４０％アルコール（またはエタノール）中ブタ
ン、プロパン、イソブタン、酢酸ビニル、クロトン酸、
ビニルネオデカネイト共重合体、ローラミド、ラノミ
ド、ＤＥＡ、ジメチコン、アミノメチルプロパノールお
よび芳香料である。市販のヘアスプレイが適当であ
る。）染色ジャー中にサンプルスライドガラスを置く
（２０個のスライドガラス群を容易に適応し得る。）。２）固定させた細胞を９５％エタノールで１５分間洗浄
する。３）細胞を１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％パラ
ホルムアルデヒドで１５分間３７℃で再固定する。４）残留液を除去し、３７℃で空気乾燥しておく。５）２５℃で１５分間０.２ＮＨＣl中インキュベート
する。６）１５分間２ＸＳＳＣ（２０ＸＳＳＣ：３ＭＮaＣ
l、０.３Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７.０）で洗浄す
る。７）上述の溶液を除去し、第２表に記載のプラスチック
製の湿潤な箱（ハイブリダイゼーション箱）に移し、各
々に前ハイブリダイゼーション溶液（２ＸＳＳＣ：Ｎa
Ｃl、ブロッキングリージェント（商標）２％ブロッキ
ングリージェント（商標）。２％ブロッキングリージェ
ント(w/v)は、フェルケ等、ニュークレイック・アッシ
ド・リサーチ（Nucleic. acid Res.）、第１８(９)巻、
５８４３〜５８５１頁、（１９９０年）に引用されるよ
うに、牛乳タンパク質の酸性沈澱および連続的可溶化
で、得られた脱脂粉乳からのカゼイン、２０％ホルムア
ミド(v/v)、Ｎ−ラウリルサルコシン、塩化ナトリウ
ム、０.１％(w/v)、ＳＤＳ，０．０２％(w/v)を含
む。）（１００ｕｌ／スライドガラス）を適応する。３
７℃で１時間インキュベートする。溶液を完全に細胞を
覆うように塗布する。８）溶液を交換し、４０ｎｇ／ｍｌ濃度で適当なプロー
ブを含むハイブリダイゼーション溶液を加える。各々の
スライドガラスに上記の溶液３０ｕｌを加え、ハイブリ
ダイゼーション箱（第４図）に静置し、カバーガラスで
サンプルを覆う。最後に、周縁をゴムのりまたはネイル
エナメルで密封する。９）ハイブリダイゼーション箱にサンプルを分配し、９
２℃、即ち、沸騰水浴上で１０分間インキュベートし、
除去し、次いで１時間３７℃でインキュベートする。１０）室温で６ＸＳＳＣ溶液中にスライドガラスを浸
漬し、カバーガラスをはずし、ピンセットを用いて取り
除く。１１）染色ジャー中を室温にて６ＸＳＳＣで一度洗浄
し、４８℃にて６ＸＳＳＣで一度および４８℃にて２Ｘ
ＳＳＣで一度洗浄する。すべて１５分間洗浄する。

【００５３】実施例２プローブの検出（ベーリンガー
の「ゲニウス（商標）」検出キットによる）１）緩衝液１（１００ｍＭトリス−ＨＣl，１５０ｍＭ
ＮaＣl、ｐＨ７.５）中スライドガラスを簡単に洗浄す
る。２）ブロッキング溶液（緩衝液１中０.５％ブロッキン
グリージェント（商標））中３０分間インキュベートす
る。３）工程１を繰り返す。４）サンプルへ（キットから供給される）アルカリホス
ファターゼに結合する希釈された抗ジキトキシンゲニン
抗体２００μｌを適応し、１時間インキュベートする。５）穏やかに撹拌しつつ室温で１５分間緩衝液１で４度
洗浄する。６）室温で２時間緩衝液３（１００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、１００ｍＭＮaＣl、５０ｍＭＭgＣl₂、ｐＨ７.
５）で一度洗浄し、過剰の液体を除去する。７）室温にて顕色溶液（ＮＢＴ溶液４５ｕｌおよび１Ｘ
−リン酸溶液３５ｕｌ（両溶液はキットから供給する）
を緩衝液３の１０ｍｌに加える）でインキュベートす
る。少なくとも６時間または一夜顕色させておく。８）緩衝液４（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８）で反応を止める。サンプルをエタノール勾
配（７０％〜９９％）で脱水する。エオシンで対比染色
し、固定し、光学顕微鏡において４０倍で観察する。正
のシグナルは、細胞核中の暗青または紫がかった凝集で
あり、標的ゲノム存在数に比例している。第２図は、２
つの正および１つの負の事例の結果を示す。対照とし
て、第３図は、プローブとして全ウイルス性ゲノムの使
用を除く、上記の同様な製造の結果を示す。負の例にお
いて染色の背景があるけれども、正は核中の顕色とシト
ゾル中の顕色とでは顕著に異なることを示す。その顕著
な異なりは核中へのＨＰＶの混入を示す。

【００５４】実施例３ＰＣＲアッセイＰＣＲアッセイを以下のように行う。１）頸部または陰茎上皮細胞を無菌綿棒で捕集し、ＰＢ
Ｓ０.５ｍｌ中に包埋した。サンプルを２４時間以下４
℃にて保った。サンプルを長時間保管するなら、アジ化
ナトリウム（０.１％）を加える。２）簡単に撹拌し、綿棒から細胞を移し、綿棒を捨て、
細胞を小遠心分離機で１〜２分遠心分離する。３）ペレットした細胞をＰＢＳで一度洗浄し、再度遠心
分離する。４）ペレットをリーシス溶液（水中プロテインナーゼＫ
５０ｕｇ／ｍｌ、１％ノニデットP40）１００ｕｌ中に
再懸濁する。５）サンプルを６５℃で３０分間次いで９５℃で３０分
間インキュベートする。６）溶解-細胞溶液５ｕｌを最終容積１００ｕｌ中ＰＣ
Ｒ反応緩衝液（５００ｍＭＫＣl、０.０１％ゼラチ
ン、１.５％ＭgＣl₂、０.０５％トリトン−Ｘ１００、
２００ｎＭ各々ｄＮＴＰ、１ｕＭ各プライマーおよびタ
ックＤＮＡポリメラーゼの２.５ユニット）に加える。
サイクルを行う間に水の損失を避けるために各々の反応
において鉱油で液の表面を覆った。７）温度−サイクルプロフィルを第II表に示す。第１表正プライマー標的プライマー標的部位 HPV6および配列番号３１７８５ HPV11 HPV16および配列番号４１９４１ HPV18 第２表逆プライマー標的プライマー標的部位ＰＣＲ断片大きさ部位 HPV6 配列番号５ 2007 222bp HPV11 配列番号６ 2148 363bp HPV16 配列番号７ 2465 524bp HPV18 配列番号８ 2821 809bp 使用された温度−サイクルプロフィルを、エリコンプ・
シングル−ブロック（商標）システムにおいて自動的に
行い、以下のようにサイクルを行った。ＤＮＡの起源は、クローン化ＨＰＶゲノムを有する組換
え型プラスミドｎｇ（正コントロール）、非感染ヒトＤ
ＮＡ１００ｎｇ（負コントロール）、患者バイオプシー
から精製されたＤＮＡ１００ｎｇ、頸部細胞を捕集した
綿棒から得られらた直接溶解細胞（ＤＮＡ約１５０ｎ
ｇ）およびバイオプシーからの１ｍｍ³組織であった。
反応を最終容積１００ｕｌ中反応緩衝液（５０ｍＭＫＣ
l、０.０１％ゼラチン、１.５％ＭgＣl₂、０.０５％ト
リトン−Ｘ１００、２００ｎＭ各々ｄＮＴＰ、１ｕＭ各
々プライマーおよびタックＤＮＡポリメラーゼの２.５
ユニット）中で行った。サイクルを行う間水の損失を避
けるために各々の反応において鉱油で液の表面を覆っ
た。

【００５５】アガロースまたはアクリルアミドゲル電気
泳動図において、増幅された断片の型により感染してい
るウイルス型を区別するのは容易である(第５図参照)。
第５図は、エチジウムブロミドで染色後にＰＣＲアッセ
イの結果の典型的なポリアクリルアミド電気泳動の６−
結合パターンを示す。各々の型−特異性逆プライマーの
塩基対型を左のカラムに示す。ＰＣＲ増幅生成物の不在
または存在に従って、患者がＨＰＶおよびどちらの型に
感染しているかを同定する。更に、図はプライマーが完
全に両立でき、同様の反応において使用され得ることを
示す。ウイルス型感染を、同様の電気泳動において、全
４種のＨＰＶを含む、正コントロールでの正の事例から
増幅された断片型を対照して区別し得る。

【００５６】

【配列表】

【００５７】配列番号：１配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１：配列ＧＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＣＡＧＴＧＴＴＡＴＡＣＡＧＧ

【００５８】配列番号：２配列の長さ：２５配列の型：核酸配列の数：単鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：２：配列ＡＴＡＴＣＡＧＡＴＧＡＣＧＡＧＲＡＣＧＡＡＡＡＴＧ

【００５９】配列番号：３配列の長さ：１５配列の型：核酸配列の数：単鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：３：配列ＡＧＣＣＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴ

【００６０】配列番号：４配列の長さ：１４配列の型：核酸配列の数：単鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：４：配列ＡＴＧＧＴＡＣＡＡＴＧＧＧＣ

【００６１】配列番号：５配列の長さ：１８配列の型：核酸配列の数：単鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：５：配列ＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＧＡＡＴＣ

【００６２】配列番号：６配列の長さ：１８配列の型：核酸配列の数：単鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：６：配列ＧＴＴＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＣ

【００６３】配列番号：７配列の長さ：２２配列の型：核酸配列の数：単鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：７：配列ＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＣＡＡＣＡＧ

【００６４】配列番号：８配列の長さ：２２配列の型：核酸配列の数：単鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：８：配列ＴＧＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＣ

【図面の簡単な説明】

【図１】万能及び悪性プローブとの化学反応産物ドッ
トブロットハイブリダイゼーションのオートラジオグラ
ムを示す。

【図２】ＨＰＶ感染及び非感染組織のインサイチュ・
ハイブリダイゼーションの陽性及び陰性反応の顕微鏡写
真の写真複写を示す。

【図３】インサイチュ・ハイブリダイゼーションの結
果を実施している顕微鏡写真の写真複写である。

【図４】本発明に有用なハイブリダイゼーション箱の
概要の描写である。

【図５】エチジウムブロミドで染色後ＰＣＲアッセー
の結果の典型的ポリアクリルアミド電気泳動６バンドパ
ターンヲ示す。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年３月１０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】万能及び悪性プローブとの化学反応産物ドッ
トブロットハイブリダイゼーションのオートラジオグラ
ムを示す薄膜の写真である。

【図２】ＨＰＶ感染及び非感染組織のインサイチュ・
ハイブリダイゼーションの陽性及び陰性反応を顕微鏡的
に示す薄膜の写真である。

【図３】完全ＨＰＶウイルス性ゲノムをプローブとし
て用いたインサイチュ・ハイブリダイゼーションの結果
を顕微鏡的に示す薄膜の写真である。

【図４】本発明に有用なハイブリダイゼーション箱の
斜視図である。

【図５】エチジウムブロミドで染色後ＰＣＲアッセー
の結果の典型的ポリアクリルアミド上の電気泳動を示す
写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 8310−2Ｊ (71)出願人 592157249 ウニベルシダッド・セントラル・デ・ヴェネズエラＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＣＥＮＴＲＡＬＤＥＶＥＮＥＺＵＥＬＡヴェネズエラ、カラカス、シウダッド・ウニベルシタリア（番地の表示なし) (72)発明者イバン・ガリンド−カストロヴェネズエラ、カミノス・ウルブ・ロス・ドス・カラカス、レシデンシアス・ジュタヘ・アパルタメント・ベー−134、アベニダ・スクレ（番地の表示なし) (72)発明者ホセ・ルイス・ラミレスヴェネズエラ、カラカス、モンテ、ウルブ・コリナス・デ・ベジョ、アパルタメント１−５アー、レシデンシアス・タマナコ・イー、カジェ・オリノコ、ラマル１番 (72)発明者ラファエル・ランヘル−アルダオヴェネズエラ、カラカス、ウルブ・ロス・ナランホス、レシデンシアス・エル・ポルタル、アパルタメント８ベー、アベニダ・エステ３番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１又はその安定してハイブリダ
イゼーション可能な断片を含むポリヌクレオチド分子。
【請求項２】配列番号２(式中ＲはＡ又はＧである)又
はその安定してハイブリダイゼーション可能な断片を含
むポリヌクレオチド分子。
【請求項３】該配列から本質的に成る請求項１のポリ
ヌクレオチド。
【請求項４】該配列から本質的に成る請求項２のポリ
ヌクレオチド。
【請求項５】ポリデオキシヌクレオチドである請求項
１又は２のいずれかのポリヌクレオチド。
【請求項６】検出可能標識形である請求項１又は２の
いずれかのポリヌクレオチド。
【請求項７】該検出可能標識形が標識を含み、該標識
は放射活性標識、酵素、蛍光色素、化学発光剤、抗体及
びビオチンからなる群から選ばれる請求項６のポリヌク
レオチド。
【請求項８】該検出可能標識形が抗原を含み、該抗原
は標識抗体に特異的に結合する請求項６のポリヌクレオ
チド。
【請求項９】該抗原が該プローブに付着したデオキシ
ヌクレオチド三リン酸塩(dＮＴＰ)尾部を含み、該dＮＴ
Ｐ尾部はそこに結合した抗体残基を有する請求項８のポ
リヌクレオチド。
【請求項１０】該抗体残基がジゴキシゲニンを含む請
求項９のポリヌクレオチド。
【請求項１１】該標識抗体がアルカリホスファターゼ
接合抗ジゴキシゲニン抗体を含む請求項８のポリヌクレ
オチド。
【請求項１２】該検出可能標識形が該ポリヌクレオチ
ド分子の３'末端に付着したジゴキシゲニンdＮＴＰ尾部
を含む請求項６のポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】該検出可能標識形がアルカリホスファ
ターゼ接合抗ジゴキシゲーンポリクローナル抗体との組
合せで該ポリヌクレオチド分子に付着したジゴキシゲニ
ンdＮＴＰ尾部を含む請求項６のポリヌクレオチド分
子。
【請求項１４】請求項１のポリヌクレオチドと請求項
２のそれの混合物を含む組成物。
【請求項１５】 (a)ＨＰＶ遺伝配列を含む試料(b)ハイ
ブリダイゼーション緩衝液、及び(c)請求項１又は２の
ポリヌクレオチドのいずれか１つ又は両者の混合物の配
列を有する検出可能標識プローブ、を含むハイブリダイ
ゼーション混合物。
【請求項１６】該検出可能標識プローブが標識を含
み、該標識は放射活性標識、酵素、蛍光色素、化学発光
剤、抗体及びビオチンからなる群から選ばれる請求項１
５のハイブリダイゼーション混合物。
【請求項１７】該検出可能標識プローブが抗原を含
み、該抗原が標識抗体に特異的に結合する請求項１５の
ハイブリダイゼーション混合物。
【請求項１８】該抗体が該プローブに付着したデオキ
シヌクレオチド三リン酸塩(dＮＴＰ)尾部を含み、該dＮ
ＴＰ尾部はそれに付着した抗原残基を有する請求項１７
のハイブリダイゼーション混合物。
【請求項１９】該抗原残基がジゴキシゲニンを含む請
求項１８のハイブリダイゼーション混合物。
【請求項２０】該標識抗体がアルカリホスファターゼ
接合抗ジゴキシゲニン抗体を含む請求項１７のハイブリ
ダイゼーション混合物。
【請求項２１】ＨＰＶの遺伝配列を含むか又は含むと
考えられる試料中のＨＰＶを検出する方法であって、該
試料を請求項１又は請求項２の配列を有する検出可能標
識プローブと、又は両者の混合物と適当なハイブリダイ
ゼーション条件下接触させて、該プローブ又はプローブ
類を該試料に安定にハイブリダイゼーションすること、
及び該標識を検出することを含む。
【請求項２２】インサイチユ・サイトハイブリダイゼ
ーションである請求項２１の方法。
【請求項２３】該試料が外陰、頚又は陰茎起原の細胞
を含む請求項２１の方法。
【請求項２４】 (a)請求項１又は２のポリヌクレオチ
ド分子又はその混合物を含む第１コンテナー及び(b)該
ポリヌクレオチドの存在を示す能力のある１又はそれ以
上の試薬を含む第２コンテナーを組合せて含む、１又は
それ以上のコンテナーを密閉監禁されるように区分され
たキット。
【請求項２５】該ポリヌクレオチドの存在を示しうる
該試薬が検出可能標識を含む請求項２４のキット。
【請求項２６】該検出可能標識が放射活性標識、酵
素、蛍光色素、化学発光剤、抗体及びビオチンからなる
群から選ばれる請求項２５のキット。
【請求項２７】抗原が該ポリヌクレオチドに付着した
デオキシヌクレオチド三リン酸塩(dＮＴＰ)尾部を含
み、該dＮＴＰ尾部がそれに付着した抗原残基を有する
請求項２６のキット。
【請求項２８】該抗原残基がジゴキシゲニンを含む請
求項２７のキット。
【請求項２９】該抗体が検出可能標識に接合し、請求
項２８の抗原残基に特異的に結合する請求項２６のキッ
ト。
【請求項３０】該標識抗体がアルカリホスファターゼ
接合抗ジゴキシゲニン抗体を含む請求項２９のキット。