ES2965345T3 - Agente de liberación de ácido nucleico, método de amplificación de ácido nucleico por PCR y kit de amplificación por PCR - Google Patents

Agente de liberación de ácido nucleico, método de amplificación de ácido nucleico por PCR y kit de amplificación por PCR Download PDF

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Abstract

Se desvelan un agente de liberación de ácido nucleico, un método de amplificación por PCR y un kit de amplificación por PCR. El agente de liberación de ácido nucleico comprende Tris-HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, tween 20, Triton X-100, etilfenilpolietilenglicol y una base fuerte, siendo la concentración molar de Tris-HCl de 0,5 mM a 500 mM, siendo la concentración molar de Tris-HCl de 0,5 mM a 500 mM. de cloruro de sodio siendo de 20 mM a 500 mM, siendo el porcentaje en volumen de Tween 20 de 0,1% a 2%, siendo el porcentaje en volumen de Triton X-100 de 0,1% a 3%, siendo el porcentaje en volumen de etilfenilpolietilenglicol de 0,1% a 500 mM. 3%, siendo la concentración en masa de cloruro de potasio de 5 mg/ml a 8 mg/ml y siendo la concentración en masa de la base fuerte de 2 mg/ml a 50 mg/ml. El agente de liberación de ácido nucleico puede permitir que una muestra que contiene ARN libere ARN directamente a temperatura ambiente y se mezcle directamente con una solución de reacción de PCR para la amplificación por PCR. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Agente de liberación de ácido nucleico, método de amplificación de ácido nucleico por PCR y kit de amplificación por PCR
Campo técnico
La presente descripción se relaciona con el campo de la biología molecular, en particular a un agente de liberación de ácido nucleico, un método para la amplificación de un ácido nucleico por PCR y un kit de amplificación por PCR.
Antecedentes
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica biológica molecular para amplificar un fragmento de ácido nucleico específico, que se caracteriza importantemente, por el enriquecimiento masivo y el aumento de una cantidad mínima de ácido nucleico, para facilitar la detección de la cantidad mínima de ácido nucleico. El método de PCR usado comúnmente en el diagnóstico médico es principalmente un método de PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real basado en sondas fluorescentes duales. Las dianas para el diagnóstico in vitro usando el método de qPCR incluyen principalmente ADN genómico humano, virus de ADN, bacterias, hongos, virus de ARN y lo similar. WO 94/26867 A1 se refiere a un proceso para alterar los viriones y aislar los ácidos nucleicos de un virus mediante la provisión de un regulador de lisis directa que comprende una combinación de proteinasa K y detergentes seleccionados de dodecil sulfato de sodio, Triton X-100 y Tween 20. WO 2007/146197 A1 se refiere a métodos y reactivos para el aislamiento y detección de virus, en particular, a un reactivo de aislamiento de partículas virales, que comprende un agente aglutinante de partículas de virus y un soporte sólido, tal como un reactivo de captura del virus de la Hepatitis o VIH. Sin embargo, dado que el ARN tiene una estructura monocatenaria, que es inestable y fácilmente degradada, un proceso de tratamiento de muestras se somete a requisitos muy estrictos, y se requiere un método más complicado para el pretratamiento, extracción de ácido nucleico y purificación de la muestra de ARN a ser amplificadas para obtener el ácido nucleico puro, después puede realizarse la detección para obtener un resultado estable.
Sumario
Por consiguiente, es necesario proporcionar un agente de liberación de ácido nucleico que pueda simplificar el método de amplificación por PCR de las muestras de ARN.
La presente descripción proporciona un agente de liberación de ácido nucleico que comprende Tris-HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, Tween 20, Triton X-100, etilfenilpolietilenglicol y una base fuerte; caracterizado porque el Tris-HCl tiene una concentración molar que varía de 0.5 mM a 500 mM, el cloruro de sodio tiene una concentración molar de 20 mM a 500 mM, el cloruro de potasio tiene una concentración de masa que varía de 5 mg/ml a 8 mg/ml, Tween 20 tiene un porcentaje de volumen que varía de 0.1 % a 2 %, Triton X-100 tiene un porcentaje en volumen que varía de 0.1 % a 3 %, el etilfenilpolietilenglicol tiene un porcentaje de volumen que varía de 0.1 % a 3 %, y la base fuerte tiene una concentración de masa que varía de 2 mg/ml a 50 mg/ml.
En el agente de liberación de ácido nucleico de la presente descripción, una cierta proporción de la base fuerte lisa las células, que liberan ácidos nucleicos. El cloruro de sodio y el cloruro de potasio protegen los ácidos nucleicos al coordinar el equilibrio de iones intracelulares y extracelulares. El Tris-HCl es para mantener un valor de pH estable durante la lisis celular y mejor compatible con una solución de reacción de PCR en la posterior amplificación. El Triton X-100, por un lado, puede proteger los ácidos nucleicos, especialmente el ARN monocatenario, lo que permite que el ARN se almacene en un ambiente alcalino. Por otro lado, el Triton X-100 con cloruro de potasio en una cierta relación puede reducir el efecto inhibitorio del ambiente alcalino fuerte sobre la enzima en la reacción de PCR, lo que asegura la eficiencia de amplificación del ARN. El Tween 20 y el etilfenilpolietilenglicol pueden proteger la transcriptasa inversa, de manera que la transcriptasa inversa funciona normalmente en el ambiente alcalino. A través de la sinergia de los componentes anteriores, el agente de liberación de ácido nucleico de la presente descripción permite que una muestra que contiene ARN libere directamente ARN a temperatura ambiente, lo que evita el problema de la contaminación de la muestra causada por el aerosol generado por el calentamiento, y evita eficazmente que el ARN se degrade en el ambiente alcalino. Más importante, puede mezclarse directamente con la solución de reacción de PCR para la amplificación por PCR para completar la amplificación sin la necesidad de procesos complicados de extracción y purificación de ácido nucleico. Esto realmente realiza una amplificación y detección por ARN en una cámara, libre de contaminación, simple y rápida, con sensibilidad de alta detección y buena repetibilidad.
En una de las modalidades, el agente de liberación de ácido nucleico comprende además betaína y albúmina sérica bovina, en donde la betaína tiene una concentración de masa que varía de 0.1 mg/ml a 20 mg/ml, y la albúmina sérica bovina tiene una concentración de masa que varía de 5 mg/ml a 100 mg/ml.
En una de las modalidades, el agente de liberación de ácido nucleico comprende además proteinasa K y dodecil sulfato de litio, en donde la proteinasa K tiene una concentración de masa que varía de 0.02 mg/ml a 1.5 mg/ml, y el dodecil sulfato de litio tiene una concentración de masa que varía de 0.4 mg/ml a 30 mg/ml.
La presente descripción también proporciona un método para la amplificación por PCR de un ácido nucleico, que comprende las etapas de: mezclar el agente de liberación de ácido nucleico como se describió anteriormente con una muestra, colocar la mezcla a 25 °C a 60 °C durante 2 min a 10 min, y añadir una solución de reacción de PCR para la amplificación por PCR.
En una de las modalidades, el método comprende además una etapa de pretratamiento de muestras de mezclar la muestra con polietilenglicol seguido de centrifugación para recolectar un precipitado antes de mezclar el agente de liberación de ácido nucleico con la muestra.
En una de las modalidades, la amplificación por PCR de los virus intestinales en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
transcripción inversa a 48 °C a 52 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de
53 °C a 57 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
En una de las modalidades, la amplificación por PCR del virus de la hepatitis C en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
predesnaturalización y activación enzimática a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
transcripción inversa a 58 °C a 62 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de
58 °C a 62 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
En una de las modalidades, la amplificación por PCR de virus respiratorios en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
transcripción inversa a 48 °C a 52 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de
58 °C a 62 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
En una de las modalidades, la amplificación por PCR de bacterias respiratorias en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
reacción enzimática UDG a 48 °C a 52 °C durante 1.9 min a 2.1 min;
desnaturalización térmica a 92 °C a 96 °C durante 2.9 min a 3.1 min;
varios ciclos de amplificación a 92 °C a 96 °C durante 8 segundos a 12 segundos seguido de
58 °C a 62 °C durante 18 segundos a 22 segundos;
la extensión y la recolección de fluorescencia a 73 °C a 77 °C durante 18 segundos a 22 segundos; curva de fusión: 62 °C a 75 °C.
La presente descripción también proporciona un kit de amplificación por PCR, que comprende el agente de liberación de ácido nucleico como se describe anteriormente y una solución de reacción de PCR.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra curvas de amplificación por PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real en los Ejemplos 1 25.
La Figura 2 muestra curvas de amplificación por PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real en los Ejemplos 26-50.
La Figura 3 muestra curvas de amplificación por PCR cuantitativa por fluorescencia, en tiempo real en los Ejemplos 51-70.
La Figura 4 muestra curvas de amplificación por PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real en los Ejemplos 71-90.
Descripción detallada de las modalidades
Para hacer la presente descripción fácil de entender, a continuación se proporcionará una descripción más completa de la presente descripción, y se proporcionan mejores modalidades de la presente descripción a continuación. Sin embargo, la presente descripción puede implementarse en muchas maneras diferentes y no debe limitarse a las modalidades descritas en la presente descripción. Por el contrario, el propósito de proporcionar estas modalidades es proporcionar una comprensión más minuciosa y completa de la descripción de la presente descripción.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen los mismos significados que los entendidos generalmente por los expertos en la técnica de la presente descripción. Los términos usados en la especificación de la presente descripción son solo para el propósito de describir modalidades específicas, en lugar de limitar la presente descripción. El término “y/o” como se usa en la presente descripción incluye cualquiera y todas las combinaciones de uno o más elementos enumerados relacionados.
En una modalidad de la presente descripción, un agente de liberación de ácido nucleico comprende Tris-HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, Tween 20, Triton X-100, etilfenilpolietilenglicol y una base fuerte; caracterizado porque el Tris-HCl tiene una concentración molar que varía de 0.5 mM a 500 mM, el cloruro de sodio tiene una concentración molar de 20 mM a 500 mM, el cloruro de potasio tiene una concentración de masa que varía de 5 mg/ml a 8 mg/ml, Tween 20 tiene un porcentaje de volumen que varía de 0.1 % a 2 %, Triton X-100 tiene un porcentaje en volumen que varía de 0.1 % a 3 %, el etilfenilpolietilenglicol tiene un porcentaje de volumen que varía de 0.1 % a 3 %, y la base fuerte tiene una concentración de masa que varía de 2 mg/ml a 50 mg/ml.
Para lograr el efecto de lisis, una solución de lisis necesita ser alcalina, pero el ARN se degrada fácilmente en un ambiente alcalino. Además, una transcriptasa inversa, que se requiere para la amplificación por PCR y la detección de ARN, es relativamente frágil en comparación con la polimerasa de TaqADN térmicamente estable y se inhibe fácilmente en un ambiente alcalino, lo que da como resultado una incapacidad para lograr el efecto de la transcripción inversa. Por lo tanto, el ARN en la solución de lisis generalmente no puede amplificarse directamente y detectarse mediante PCR. En la actualidad, los métodos de pretratamiento para la amplificación por PCR y la detección de muestras de ARN incluyen principalmente un método de lisis en ebullición y un método de microesferas magnéticas. En el método de lisis en ebullición, los ácidos nucleicos en una muestra se liberan por ebullición bajo la acción de un regulador de lisis y se disuelven en el regulador de lisis. Mientras las células se lisan en un baño de agua hirviendo, las proteínas y los cromosomas de las células se desnaturalizan. Después, las proteínas desnaturalizadas y otras impurezas se eliminan mediante centrifugación, y los ácidos nucleicos en el sobrenadante se recuperan para la amplificación por PCR. Sin embargo, la coagulación de las proteínas sometidas a ebullición a una temperatura alta provoca que parte de los ácidos nucleicos se envuelva y se apague con la centrifugación, lo que conduce directamente a una disminución en la cantidad de ácidos nucleicos plantilla en el sobrenadante, lo que reduce la sensibilidad de la amplificación y detección posteriores. Además, los aerosoles se producen fácilmente por ebullición y calentamiento, lo que conduce a la contaminación de la muestra, lo que resultará en resultados falsos positivos en la detección posterior. En el método de microesferas magnéticas, las células se lisan en una solución de lisis y las moléculas de ácido nucleico libre se adsorben específicamente a la superficie de las partículas magnéticas, mientras que las impurezas tales como las proteínas no se adsorben, pero permanecen en la solución. Después de reaccionar durante un cierto período de tiempo, las partículas magnéticas se separan del líquido bajo la acción de un campo magnético, seguido de la elución con un eluyente para obtener ácidos nucleicos puros. Sin embargo, el método de microesferas magnéticas tiene una operación complicada, requiere un tamaño de muestra que es generalmente de 200 a 600 microlitros, y tiene una demanda muy alta en los equipos, lo que da limitaciones en su promoción y uso.
Basada en el mecanismo anterior, en el agente de liberación de ácido nucleico de esta modalidad, una cierta proporción de base fuerte lisa células, que liberan ácidos nucleicos. El cloruro de sodio y el cloruro de potasio protegen los ácidos nucleicos al coordinar el equilibrio de iones intracelulares y extracelulares. El Tris-HCl es para mantener un valor de pH estable durante la lisis celular y es más compatible con una solución de reacción de<p>C<r>en la posterior amplificación. El Triton X-100, por un lado, puede proteger los ácidos nucleicos, especialmente el ARN monocatenario, lo que permite que el ARN se almacene en un ambiente alcalino. Por otro lado, el Triton X-100 con cloruro de potasio en una cierta relación puede reducir el efecto inhibitorio del ambiente alcalino fuerte sobre la enzima en la reacción de PCR, lo que asegura la eficiencia de amplificación del ARN. El Tween 20 y el etilfenilpolietilenglicol pueden proteger la transcriptasa inversa, de manera que la transcriptasa inversa funciona normalmente en el ambiente alcalino. A través de la sinergia de los componentes anteriores, el agente de liberación de ácido nucleico de esta modalidad permite que una muestra que contiene ARN libere directamente ARN a temperatura ambiente, lo que evita el problema de la contaminación de la muestra causada por el aerosol generado por el calentamiento y evita eficazmente que el ARN se degrade en el ambiente alcalino. Más importante, puede mezclarse directamente con la solución de reacción de PCR para la amplificación por PCR para completar la amplificación, sin la necesidad de procesos complicados de extracción y purificación de ácido nucleico. Esto realmente realiza una amplificación y detección por ARN en una cámara, libre de contaminación, simple y rápida, con sensibilidad de alta detección y buena repetibilidad. Puede entenderse que el agente de liberación de ácido nucleico puede usarse no solo para la amplificación por PCR y la detección de muestras de ARN, sino también para la amplificación y detección múltiple y combinada de muestras de ADN o muestras mixtas de ARN y ADN.
Específicamente, la base fuerte es hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, y lo similar, que pueden seleccionarse según sea necesario.
En un ejemplo específico, el agente de liberación de ácido nucleico comprende además betaína y albúmina sérica bovina, en donde la betaína tiene una concentración de masa que varía de 0.1 mg/ml a 20 mg/ml, y la albúmina sérica bovina tiene una concentración de masa que varía de 5 mg/ml a 100 mg/ml. La cierta proporción de betaína y albúmina sérica bovina añadida puede colaborar con el Triton X-100 para proteger mejor el ARN en condiciones alcalinas y prevenir la polimerasa y transcriptasa inversa a partir de su desnaturalización, lo que garantiza la liberación rápida y la amplificación del ARN para lograr una rápida detección de muestras de ARN.
En un ejemplo específico, el agente de liberación de ácido nucleico comprende además proteinasa K y dodecil sulfato de litio, en donde la proteinasa K tiene una concentración de masa que varía de 0.02 mg/ml a 1.5 mg/ml, y el dodecil sulfato de litio tiene una concentración de masa que varía de 0.4 mg/ml a 30 mg/ml. La cierta proporción de proteinasa K y dodecil sulfato de litio añadida puede desnaturalizar y degradar ribonucleasa, lo que protege adicionalmente el<a>R<n>a partir de su degradación.
En una modalidad de la presente descripción, un método para la amplificación por PCR de un ácido nucleico comprende las etapas de: mezclar el agente de liberación de ácido nucleico como se describió anteriormente con una muestra, colocar la mezcla a 25 °C a 60 °C durante 2 min a 10 min, y añadir una solución de reacción de PCR para la amplificación por PCR.
El método para la amplificación por PCR del ácido nucleico en esta modalidad da cuenta de la operación de amplificación directa sin extracción y purificación para muestras de ácido nucleico tales como ARN, es decir, la amplificación y detección de la muestra de ácido nucleico puede realizarse al añadir el agente de liberación de ácido nucleico descrito anteriormente a la muestra para liberar los ácidos nucleicos de las células, añadir la solución de reacción de PCR y realizar amplificación por PCR tal como PCR cuantitativa en tiempo real directamente, sin la necesidad de procesos de ebullición y calentamiento o extracción y purificación, y lo similar. Esto realmente realiza una amplificación y detección por ARN en una cámara, libre de contaminación, simple y rápida, con sensibilidad de alta detección y buena repetibilidad.
En un ejemplo específico, una relación de volumen del agente de liberación de ácido nucleico a la muestra es de 1:1 a 1:5. Opcionalmente, las muestras pueden ser de una variedad de tipos que incluyen suero, plasma, un hisopo orofaríngeo, un hisopo nasofaríngeo, fluido de lavado alveolar, deposición y lo similar, y después de mezclarse con el agente de liberación de ácido nucleico, pueden usarse directamente en los métodos de detección corriente abajo, tales como amplificación por PCR o chip génico.
En un ejemplo específico, la solución de reacción de PCR comprende trifosfato de desoxirribonucleósido, un cebador directo, un cebador inverso, ADN polimerasa, transcriptasa inversa y tampón de amplificación, y lo similar. Puede entenderse que, de acuerdo con diferentes tipos y propósitos de la reacción de PCR, la composición de la solución de reacción de PCR puede seleccionarse según sea necesario y no se limita a estas. Por ejemplo, cuando se realiza una PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real, la solución de reacción de PCR también incluye sondas fluorescentes o tintes fluorescentes, etc.
En un ejemplo específico, el método comprende además una etapa de pretratamiento de la muestra donde se mezcla la muestra con polietilenglicol seguido de centrifugación para recolectar un precipitado antes de mezclar el agente de liberación de ácido nucleico con la muestra. Específicamente, el polietilenglicol es PEG-6000, con una concentración de 0.5 % a 5 % en volumen. Puede utilizarse polietilenglicol como agente de sedimentación de ácido nucleico para el tratamiento de muestras complejas. Puede capturar eficazmente los virus de ARN en forma libre y aumentar la sensibilidad de la detección posterior sin afectar el sistema de reacción de PCR, y puede mejorar significativamente el rendimiento de la detección rápida de ARN. Por ejemplo, para fluidos conservantes de células que contienen soluciones de alta sal, fluidos de conservación de virus o muestras de sangre hemolizadas, pueden tomarse 50 a 5000 microlitros de la muestra y puede añadirse la solución de PEG en un volumen igual a esta seguido de centrifugación a 3000 a 13000 rpm/min durante 1 a 10 min, con el sobrenadante descartado y añadir el gránulo, y después se añaden 50 a 100 microlitros de agente de liberación de ácido nucleico.
En un ejemplo específico, la amplificación por PCR de los virus intestinales en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
transcripción inversa a 48 °C a 52 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de
53 °C a 57 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
En un ejemplo específico, la amplificación por PCR del virus de la hepatitis C (HCV) en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
predesnaturalización y activación enzimática a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
transcripción inversa a 58 °C a 62 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de
58 °C a 62 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
En un ejemplo específico, la amplificación por PCR de virus respiratorios en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
transcripción inversa a 48 °C a 52 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de
58 °C a 62 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
En un ejemplo específico, la amplificación por PCR de bacterias respiratorias en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
reacción enzimática UDG a 48 °C a 52 °C durante 1.9 min a 2.1 min;
desnaturalización térmica a 92 °C a 96 °C durante 2.9 min a 3.1 min;
varios ciclos de amplificación a 92 °C a 96 °C durante 8 segundos a 12 segundos seguido de
58 °C a 62 °C durante 18 segundos a 22 segundos;
la extensión y la recolección de fluorescencia a 73 °C a 77 °C durante 18 segundos a 22 segundos; curva de fusión: 62 °C a 75 °C.
Puede entenderse que las condiciones para la amplificación por PCR no se limitan a los ejemplos específicos anteriores, y pueden ajustarse de acuerdo con diferentes tipos y propósitos de PCR.
En una modalidad de la presente descripción, un kit de amplificación por PCR comprende el agente de liberación de ácido nucleico como se describe anteriormente y una solución de reacción de PCR. El kit de amplificación por PCR en esta modalidad realiza la operación de amplificación directa sin extracción y purificación para muestras de ácido nucleico tales como ARN, es decir, la amplificación y detección de la muestra de ácido nucleico puede realizarse mediante la adición del agente de liberación de ácido nucleico descrito anteriormente a la muestra para liberar los ácidos nucleicos de las células, añadir la solución de reacción de PCR y realizar amplificación por PCR tal como PCR cuantitativa en tiempo real directamente, sin la necesidad de procesos de ebullición y calentamiento o extracción y purificación, y lo similar. Esto realmente realiza una amplificación y detección por ARN en una cámara, libre de contaminación, simple y rápida, con sensibilidad de alta detección y buena repetibilidad.
Los siguientes son ejemplos específicos.
1. Detección para virus intestinales
Ejemplos 1 a 25: Se prepararon 25 muestras de hisopado de garganta de virus intestinal (vehículo de preservación de fluido de virus). Se tomaron 100 pl de cada muestra y se centrifugaron a 12,000 rpm/min durante 10 min, con el sobrenadante descartado. Después de añadir 50 pl de un agente de liberación de ácido nucleico y reposar durante 10 minutos, 10 pl de la muestra tratada con agente de liberación de ácido nucleico se mezclaron con 40 pl de una solución de reacción de PCR para realizar una amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real. La curva de amplificación se muestra en la Figura 1. El agente de liberación de ácido nucleico usado en los Ejemplos 1 a 25 comprendió Tris-HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, Tween 20, Triton X-100, etilfenilpolietilenglicol, betaína, albúmina sérica bovina, proteinasa K, dodecil sulfato de litio e hidróxido de sodio; en donde el Tris-HCl tuvo una concentración molar de 0.5 mM, el cloruro de sodio tuvo una concentración molar de 500 mM, Tween 20 tuvo un porcentaje de volumen de 0.1 %, Triton X-100 tuvo un porcentaje de volumen de 3 %, el etilfenilpolietilenglicol tuvo un porcentaje en volumen de 0.1 %, el cloruro de potasio tuvo una concentración de masa de 8 mg/ml, el hidróxido de sodio tuvo una concentración en masa de 2 mg/ml, la betaína tuvo una concentración de masa de 20 mg/ml, la albúmina sérica bovina tuvo una concentración de masa de 5 mg/ml, la proteinasa K tuvo una concentración de masa de 1.5 mg/ml, y el dodecil sulfato de litio tuvo una concentración de masa de 0.4 mg/ml.
Ejemplos comparativos 1-25: Las 25 muestras anteriores se trataron mediante el método de microesferas magnéticas y se realizó la amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real. Los Ejemplos comparativos 26-35 fueron básicamente los mismos que los Ejemplos 1 a 10, excepto que el Tween 20 y el etilfenilpolietilenglicol no estaban comprendidos en el agente de liberación de ácido nucleico.
Los Ejemplos comparativos 36-45 fueron básicamente los mismos que los Ejemplos 11 a 20, excepto que el Triton X-100 no estaba comprendido en el agente de liberación de ácido nucleico. Los Ejemplos comparativos 46-50 fueron básicamente los mismos que los Ejemplos 21 a 25, excepto que Triton X-100 en el agente de liberación de ácido nucleico tuvo un porcentaje de volumen de 8 % y el cloruro de potasio tuvo una concentración de masa de 15 mg/ml.
Los valores de Ct en los ejemplos y los ejemplos comparativos se muestran en la Tabla 1. La amplificación por PCR se realizó en las siguientes condiciones:
transcripción inversa a 50 °C durante 30 min;
desnaturalización térmica a 95 °C durante 1 min;
45 ciclos de amplificación a 95 °C durante 15 segundos seguido de 55 °C durante 30 segundos; enfriar a 25 °C durante 10 segundos.
Tabla 1
De acuerdo con los resultados de la prueba, pueden detectarse muestras que eran positivas para el virus intestinal en todos los Ejemplos comparativos 1 a 25 y los Ejemplos 1 a 25 con una tasa consistente de resultados de 100 % y una buena precisión. Sin embargo, las muestras que eran positivas para el virus intestinal no pueden detectarse de manera estable y exitosa en los Ejemplos comparativos 26-50. Además, un valor de Ct más pequeño indica una mayor sensibilidad de detección. Al comparar los valores de Ct, puede verse que en los ejemplos usando el agente de liberación de ácido nucleico y el método para la amplificación por PCR del ácido nucleico de la presente descripción, la sensibilidad de la amplificación y detección de muestras de ARN es equivalente a la que usa el método de microesferas magnéticas.
2. Detección combinada para bacterias respiratorias
Ejemplos 26 a 50: 25 Se prepararon muestras de esputo del tracto respiratorio (vehículo salino normal). Se tomaron 5 |jl de cada muestra y a estas se añadió 5 j l de un agente de liberación de ácido nucleico, seguido de reposo durante 10 min. Se añadió 40 j l de una solución de reacción de PCR con mezcla para realizar una amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real. La curva de amplificación se muestra en la Figura 2. Los agentes de liberación de ácido nucleico usados comprenden Tris-HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, Tween 20, Triton X-100, etilfenilpolietilenglicol, betaína, albúmina sérica bovina, proteinasa K, dodecil sulfato de litio e hidróxido de sodio; en donde el Tris-HCl tuvo una concentración molar de 500 mM, el cloruro de sodio tuvo una concentración molar de 20 mM, Tween 20 tuvo un porcentaje de volumen de 2 %, Triton X-100 tuvo un porcentaje de volumen de 0.1 %, el etilfenilpolietilenglicol tuvo un porcentaje de volumen de 3 %, el cloruro de potasio tuvo una concentración de masa de 5 mg/ml, el hidróxido de sodio tuvo una concentración de masa de 50 mg/ml, la betaína tuvo una concentración de masa de 0.1 mg/ml, la albúmina sérica bovina tuvo una concentración de masa de 100 mg/ml, la proteinasa K tuvo una concentración de masa de 0.02 mg/ml, y el dodecil sulfato de litio tuvo una concentración de masa de 30 mg/ml.
Ejemplos comparativos 51-75: Las 25 muestras anteriores se trataron mediante el método de microesferas magnéticas y se realizó la amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real.
Los valores de Ct en los ejemplos y los ejemplos comparativos se muestran en la Tabla 2. La amplificación por PCR se realizó en las siguientes condiciones:
Reacción enzimática UDG a 50 °C durante 2 min;
desnaturalización térmica a 94 °C durante 3 min;
45 ciclos de amplificación a 94 °C durante 10 segundos seguido de 60 °C durante 20 segundos;
la extensión y la recolección de fluorescencia a 75 °C durante 20 s;
curva de fusión: 62 °C a 75 °C.
Tabla 2
De acuerdo con los resultados de la prueba, las muestras que eran positivas para las bacterias respiratorias pueden detectarse en todos los ejemplos comparativos y los ejemplos con una tasa consistente de resultados de 100 % y una buena precisión. Además, un valor de Ct más pequeño indica una mayor sensibilidad de detección. Al comparar los valores de Ct, puede verse que en los ejemplos usando el agente de liberación de ácido nucleico y el método para la amplificación por PCR del ácido nucleico de la presente descripción, la sensibilidad de la amplificación y detección múltiple de bacterias fue equivalente a la que usa el método de microesferas magnéticas. También muestra que el agente de liberación de ácido nucleico y el método para la amplificación por PCR del ácido nucleico de la presente descripción no solo son aplicables a la amplificación y detección de muestras de ARN, sino que también pueden aplicarse a la amplificación y detección de muestras de ADN.
3. Detección de virus del HCV
Ejemplos 51 a 70: Se prepararon 20 muestras de suero de HCV. Se tomaron 15 pl de cada muestra y a estas se añadió 5 pl de un agente de liberación de ácido nucleico, seguido de reposo durante 10 min. Se añadió 30 pl de una solución de reacción de PCR con mezcla para realizar una amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real. La curva de amplificación se muestra en la Figura 3. El agente de liberación de ácido nucleico usado comprendió Tris-HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, Tween 20, Triton X-100, etilfenilpolietilenglicol, betaína, albúmina sérica bovina e hidróxido sódico; en donde el Tris-HCl tuvo una concentración molar de 200 mM, el cloruro de sodio tuvo una concentración molar de 250 mM, Tween 20 tuvo un porcentaje de volumen de 1 %, Triton X-100 tuvo un porcentaje de volumen de 2 %, el etilfenilpolietilenglicol tuvo un porcentaje en volumen de 2 %, el cloruro de potasio tuvo una concentración de masa de 7 mg/ml, el hidróxido de sodio tuvo una concentración de masa de 25 mg/ml, la betaína tuvo una concentración de masa de 10 mg/ml, y la albúmina sérica bovina tuvo una concentración de masa de 60 m g/m l.
Ejemplos 91 a 110: se usaron las mismas muestras de suero de HCV como en los Ejemplos 51 a 70. Se tomaron 15 pl de cada muestra y a estas se añadió 5 pl de un agente de liberación de ácido nucleico, seguido de reposo durante 10 min. Se añadió 30 pl de una solución de reacción de PCR con mezcla para realizar una amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real. El agente de liberación de ácido nucleico es el mismo que el agente de liberación de ácido nucleico usado en los Ejemplos 1 a 25.
Los valores de Ct en los ejemplos se muestran en la Tabla 3. La amplificación por PCR se realizó en las siguientes condiciones:
predesnaturalización y activación enzimática a 95 °C durante 1 min;
transcripción inversa a 60 °C durante 30 min;
desnaturalización térmica a 95 °C durante 1 min;
45 ciclos de amplificación a 95 °C durante 15 segundos seguido de 60 °C durante 30 segundos; enfriar a 25 °C durante 10 segundos.
Tabla 3
De acuerdo con la Figura 3, puede observarse que en muestras que eran positivas para el HCV pueden detectarse en todos los ejemplos usando el agente de liberación de ácido nucleico y el método para la amplificación por PCR del ácido nucleico de la presente descripción con buena precisión. Además, puede verse en la Tabla 3 que la sensibilidad de detección en los Ejemplos 51 a 70 es ligeramente peor que la de los Ejemplos 91 a 100, lo que indica que el efecto del agente de liberación de ácido nucleico usado en los Ejemplos 51 a 70 es ligeramente inferior al del agente de liberación de ácido nucleico usado en los Ejemplos 91 a 100.
4. Detección de virus respiratorios
Ejemplos 71 a 90: Se prepararon 20 muestras de hisopado de garganta de virus respiratorio (vehículo salino normal). Se tomaron 100 pl de cada muestra y se centrifugaron a 12,000 rpm/min durante 10 min, con el sobrenadante descartado. Después de añadir 50 pl de un agente de liberación de ácido nucleico y reposar durante 10 minutos, 10 pl de la muestra tratada con agente de liberación de ácido nucleico se mezclaron con 40 pl de una solución de reacción de PCR para realizar una amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real. La curva de amplificación se muestra en la Figura 1. El agente de liberación de ácido nucleico usado comprendió Tris-HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, Tween 20, Triton X-100, etilfenilpolietilenglicol, e hidróxido de sodio; en donde el Tris-HCl tuvo una concentración molar de 400 mM, el cloruro de sodio tuvo una concentración molar de 150 mM, Tween 20, tuvo un porcentaje de volumen de 0.8 %, Triton X-100 tuvo un porcentaje de volumen de 1.2 %, el etilfenilpolietilenglicol tuvo un porcentaje de volumen de 1.5 %, el cloruro de potasio tuvo una concentración de masa de 6 mg/ml, y el hidróxido de sodio tuvo una concentración de masa de 15 mg/ml.
Los Ejemplos 111 a 130: usaron las mismas muestras de hisopado de garganta de virus respiratorio como en los Ejemplos 71 a 90. Se tomaron 100 pl de cada muestra y se centrifugaron a 12,000 rpm/min durante 10 min, con el sobrenadante descartado. Después de añadir 50 pl de un agente de liberación de ácido nucleico y reposar durante 10 minutos, 10 pl de la muestra tratada con agente de liberación de ácido nucleico se mezclaron con 40 pl de una solución de reacción de PCR para realizar una amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real. El agente de liberación de ácido nucleico fue el mismo que el agente de liberación de ácido nucleico usado en los Ejemplos 51 a 70.
Los valores de Ct en los ejemplos se muestran en la Tabla 4. La amplificación por PCR se realizó en las siguientes condiciones:
transcripción inversa a 50 °C durante 30 min;
desnaturalización térmica a 95 °C durante 1 min;
45 ciclos de amplificación a 95 °C durante 15 segundos seguido de 60 °C durante 30 segundos; enfriar a 25 °C durante 10 segundos.
Tabla 4
De acuerdo con la Figura 4, puede verse que las muestras que eran positivas para virus respiratorio pueden detectarse en todos los ejemplos usando el agente de liberación de ácido nucleico y el método para la amplificación por PCR del ácido nucleico de la presente descripción con buena precisión. Además, puede verse en la Tabla 4 que la sensibilidad de detección en los Ejemplos 71 a 90 fue ligeramente peor que la de los Ejemplos 111 a 130, lo que indica que el efecto del agente de liberación de ácido nucleico usado en los Ejemplos 71 a 90 fue ligeramente inferior al del agente de liberación de ácido nucleico usado en los Ejemplos 111 a 130.
Las características técnicas de las modalidades descritas anteriormente pueden combinarse arbitrariamente. Para simplificar la descripción, no se describen todas las combinaciones posibles de las características técnicas en las modalidades anteriores. Sin embargo, todas las combinaciones de estas características técnicas deben considerarse dentro del alcance de la presente descripción, siempre que tales combinaciones no se contradigan entre sí.
Las modalidades descritas anteriormente representan simplemente varias modalidades de la presente descripción, y la descripción de esta es más específica y detallada, pero no debe interpretarse como limitación del alcance de la presente descripción. Por lo tanto, el alcance de la presente descripción se definirá mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un agente de liberación de ácido nucleico, que comprende Tris-HCl, cloruro de sodio, cloruro de potasio, Tween 20, Tritón X-100, etilfenilpolietilenglicol y una base fuerte; caracterizado porque el Tris-HCl tiene una concentración molar que varía de 0.5 mM a 500 mM, el cloruro de sodio tiene una concentración molar de 20 mM a 500 mM, el cloruro de potasio tiene una concentración de masa que varía de 5 mg/ml a 8 mg/ml, Tween 20 tiene un porcentaje de volumen que varía de 0.1% a 2% , Triton X-100 tiene un porcentaje en volumen que varía de 0.1% a 3%, el etilfenilpolietilenglicol tiene un porcentaje de volumen que varía de 0.1 % a 3%, y la base fuerte tiene una concentración de masa que varía de 2 mg/ml a 50 mg/ml.
2. El agente de liberación de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además betaína y albúmina sérica bovina, caracterizado porque la betaína tiene una concentración de masa que varía de 0.1 mg/ml a 20 mg/ml, y la albúmina sérica bovina tiene una concentración de masa que varía de 5 mg/ml a 100 mg/ml.
3. El agente de liberación de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además proteinasa K y dodecil sulfato de litio, caracterizado porque la proteinasa K tiene una concentración de masa que varía de 0.02 mg/ml a 1.5 mg/ml, y el dodecil sulfato de litio tiene una concentración de masa que varía de 0.4 mg/ml a 30 mg/ml.
4. Un método para la amplificación por PCR de un ácido nucleico, que comprende las etapas de: mezclar el agente de liberación de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con una muestra, colocar la mezcla a 25 °C a 60 °C durante 2 min a 10 min, y añadir una solución de reacción de PCR para la amplificación por PCR.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además una etapa de pretratamiento de la muestra de mezclar la muestra con polietilenglicol seguido de centrifugación para recolectar un precipitado antes de mezclar el agente de liberación de ácido nucleico con la muestra.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la amplificación por PCR de los virus intestinales en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
transcripción inversa a 48 °C a 52 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de 53 °C a 57 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la amplificación por PCR del virus de la hepatitis C en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
predesnaturalización y activación enzimática a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
transcripción inversa a 58 °C a 62 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de 58 °C a 62 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la amplificación por PCR de virus respiratorios en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
transcripción inversa a 48 °C a 52 °C durante 28 min a 32 min;
desnaturalización térmica a 93 °C a 97 °C durante 0.9 min a 1.1 min;
varios ciclos de amplificación a 93 °C a 97 °C durante 13 segundos a 17 segundos seguido de 58 °C a 62 °C durante 28 segundos a 32 segundos;
enfriar a 23 °C a 27 °C durante 8 segundos a 12 segundos.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la amplificación por PCR de bacterias respiratorias en la muestra se realiza en las siguientes condiciones:
reacción enzimática UDG a 48 °C a 52 °C durante 1.9 min a 2.1 min;
desnaturalización térmica a 92 °C a 96 °C durante 2.9 min a 3.1 min;
varios ciclos de amplificación a 92 °C a 96 °C durante 8 segundos a 12 segundos seguido de 58 °C a 62 °C durante 18 segundos a 22 segundos;
la extensión y la recolección de fluorescencia a 73 °C a 77 °C durante 18 segundos a 22 segundos; curva de fusión: 62 °C a 75 °C.
10. Un kit de amplificación por PCR, que comprende el agente de liberación de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una solución de reacción de PCR.
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