CN114181932B - 核酸释放剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸释放剂及其应用,核酸释放剂包含15mM‑50mM的强碱、体积百分比为1%‑3%的非离子型表面活性剂、2mM‑5mM的金属离子螯合剂以及缓冲液,强碱包含氢氧化钠或/和氢氧化钾,缓冲液为10mM‑25mM的Tris‑HCl缓冲液。该核酸释放剂能够在常温下进行保存且保存期可超过一年,便于常温运输及储存,降低储存成本,可大规模推广。采用该核酸释放剂能够使整个核酸释放的过程均在室温下进行,有效降低气溶胶的污染,能有效的保护实验操作人员的安全。并且,该核酸释放剂对下游PCR检测试剂盒无特殊要求,下游PCR检测试剂盒适配性较广,也不需要配合使用复杂的仪器。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,特别是涉及一种核酸释放剂及其应用。
背景技术
如何快速可靠地检测SARS-CoV-2对于有效控制COVID-19的大流行至关重要。但是,样本中核酸的提取和纯化,严重影响了样本检测的速度以及现场应用,因为其是整个实验中最耗时,最繁琐的过程。现市面上存在的若干种新型冠状病毒提取试剂盒可以保证检测灵敏度及准确性,但因为提取时间较长,且需要专业设备,因此无法达到进行快速诊断的目的。特别是在疫情爆发期间,大量样本等待检测,一种可以最大化缩短核酸提取时间缩短来降低整个检测周期的解决方案势在必行。
目前,核酸提取技术包括煮沸法、离心柱法以及磁珠法。煮沸法快速、简单,仅需要一台加热装置,但其检测灵敏度较低(尤其提取低拷贝的样本),并且其通过高温破坏病毒结构释放核酸,并不能去除样本中的干扰物质,结果重复性较差,且在操作过程中容易产生气溶胶污染。离心柱法可以提取高质量的核酸,但提取过程操作频繁,需要多个步骤(裂解、漂洗和洗脱等),容易造成气溶胶污染。磁珠法提取步骤简便,易于自动化,但需要的仪器精密,成本相对较高,并且不方便进入现场,无法满足当前下沉市场的需要。
核酸释放剂是一种基于直接能快速释放核酸并且对后续基因检测实验无影响的核酸快速释放方法的试剂。众多专利揭示了传统核酸样本释放剂的配方。中国发明专利申请CN111394346A公开的释放剂配方包括七种组分,分别是NaOH(氢氧化钠)、NP40(乙基苯基聚乙二醇)、异硫氰酸胍、LDS、Foamban(一种消泡剂)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、LLS(十二烷基硫酸锂),但该配方含有胍盐,极易受室温、季节温度、盐离子浓度等影响造成的核酸提取效果下降。中国发明专利申请CN109402240A公开了一种样本释放剂,其包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、NP40(乙基苯基聚乙二醇)和强碱共七种组分。另外,中国发明专利申请CN 107475252A公开的释放剂配方组分相对简单,包括Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS、LLS、甜菜碱6种组分。传统的核酸释放剂配方,存在不适用于常温保存和市售核酸检测试剂盒适配性差的问题。
发明内容
基于以上技术问题,本发明的主要目的是提供一种核酸释放剂,该核酸释放剂可直接与核酸样本混合释放核酸,缩短核酸提取耗时,并且该核酸样本还具有能够在常温下保存、与核酸检测试剂盒适配性范围广的优点。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
一种核酸释放剂,所述核酸释放剂包含15mM-50mM的强碱、体积百分比为1%-3%的非离子型表面活性剂、2mM-5mM的金属离子螯合剂以及缓冲液,所述强碱包含氢氧化钠或/和氢氧化钾,所述缓冲液为10mM-25mM的Tris-HCl缓冲液。
在其中一个实施例中,所述核酸释放剂包含20mM-30mM的所述强碱、体积百分比为1%-2.5%的所述非离子型表面活性剂、2mM-2.5mM的所述金属离子螯合剂以及所述缓冲液。
在其中一个实施例中,所述核酸释放剂还包含质量百分比为1%-20%的PCR增强剂或/和体积百分比为1%-10%的极性有机溶剂。
在其中一个实施例中,所述核酸释放剂还包含质量百分比为7%-15%的PCR增强剂或/和体积百分比为1%-3%的极性有机溶剂。
在其中一个实施例中,所述PCR增强剂包含海藻糖、甜菜碱、牛血清白蛋白、甘氨酸、明胶、甘氨酸和甲酰胺中的一种或者多种。
在其中一个实施例中,所述极性有机溶剂包含二甲基亚砜或/和氯化四甲基铵。
在其中一个实施例中,所述非离子型表面活性剂包含Triton X-100、Tween 20和NP40中的一种或多种。
在其中一个实施例中,所述金属离子螯合剂包含EDTA、EGTA和柠檬酸中的一种或多种。
一种核酸样本检测试剂盒,所述试剂盒包含核酸释放试剂和核酸检测试剂,所述核酸提取试剂选用所述的核酸释放剂。
一种非疾病治疗和诊断目的的核酸检测方法,所述检测方法包括如下步骤:用所述的核酸释放剂释放待测核酸样本中的核酸,对所得核酸进行检测。
在其中一个实施例中,所述核酸释放剂的作用时长为1min,所述核酸释放剂的作用温度为5℃-25℃。
在其中一个实施例中,所述核酸释放剂和所述待测核酸样本的体积比为1:(0.8-1.2)。
与传统技术相比,本发明具备如下有益效果:
本发明提供一种配方优化的核酸释放剂,核酸释放剂能够在常温下进行保存且保存期可超过一年,便于常温运输及储存,降低储存成本,可大规模推广。采用该核酸释放剂能够使整个核酸释放的过程均在室温下进行,可有效降低气溶胶的污染,能有效的保护实验操作人员的安全。
并且,该核酸释放剂对下游PCR检测试剂盒无特殊要求,下游PCR检测试剂盒适配性较广,也不需要配合使用复杂的仪器。
同时,核酸样本采集完成后,只需将其直接与该核酸释放剂混合(例如1分钟)即可完成对样本的核酸释放,耗时短,无需额外对核酸样本进行预处理也不影响后续的PCR效果。
整体来讲,相比于传统核酸检测技术,本发明提供了一个很好的补充和替代方案,在突发性传染病事件中,本发明的核酸释放剂有着快速、安全、稳定、高效、成本低等明显的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明核酸释放剂和市购某公司核酸释放剂释放样本核酸后上机进行荧光定量PCR扩增图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更详细的描述。但是,应当理解,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地,提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个,也包括相关所列项目的任意的和所有的组合,所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中,“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”等仅用于描述目的,不能理解为指示或暗示相对重要性或数量,也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本发明中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中涉及的百分比含量,如无特别说明,对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比,对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度,如无特别说明,均指终浓度。所述终浓度,指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
第一方面,本发明提供一种核酸释放剂,所述核酸释放剂包含15mM-50mM的强碱、体积百分比为1%-3%的非离子型表面活性剂、2mM-5mM的金属离子螯合剂以及缓冲液,所述强碱包含氢氧化钠或/和氢氧化钾,所述缓冲液为10mM-25mM的Tris-HCl缓冲液。
需要说明的是,本发明提供的核酸稀释剂中,其所含组分的浓度为使用浓度。
本发明提供的核酸释放剂,为一种一步法裂解液,一步法裂解液是基于碱裂解法原理,加入多项优化试剂,释放大部分液体样本中的核酸,并且降低样本中干扰物质对下游PCR的影响,进而直接加入下游PCR反应液中完成PCR检测。
本发明提供的核酸释放剂,用氢氧化钠/氢氧化钾来提供一个碱性环境,使病毒包膜破裂,释放核酸;细胞在裂解的过程中,非离子型表面活性剂一方面可以加速细胞外模蛋白和脂类的溶解,加快核酸释放,另一方面非离子型表面活性剂可以很好地对核酸特别是单链的RNA起到保护作用,使RNA能够在碱性环境中得以保存;金属离子螯合剂可以结合溶液中的离子,从而抑制RNA酶活性,阻止核酸降解。
在其中一个示例中,所述核酸释放剂包含20mM-30mM的所述强碱、体积百分比为1%-2.5%的所述非离子型表面活性剂、2mM-2.5mM的所述金属离子螯合剂以及所述缓冲液。
在其中一个示例中,所述核酸释放剂还包含质量百分比为1%-20%的PCR增强剂或/和体积百分比为1%-10%的极性有机溶剂。PCR增强剂可以对酶起到保护作用也可以增强PCR的灵敏度。极性有机溶剂能增强溶解性能。
在其中一个示例中,所述核酸释放剂还包含质量百分比为7%-15%的PCR增强剂或/和体积百分比为1%-3%的极性有机溶剂。
在其中一个示例中,所述PCR增强剂包含海藻糖、甜菜碱、牛血清白蛋白、甘氨酸、明胶、甘氨酸和甲酰胺中的一种或者多种。
在其中一个示例中,所述极性有机溶剂包含二甲基亚砜或/和氯化四甲基铵。
在其中一个示例中,所述核酸释放剂包含20mM-30mM的所述强碱、体积百分比为1%-2.5%的所述非离子型表面活性剂、2mM-2.5mM的所述金属离子螯合剂、质量百分比为7%-15%的PCR增强剂、体积百分比为1%-3%的极性有机溶剂以及所述缓冲液。
第二方面,本发明提供一种核酸样本检测试剂盒,所述试剂盒包含核酸释放试剂和核酸检测试剂,所述核酸提取试剂选用所述的核酸释放剂。
可选地,所述核酸检测试剂包括但不限于核酸扩增试剂,核酸扩增试剂例如PCR反应液,其可以包括脱氧核糖核苷三磷酸、上游引物、下游引物、聚合酶、逆转录酶和扩增缓冲液等。可以理解,根据扩增反应类型和目的的不同,核酸扩增试剂的组成可以根据需要进行选择,不限于此,例如进行实时荧光定量PCR时,核酸扩增试剂还包括荧光探针或荧光染料等。
第三方面,本发明提供一种非疾病治疗和诊断目的的核酸检测方法,所述检测方法包括如下步骤:用所述的核酸释放剂释放待测核酸样本中的核酸,对所得核酸进行检测。
在其中一个示例中,所述核酸释放剂的作用时长为1min,所述核酸释放剂的作用温度为5℃-25℃(例如5℃、10℃、15℃、20℃、25℃)。
在其中一个示例中,所述核酸释放剂和所述待测核酸样本的体积比为1:(0.8-1.2)。例如1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2。
本发明的核酸检测方法,例如将待测核酸样本与核酸释放剂按照体积比1:1的比例进行混合,室温放置1min-3min,取5μL混合液进行扩增(25μLPCR反应体系,可按比例增大反应体系)。
可选地,本发明所述的核酸样本,其类型包括血清、血浆、口咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、粪便等多种类型,与核酸释放剂混合后可以直接对接下游的PCR扩增等检测方法。
可选地,本发明所述的核酸样本,其类型包括病毒核酸样本,例如严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型。
实施例1:
核酸释放剂包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、2mM EDTA和10mM Tris-HCl。
实施例2:
核酸释放剂包括15mM NaOH、3%Triton X-100、3mM EDTA和15mM Tris-HCl。
实施例3:
核酸释放剂包括50mM NaOH、2%Triton X-100、5mM EDTA和25mM Tris-HCl。
对比例1,
核酸释放剂包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、0mM EDTA和10mM Tris-HCl。
对比例2:
核酸释放剂包括25mM NaOH、0.5%Triton X-100、0.5%十二烷基硫酸锂、2mMEDTA和10mM Tris-HCl。
对比例3:
核酸释放剂包括25mM NaOH、0.5%Triton X-100、2mM EDTA和10mM Tris-HCl。
对比例4:
核酸释放剂包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、2mM EDTA和5mM Tris-HCl。
对比例5:
核酸释放剂包括75mM NaOH、4%Triton X-100、6mM EDTA、30mM Tris-HCl。
表1、实施例1至实施例3和对比例1至对比例5的核酸释放剂配方
实验方法:准备8份装甲RNA呼吸道病毒咽拭子模拟样本,取20μL样本,加入20μL核酸释放剂,涡旋混匀,室温放置1min后,取5μL与20μLPCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增。
配置qRT-PCR扩增体系:
表2
试剂 | 使用量 |
5xNeoscript Fast RT Buffer | 5μL |
25x Neoscript Fast RTase/UNG mix | 1μL |
引物探针混合液 | 6μL |
RNase free H<sub>2</sub>O | 8μL |
Template | 5μL |
Total | 25μL |
扩增程序:
表3
实验结果评价:实施例之间CT值差异在1-2之间,为可接受范围;对比例以与最优组合实施例1的CT值相差3.320为可接受范围。
评价依据:荧光定量PCR之后计算目的基因的相对表达量一般采用2-△△CT的方法。若2-△△3.320=10,即若对比例以与最优组合实施例1的CT值相差3.320,则核酸释放倍数降低了9倍。
表4、实施例1至实施例3、对比例1至5的核酸释放剂的CT值比较
结果显示,当各组分在规定保护的范围内,实施例1-3核酸释放剂相差在CT值差异在1-2之间,在可接受范围内。对比例1及5核酸释放剂超过了规定范围,相同样本CT值延后了7-8个CT值,释放核酸效果明显不可接受。
实施例4:
核酸释放剂包括25mM NaOH、1.5%Triton X-100、2mM EDTA、10mM Tris-HCl、10%甘氨酸、1%BSA、1%DMSO。
实施例5:
核酸释放剂包括25mM NaOH、1.5%Triton X-100、2mM EDTA、10mM Tris-HCl、1%甲酰胺、5%甜菜碱、1%海藻糖、0.5%明胶。
实施例6:
核酸释放剂包括25mM NaOH、1.5%Triton X-100、2mM EDTA、10mM Tris-HCl、1%甘氨酸、5%BSA、10%DMSO、10%甲酰胺、20%甜菜碱、5%海藻糖、2%明胶。
对比例6:
市购某公司的核酸释放剂,其主要成分包括:50mM Tris-HCl,0.1%莎梵婷,100mMKCl,2M甜菜碱。
对比例7:
根据专利CN109402240A的核酸释放剂,其成份包括:0.5mM Tris-HCl、500mM氯化钠、8mg/mL氯化钾、0.1%吐温20、3%曲拉通X-100、0.1%乙基苯基聚乙二醇、20mg/mL甜菜碱、5mg/mL牛血清白蛋白、1.5mg/mL蛋白酶K、0.4mg/mL十二烷基硫酸锂和2mg/mL氢氧化钠。
表5、实施例4至实施例6的核酸释放剂配方
实验方法:准备5份装甲RNA呼吸道病毒咽拭子模拟样本,取20μL样本,加入20μL核酸释放剂,涡旋混匀,室温放置1min后,取5μL与20μLPCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增。
实验结果:
表6、实施例4至实施例6和对比例6至对比例7的核酸释放剂CT值比较
结果显示,本发明的核酸释放剂释放效果要优于市购某公司核酸释放剂(见图1)和专利CN109402240A的核酸释放剂的作用效果,相同样本Ct值靠前约1-2个Ct。本发明实施例1核酸释放剂作用效果最优。
实施例10:核酸释放剂与PCR检测试剂盒适配验证
为了验证本发明核酸释放剂与市面上不同厂家新型冠状病毒PCR检测试剂盒的适配性,分别测试与达安、圣湘、卓诚惠生、硕世、迈克新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)检测试剂盒匹配情况。
1、达安新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)匹配实验:
实验样本:达安新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)阳性质控品、阴性质控品以及新型冠状病毒装甲RNA模拟样本。
实施例1提供的核酸释放剂,包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、2mM EDTA、10mMTris-HCl。
实验方法:将实验样本加入到拭子采样管,取20μL待测样本,,加入20μL样本释放剂,室温裂解1min,取5μL进行PCR扩增,qRT-PCR扩增体系及程序见表7及表8。结果判定标准(试剂盒自带,见表9)。
配置qRT-PCR扩增体系:
表7
试剂 | 使用量 |
反应液A | 17 |
反应液B | 3 |
TotalRNA | 5 |
Total | 25μL |
扩增程序:
表8
表9
实验结果:
表10
使用达安商品试剂盒中阳性质控品,核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道Ct值均小于32,符合达安新冠检测试剂盒的质控标准。
使用达安商品试剂盒中阴性质控品,核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道无Ct值,符合达安新冠检测试剂盒的质控标准。
使用新冠模拟样本,核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道Ct值均小于40,内标有CT值,符合达安新冠检测试剂盒的阳性判定标准。
实验结论:本发明实施例1提供的所述核酸释放剂可以匹配达安新冠检测试剂盒。
2、圣湘新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)匹配实验方案:
实验样本:圣湘新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒阳性质控品、阴性质控品以及新型冠状病毒装甲RNA模拟样本。
实施例1提供的核酸释放剂,包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、2mM EDTA、10mMTris-HCl。
实验方法:将实验样本加入到拭子采样管,取20μL待测样本,,加入20μL核酸释放剂,室温裂解1min,取20μL进行PCR扩增,qRT-PCR扩增体系及程序见表11及表12。结果判定标准(试剂盒自带,见表13):
配置qRT-PCR扩增体系:
表11
圣湘试剂 | 使用量 |
2019-nCoV-PCR-反应液 | 26μL |
2019-nCoV-PCR-酶反应液 | 4μL |
Template RNA | 20μL |
Total | 50μL |
扩增程序:
表12
表13
实验结果:
表14
使用圣湘商品试剂盒中阳性质控品,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道Ct值均小于35,符合圣湘新冠检测试剂盒的质控标准。
使用圣湘商品试剂盒中阴性质控品,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道无Ct值,符合圣湘新冠检测试剂盒的质控标准。
使用新冠模拟样本,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道Ct值均小于40,内标有CT值,符合圣湘新冠检测试剂盒的阳性判定标准。
实验结论:本发明实施例1所述核酸释放剂可以匹配圣湘新冠检测试剂盒。
3、卓诚惠生新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)匹配实验方案:
实验样本:卓诚惠生新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒阳性质控品、阴性质控品以及新型冠状病毒装甲RNA模拟样本。
实施例1提供的核酸释放剂,包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、2mM EDTA、10mMTris-HCl。
实验方法:将实验样本加入到拭子采样管,取20μL待测样本,加入20μL核酸释放剂,室温裂解1min,取5μL进行PCR扩增,qRT-PCR扩增体系及程序见表15及表16。结果判定标准(试剂盒自带,见表17)。
配制qRT-PCR扩增体系:
表15
试剂 | 使用量 |
无核酸酶水 | 2μL |
核酸扩增反应液 | 10μL |
20×逆转录酶 | 1μL |
10×反应液 | 2μL |
模板 | 5μL |
总体积 | 20μL |
实验程序:
表16
表17
实验结果:
表18
使用卓诚惠生商品试剂盒中阳性质控品,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道Ct值均小于38,符合卓诚惠生新冠检测试剂盒的质控标准。
使用卓诚惠生商品试剂盒中阴性质控品,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道无Ct值,符合卓诚惠生新冠检测试剂盒的质控标准。
使用新冠模拟样本,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道Ct值均小于38,内标有CT值,符合卓诚惠生新冠检测试剂盒的阳性判定标准。
实验结论:本发明实施例1所述核酸释放剂可以匹配卓诚惠生新冠检测试剂盒。
4、硕世新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)匹配实验方案:
实验样本:硕世新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)阳性质控品、阴性质控品以及新型冠状病毒装甲RNA模拟样本。
实施例1提供的核酸释放剂,包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、2mM EDTA、10mMTris-HCl。
实验方法:将实验样本加入到拭子采样管,取20μL待测样本,,加入20μL核酸释放剂,室温裂解1min,取5μL进行PCR扩增,qRT-PCR扩增体系及程序见表19及表20。
结果判定标准(试剂盒自带,见表21)。
配制qRT-PCR扩增体系:
表19
试剂 | 使用量 |
核酸扩增反应液 | 7.5μL |
酶混合液 | 5μL |
新型冠状病毒(2019-nCoV)反应液 | 4μL |
去RNA酶水 | 3.5μL |
Template | 5μL |
Total | 25μL |
实验程序:
表20
表21
实验结果:
表22
使用硕世商品试剂盒中阳性质控品,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道Ct值均小于30,符合硕世新冠检测试剂盒的质控标准。
使用硕世商品试剂盒中阴性质控品,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道无Ct值,符合硕世新冠检测试剂盒的质控标准。
使用新冠模拟样本,实施例1核酸释放剂释放结果FAM和VIC通道Ct值均小于37,内标有CT值,符合硕世新冠检测试剂盒的阳性判定标准。
实验结论:本发明实施例1所述核酸释放剂可以匹配硕世新冠检测试剂盒。
5、迈克新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)匹配实验方案:
实验样本:迈克新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒阳性质控品、阴性质控品以及新型冠状病毒装甲RNA模拟样本。
实施例1提供的核酸释放剂,包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、2mM EDTA、10mMTris-HCl。
实验方法:将实验样本加入到拭子采样管,取20μL待测样本,,加入20μL核酸释放剂,室温裂解1min,取20μL进行PCR扩增,qRT-PCR扩增体系及程序见表23及表24。
结果判定标准(试剂盒自带,见表25)。
配制迈克qRT-PCR扩增体系:
表23
实验程序:
表24
表25
实验结果:
表26
使用迈克商品试剂盒中阳性质控品,实施例1核酸释放剂释放结果FAM、ROX以及CY5通道Ct值均小于32,内标HEX通道Ct值小于38,符合迈克新冠检测试剂盒的质控标准。
使用迈克商品试剂盒中阴性质控品,实施例1核酸释放剂释放结果FAM、ROX以及CY5通道无Ct值,内标HEX通道Ct值小于38,符合迈克新冠检测试剂盒的质控标准。
使用新冠模拟样本,实施例1核酸释放剂释放结果FAM及CY5通道CT值小于38,ROX通道小于37,符合迈克新冠检测试剂盒的阳性判定标准。
实验结论:本发明实施例1所述核酸释放剂可以匹配迈克新冠检测试剂盒。参照上述方法,验证得到的其他实施例和对比例1至5的核酸释放剂的适配性结果汇总如下:
表27
达安 | 圣湘 | 卓诚惠生 | 硕世 | 迈克 | |
实施例2 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 |
实施例3 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 |
实施例4 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 |
实施例5 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 |
实施例6 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 | 适配 |
对比例1 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 |
对比例2 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 |
对比例3 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 |
对比例4 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 |
对比例5 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 | 不适配 |
实施例11:核酸释放剂常温保存测试
实施例1提供的核酸释放剂,包括25mM NaOH、1.0%Triton X-100、2mM EDTA、10mMTris-HCl。
以上述实施例1为例验证核酸释放剂的常温保存和运输效果,将核酸本释放剂置于包装箱中,将包装箱置于运输车中,以无锡为始发地,选择运输条件较差的黑龙江齐齐哈尔作为目的地,运输完成后,对核酸释放剂的性能进行检测,在放置于25℃下,分别于第1个月、第4个月、第7个月、第10个月、第13个月时,进行实时荧光定量PCR扩增。
配置qRT-PCR扩增体系:
表28
试剂 | 使用量 |
5×Neoscript Fast RT Buffer | 5μL |
25×Neoscript Fast RTase/UNG mix | 1μL |
引物探针混合液 | 6μL |
RNase free H<sub>2</sub>O | 8μL |
Template | 5μL |
Total | 25μL |
扩增程序:
表29
实验结果:
表30
核酸释放剂在第1个月、第4个月、第7个月、第10个月、第13个月时,效果并无明显下降,表明核酸释放剂可以在常温运输后再常温保存一年。
参照上述方法,检测得到的其他实施例和对比例1至5的常温保存测试结果汇总如下:
表31
对比例1-4中的样本释放剂在第7个月时,对比例5中的样本释放剂在第4个月时,效果明显下降效果明显下降。表明样本释放剂无法在常温运输后再常温保存一年。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
应当理解,本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案,均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种核酸释放剂,其特征在于,所述核酸释放剂包含15mM-50mM的强碱、体积百分比为1%-3%的非离子型表面活性剂、2mM-5mM的金属离子螯合剂以及缓冲液,所述强碱包含氢氧化钠或/和氢氧化钾,所述缓冲液为10mM-25mM的Tris-HCl缓冲液;
所述非离子型表面活性剂为Triton X-100;
所述金属离子螯合剂为EDTA。
2.根据权利要求1所述的核酸释放剂,其特征在于,所述核酸释放剂包含20mM-30mM的所述强碱、体积百分比为1%-2.5%的所述非离子型表面活性剂、2mM-2.5mM的所述金属离子螯合剂以及所述缓冲液。
3.根据权利要求1或者2所述的核酸释放剂,其特征在于,所述核酸释放剂还包含质量百分比为1%-20%的PCR增强剂或/和体积百分比为1%-10%的极性有机溶剂;
所述PCR增强剂包含海藻糖、甜菜碱、牛血清白蛋白、甘氨酸、明胶、甘氨酸和甲酰胺中的一种或者多种;
所述极性有机溶剂包含二甲基亚砜或/和氯化四甲基铵。
4.根据权利要求3所述的核酸释放剂,其特征在于,所述核酸释放剂还包含质量百分比为7%-15%的PCR增强剂或/和体积百分比为1%-3%的极性有机溶剂。
5.一种核酸样本检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含核酸释放试剂和核酸检测试剂,所述核酸释放试剂选用权利要求1至4任一项所述的核酸释放剂。
6.一种非疾病治疗和诊断目的的核酸检测方法,其特征在于,所述检测方法包括如下步骤:用权利要求1至4任一项所述的核酸释放剂释放待测核酸样本中的核酸,对所得核酸进行检测。
7.根据权利要求6所述的非疾病治疗和诊断目的的核酸检测方法,其特征在于,所述核酸释放剂的作用时长为1min,所述核酸释放剂的作用温度为5℃-25℃。
8.根据权利要求6或者7所述的非疾病治疗和诊断目的的核酸检测方法,其特征在于,所述核酸释放剂和所述待测核酸样本的体积比为1:(0.8-1.2)。
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