CN115896347A - 一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合包括甲型流感病毒的引物和探针以及乙型流感病毒的引物和探针。本发明开发恒温扩增快速检测甲、乙流病毒的引物探针组合，所述引物探针组合具有良好的灵敏度，能在20min内快速、高特异性地检测到低浓度模板，不易产生由高温引起的气溶胶污染，另外，且恒温检测仪器价格相对低廉，便于广泛推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用。
背景技术
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，传播速度快，容易引起大范围流行。流感病毒属于正粘液病毒科，可分为甲、乙、丙型流感病毒三型。其中，甲型流感病毒经常发生抗原变异、传染性强，最易引起大范围流行，乙型次之，丙型极少引起流行。由于流感病毒引起的感染症状和流行特点相似，仅靠临床症状无法对病原进行区分，实验室主要通过病毒分离、抗原检测与核酸检测等方法进行常规诊断。目前，主要通过荧光PCR单重核酸检测试剂盒对甲型流感病毒、乙型流感病毒进行检测。
如CN102251061A公开一种甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒包括RNA酶抑制剂、RT-PCR反应液、酶混合液、甲型/乙型流感病毒双重反应液、阳性对照和阴性对照，其中，所说的甲型/乙型流感病毒双重反应液包括以下组分：组分(1)：由一对检测甲型流感病毒的引物和一条检测甲型流感病毒的探针组成；组分(2)：由一对检测乙型流感病毒的引物和一条检测乙型流感病毒的探针组成；所说的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶。能够同时检测出甲型、乙型流感病毒，解决了现有产品只能在一管反应中检测一种流感病毒的问题，但整个实验流程至少需要2.5～3小时，且需要配备复杂的仪器，不利于在基层医院推广。
综上所述，如何提供一种灵敏度高、特异性好、操作简便、检测时间短的甲型流感病毒、乙型流感病毒检测产品已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用，本发明开发恒温扩增快速检测甲、乙流病毒的引物探针组合，所述引物探针组合具有良好的灵敏度，能在20min内快速、高特异性地检测到低浓度模板，不易产生由高温引起的气溶胶污染，另外，且恒温检测仪器价格相对低廉，便于广泛推广应用。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合，所述引物探针组合包括甲型流感病毒的引物和探针以及乙型流感病毒的引物和探针，所述甲型流感病毒的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，所述甲型流感病毒的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列，所述乙型流感病毒的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列，所述乙型流感病毒的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
本发明中，开发恒温扩增快速检测甲、乙型流感病毒的引物探针组合，设计特定的引物、探针序列，其中探针的结构包括从5’端到3’端顺次连接的5’端序列、荧光发生基团、四氢呋喃、间隔序列、荧光淬灭基团、3’端序列和C3阻断基团，获得具备高灵敏度和特异性的引物、探针组合，能在恒温条件下20min内快速、高特异性地检测到低浓度模板，检测时间短、灵敏度高，且不易产生由高温引起的气溶胶污染，此外，使用恒温检测仪器相对低廉的价格为相关产品在基层技术条件落后地区的应用提供了条件。
优选地，所述甲型流感病毒的探针和乙型流感病毒的探针的各自独立地包括荧光发生基团和荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光发生基团包括FAM、ROX或CY5中的任意一种。
优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。
SEQ ID NO.1：CGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG。
SEQ ID NO.2：AATAACTGAGTGCTATTTCTTTGGCCCCATGG。
SEQ ID NO.3：
GCCCTTAATGGGAATGGGGATCCAAATAAT-(THF)-TGGACAGAGCAGTCA。
SEQ ID NO.4：CACCTGTCTTGTTCTCCAACAAAATAGCCAGATTAGG。
SEQ ID NO.5：TATTCCTTGTTTCCAATGTTTTTGATGCCTAGTGCTGC。
SEQ ID NO.6：
TCCTGATCTGTTCAGCATACCATTAGAAAGATAT-(THF)-TGAAGAAACAAGGGC。
THF为四氢呋喃。
第二方面，本发明提供第一方面所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合在制备检测甲型和乙型流感病毒的产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合。
优选地，所述试剂盒还包括RPA扩增反应液、阳性对照和阴性对照。
优选地，所述RPA扩增反应液包括包括缓冲液、酶混合物和激活剂。
优选地，所述缓冲液含有Tris-HCl、EDTA、KCl、dNTP、dATP、DTT、肌酸激酶和磷酸肌酸，进一步优选地，所述缓冲液含有100mM Tris-HCl(pH7.6)、0.1mM EDTA、50mM KCl、200nMdNTP、2mM dATP、2mM DTT、0.2mg/mL肌酸激酶和50mM磷酸肌酸。
优选地，所述酶混合物含有结合单链核酸的逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶和解旋酶。
优选地，所述激活剂包括MgCl2，浓度可以为5～20mM，包括但不限于6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、15mM、17mM、18mM或19mM。
优选地，所述阳性对照包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的核酸片段。
优选地，所述阴性对照包括无菌水。
本发明中，所述阳性对照可选择甲型流感病毒M1基因序列片段和乙型流感病毒PB1基因序列片段，可以理解，为便于保存和应用，可将相应基因序列插入质粒载体中。
第四方面，本发明提供第一方面所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合在以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒中的应用。
第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，所述方法包括：
以待测样本中核酸为模板，利用第三方面所述的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒进行RPA扩增反应，根据RPA扩增结果判断是否是甲型流感病毒和/或乙型流感病毒阳性。
本发明开发恒温扩增快速检测甲、乙型流感病毒的引物探针组合，并进一步设计快速检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，实现快速准确检测甲、乙型流感病毒，具有广泛的应用前景，可广泛应用于人体样本、环境样本以及食品等的甲、乙型流感病毒检测。
优选地，所述RPA扩增反应的反应体系包括第一方面所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合和所述RPA扩增反应液。
本发明中，可将用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合和酶混合物和缓冲液先混合作为预混液，随后将待测样本中核酸与预混液混合，所述待测样本中核酸与预混液的体积比为1:(9～10)，优选为1:10。
优选地，所述RPA扩增反应的反应体系中所述用于检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组合、酶混合物和缓冲液的体积比为1:(1～2):(3～5)，优选为3:4:10。
优选地，所述RPA扩增反应的反应体系中所述激活剂的体积百分比为5％～10％，包括但不限于6％、7％、8％或9％。
优选地，所述RPA扩增结果包括Ct值和荧光信号。
优选地，所述RPA扩增反应的温度为37～42℃(例如可以是38℃、39℃、40℃或41℃)，时间为10～30min，包括但不限于11min、12min、15min、18min、20min、21min、25min、26min、27min、28min或29min。
作为优选的技术方案，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待测样本中核酸；
(2)以待测样本中核酸为模板，利用第三方面所述的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒中检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合和RPA扩增反应液配制反应体系，进行RPA扩增反应，根据RPA扩增Ct值和荧光信号判断是否是甲型流感病毒和/或乙型流感病毒阳性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明开发恒温扩增快速检测甲、乙型流感病毒的引物探针组合，获得具备高灵敏度和特异性的引物、探针组合，能在恒温条件下20min内快速、高特异性地检测到低浓度模板，检测时间短、灵敏度高，且不易产生由高温引起的气溶胶污染，此外，使用恒温检测仪器相对低廉的价格为相关产品在基层技术条件落后地区的应用提供了条件。
附图说明
图1为实施例3中的甲型、乙型流感病毒检测结果图；
图2为实施例3中的乙型流感病毒检测限测定结果图；
图3为实施例3中的甲型流感病毒检测限测定结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，试剂盒包括用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合、RPA扩增酶混合物(厂家：安普未来，货号：WLRE5003)、缓冲液(含有100mM Tris-HCl(pH7.6)、0.1mM EDTA、50mM KCl、200nM dNTP、2mM dATP、2mM DTT、0.2mg/mL肌酸激酶和50mM磷酸肌酸)、激活剂(10mM MgCl2)、阳性对照和阴性对照(无菌水)，所述甲型流感病毒的引物的核酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，所述甲型流感病毒的探针的核酸序列为SEQ ID NO.3所示的序列，所述乙型流感病毒的引物的核酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列，所述乙型流感病毒的探针的核酸序列为SEQ ID NO.6所示的序列，所述阳性对照为含有甲型流感病毒M1基因序列片段和乙型流感病毒PB1基因序列片段的重组质粒。
SEQ ID NO.1：CGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG。
SEQ ID NO.2：AATAACTGAGTGCTATTTCTTTGGCCCCATGG。
SEQ ID NO.3：
GCCCTTAATGGGAATGGGGATCCAAATAAT(FAM)-(THF)-T(BHQ1)GGACAGAGCAGTCA。
SEQ ID NO.4：CACCTGTCTTGTTCTCCAACAAAATAGCCAGATTAGG。
SEQ ID NO.5：TATTCCTTGTTTCCAATGTTTTTGATGCCTAGTGCTGC。
SEQ ID NO.6：
TCCTGATCTGTTCAGCATACCATTAGAAAGATAT(ROX)-(THF)-T(BHQ2)GAAGAAACAAGGGC。
实施例2
本实施提供一种检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，利用实施例中试剂盒，以提取的待测咽拭子样本核酸作为模板进行检测。
以提取的待测咽拭子样本核酸作为模板，加入甲、乙型流感病毒反应体系(如表1所示)进行RPA扩增反应，扩增反应程序为42℃，反应20min。
表1
| 试剂名称 | 加入体积(μL) |
| 甲型流感病毒上游引物(10μM) | 0.65 |
| 甲型流感病毒下游引物(10μM) | 0.65 |
| 甲型流感病毒探针(10μM) | 0.2 |
| 乙型流感病毒上游引物(10μM) | 0.65 |
| 乙型流感病毒下游引物(10μM) | 0.65 |
| 乙型流感病毒探针(10μM) | 0.2 |
| 酶混合液 | 4 |
| 缓冲液 | 10 |
| 激活剂 | 1 |
在扩增反应过程中采集实时荧光，扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断甲、乙流核酸的阴、阳性，若待检样本包含甲、乙型流感病毒核酸，则对应的探针产生荧光信号(如图1所示)。
实施例3
本实施例对本发明检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法的灵敏度和特异性进行分析。
1、灵敏度分析
将阳性对照质粒(含有甲型流感病毒M1基因序列片段和乙型流感病毒PB1基因序列片段的重组质粒)经PBS进行10倍系列稀释(包括5×105、5×104、5×103、5×102、5×101和5拷贝/μL)，以无菌双蒸水作为阴性对照，参照实施例2进行RPA扩增反应，在扩增反应过程中采集实时荧光，结果如图2和图3所示，105-101结果均为阳性，即恒温扩增快速核酸检测甲、乙型流感病毒的灵敏度达到50拷贝/μL，甲、乙型流感病毒引物探针混合后，可检出浓度为50拷贝/μL的阳性质粒，同时检测甲、乙型流感核酸的检测限为50和50拷贝/反应。
2、特异性分析
采用实施例2中同时检测甲型和乙型流感核酸的RPA扩增体系对甲型、乙型流感病毒以外的其它病原体进行检测，结果如表2所示，本发明的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法对甲型流感病毒、乙型流感病毒检测为阳性，阴性对照为阴性，对腺病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型，副流感病毒3型，副流感病毒4型，呼吸道合胞病毒B型，呼吸道合胞病毒A型，百日咳杆菌，肺炎链球菌，嗜肺军团菌，流感嗜血杆菌，(人)鼻病毒，(人)博卡病毒，(人)肠道病毒，(人)偏肺病毒，(人)冠状病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体样本的检测均为阴性，表明本发明检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法具备高特异性。
综上所述，本发明开发恒温扩增快速检测甲、乙型流感病毒的引物探针组合获得具备高灵敏度和特异性的引物、探针组合，能在恒温条件下20min内快速、高特异性地检测到低浓度模板，检测时间短、灵敏度高，同时检测甲、乙型流感核酸的检测限分别为50和50拷贝/反应，且不易产生由高温引起的气溶胶污染。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括甲型流感病毒的引物和探针以及乙型流感病毒的引物和探针；
所述甲型流感病毒的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；
所述甲型流感病毒的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；
所述乙型流感病毒的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列；
所述乙型流感病毒的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合，其特征在于，所述甲型流感病毒的探针和乙型流感病毒的探针的各自独立地包括荧光发生基团和荧光淬灭基团；
优选地，所述荧光发生基团包括FAM、ROX或CY5中的任意一种；
优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。
3.权利要求1或2所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合在制备检测甲型和乙型流感病毒的产品中的应用。
4.一种检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA扩增反应液、阳性对照和阴性对照；
优选地，所述RPA扩增反应液包括包括缓冲液、酶混合物和激活剂；
优选地，所述缓冲液含有Tris-HCl、EDTA、KCl、dNTP、dATP、DTT、肌酸激酶和磷酸肌酸；
优选地，所述酶混合物含有结合单链核酸的逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶和解旋酶；
优选地，所述激活剂包括MgCl2；
优选地，所述阳性对照包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的核酸片段；
优选地，所述阴性对照包括无菌水。
6.权利要求1或2所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合在以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒中的应用。
7.一种以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测样本中核酸为模板，利用权利要求4或5所述的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒进行RPA扩增反应，根据RPA扩增结果判断是否是甲型流感病毒和/或乙型流感病毒阳性。
8.根据权利要求7所述的以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，其特征在于，所述RPA扩增反应的反应体系包括权利要求1或2所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合和所述RPA扩增反应液；
优选地，所述RPA扩增反应的反应体系中所述用于检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组合、酶混合物和缓冲液的体积比为1:(1～2):(3～5)；
优选地，所述RPA扩增反应的反应体系中所述激活剂的体积百分比为5％～10％。
9.根据权利要求7或8所述的以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，其特征在于，所述RPA扩增结果包括Ct值和荧光信号；
优选地，所述RPA扩增反应的温度为37～42℃，时间为10～30min。
10.根据权利要求7-9任一项所述的以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待测样本中核酸；
(2)以待测样本中核酸为模板，利用权利要求4或5所述的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒中检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合和RPA扩增反应液配制反应体系，进行RPA扩增反应，根据RPA扩增Ct值和荧光信号判断是否是甲型流感病毒和/或乙型流感病毒阳性。
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