CN117106772B - 一种用于病毒核酸检测的样本释放剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于病毒核酸检测的样本释放剂，属于生物试剂领域。包括：体积分数为1‑3%的Triton X‑100、体积分数为2‑4%的IGEPAL CA‑630、0.5‑1.5mg/ml的蛋白酶k、体积分数为10‑17%的多果定、0.5‑400mM的Tris‑HCl、体积分数为1‑3%的促溶剂、体积分数为1‑20%的稳定剂、氯化钠、氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。本发明的样本释放剂释放速度快、保存效果好，在加热条件下，反应1‑2分钟即可释放病毒核酸，且保存至至少第10天，能够有效节省检测时间、保存样本。
Description
技术领域
本发明属于生物试剂领域，具体涉及一种用于病毒核酸检测的样本释放剂。
背景技术
核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的组成物质，是所有生物分子中最重要的物质，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。
核酸提取是现代分子生物学研究的必要的基础技术，制备高质量核酸是后续研究成功与否的关键。核酸提取的原则首先保证核酸一级结构的完整，其次要排除其它分子的污染。核酸的提取方法，有着悠久的历史，且形成多种提取方法。迄今为止，核酸提取方法主要有煮沸法、离心柱法以及磁珠法。但是，上述方法均存在着对病毒核酸释放效率偏低、核酸检测灵敏度下降、保存时间短等问题。根据文献报道，样本前处理所花费的时间占据整个分析过程的61％；同时，样本前处理产生约30％的误差，加上人为操作误差，样本前处理所引进的误差约占据全部误差来源的50％。由于耗时长且容易产生误差，样本前处理已成为制约核酸快速检测技术发展以及准确度提高的瓶颈之一。
因此，亟需开发一种能快速、高精准地释放核酸且能够长期保存的核酸释放剂。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于病毒核酸检测的样本释放剂。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于病毒核酸检测的样本释放剂，包括：
体积分数为1-3%的Triton X-100、体积分数为2-4%的IGEPALCA-630 、0.5-1.5mg/ml的蛋白酶k、体积分数为10-17%的多果定、0.5-400mM的Tris-HCl、体积分数为1-3%的促溶剂、体积分数为1-20%的稳定剂、15-50mM的氯化钠、5-8mg/ml的氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。
优选的，所述稳定剂包括轻质白油、甘氨酸或甘油中的一种或多种。
优选的，所述促溶剂为异丙醇、乙酸乙酯、乙氰或二甲基亚砜中的一种或多种。
本发明的第二方面，提供上述样本释放剂的制备方法，步骤如下：
将原料按配比加入至去离子水，溶解搅拌，即得。
本发明的第三方面，上述样本释放剂在提取病毒核酸中的应用。
本发明的第四方面，提供一种核酸样本检测试剂盒，包含上述用于病毒核酸检测的样本释放剂。
本发明的第五方面，提供一种病毒核酸的提取方法，提取步骤如下：
将上述样本释放剂与待测样品进行振荡混匀，加热后进行PCR检测。
优选的，所述样本释放剂和待测样本的体积比为1：（0.5-1.5）。
优选的，所述加热反应的时间为1-2min。
优选的，所述加热反应的温度为60-80℃。
本发明的有益效果：
（1）本发明提供了一种用于病毒核酸检测的样本释放剂。本发明的样本释放剂具有释放速度快、检测灵敏度高以及操作简便等优点，其中，本发明采用的IGEPAL CA-630 、蛋白酶k和多果定对提高样本的检测灵敏度具有协同增效的作用。
（2）本发明的样本释放剂释放速度快、保存效果好，在加热条件下，反应1-2分钟即可释放病毒核酸，且保存至至少第10天，能够有效节省检测时间、保存样本。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所述，目前病毒核酸检测的样本释放剂还存在着提取效率低、准确性低的问题。因此，本发明的目的是提供一种病毒核酸检测的样本释放剂，该样本释放剂能够在60-80℃的条件下反应1-2min即可释放样本病毒，且在静置10天后仍能检测出样本病毒，具有效率高、准确性高和稳定性好等优点。
本发明的样本释放剂以去离子水作为释放剂的溶剂，以Triton X-100、Tris-HCl、促溶剂、稳定剂、氯化钠、氯化钾为基础成分，以IGEPAL CA-630 、蛋白酶k、多果定作为主要提取成分。其中，TritonX-100为非离子表面活性剂；Tris-HCl为生物缓冲溶液，能够保持反应液的Ph值，并提供适当的离子强度和缓冲能力，提高PCR反映的效率和特异性；促溶剂能够增强样本释放剂的溶解能力，稳定剂能够对酶起到保护作用，提高PCR结果的稳定性；而氯化钠和氯化钾能够提供盐离子，破坏蛋白稳定性，增加释放效率。
主要成分中的三种物质均起到提高核酸释放效率的作用，具体而言，IGEPAL CA-630能够对膜蛋白进行增溶、分离与纯化，从而对病毒进行裂解；蛋白酶k能够酶解与核酸结合的组蛋白，使核酸游离在溶液中，便于收集核酸；多果定能够对样本病毒进行有效的裂解，释放核酸。同时，IGEPAL CA-630 、蛋白酶k和多果定共同使用对提高样本的检测灵敏度起到了协同增效的作用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
以下各实施例、对比例与试验例中所用的甲型流感病毒假病毒购自上海汉恒生物科技有限公司，Triton X-100购自碧云天生物技术有限公司，IGEPAL CA-630购自碧云天生物科技有限公司，多果定购自上海贝万塔生物科技有限公司，蛋白酶k购自北京康瑞纳生物科技有限公司。
实施例1：
本实施例中样本释放剂的原料组成如下：
体积分数为1%的Triton X-100、体积分数为2%的IGEPALCA-630 、0.5mg/ml的蛋白酶k、体积分数为10%的多果定、0.5mM的Tris-HCl、体积分数为1%的异丙醇、体积分数为1%的轻质白油、15-50mM的氯化钠、5-8mg/ml的氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。
实施例2：样本释放剂的制备。
本实施例中样本释放剂的原料组成如下：
体积分数为3%的Triton X-100、体积分数为4%的IGEPALCA-630 、1.5mg/ml的蛋白酶k、体积分数为17%的多果定、400mM的Tris-HCl、体积分数为3%的乙酸乙酯、体积分数为20%的甘氨酸、50mM氯化钠、8mg/ml的氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。
实施例3：样本释放剂的制备。
本实施例中样本释放剂的原料组成如下：
体积分数为2%的Triton X-100、体积分数为3%的IGEPALCA-630 、1mg/ml的蛋白酶k、体积分数为14%的多果定、200mM的Tris-HCl、体积分数为2%的乙氰、体积分数为12%的甘油、25mM氯化钠、6mg/ml的氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。
对比例1：
与实施例1相比，本对比例中样本释放剂的原料不含IGEPAL CA-630与蛋白酶k，具体如下：
体积分数为1%的Triton X-100、体积分数为10%的多果定、0.5mM的Tris-HCl、体积分数为1%的异丙醇、体积分数为1%的轻质白油、15-50mM的氯化钠、5-8mg/ml的氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。
对比例2：
与实施例1相比，本对比例中样本释放剂的原料不含蛋白酶k与多果定，具体如下：
体积分数为1%的Triton X-100、体积分数为2%的IGEPALCA-630 、0.5mM的Tris-HCl、体积分数为1%的异丙醇、体积分数为1%的轻质白油、15-50mM的氯化钠、5-8mg/ml的氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。
对比例3：
与实施例1相比，本对比例中样本释放剂的原料不含多果定与IGEPAL CA-630，具体如下：
体积分数为1%的Triton X-100、0.5mg/ml的蛋白酶k、0.5mM的Tris-HCl、体积分数为1%的异丙醇、体积分数为1%的轻质白油、15-50mM的氯化钠、5-8mg/ml的氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。
对比例4：
与实施例1相比，本对比例中样本释放剂的原料不含蛋白酶k、多果定和IGEPALCA-630，具体如下：
体积分数为1%的Triton X-100、0.5mM的Tris-HCl、体积分数为1%的异丙醇、体积分数为1%的轻质白油、15-50mM的氯化钠、5-8mg/ml的氯化钾，释放剂的溶剂为去离子水。
试验例1：样本释放剂扩增灵敏度的测定。
（1）试验方法：
准备7份甲型流感病毒假病毒分为试验组1-3和对照组1-4，取100μL样品于50μL样本释放剂混合均匀，于13000rmp/min条件下离心1min，加热至60℃得到释放液，然后取10μL释放液与40μL的PCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增。试验组1-3所用样本释放剂为实施例1-3的样本释放剂，对照组1-4所用样本释放剂为对比例1-4的样本释放剂。
PCR的扩增条件参考TaKaRa RNA RCR试剂盒的说明书。
（2）试验结果：
各试验组和对照组的Ct值如表1所示。
表1：试验组及对照组的Ct值
Ct值（阈值循环数）是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系：起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。在相同模板量的条件下，Ct数值越小说明检测灵敏度越高。
由表1可以看出，对照组1-4的试验结果Ct值均高于36，而试验组1-3的Ct值均低于25，这说明试验组中的样本释放剂对甲型流感病毒扩增检测的灵敏度更高。同时，将试验组1、对照组1-4的数值进行比较，可以看出本发明中使用的IGEPAL CA-630 、蛋白酶k和多果定对提高检测灵敏度具有协同增效作用。
试验例2：样本释放剂释放速度及保存效果的测定。
（1）试验方法：
将7份甲型流感病毒假病毒分为试验组4-6、对照组5-8，分别使用实施例1-3和对比例1-4的样本释放剂稀释至100拷贝/mL，在37℃、常压条件下放置10天，分别于5、10、15、20min以及1、3、5、10天时吸取5μL的样本进行检测。
（2）试验结果：
表2：样本释放剂的释放速度及保存效果
注：表2中+代表检出，-代表未检出。
由表2可知，试验组4-6的样本释放剂在5min-10天的时间范围内均能够检出甲型流感病毒假病毒，这说明试验例1-3的样本释放剂均能够在5分钟之内释放病毒核酸，且释放后能够保存至第10天；而对比例5-8的数据表明，仅有对比例3的样本释放剂能够在5分钟之内释放病毒核酸，但在一天之后即无法有效检测出病毒，这说明对比例3的样本释放剂保存效果较差，同时，对比例1、2和4均无法在5分钟之内释放病毒核酸，且均无法保存至第5天。这些数据均表明实施例1-3的样本释放剂在释放速度和保存效果上均要优于对比例1-4。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (1)
1.样本释放剂在提取病毒核酸中的应用；其特征在于，所述样本释放剂的原料组成如下：
体积分数为1%的Triton X-100、体积分数为2%的IGEPALCA-630、0.5mg/ml的蛋白酶k、体积分数为10%的多果定、0.5mM的Tris-HCl、体积分数为1%的异丙醇、体积分数为1%的轻质白油、15-50mM的氯化钠、5-8mg/ml的氯化钾，样本释放剂的溶剂为去离子水。
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