CN115397453A

CN115397453A - 用于检测病毒核酸的产品和方法

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Publication number: CN115397453A
Application number: CN202180028582.2A
Authority: CN
Inventors: F.C.A.加埃塔; W.菲利普斯
Original assignee: Spectrum Solutions LLC
Current assignee: Spectrum Solutions LLC
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2022-11-25
Also published as: EP3996732A4; US20230272368A1; EP3996732A1; JP2023521803A; CA3171097A1; WO2021211740A1; MX2022012104A

Abstract

公开了核酸保存组合物及其制造和使用方法，特别是用于检测COVID‑19病毒。组合物包括载体、离散剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、醇、酸和黏液溶解剂。作为水性溶液的组合物可以包括水作为载体。优选的实施方式包括水、硫氰酸胍、Tris、EDTA、SLS、SDA 3C、HCl和N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸。一些实施方式包括有色染料作为视觉指示剂。试剂盒包括布置在生物样品采集装置的一部分中的组合物。制造方法包括将组分组合成混合物，诸如水性溶液。使用方法包括提供包括核酸的生物样品并使生物样品与组合物接触。证明了对COVID‑19病毒的检测。组合物还保存并稳定化人核酸用于后续分析。

Description

用于检测病毒核酸的产品和方法

背景技术

1.技术领域

本公开涉及保存和分析核酸。具体地，本公开涉及用于保存生物样品中的病毒核酸以进一步分析的组合物和方法，并且特别涉及用于保存唾液中的病毒核酸以进一步分析的组合物和方法。

2.相关技术

最近对病毒株的检测、分析、量化和/或测量引起了兴趣，该病毒株包括冠状病毒株，诸如严重急性呼吸综合征(或SARS)相关的冠状病毒SARS-CoV(例如，SARS-CoV-2，已知其已经引起2019年的冠状病毒疾病(COVID-19)，以及其英国和/或南非的一种或多种变体等)、中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)，以及其他；丝状病毒(纤丝病毒科(Filoviridae))，已知其会引起严重的病毒性出血热(VHF)，包括奎瓦病毒属(Cuevavirus)、马尔堡病毒属(Marburgvirus)和埃博拉病毒属(Ebolavirus)，及其物种/亚型(例如，扎伊尔埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)、苏丹埃博拉病毒(Sudan ebolavirus)、塔伊森林埃博拉病毒(

Forest ebolavirus)、科特迪瓦埃博拉病毒(

d’Ivoireebolavirus)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo ebolavirus)、雷斯顿埃博拉病毒(Restonebolavirus)和邦巴利埃博拉病毒(Bombali ebolavirus))。

病毒核酸可以从包括细胞和/或无细胞病毒核酸的生物样品中提取。提取的病毒核酸可以用于各种各样的分析目的，包括感染和/或疾病的检测、量化和/或诊断。从唾液中提取病毒核酸可能特别有用的，因为唾液样品采集是相对非侵入的。含病毒核酸的生物样品，包括唾液样品，通常需要适当处理以用于特定类型的核酸分析。分析技术诸如聚合酶链反应(PCR)、核酸测序(例如，下一代测序(NGS))以及其他，可能需要依赖于待使用的特定平台的特定处理或预处理步骤。在一些情况下，可能需要处理含病毒核酸的生物样品以稳定样品或其核酸。通常将稳定溶液添加至含核酸的生物样品中以确保一部分核酸的存活直到可以对其进行分析。

现有的稳定溶液对于某些类型的生物样品和/或某些分析技术或用于进行该分析技术的设备可能不是最佳的。例如，用于某个下一代测序仪中的最佳或合适的分析来配制的稳定溶液可能不是最佳的或不适用于其他下一代测序仪或PCR设备中的分析，反之亦然。在一些情况下，不适当的制剂可能会产生或导致分析伪影和/或高背景信号(或噪音)。现有的稳定溶液也可能在保存病毒核酸或用于控制微生物(例如，(细菌、真菌)生长或生命中存在缺陷。生物样品，诸如唾液，通常包括和/或由一种或多种微生物(例如，细菌、真菌等)污染。这些微生物包含的核酸可能干扰生物样品中的一种或多种病毒株的核酸或者连同生物样品中的一种或多种病毒株的核酸一起被检测到。保存溶液可能不经意稳定细菌或真菌核酸，或者甚至允许微生物生长。类似地，生物样品可能包含受试者、宿主或生物样品来源(例如，人)的核酸，其可能干扰生物样品中的病毒株的核酸或者连同生物样品中的病毒株的核酸一起被检测到。在某些类型的分析技术或设备中，现有的稳定溶液对于区分宿主和病毒病原体之间可能是次优的。此外，生物样品中可能包含非目标病毒的核酸，该核酸可能干扰生物样品中的目标病毒株的核酸或者连同生物样品中的目标病毒株的核酸一起被检测到。

因此，持续需要适用于各种各样分析技术和设备的通用核酸稳定溶液和/或与现有产品相比提供更好的病毒核酸总产量和样品质量的溶液。

发明内容

本公开的实施方式用包括以下项的一种或多种实施方式解决了本领域中前述或其他问题中的一个或多个，所述实施方式包括核酸保存、稳定和/或制备组合物、包括所述组合物的试剂盒、以及制造和使用所述组合物的方法。例如，本公开的一些实施方式包括用于保存、稳定和/或制备生物样品中核酸的组合物。所述组合物可以适用于各种各样的分析技术和设备。所述组合物可以产生大量核酸用于后续分析。例如，所述组合物可以产生大量的病毒核酸(例如，DNA、RNA)，优选地和/或任选地具有少量的微生物(例如，细菌、真菌)核酸(例如，DNA、RNA)用于后续分析。所述组合物可以包括溶液或水基(例如水性)液体，任选地(浅)蓝色或黄色，适用于稳定化病毒核酸(DNA和/或RNA)和/或防止细菌污染和/或长期储存。

本公开的实施方式包括核酸保存组合物，其包括水性载体、离散剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂(或洗涤剂)、醇、任选的酸；以及黏液溶解剂。实施方式可以进一步包括视觉指示剂。在一些实施方式中，水性载体可以是以下项或包括以下项：水，优选过滤水、纯化水、蒸馏水和/或去离子水。在一些实施方式中，离散剂可以是以下项或包括以下项：胍和/或硫氰酸盐，优选硫氰酸胍。在一些实施方式中，缓冲剂可以是以下项或包括以下项：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，优选Tris-HCl，更优选

碱。在一些实施方式中，螯合剂可以是以下项或包括以下项：乙二胺四乙酸(EDTA)，优选作为EDTA二钠盐，更优选作为EDTA二钠(盐)二水合物。在一些实施方式中，表面活性剂(或洗涤剂)可以是月桂酰肌氨酸钠(SLS)或包括月桂酰肌氨酸钠(SLS)。在一些实施方式中，醇可以是以下项或包括以下项：醇，优选特异变性醇(SDA)或者乙醇和异丙醇的混合物，更优选约95％乙醇，v/v和约5％异丙醇，v/v的混合物(或SDA 3C)。在一些实施方式中，任选的酸可以是盐酸或包括盐酸。在一些实施方式中，黏液溶解剂可以是N-乙酰基-L-半胱氨酸或包括N-乙酰基-L-半胱氨酸。在一些实施方式中，视觉指示剂可以是以下项或包括以下项：着色剂，诸如染料(例如，FD&C Blue No.1)。

本公开的实施方式包括病毒核酸保存组合物，其包括约43.92％离散剂(例如，硫氰酸胍)，w/w；约2.65％缓冲剂(例如，Tris)，w/w；约1.03％螯合剂(例如，EDTA (二钠)二水合物)，w/w；约0.279％表面活性剂或洗涤剂(例如，SLS)，w/w(或其30％溶液的约0.93％，w/w)；约17.73％醇(例如，乙醇或乙醇和异丙醇的混合物，诸如SDA 3C)，w/w；约0.093％黏液溶解剂(例如，N-乙酰基-L-半胱氨酸)，w/w；如果需要，约0.4％酸(例如，盐酸)，w/w或酸qs至约pH 7.8-8.4，优选pH 8.0或8.1；和/或约34.12％载体，w/w(例如，包括过滤水、纯化水、蒸馏水和/或去离子水的水性载体)，32.78％载体，w/w，或载体qs至100％。实施方式可以进一步包括约0.00037％，w/w，视觉指示剂(例如，FD&C Blue No.1)或其等效物(例如，0.00037％，w/w的37％，w/w溶液或视觉指示剂浓缩物；0.185％，w/w的0.2％，w/w溶液或视觉指示剂浓缩物，等(例如，在水中))。

一种或多种实施方式可以包括(约)43.92％离散剂(例如，硫氰酸胍)，w/w，±10％，(约)2.65％缓冲剂(例如，Tris)，w/w，±10％，(约)1.03％螯合剂(例如，EDTA(二钠)二水合物)，w/w，±10％，(约)0.279％表面活性剂或洗涤剂(例如，SLS)，w/w，±10％，(或其30％溶液的(约)0.93％，w/w，±10％)，(约)17.73％醇(例如，乙醇或乙醇和异丙醇的混合物，诸如SDA 3C)，w/w，±10％，(约)0.093％黏液溶解剂(例如，N-乙酰基-L-半胱氨酸)，w/w，±10％；如果需要，(约)0.4％酸(例如，盐酸)，w/w，±10％，或酸qs至(约)pH 7.2-9.5；和/或(约)34.12％载体，w/w，±10％，(例如，包括过滤水、纯化水、蒸馏水和/或去离子水的水性载体)，32.78％载体，w/w，±10％，或载体qs至100％。实施方式可以进一步包括(约)0.00037％，w/w，±10％，视觉指示剂(例如，FD&C Blue No.1)或其等效物(例如，(约)0.00037％，w/w，±10％的37％，w/w溶液或视觉指示剂浓缩物；(约)0.185％，w/w，±10％的0.2％，w/w，溶液或视觉指示剂浓缩物，等(例如，在水中))。在一些实施方式中，各组分的量，±10％，进一步是(限于列举的量)±9％，优选±8％，更优选±7％，仍更优选±6％，仍更优选±5％，仍更优选±4％，仍更优选±3％，仍更优选±2％，仍更优选±1％。

一种或多种实施方式可以包括20-50％离散剂，w/w，0.1-5％缓冲剂，w/w，0.05-2.5％螯合剂，w/w，0.01-5％表面活性剂，w/w，5-25％醇，w/w，0.005-0.25％黏液溶解剂，w/w，0.005-5％酸或酸qs至pH7.2-9.5，和/或10-60％载体或载体qs至100％。实施方式可以包括0.00005-0.5％，w/w，视觉指示剂(或0.01-2.5％，w/w的0.0001-5％，w/w视觉指示剂浓缩物(例如，在水中))。

在一种或多种实施方式中，组合物可以具有的pH为约8.0或约8.1、或者pH 7.1-9.5、pH 7.2-9.5、pH 7.2-9.0、pH 7.2-8.8、pH 7.3-8.7、pH 7.4-8.6、pH 7.5-8.5、pH 7.6-8.4、pH 7.7-8.3、pH 7.8-8.2、pH 7.8-8.4、pH 7.9-8.3或者其之间的任何值或值的范围。

一种或多种实施方式可以(基本上)不含有(例如，除了以下项或者除了以下项以外：一种或多种醇、一种或多种离散剂、一种或多种表面活性剂/一种或多种洗涤剂和/或一种或多种黏液溶解剂)(额外的或者任何)一种或多种抗微生物(例如，一种或多种杀菌和/或一种或多种抑菌)剂。一种或多种实施方式可以(基本上)不含有(例如，除了一种或多种离散剂或除了一种或多种离散剂以外)(额外的或任何)一种或多种核糖核酸酶抑制剂，或核糖核酸酶的一种或多种抑制剂。一种或多种实施方式可以(基本上)不含有(任何)一种或多种蛋白酶。

一些实施方式包括稳定核酸的方法。所述方法可以包括提供包含核酸的生物样品并将本公开的组合物与生物样品组合。所述方法还可以包括本领域已知的其他处理步骤。本公开的实施方式包括稳定核酸(例如，病毒核酸，诸如病毒DNA或病毒RNA)的方法。实施方式包括使包含核酸的生物样品与本公开的组合物接触。在实施方式中，生物样品包括人(或哺乳动物)唾液。

一些实施方式包括生物样品保存试剂盒。所述试剂盒可以包括样品采集装置和核酸保存组合物。样品采集装置可以包括溶液分隔室。核酸保存组合物可以设置在溶液分隔室中。本公开的实施方式包括试剂盒，所述试剂盒包括设置在样品采集装置的一部分中的本公开的组合物。

一些实施方式包括制造本公开的组合物的方法。所述方法可以包括组合本公开的组分。所述方法还可以包括本领域已知的其他制造步骤。本公开的实施方式包括制造核酸稳定化组合物的方法。实施方式包括获得载体并将本公开的组合物的组分或成分添加至载体中。

令人惊讶地且出人意料地，本公开的实施方式可以用于与以下项有关的方面：病毒核酸保存、检测和/或分析，以及人核酸保存、检测和/或分析，尤其是来自唾液样品诸如人或非人动物(哺乳动物)的唾液样品。本公开的各种实施方式可以用于与以下项有关的方面：病毒株的保存、检测和/或分析，该病毒株包括冠状病毒株，诸如严重急性呼吸综合征(或SARS)相关的冠状病毒SARS-CoV(例如，SARS-CoV-2，已知其已经引起2019年的冠状病毒疾病(COVID-19)，以及其英国和/或南非的一种或多种变体等)、中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)；丝状病毒(纤丝病毒科)，已知其会引起严重的病毒性出血热(VHF)，包括奎瓦病毒属、马尔堡病毒属和埃博拉病毒属，及其物种/亚型(例如，扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒、塔伊森林埃博拉病毒、科特迪瓦埃博拉病毒、前本迪布焦埃博拉病毒、莱斯顿埃博拉病毒和邦巴利埃博拉病毒)以及其他。本公开的实施方式在本文中示出在与以下项相关的方面是有效的：保存、检测和/或分析来自导致COVID-19的新型冠状病毒SARS-CoV-2的核酸。

因此，本公开的实施方式可以包括如本文阐述的病毒脱氧核糖核酸(DNA)和/或病毒核糖核酸(RNA)保存组合物、方法、试剂盒等。所述组合物和方法可以保存病毒核酸免于降解和/或损失。所述组合物和方法可以提供和/或产生高产量的病毒核酸量。所述组合物和方法可以以与病毒核酸的保存后、定性和/或定量测试、分析和/或测量一致和/或相容的方式保存病毒核酸。

实际上，本文阐述的各个方面和/或实施方式，包括组合物、方法、试剂盒及它们相关的结果、数据、益处等，可以适用于病毒核酸保存、检测和/或分析，如它们适用于人核酸保存、检测和/或分析，如先前所述和/或公开的。

此外，本公开的实施方式可以用于与以下项相关的方面：病毒核酸保存、检测和/或分析来自唾液样品诸如人或非人动物(哺乳动物)的唾液样品。而且，本公开的实施方式可以令人惊讶地和出人意料地有效用于与以下项相关的方面：来自唾液样品诸如人或非人动物(哺乳动物)唾液样品的病毒和人核酸两者的保存、检测和/或分析。在一些实施方式中，本公开的实施方式可以用于与以下项相关的方面：病毒核酸保存、检测和/或分析来自咳出的唾液样品，诸如咳出的人唾液样品，而不是鼻、口、咽等拭子(如用于与典型病毒检测方法相关的方面)。然而，应当理解，本文还考虑来自鼻、口、咽等拭子的生物样品或者采集来自鼻、口、咽等拭子的生物样品。在至少一种实施方式中，根据本公开的实施方式，包括例如一种或多种核酸保存组合物和/或方法论，病毒DNA/RNA产量、检测、定量等使用咳出的唾液可能是更有效的。

本公开的示例实施方式的额外特征和优点将在随后的描述中阐述，并且部分地从描述中将是显而易见的，或者可能通过对这样的示例实施方式的实践来了解。这样的实施方式的特征和优点可能通过所附权利要求中特别指出的仪器和组合来实现并获得。这些和其他特征将从以下描述和所附权利要求中变得更加明显，或者可以通过下文所述的示例实施方式的实践来了解。

附图说明

为了描述可以获得本公开的上面列举和其他优点和特征的方式，将通过参考附图中所示的其特定实施来对上面简要描述的实施进行更具体的描述。为了更好地理解，贯穿一副或多副附图中，相同的元素用相同的参考编号表示。应当理解这些附图仅描述了本发明的典型实施并且因此不应被认为是对其范围的限制，本发明将通过使用一副或多副附图以额外的具体性和细节来描述并解释，其中：

图1A是使用根据本公开的实施方式的组合物保存的具有高分子量DNA的凝胶的图像；以及

图1B是具有Bionexus All Purpose HI-LO DNA标志物的凝胶的图像。

具体实施方式

在详细描述本公开的各种实施方式之前，应当理解，本公开不限于特定示例的系统、方法和/或产品的具体参数和描述，这些系统、方法和/或产品可以从一种实施方式到下一种实施方式有所不同。因此，虽然参考具体特征(例如，配置、参数、特性、步骤、组分、成分、成员、元素、部件和/或部分等)来详细描述本公开的某些实施方式，但是该描述是说明性的并且不应被解释为限制本公开和/或要求保护的发明的范围。另外，本文使用的技术术语是为了描述实施方式的目的，并且不一定是旨在限制本公开和/或要求保护的发明的范围。

虽然将详细描述分成多个分段，但每个分段中的分段标题和内容并不旨在是自包含的描述和实施方式。相反，详细描述中的每个分段的内容旨在作为一个整体来阅读和理解，其中一个分段的元素可能涉及其他分段和/或影响其他分段。因此，在一个分段中具体公开的实施方式也可以涉及和/或用作具有相同和/或相似系统、设备、方法和/或技术术语的另一分段中的额外和/或替代实施方式。

定义的术语的缩写列表

为了帮助理解前述以及即将提出的书面描述和所附权利要求的范围和内容，下面直接定义了选定的一些术语。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，过渡性短语“基本上由……组成”意指将权利要求的范围解释涵括权利要求中列举的特定材料或步骤，“以及不会实质影响要求保护的发明的基本和一个或多个新颖特征的那些”。参见In re Herz,537F.2d 549,551-52,190U.S.P.Q.461,463(CCPA1976)(原文中强调)；另参见MPEP§2111.03。因此，当在本公开的权利要求中使用时，术语“基本上由……组成”并不旨在解释为等同于“包括”。

术语“SARS-CoV-2”是指严重急性呼吸综合征冠状病毒2。SARS-CoV-2是引起COVID-19的病毒。

术语“CPE”是指致细胞病变效应，即由病毒感染导致的宿主细胞中的结构变化。CPE发生在当感染病毒引起宿主细胞裂解(溶解)时或当细胞由于无能力增殖从而在没有裂解下死亡时。

术语“RT-PCR”是指逆转录聚合酶链反应，由此经由RNA提取(例如，使用(基于珠粒的)核酸提取)随后通过定量PCR(使用双标记探针化学)来进行病毒检测，优选用于检测核酸，诸如SARS-CoV-2病毒转录物。

如本文所用，术语“核酸”是指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA或RNA或DNA-RNA杂交体、单链或双链、有义或反义，其能够通过Watson-Crick碱基配对与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物(例如，BrdU、dUTP、7-deaza-dGTP)和非磷酸二酯核苷间键(例如，肽核酸(PNA)或硫二酯键)。尤其，核酸可以包括但不限于DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。在适用的情况下，可以将对一种示例核酸的说明性参考视为对其他核酸的参考。

术语“样品”、“生物样品”等是指动物；来自动物的组织或器官；细胞(在受试者内，直接取自受试者，或维持在培养中的细胞或来自培养的细胞系)；细胞裂解物(或裂解物部分)或细胞提取物；包含源自细胞、细胞物质或病毒物质(例如多肽或核酸)的一种或多种分子的溶液；或包含天然或非天然存在的核酸的溶液，其如本文所述进行测定或可以如本文所述进行测定。样品还可以是包含一种或多种细胞、细胞组分或核酸的任何体液或排泄物，包括但不限于细胞、细胞核或无细胞核酸。

“体液”意指天然存在的流体，包括但不限于来自动物(例如人或非人动物或哺乳动物)的液体、半固体、充气液体、液-气混合物等。这样的体液可以包括但不限于唾液、痰、血清、血浆、血液、尿、黏液、汗液、泪液或其他眼流体、耳流体、脓液(例如，来自水疱或疮)、胃流体或汁液、粪流体、胰流体或汁液、精液、泌乳或测诊的产物、脊流体、骨髓流体或淋巴液。

“痰”意指包含在哺乳动物的鼻或口腔中或从哺乳动物的鼻或口腔排出的粘液样物质。如本文所用，痰通常包括唾液并从呼吸道(包括肺)中排出。

“唾液”意指来自任何唾液腺(包括腮腺、颌下腺和舌下腺)的分泌物或分泌物的组合，任选地与来自颊腺的分泌物混合。

“黏液”意指包含黏蛋白的任何体液。

“黏蛋白”意指提高围绕分泌它的细胞的介质的粘度的任何黏蛋白。

如本文所用，关于值的术语“约”意指所述值或由此表示的量的+/-10％。例如，贯穿本公开，术语“约”用于与以下项相关的方面：组分或成分的百分比浓度或组成(例如，在混合物诸如流体或液体混合物、水性混合物、溶液等中，任选地或优选地测量为w/w百分比、w/v百分比、v/v百分比等)。在这样的情况下，术语“约”和/或术语“+/-10％”意味着和/或包括所述数值的+/-10％，而不是列举百分比的+/-10个百分点。举例来说，当20％w/w的组分或成分反映了每100mL总混合物中的20g组分或成分时，术语“约”和/或术语“+/-10％”意味着和/或包括列举范围为18g至22g(即，18％w/w至22％w/w)，而不是10％w/w至30％w/w的范围。所谓“约”值和/或+/-10％的替代包括设定值的+/-1％、+/-2％、+/-3％、+/-4％、+/-5％、+/-6％、+/-7％、+/-8％或+/-9％，其中每一个都被考虑是术语“约”或使用+/-10％的适合替代或代替。

如本文所用，术语“大约”和“基本上”代表或意味着接近设定量的(或任何)量(例如，仍进行期望的功能或实现(期望的或预期的)结果)。例如，术语“大约”和“基本上”可以是指在以下项内的量或小于以下项的量：设定量的10％、5％、1％、0.1％、0.01％或其他百分比。如本文所用，术语“基本上不含有”意指(1)不可检测或不可量化的量，(2)小于或低于本领域技术人员通常认为反映可检测或可量化的量的量，和/或(3)小于或低于本领域技术人员通常认为具有功能或能够实现(期望或预期)结果的量(例如，小于10％、5％、1％、0.1％、0.01％或其他百分比)。

“足量(Quantum satis)”(也称为“q.s.”或“qs”)意指足够的量。因此，组分或成分“qs 100％”、“以qs 100％提供”或“qs至100％”指示组分或成分的提供或包括的量足以完成组合物或使总计(所有组分，无论是否列举)达到100％。然而，应当注意，(最终)组分或成分“qs 100％”、“以qs 100％提供”或“qs至100％”并不指示混合物由以下项组成、基本上由以下项组成或仅包含以下项：紧接在“qs 100％”组分之前列出或列举的组分。换句话说，“qs 100％”和类似的术语意指指示剩余部分的来源的开放式的表达，无论剩余部分可能是什么。

“醇”意指包含羟基基团的水混溶性有机化合物，包括含羟基有机化合物的水混溶性混合物。

“水性”意指包含(按体积或重量计)30％或更多水的介质或物质。

“水性溶液”意指包含按体积计30％或更多水的溶液或悬浮剂。

“变性剂”意指改变添加物的自然状态的物质。

“离散剂”意指发挥离散活性的分子。如本领域技术人员所理解的，发挥离散活性的分子可以破坏水分子之间的氢键合网络，从而通过减弱疏水效应来影响其他分子(在溶液中)，主要是大分子(蛋白质、核酸)的天然状态的稳定性。因此，发挥离散活性的分子可以具有蛋白质变性活性(或是蛋白变性剂)。

“抗微生物剂”意指以下项的物质或物质的组，与该一种物质或一组物质不存在时生物的生长速率相比，它们降低了生物的生长速率。生物的生长速率可以降低至少5％，更期望降低至少10％，甚至更期望降低至少20％、50％或75％，以及最期望降低90％或者更多。该定义还扩展到影响生物的生存力、毒力或致病性的物质。抗微生物剂可以是天然(例如，源自细菌或其他来源)、合成或重组的。抗微生物剂可以是抑菌的、杀菌的或两者。如果抗微生物剂抑制细胞分裂而不影响被抑制细胞的生存力，则抗微生物剂是抑菌的。如果抗微生物剂引起细胞死亡，则抗微生物剂是杀菌的。通常通过在液体生长培养基中(例如，没有浊度)或在固体表面(例如，在琼脂上没有集落形成)中没有细胞生长来检测细胞死亡。本领域技术人员知道，在给定浓度下抑菌的物质或物质的组在更高浓度下可能是杀菌的。某些抑菌物质在任何浓度下都不会杀菌。

如本文所用，“乙酰半胱氨酸”或“N-乙酰半胱氨酸”(NAC)包括任何形式的乙酰半胱氨酸，包括N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸和外消旋N-乙酰半胱氨酸或者N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-乙酰基-D-半胱氨酸的(外消旋)混合物)。提及一种形式的乙酰半胱氨酸支持具体提及任何形式的乙酰半胱氨酸。

如本文所用，术语“组合物”包括产品、制剂和混合物，以及设备、装置、组件、试剂盒等。类似地，术语“方法”包括过程、程序、步骤等。

本公开的各个方面，包括系统、方法和/或产品，可以参考本质上是示例的一种或多种实施例或者实施方案来说明。如本文所用，术语“实施方式”和“实施方案”意指“用作实例、例子或说明”，并且不应被解释为比本文公开的其他方面更优选或有利。另外，对本公开或发明的“实施方案”的提及包括对其一种或多种实施方式的具体提及，反之亦然，并且旨在提供说明性实例而不限制本发明的范围，其由所附权利要求书，而不是其描述所指示。

如本文所用，本公开或本文公开的实施方式的“特征”是指现有主题的特性、组分、成分、元素、部件、部分、(方法)步骤或其他方面。

如贯穿本公开所用，词语“可以”和“可能”以许可的意义使用(即，意指有可能)，而不是强制性的意义(即，意指必须)。额外地，术语“包括(including)”、“具有(“having)”、“涉及(involving)”、“包含(containing)”、“特征在于”、其变体(例如，“包括(includes)”、“具有(“has)”和“涉及(involves)”、“包含(contains)”等)，以及如本文，包括权利要求所用的类似术语，应是包容性的和/或开放式的，应与词语“包括(comprising)”及其变体(例如，“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)具有相同的含义，并且举例说明，不排除额外的、未列举的元素或方法步骤。

如本文所用，词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。

如在本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”各自考虑、包括并具体公开了单数和复数指示物两者。例如，提及“蛋白质”考虑并具体公开了一种以及两种或更多种蛋白质。类似地，除非上下文另有明确规定，否则复数指示物的使用不一定需要多个这样的指示物，而是考虑、包括并具体公开一个以及两个或更多个这样的指示物，除非上下文另有明确规定。

应当注意，本公开的实施方式可以包括本文描述的两个或更多个特征的一种或多种组合。如本文所用，“一个或多个特征”和类似术语可以包括例如组合物、成分、组分、元素、成员、部件、部分、系统、方法、配置、参数、特性等。实施方式可以包括在本公开的其他地方——包括在本公开的其他方面或实施方式中——提出的特征、选项和/或可能性的任何一种。还应当注意，本文所述的前述、以下和/或其他特征中的每一个均代表本公开的不同实施方式。特征还可以以任何合适的组合和/或顺序与另一一个或多个其他特征组合和/或可组合，有或没有一个或多个额外特征包括在其内或在其间进行，以形成独特的实施方式，其中的每一个都被考虑在本公开中。任何两个或更多个这样的特征的这样的组合代表本公开的不同实施方式。因此，本公开不限于本文详细描述的示例实施方式的特定组合，并且与本公开的特定实施方式相关的某些特征的公开不应被解释为将所述特征的应用或包括限制于特定实施方式。

另外，除非在特定实施方式中将特征描述为需要，否则在各种实施方式中描述的特征可以是任选的并且可能不包括在本公开的其他实施方式中。此外，除非将特征被描述为需要与其组合的另一特征，否则本文的任何特征可以与本文公开的相同或不同实施方式的任何其他特征组合。同样，除非另有说明(明确地或隐含地)，否则本文所述的任何方法中列举的和/或权利要求书中列举的任何步骤都可以以任何合适的顺序执行，并且不必限于所描述和/或列举的顺序。然而，在本公开的某些实施方式中，这样的步骤也可能需要以特定顺序进行。

还应当理解，在公开或列举的两个或更多个值，或值的范围(例如，小于、大于、至少和/或高达某个值，和/或在两个列举的值之间)的情况，落入公开值或值范围内的任何特定值或值范围在本文中同样被具体公开和考虑。因此，举例说明，对小于或等于约10个单位或者0和10个单位之间的说明性测量(例如，长度、宽度、厚度等)的公开包括以下具体公开：(i)9个单位、5个单位、1个单位或者0和10个单位之间的任何其他值的测量，包括0个单位和/或10个单位；和/或(ii)9个单位和1个单位之间、8个单位和2个单位之间、6个单位和4个单位之间的测量，和/或0个和10个单位之间的任何其他范围的值。

为了便于理解，在可能的情况下，使用了相似的参考(即，组分和/或元素的相似命名)来指定本公开的不同实施方式共有的相似元素。类似地，在可能的情况下，类似组分或具有类似功能的组分将提供类似的参考名称。本文将使用特定语言来描述示例实施方式。然而，应当理解，并不因此旨在限制本公开的范围。相反，应当理解，用于描述示例实施方式的语言仅是说明性的并且不应被解释为限制本公开的范围(除非这种语言在本文中被明确地描述为必要的)。

直到最近，传统的病毒测试方法在很大程度上依赖于血液或鼻咽拭子采集样品。这些不舒适和/或侵入性的生物样品采集方法需要医护专业人员或训练有素的技术人员来进行，并且包括将长拭子插入鼻中至样品所在的咽喉后部。4月中旬(2020年)，美国食品药品监督管理局(United States Food and Drug Administration，FDA)对仅使用本公开的唾液样品采集设备(称为“SDNA-1000)的基于唾液的测试授予紧急使用授权(EUA)，该设备包含根据本公开实施方式的病毒核酸保存组合物。SDNA-1000是易于使用和自我施用的设备，旨在用于非侵入性唾液采集。SDNA-1000唾液采集设备(SDNA-1000)旨在用于供个体在运输期间采集、稳定和维护怀疑包含SARS-CoV-2核糖核酸(RNA)的未处理唾液样本。与许多不同的拭子采集相比，使用SDNA-1000的唾液样品采集被证明通过简单的被动吐出的自我采集对患者来说更容易且更舒适。SDNA-1000不需要额外的采集供给或者与医护人员的任何直接互动，唾液采集有效地降低了对口罩、长衫、手套和其他个人防护装备(PPE)的需求，如果需要医护人员来施用样品采集，则需要这些。首创病毒感染的家庭生物样品自我采集的新时代，并增加了使用SDNA-1000唾液采集设备和相关核酸保存组合物的日益增长的益处，进行研究以评价和证明当使用本公开的一种或多种病毒核酸保存剂在SDNA-1000唾液设备中采集时SARS-CoV-2活病毒的100％中和。

在全球大流行的聚光灯下，COVID-19很容易证明，随着测试需求增加1000倍，对关键生物样品采集供给和PPE的需求也增加1000倍。当采集生物样品、后续的运输和用于病毒测试样品处理时，一线支持的暴露风险始终是严重的防范弱点。随着测试供给和PPE开始耗尽，在样品采集期间暴露于病毒不仅对医护团队，而且额外地对公众生成威胁。测试供给的缺乏不仅直接影响了广泛提供测试的能力，其还使那些人可能暴露但无症状、未测试、未诊断，并且不知道有进一步感染直接和密切接触者的潜在风险。很明显，为了为现有生物样品采集问题递送可行的解决方案，必须做三件事。第一，该解决方案必须不掺入已经非常低的供给元素的任何一种。第二，它需要递送缓解供给紧张的方式，同时消除解除暴露的威胁。第三，解决方案需要提供向患者递送测试而不是使患者接受测试的途径。

本公开的实施方式允许非侵入性唾液样本采集用于病毒核酸保存和分析。本公开的实施方式在本文中示出在唾液样品的采集、病毒核酸(例如，用于分子分析的RNA)的保存、活病毒的灭活以及将生物样品安全运输到实验室进行分子测试方面是有效的。实施方式进一步提供高质量的分析结果，包括高纯度、高产量和/或低伪影结果。

唾液是用于COVID-19分子检测的经授权和优选的样品采集方法。罗格斯临床基因组学实验室(Rutgers Clinical Genomics Laboratory，RCGL)，现为Infinity BiologiX，于2020年4月10日获得FDA紧急使用授权(FDA EUA#200090)，授权首次使用仅使用具有本发明组合物的唾液采集设备采集的唾液，用于分析和检测COVID-19。具体而言，于2020年2月4日，根据该法案第564(b)(1)(C)节，卫生与公众服务部(Department of Health and HumanServices，HHS)部长确定存在公共卫生紧急情况，该紧急情况显著潜在地影响国家安全或居住在国外的美国公民的健康和安全，并且其涉及引起COVID-19的病毒。根据该法案第564节，并基于这样的确定，HHS部长随后于2020年3月24日宣布，存在证明在COVID-19爆发期间授权紧急使用医疗设备的情况，但须遵守在该法案第564(a)节下发布的任何授权条款。FDA考虑了授权紧急使用本发明的含组合物的产品用于鉴定的适应症的所有可用科学信息。FDA授权的过程要求通过将唾液咳出(即吐出)到SDNA-1000采集管中直至分界线来采集最少量的唾液。本发明的保存组合物(化学)使任何COVID-19病毒灭活并保存病毒核酸(例如，RNA)，以用于运输到参考实验室进行分子分析。

举例说明，在到达实验室后，可以从唾液样品中提取病毒RNA(例如，使用针对病毒RNA纯化而优化的基于珠粒的核酸提取化学)。独立研究现已示出，当使用唾液进行分子分析时，提取和纯化的基本步骤递送最佳准确性所需的灵敏度提升。可以对病毒RNA进行多重RT-PCR以定性鉴定，例如，将三个独立的病毒转录物，用于确定患者是否被主动感染以及是否有可能对直接和密切接触者构成感染风险。

鉴于COVID-19唾液采集的科学、安全和经验优点，确保以下项也是重要的：由任何指定患者提供的潜在感染性材料对于从采集到实验室的运输以及其一旦到达实验室则安全处理材料两者是安全的。目前，将所有拭子采集都放置在病毒或通用转移介质中，该介质支持在其中任何感染性病毒保留其感染样品处理人员的潜力的环境；由于SARS-Cov-2是非常强大的病毒，因此干拭子和未保存的唾液也令人担忧。相比之下，使用具有根据本公开的发明保存组合物的SDNA-1000设备来采集唾液使任何感染性冠状病毒完全灭活，从而允许更安全的实验室体验和用于从采集设备中取样和提取的更稳健的自动化过程。

本公开描述了支持上面病毒灭活要求的一系列研究。通过使用RT-PCR测量致细胞病变效应(CPE)和病毒转录物检测两者作为感染性的直接测量来确定病毒灭活。COVID-19活性和感染是通过在细胞饲养层的环境下评价主要临床样品来测量的，该细胞饲养层模拟了支持人中病毒感染的环境。为了进行这些类型的研究，在BSL3实验室环境中培养完整且具有复制能力的COVID-19病毒并用于实验。将病毒暴露于本发明的保存剂以模拟临床唾液样品采集。保存剂包含一种或多种成分，包括例如可以杀死培养的真核细胞的离散剂。因此，使用Amicon过滤器进行透析程序以去除会导致破坏饲养细胞(Vero)并最终阻止在样品采集后测量潜在感染的任何缓冲液组分。用于去除保存剂中任何细胞毒性组分的方法已发表(Burton JE,et al.,The effect of a non-denaturing detergent and aguanidinium-based inactivation agent on the viability of Ebola virus in mockclinical serum samples.J.Virol.Methods.2017Dec；250:34-40)并且被本文验证为是测量在其本身对细胞培养有毒的缓冲液中病毒活性的有效方法。

培养COVID-19病毒并将其添加至无保存剂(实验对照)的介质/唾液或本公开的发明保存剂中。另外，在不添加活病毒作为额外对照的情况下测试了介质/唾液和保存剂。将在不同浓度下的病毒添加至介质/唾液和保存剂中，以模拟不同病毒载量下的活性感染，强调高病毒滴度，以真正测试保存在最具高度感染性条件下灭活病毒的能力。一旦制备好样品，每种条件或者进行过滤(以去除任何细胞生长抑制组分)，或者以一系列有限稀释直接应用于Vero细胞培养物。

一旦用透析和纯样品条件(单独的病毒、病毒+介质/唾液、病毒+本发明的保存剂)处理培养物，将细胞培养72小时，并进行致细胞病变效应(CPE)和RT-PCR分析。在第一次分析之后，细胞被传代并在72小时后重新测试，以模拟类似于持续感染环境的时间过程。在第二个时间点结束时，用两种分析测试所有培养物。

致细胞病变效应分析(CPE)是对由病毒感染引起的宿主细胞结构变化的测量。由于病毒感染导致无能力增殖，感染可以引起宿主细胞裂解或宿主细胞死亡。这两种结果都被认为是CPE，并通过对每种培养物的病理学复查手动评分。RT-PCR分析是对指定样品中病毒RNA转录物的测量。该分析过程需要裂解样品中的病毒，随后提取RNA。然后可以对RNA进行定性测量，并且在一些情况下定量(经由qPCR)地来评估样品是否暴露于COVID-19并被COVID-19感染。当组合起来时，这些测量提供了对病毒活性和感染性的完整和敏感的评估，作为样品采集场景的函数。参见以下表1。

表1

这项研究的结果通过CPE读出或RT-PCR成功地得出结论，在SDNA-1000裂解缓冲液的存在下，没有病毒生长的证据。参见，表1。与SDNA-1000裂解缓冲液混合的任何样品中CPE完全缺失表明Vero培养细胞中的病毒活性降低大于6对数级。额外地，细胞培养数天内病毒载量没有增加(通过RT-PCR测量)，表明暴露于SDNA保存剂后没有COVID-19生长或感染。已证实SDNA-1000保存剂本身对饲养细胞有毒，因此需要对缓冲液组分进行透析以进行病毒灭活研究。掺入活病毒的PBS/介质/唾液对照在用于去除保存剂中任何细胞毒性组分的相同透析程序之后保留了通过CPE和RT-PCR测量的感染性。该数据支持在SDNA-1000保存剂的存在下完全灭活COVID-19病毒。

DNA-1000唾液采集设备中病毒的灭活创建了用于检测COVID-19感染的最稳健和最安全的生物材料采集方法，并为在家中自我采集生物样品以诊断病毒感染开辟了新时代。

使用用SDNA-1000采集并用本公开的本发明组合物保存的唾液作为COVID-19检测的主要来源用于分子分析有几个优点。以下总结突出了主要益处。第一，无痛SDNA-1000唾液采集系统降低了施用测试的那些个体的所有感染风险，因为它不需要像基于拭子的采集那样与医护专业人员密切接触。第二，与目前拭子采集的使用相比，个人防护装备(PPE)的使用/需求降低大于90％，这为那些采集所需的测试供给和PPE两者的全球短缺提供了直接的缓解。第三，唾液是促进分子测试的更稳健的生物材料。使用SDNA-1000来采集唾液的样品变异性较小，同时提供最大的灵敏度和最佳的测试准确性。最后，与大多数侵入性拭子样品采集相比时，使用SDNA-1000设备可使任何感染性COVID-19病毒完全失活，不仅提供更好、无痛的患者体验，而且也额外地提供更安全的实验室体验。具有本公开的发明组合物的SDNA-1000设备在环境温度下递送病毒灭活的能力显著降低了在层流柜中花费的时间，并最终提高了实验室过程效率，促进了在样品处理过程的最开始时的自动化的使用。

说明性实施方式

实施方式的以下描述包括与本公开的一种或多种实施方式相关的公开。因此，一些实施方式可以包括在以下实例中公开的特征而不脱离本公开的范围。换言之，以下实施例中公开的特征可以包括以下项和/或并入以下项：本文公开的一种或多种实施方式的任何一种。

组合物

本公开的一些实施方式包括组合物。组合物可以使痰或唾液作为用于纯化和分析的核酸的可行来源。组合物提供了核酸的化学稳定化和核酸酶(包括脱氧核糖核酸酶)的抑制以及微生物生长的有利特性。唾液样品中核酸的化学稳定化可以通过使用缓冲液、酸、螯合剂、黏液溶解剂、离散剂、表面活性剂和醇来实现。

本公开的组合物当与生物样品(例如，含黏蛋白的体液)混合时，可以在室温和环境条件下将核酸保存延长的时间段。也可以将样品冷藏，但不需要在核酸回收和纯化前冷冻样品。本公开的某些组合物的特性是它(a)化学稳定核酸，(b)抑制可能存在于唾液中的核酸酶，和(c)与蛋白水解酶和用于纯化/扩增寡核苷酸或多核苷酸的其他试剂相容。

载体

在至少一种实施方式中，组合物可以包括载体。优选地，载体可以是液体载体或溶剂，更优选水性载体或溶剂，仍更优选水。最优选地，载体可以是以下项或包括以下项：纯化水、过滤(例如，0.2微米过滤)水、蒸馏水和/或去离子水。因此，组合物可以包括载体。载体可以是以下项或包括以下项：水，诸如过滤水、纯化水、蒸馏水或去离子水。

在一些实施方式中，组合物可以包括qs至100％的载体。在一些实施方式中，组合物可以包括10-60％、优选15-55％、更优选20-50％、仍更优选25-45％、仍更优选28-40％、仍更优选30-35％、仍更优选31-34％、仍更优选32-33％载体，w/w(或其之间的任何值或值范围)。最优选地，组合物可以包括(约)32.602％的水，w/w。

离散剂

组合物可以包括一种或多种离散剂。在一种或多种实施方式中，一种或多种离散剂可以是蛋白变性剂。在一些实施方式中，离散剂可选自由以下组成的组：氯化胍和/或硫氰酸胍。因此，在至少一种实施方式中，组合物可以包括离散剂。优选地，离散剂可以是胍(或胍鎓)或其合适的盐或者包括胍(或胍鎓)或其合适的盐。更优选地，离散剂可以是硫氰酸胍或包括硫氰酸胍。在至少一种实施方式中，离散剂可以是硫氰酸盐或包括硫氰酸盐。在至少一种实施方式中，离散剂可以是以下项或包括以下项：异硫氰酸胍、氯化胍、盐酸胍、碘化胍等。

在一些实施方式中，离散剂可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒形式。在一些实施方式中，离散剂可以具有至少、高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％.99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量)。在一些实施方式中，离散剂可以包括以下项或呈以下项形式(提供)：具有任何合适浓度的储备溶液(例如，在水中)。在一些实施方式中，离散剂可以具有基本上对应于溶液中离散剂浓度的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量的)。

在一些实施方式中，组合物可以包括20-50％、优选25-49％、更优选30-48％、仍更优选35-47％、仍更优选40-46％、仍更优选42-45％、仍更优选43-44％的螯合剂(例如，硫氰酸胍)，w/w，或其之间的任何值或值范围。最优选地，组合物可以包括(约)43.92％的硫氰酸胍，w/w。离散剂(例如硫氰酸胍)可以以在以下项下包括在组合物中：约43.92％w/w，或在约35％至约50％、优选约40％至约46％、更优选约42％至约45％，仍更优选约43％至约44％，w/w的范围内。

缓冲剂

组合物可以包括一种或多种缓冲剂(或缓冲液、pH缓冲液等)。缓冲剂的实例包括但不限于三(羟甲基)氨基甲烷(也称为Tris；Tris碱、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇、THAM、氨丁三醇)或其合适的制剂(例如，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐或Tris-HCl,)、

碱(例如，Tris 40％(w/w)储备溶液在水中)、HEPES、BES、MOPS、HEPES、TAE、TBE、磷酸盐缓冲液、硼酸钠缓冲液、二甲胂酸钠缓冲液等。优选地，缓冲剂可以是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或包括三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。更优选地，缓冲剂可以是Tris-HCl或包括Tris-HCl。最优选地，缓冲剂可以是碱或包括

碱。

在一些实施方式中，缓冲剂可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒形式。在一些实施方式中，缓冲剂可以具有至少、高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％.99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量)。在一些实施方式中，缓冲剂可以包括以下项或呈以下项的形式(提供)：具有任何合适浓度的储备溶液(例如，Tris～40％(w/w)储备溶液在水中)(例如，在水中)。在一些实施方式中，缓冲剂可以具有基本上对应于溶液中缓冲剂浓度的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量的)。

缓冲剂可以以在以下项下包括在组合物中：约2.65％％w/w，或在约0.1％至约5％、优选约0.5％至约4.5％、更优选约0.75％至约4％、仍更优选约1％至约3.5％、仍更优选约1.5％至约3.25％、仍更优选约2％至约3％、仍更优选约2.5％至约2.8％，w/w的范围。在一些实施方式中，组合物可以包括1-5％、优选1.25-4.5％、更优选1.5-4％、仍更优选1.75-3.75％、仍更优选2-3.5％、仍更优选2.25-3％、仍更优选2.5-2.75％的缓冲剂(例如，Tris)，w/w，或其之间的任何值或值范围。最优选地，组合物可以包括(约)2.65％Tris，w/w。

螯合剂

在至少一种实施方式中，组合物可以包括螯合剂(chelating agent)(或螯合剂(chelator))。优选地，螯合剂可以是以下项或包括以下项：乙二胺四乙酸(EDTA)或其合适的盐和/或水合物。更优选地，螯合剂可以是EDTA二钠盐，或包括EDTA二钠盐，或作为EDTA二钠盐提供。仍更优选地，螯合剂可以是EDTA二钠(盐)二水合物，或包括EDTA二钠(盐)二水合物，或作为EDTA二钠(盐)二水合物提供。在至少一种实施方式中，螯合剂可以是以下项或包括以下项：乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺(或1,2-二氨基乙烷)等。在一些实施方式中，螯合剂包括(comprise)反荷离子(例如，钠)，包括(include)反荷离子(例如，钠)，或以反荷离子(例如，钠)提供。在至少一种实施方式中，螯合剂包括(comprise)水合物(例如，二水合物)，包括(include)水合物(例如，二水合物)，或作为水合物(例如，二水合物)提供。

组合物可以包括一种或多种螯合剂。组合物的螯合剂可以选自由以下项组成的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(cyclohexane diaminetetraacetate，CDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)、四氮杂环十四烷四乙酸(tetraazacyclotetradecanetetraacetic acid，TETA)、去铁亚胺(desferrioximine)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺(或1,2-二氨基乙烷)或其各自的螯合剂类似物、盐和/或水合物。优选地，螯合剂可以是以下项或包括以下项：EDTA(例如，作为EDTA二钠盐，优选作为EDTA二钠(盐)二水合物)。在一些实施方式中，螯合剂包括反荷离子(例如，钠)，包括反荷离子(例如，钠)，或以反荷离子(例如，钠)提供。在至少一种实施方式中，螯合剂包括水合物(例如，二水合物)，包括水合物(例如，二水合物)，或作为水合物(例如，二水合物)提供。

在一些实施方式中，螯合剂可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒形式。在一些实施方式中，螯合剂可以具有至少、高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％.99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量)。在一些实施方式中，螯合剂可以包括以下项或呈以下项的形式(提供)：具有任何合适浓度的储备溶液(例如，在水中)。在一些实施方式中，螯合剂可以具有基本上对应于溶液中螯合剂浓度的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量的)。

螯合剂(例如，EDTA)可以以在以下项下包括在组合物中：约0.81％，w/w，或约1.029％，w/w，或在约0.05％至约2.5％、优选约0.1％至约2％、更优选约0.5％至约1％，仍更优选约0.75％至约0.9％，w/w的范围内。在一些实施方式中，组合物可以包括0.05-2.5％，w/w，优选0.1-2.25％，w/w，更优选0.25-2％，w/w，仍更优选0.5-1.75％，w/w，仍更优选0.6-1.5％，w/w，仍更优选0.7-1.25％，w/w，仍更优选0.75-1％，w/w的螯合剂(例如，EDTA)，w/w，或其之间的任何值或值范围。最优选地，组合物可以包括(约)0.81％，w/w，EDTA或(约)1.029％，w/w，EDTA(例如，无水或二钠盐二水合物)。

表面活性剂

在至少一种实施方式中，组合物可以包括表面活性剂或洗涤剂。优选地，表面活性剂可以是月桂酰肌氨酸盐或包括月桂酰肌氨酸盐。在一些实施方式中，表面活性剂可以是月桂酰肌氨酸钠(SLS)或包括月桂酰肌氨酸钠(SLS)。在至少一种实施方式中，表面活性剂可以是选自由以下项组成的组的一种或多种组分或者包括选自由以下项组成的组的一种或多种组分：十二烷基硫酸钠(SDS)、聚山梨醇酯(吐温^TM)、月桂基二甲基氧化胺、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、聚乙氧基醇、聚氧乙烯脱水山梨醇、辛苯昔醇(Triton X100^TM)、N,N-十二烷基二甲基叔胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)、聚氧乙烯10月桂基醚、胆汁盐(脱氧胆酸钠、胆酸钠)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor^TM)、壬基酚聚氧乙烯醚(Tergitol^TM)、环糊精、卵磷脂、甲基苄索氯铵(methylbenzethonium chloride)(Hyamine^TM)等。组合物可以包括表面活性剂或洗涤剂，诸如脲、高氯酸盐、十二烷基硫酸(钠)盐(SDS)和/或月桂酰肌氨酸(钠)(SLS)，优选月桂酰肌氨酸钠(SLS)。在一些实施方式中，SLS可以优于SDS或其他(可溶性较低的)表面活性剂。

在一些实施方式中，表面活性剂可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒形式。在一些实施方式中，表面活性剂可以具有至少、高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％.99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量)。在一些实施方式中，表面活性剂可以包括以下项或呈以下项的形式(提供)：具有任何合适浓度(例如，约10％、15％、20％、25％、28％、29％、30％、32％、35％、40％或45％，w/w，水性溶液(例如，在水中)的储备溶液(例如，在水中)。在一些实施方式中，表面活性剂可以具有基本上对应于溶液中表面活性剂浓度(例如，约30％，w/w)的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量的)。

在一些实施方式中，表面活性剂(例如，SLS)可以以约0.279％，w/w包括在组合物中。在一些实施方式中，表面活性剂可以在以下项的范围内下包括在组合物中：约0.01％至约5％，w/w，优选约0.025％至约2.5％，w/w，更优选约0.05％至约2％，w/w，仍更优选约0.075％至约1.5％，w/w，仍更优选约0.1％至约1％，w/w，仍更优选约0.15％至约0.5％，w/w，仍更优选约0.2％至约0.4％，w/w，仍更优选约0.25％至约0.3％，w/w。一些实施方式包括0.01％至5％，w/w，优选约0.025％至2.5％，w/w，更优选0.05％至2％，w/w，仍更优选0.075％至1.5％，w/w，仍更优选0.1％至1％，w/w，仍更优选0.15％至0.5％，w/w，仍更优选0.2％至0.4％，w/w，仍更优选0.25％至0.3％，w/w，最优选0.279％，w/w的表面活性剂或SLS。在至少一种实施方式中，表面活性剂(例如，SLS)可以以约0.93％w/w的～30％储备(水性)溶液或其等效物包括在组合物中。

醇

在至少一种实施方式中，组合物可以包括醇。优选地，醇可以是乙醇或包括乙醇。更优选地，醇可以是以下项或包括以下项：乙醇和一种或多种额外的化学品或组分的混合物。在至少一种实施方式中，一种或多种额外的化学品或组分可以是异丙醇或包括异丙醇。仍更优选地，醇可以是乙醇和异丙醇的混合物或包括乙醇和异丙醇的混合物。在至少一种实施方式中，一种或多种额外的化学品或组分可以是以下项或包括以下项：甲醇、丙醇、丁醇、异丁醇等。在至少一种实施方式中，醇可以是特异变性醇(SDA)或包括特异变性醇(SDA)。更优选地，醇可以是以下项或包括以下项：SDA3C，如本领域技术人员已知的，包括约95％乙醇v/v和约5％异丙醇v/v的混合物。组合物可以包括醇，诸如乙醇、甲醇、丙醇和/或异丙醇，优选特异变性醇(SDA)，或者乙醇和另一种醇诸如甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、三氟乙醇、苯酚或2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的混合物，更优选乙醇和异丙醇的混合物，仍更优选乙醇和一种或多种额外的化学品或组分诸如异丙醇的混合物。

在一些实施方式中，表面活性剂可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒形式。在一些实施方式中，醇可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：液体、水性和/或溶液形式。在一些实施方式中，醇可以包括以下项或呈以下项形式(提供)：具有任何合适浓度的醇(例如，在水中)的储备溶液(例如，在水中)。在一些实施方式中，醇可以是基本上纯的，或基本上纯的醇的混合物。在一些实施方式中，醇可以具有至少、高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％.99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量)。

在一些实施方式中，醇可以是以下项或包括以下项：约95％v/v乙醇和约5％v/v异丙醇的混合物或储备溶液，或者包括95％v/v乙醇和约5％v/v异丙醇的混合物或储备溶液。在一些实施方式中，醇可以是以下项或包括以下项：90-99％v/v乙醇和约1-10％v/v异丙醇的混合物或储备溶液，或者包括90-99％v/v乙醇和约1-10％v/v异丙醇的混合物或储备溶液。在某些实施方式中，醇可以包括50-99％乙醇v/v和1-50％异丙醇v/v的混合物。更优选地，醇可以包括60-98％乙醇v/v和2-40％异丙醇v/v的混合物。更优选地，醇可以包括75-97％乙醇v/v和3-25％异丙醇v/v的混合物。仍更优选地，醇可以包括80-96％乙醇v/v和4-20％异丙醇v/v的混合物。仍更优选地，醇可以包括85-95％乙醇v/v和5-15％异丙醇v/v的混合物。仍更优选地，醇可以包括90-95％乙醇v/v和5-10％异丙醇v/v的混合物。仍更优选地，醇可以包括92-95％乙醇v/v和5-8％异丙醇v/v的混合物。仍更优选地，醇可以包括95％乙醇v/v和5％异丙醇v/v的混合物。最优选地，醇可以是SDA 3C或包括SDA 3C。

醇(例如，SDA 3C)可以以在以下项下包括在组合物中：约17.73％w/w，或在约10％至约25％、优选约12％至约22％、更优选约15％至约20％，仍更优选约16％至约19％，仍更优选约17％至约18％，w/w的范围内。在一些实施方式中，包括在组合物中的醇的量可以比典型、传统或现有的核酸保存溶液更少(例如，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％更少)(例如，使组合物更易于运输或运送)。在一些实施方式中，组合物可以包括5-25％、优选10-22％、更优选12-20％、仍更优选15-19％、仍更优选16-18.5％、仍更优选17-18.25％、仍更优选17.5-18％醇，w/w，或其之间的任何值或值范围。

优选地，醇包括乙醇和一种或多种额外的化学品或组分诸如异丙醇的混合物，更优选地，约95％乙醇，v/v和约5％异丙醇，v/v的混合物。仍更优选地，醇是特异变性醇(SDA)，仍更优选SDA 3C(即～95％乙醇和～5％异丙醇的混合物，v/v)。最优选地，组合物可以包括(约)17.73％SDA 3C,w/w。在一些实施方式中，醇(例如，SDA 3C)可以以在以下项下包括在组合物中：约16.84％w/w乙醇或者在约10％至约25％、优选约12％至约22％、更优选约15％至约20％、仍更优选约16％至约18％、仍更优选约16.5％至约17％，w/w范围的乙醇，以及约0.89％w/w异丙醇或者在约0.05％至约2.5％、优选约0.1％至约2％、更优选约0.5％至约1.5％、仍更优选约0.75％至约1.25％、仍更优选约0.8％至约1％，w/w范围内的异丙醇。

在一些实施方式中，包括在组合物中的醇的量可以比典型、传统或现有的核酸保存溶液更少(例如，约50％更少)(例如，使组合物更易于航运或运输)。

酸——pH调节剂

在至少一种实施方式中，组合物可以包括酸。优选地，酸可以是盐酸(HCl)或包括盐酸(HCl)。在至少一种实施方式中，酸可以是以下项或包括以下项：氢溴酸(HBr)、高氯酸(HClO₄)、硝酸(HNO₃)或硫酸(H₂SO₄)。在至少一种实施方式中，酸可以是以下项或包括以下项：碳酸(H₂CO₃)或乙酸(CH₃COOH)。在至少一种实施方式中，酸可以是以下项或包括以下项：磷酸(H₃PO₄)、硼酸(H₃BO₃)或祖母绿安全酸(Emerald Safe acid，ESA)等。

在一些实施方式中，酸可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒形式。在一些实施方式中，酸可以具有至少、高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％.99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量)。在一些实施方式中，酸可以包括以下项或呈以下项的形式(提供)：具有任何合适浓度(例如，约10％、15％、20％、25％、30％、32％、35％、37％、38％、40％或45％，w/w，水性溶液(例如，在水中)的储备溶液(例如，在水中)。在一些实施方式中，酸可以具有基本上对应于溶液中酸浓度(例如，约37％，w/w)的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量的)。

在一些实施方式中，组合物可以包括酸(例如，盐酸)，qs至pH约8.0或约8.1，或者pH 7.5-9.5、pH 6.5-9.5、pH 7-9、pH 7.1-9.5、pH 7.2-9.5、pH7.2-9、pH 7.2-8.8、pH 7.4-8.6、pH 7.5-8.5、pH 7.6-8.4或pH 7.8-8.2(或者其之间的任何值或值范围)。在一些实施方式中，组合物的pH可以大于约5至小于约12，优选大于约7至小于约10，更优选大于7.0或7.1至小于10.0、9.8、9.6、9.5、9.2、9.0、8.8或8.5，或在约6至约11的pH范围内，更优选在约7至约10的pH范围内，仍更优选在约7.2至约9.5的pH范围内，仍更优选在约7.2至约9.0的pH范围内，仍更优选在约7.2至约8.8的pH范围内，仍更优选在约7.5至约8.5的pH范围内，仍更优选在约7.6至约8.4的pH范围内，仍更优选在约7.7至约8.3的pH范围内，仍更优选在约7.8至约8.3的pH范围内，仍更优选在约7.9至约8.2的pH范围内，以及最优选在约8.0or 8.1的pH。

在一些实施方式中，酸(例如，HCl)可以以在以下项下包括在组合物中：约0.4％w/w，或在约0.01％至约5％、优选约0.025％至约2.5％、更优选约0.05％至约2％、仍更优选约0.1％至约1.5％、更优选约0.25％至约1％、更优选约0.5％至约0.75％、更优选约0.3％至约0.5％，w/w的范围。在一些实施方式中，组合物可以包括0.005-5％、优选0.01-2.5％、更优选0.025-1.5％、仍更优选0.05-1％、仍更优选0.1-0.75％、仍更优选0.25-0.5％的酸(例如，盐酸)，w/w。在至少一种实施方式中，酸(例如，HCl)可以以约1.08％w/w的～37％，w/w或～12M储备(水性)溶液或其等效物包括在组合物中。最优选地，组合物可以包括(约)1.08％的盐酸37％，w/w，或其等价物，或qs至pH(约)8.0的盐酸。

在不受任何理论约束下，应当注意，本领域技术人员将理解不同的酸具有不同的“强度”或酸失去质子(H⁺)的能力或趋势。强酸是在溶液中完全电离(解离)的酸(只要有足够的溶剂)。例如，在水中，一摩尔强酸HA溶解产生一摩尔H⁺(作为水合氢离子H₃O⁺和更高的聚集体)和一摩尔共轭碱A^-。本质上，没有任何非离子化酸HA残体。强酸的一些实例是盐酸(HCl)、氢碘酸(HI)、氢溴酸(HBr)、高氯酸(HClO₄)、硝酸(HNO₃)和硫酸(H₂SO₄)。在水性溶液中，这些物质中的每一种都基本上电离100％。相反，弱酸仅部分解离。水中的实例包括碳酸(H₂CO₃)和乙酸(CH₃COOH)。在平衡时，酸和共轭碱两者都存在于溶液中。与较弱的酸相比，较强的酸具有较大的酸解离常数(Ka)和较小的对数常数(pKa＝-log Ka)。酸越强，它就越容易失去质子H+。有助于去质子化的两个关键因素是H-A键的极性和原子A的大小，这决定了H-A键的强度。酸强度还取决于共轭碱的稳定性。

鉴于前述，使组合物的pH达到期望水平所需的每种酸的w/w量是不同的。例如，虽然(约)1.08％盐酸37％，w/w(在水中)可能足以使本公开的某些实施方式达到pH(约)8.0，但1.08％乙酸37％，w/w(在水中)，可能太弱而不能使类似的实施方式达到pH(约)8.0，1.08％硫酸37％，w/w(在水中)，可能太强而不能使实施方式达到pH(约)8.0，1.08％硝酸37％，w/w(在水中),可能氧化醇，等等。不受任何理论的约束，即使是本领域普通技术人员也可能无法用另外的实验来确定哪些酸适用于本公开的一种或多种实施方式。

碱(例如，-OH源)也可以用于调节pH。

黏液溶解剂

在至少一种实施方式中，组合物可以包括黏液溶解剂。在一种或多种实施方式中，黏液溶解剂可以是还原剂或包括还原剂。优选地，黏液溶解剂可以是以下项或包括以下项：乙酰半胱氨酸(即，N-乙酰半胱氨酸”(NAC))，包括N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸和外消旋N-乙酰半胱氨酸或者N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-乙酰基-D-半胱氨酸的(外消旋)混合物)。更优选地，黏液溶解剂可以是N-乙酰基-L-半胱氨酸或包括N-乙酰基-L-半胱氨酸。在至少一种实施方式中，黏液溶解剂可以是以下项或包括以下项：N-乙酰半胱氨酸(N-乙酰基-L-半胱氨酸)、抗坏血酸、连二亚硫酸盐、异抗坏血酸盐(erythiorbate)、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)，任选地作为盐酸盐(TCEP-HCl)、二赤藓糖醇(dierythritol)、树脂负载的硫醇、树脂负载的膦、维生素E和/或trolox或其盐、柠檬酸钠、柠檬酸钾、碘化钾，氯化铵、愈创木酚甘油醚(或愈创甘油醚(guaifenesin))、妥卢香脂、Vasaka、氨溴索(ambroxol)、羧甲司坦(carbocisteine)、厄多司坦(erdosteine)、半胱甲酯、阿法链道酶(dornase alfa)等。组合物可以包括一种或多种黏液溶解剂。优选地，黏液溶解剂是抗坏血酸、异抗坏血酸盐、N-乙酰半胱氨酸、二硫苏糖醇或2-巯基乙醇，以及最优选地，黏液溶解剂是N-乙酰半胱氨酸。

在一种或多种实施方式中，该组合物不包含抗坏血酸、连二亚硫酸盐、异抗坏血酸盐、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、TCEP、二赤藓糖醇、树脂负载的硫醇、树脂负载的膦、维生素E、trolox和/或其盐。至少一种实施方式(基本上)不含有抗坏血酸、连二亚硫酸盐、异抗坏血酸盐、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、二赤藓糖醇、树脂负载的硫醇、树脂负载的膦、维生素E、trolox和/或其盐。至少一种实施方式(基本上)不含有除N-乙酰基-L-半胱氨酸之外的黏液溶解剂。

在一些实施方式中，黏液溶解剂可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒形式。在一些实施方式中，黏液溶解剂可以具有至少、高达和/或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％.99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量)。在一些实施方式中，黏液溶解剂可以包括以下项或呈以下项的形式(提供)：具有任何合适浓度的储备溶液(例如，在水中)。在一些实施方式中，黏液溶解剂可以具有基本上对应于溶液中黏液溶解剂浓度的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量的)。

黏液溶解剂(例如，N-乙酰半胱氨酸)或TCEP可以以在以下项下包括在组合物中：约0.093％w/w，或在约0.01％至约0.5％、优选约0.025％至约0.25％、更优选约0.05％至约0.2％，仍更优选约0.075％至约0.15％，仍更优选约0.08％至约0.1％，w/w的范围内。

在一些实施方式中，组合物可以包括0.005-0.25％、优选0.005-0.2％、更优选0.01-0.2％、仍更优选0.025-0.175％、仍更优选0.05-0.165％、仍更优选0.075-0.15％、仍更优选0.08-0.125％、仍更优选0.09-0.1％的黏液溶解剂(例如，N-乙酰基-L-半胱氨酸或TCEP)，w/w，或其之间的任何值或值范围。最优选地，该组合物可以包括(约)0.093％N-乙酰基-L-半胱氨酸，w/w。

视觉指示剂

至少一种实施方式可以包括视觉指示剂。优选地，视觉指示剂可以是着色剂或包括着色剂。更优选地，视觉指示剂可以是以下项或包括以下项：染料或有色染料。仍更优选地，视觉指示剂可以是蓝色染料或包括蓝色染料。最优选地，视觉指示剂可以是FD&C BlueNo.1或包括FD&C Blue No.1。组合物可以包括视觉指示剂，优选着色剂，更优选有色染料，仍更优选蓝色染料，仍更优选FD&C Blue No.1。

在一些实施方式中，视觉指示剂可以呈以下项、具有以下项、包括以下项或以以下项提供：干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒形式。在一些实施方式中，视觉指示剂可以具有至少、高达和/或约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％，92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％.99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量)。在一些实施方式中，视觉指示剂可以包括以下项或呈以下项的形式(提供)：具有任何合适浓度(例如，约0.01％、0.05％、0.075％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.25％、0.3％或0.5％，w/w，水性溶液(例如，在水中)的储备(溶液(例如，在水中))。在一些实施方式中，可以使用干燥、固体、粉末、无水和/或颗粒材料制备的储备溶液。在一些实施方式中，视觉指示剂可以具有基本上对应于溶液中酸浓度(例如，约0.2％，w/w)的纯度(如通过合适的材料测定，诸如CoA来测量的)。

视觉指示剂(例如，FD&C Blue No.1)可以以在任何视觉适合的量诸如以下项下包括在组合物中：诸如约0.00037％w/w，或在约0.00005％至约0.001％、优选约0.0001％至约0.00075％、更优选约0.0002％至约0.0005％，w/w、仍更优选约0.0003％至约0.0004％，w/w的范围内。在一些实施方式中，组合物可以包括视觉(或视觉合适)量的视觉指示剂，优选着色剂，更优选有色染料，仍更优选蓝色染料，仍更优选FD&C Blue No.1。最优选地，组合物可以包括(约)0.00037％w/w的FD&C Blue No.1。

在至少一种实施方式中，视觉指示剂(例如，FD&C Blue No.1)可以作为浓缩物添加至组合物中。在一些实施方式中，浓缩物可以是水性或水基浓缩物。在一些实施方式中，组合物可以包括0.01-2.5％，w/w的0.01-5％，w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物。优选地，组合物可以包括0.05-1％，w/w的0.05-1％，w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物。更优选地，组合物可以包括0.075-0.5％，w/w的0.075-0.5％，w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物。仍更优选地，组合物可以包括0.1-0.25％，w/w的0.1-0.25％，w/w(在水中)的视觉指示剂浓缩物。仍更优选地，组合物可以包括(约)0.185％w/w的(约)0.2％w/w(在水中)视觉指示剂浓缩物。在至少一种实施方式中，视觉指示剂(例如，FD&C Blue No.1)可以以约0.185％，w/w的～0.2％储备(水性)溶液或其等效物包括在组合物中。最优选地，组合物可以包括(约)0.185％w/w的(约)0.2％w/w(在水中)FD&C Blue No.1浓缩物。

抗微生物剂

在一些实施方式中，组合物可以包括抗微生物剂。在一些实施方式中，一种或多种前述组分可以呈现出抗微生物活性。例如，在一些实施方式中，醇、离散剂、表面活性剂和/或黏液溶解剂可以是抗微生物的或呈现出抗微生物活性。因此，某些实施方式不需要包括单独的抗微生物(例如，杀菌和/或抑菌的)剂。在一种或多种实施方式中，即使在本公开的所述一种或多种实施方式中提供醇的较低浓度(例如，约17.73％，w/w，或5-25％、10-22％、10-20％、15-19％、16-18.5％、17-18.25％或17.5-18％，w/w，或其之间的任何值或值范围)下，醇(例如，SDA 3C)的抗微生物特性仍然存在。

核糖核酸酶抑制剂

一些实施方式包括核糖核酸酶抑制剂或者核糖核酸酶的抑制剂，诸如肝素、硫酸乙酰肝素、低聚(乙烯基磺酸)、聚(乙烯基磺酸)、低聚(乙烯基膦酸)和聚(乙烯基磺酸)或其盐。在某些(例如，优选的)实施方式中，组合物不包括核糖核酸酶抑制剂或者核糖核酸酶的抑制剂，或(基本上)不含有一种或多种(例如，任何)核糖核酸酶抑制剂或者核糖核酸酶的抑制剂(例如，除了离散剂，诸如硫氰酸胍(它可能具有内在的RNA酶抑制活性)以外)。因此，至少一种实施方式(基本上)不含有一种或多种(任何)核糖核酸酶抑制剂，或核糖核酸酶的抑制剂。一种或多种实施方式(基本上)不含有任何核糖核酸酶抑制剂，或者核糖核酸酶的抑制剂(例如，除了离散剂，诸如硫氰酸胍以外)。

蛋白酶

一些实施方式包括蛋白酶。在某些(例如，优选的)实施方式中，组合物不包括蛋白酶，或(基本上)不含有一种或多种(例如，任何)蛋白酶。因此，至少一种实施方式(基本上)不含有一种或多种(任何)蛋白酶。不受任何理论约束，蛋白酶(或蛋白水解酶、肽酶或蛋白酶)是以下项的酶类型：通过水解破坏一个或多个肽键，从而使蛋白转化为更小的蛋白片段(或肽)或单个蛋白亚基(或氨基酸)。

蛋白变性剂

一些实施方式包括一种或多种蛋白变性剂。例如，在至少一种实施方式中，(i)离散剂可以是以下项、包括以下项或起以下项功能：蛋白变性剂(或使蛋白变性或具有蛋白变性活性或呈现出蛋白变性活性)。在至少一种实施方式中，(ii)表面活性剂/洗涤剂可以是以下项、包括以下项或起以下项功能：蛋白变性剂(或使蛋白变性或具有蛋白变性活性或呈现出蛋白变性活性)。在至少一种实施方式中，(iii)醇可以是以下项、包括以下项或起以下项功能：蛋白变性剂(或使蛋白变性或具有蛋白变性活性或呈现出蛋白变性活性)。在至少一种实施方式中，(iv)黏液溶解剂可以是以下项、包括以下项或起以下项功能：蛋白变性剂(或使蛋白变性或具有蛋白变性活性或呈现出蛋白变性活性)，诸如当一种或多种蛋白包含可接近的二硫键或桥键时。在一些实施方式中，(i)离散剂、(ii)表面活性剂/洗涤剂、(iii)醇和(iv)黏液溶解剂中的两种或更多种可以是以下项、包括以下项或起以下项功能：蛋白变性剂(或使蛋白质变性或具有蛋白变性活性或呈现出蛋白变性活性)。在一些实施方式中，(i)离散剂、(ii)表面活性剂/洗涤剂、(iii)醇和(iv)黏液溶解剂中的每一种或全部可以是以下项、包括以下项或起以下项功能：蛋白变性剂(或使蛋白质变性或具有蛋白变性活性或呈现出蛋白变性活性)。

不受任何理论束缚，一种或多种前述组分或成分的蛋白变性活性可以是浓度和/或时间依赖性的。

制剂

本公开的实施方式包括核酸保存组合物(或制剂)，其包括载体、离散剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、醇、酸；以及黏液溶解剂。实施方式进一步包括任选的视觉指示剂。实施方式可以包括20-50％离散剂，w/w，1-5％缓冲剂，w/w，0.05-2.5％螯合剂，w/w，0.05-2.5％表面活性剂，w/w，5-25％醇，w/w，0.005-0.25％黏液溶解剂，w/w，酸qs至pH6.5-9.5，以及载体qs至100％。实施方式可以进一步包括0.005-2.5％，w/w视觉指示剂。

在至少一种实施方式，组合物包括约43.92％w/w的离散剂、约2.65％w/w的缓冲剂、约0.81％w/w或约1.029％w/w的螯合剂、约0.279％w/w的表面活性剂、约17.73％w/w的醇、约0.093％w/w的黏液溶解剂；酸qs至pH约8.0(例如，约1.08％的37％酸溶液或其等效物)，以及载体qs至100％。组合物可以包括约0.00037％w/w的视觉指示剂。

在一些实施方式中，载体可以是以下项或包括以下项：水性载体，诸如水，优选过滤水、纯化水、蒸馏水和/或去离子水。在一些实施方式中，离散剂可以是以下项或包括以下项：胍和/或硫氰酸盐，优选硫氰酸胍。在一些实施方式中，缓冲剂可以是以下项或包括以下项：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，优选Tris-HCl，更优选

碱。在一些实施方式中，螯合剂可以是以下项或包括以下项：乙二胺四乙酸(EDTA)，优选EDTA二钠(盐)二水合物。在一些实施方式中，表面活性剂可以是月桂酰肌氨酸钠(SLS)或包括月桂酰肌氨酸钠(SLS)。在一些实施方式中，醇可以是以下项或包括以下项：特异变性醇(SDA)或者乙醇和异丙醇的混合物，优选约95％乙醇，v/v和约5％异丙醇，v/v的混合物，或者SDA 3C。在一些实施方式中，酸可以是盐酸或包括盐酸。在一些实施方式中，黏液溶解剂可以是N-乙酰基-L-半胱氨酸或包括N-乙酰基-L-半胱氨酸。

本公开的实施方式包括核酸稳定和/或保存组合物，其包括约43.92％离散剂(例如，硫氰酸胍)，w/w，约2.65％缓冲剂(例如，Tris)，w/w，约0.81％或约1.029％螯合剂(例如，EDTA或EDTA二钠(盐)二水合物)，w/w，约0.279％表面活性剂(例如，SLS)，w/w，约17.73％醇(例如，SDA 3C)，w/w，约0.093％黏液溶解剂(例如，N-乙酰基-L-半胱氨酸)，w/w，酸(例如，盐酸)qs至约pH 8.0或8.1；和/或载体(例如，包括过滤水、纯化水、蒸馏水和/或去离子水的水性载体)qs至100％。实施方式可以进一步包括约0.00037％，w/w的视觉指示剂(例如，FD&C Blue No.1)。

本公开的实施方式包括43.92％离散剂(例如，硫氰酸胍)，w/w，±10％；2.65％缓冲剂(例如，Tris)，w/w，±10％；0.81％或1.029％螯合剂(例如，EDTA或EDTA二钠(盐)二水合物)，w/w，±10％；0.279％表面活性剂(例如，SLS)，w/w，±10％；17.73％醇(例如，SDA 3C或者95％乙醇，v/v，±10％和5％异丙醇，v/v，±10％的混合物)，w/w，±10％；0.093％黏液溶解剂(例如，N-乙酰基-L-半胱氨酸)，w/w，±10％；和/或(如果需要)酸(例如，盐酸)qs至pH7.2-9.5，优选pH～8；具有载体(例如，水性载体，优选过滤水、纯化水、蒸馏水和/或去离子水)qs至100％。一种实施方式进一步包括0.00037％，w/w，±10％视觉指示剂(例如，FD&CBlue No.1)或其等效物(例如，0.185％，w/w，±10％的0.2％，w/w，±10％视觉指示剂浓缩物(例如，在水中))。在一种实施方式中，各组分的量，±10％，进一步(限于所述量)±9％，优选±8％，更优选±7％，仍更优选±6％，仍更优选±5％，仍更优选±4％，仍更优选±3％，仍更优选±2％，仍更优选±1％。

在至少一种实施方式中，组合物包括约43.92％硫氰酸胍，w/w，约2.65％ Tris，w/w，约0.81％或约1.029％ EDTA或EDTA二钠(盐)二水合物，w/w，约0.279％ SLS，w/w，约17.73％ SDA 3C，w/w，约0.093％N-乙酰基-L-半胱氨酸，w/w，约1.08％盐酸37％，w/w，如果需要，或其等效物，或如果需要，盐酸qs至pH约8.0或8.1，以及水qs至100％,，w/w。组合物可以包括约0.00037％w/w的FD&C Blue No.1(或0.185％w/w的其0.2％w/w(在水中)浓缩物)，和约32.602％水，w/w。

在一些实施方式中，组合物可以基本上不含或没有微生物(例如，细菌、真菌和/或病毒)污染。在一些实施方式中，组合物可具有小于或等于(约)100cfu/g的细菌或细菌污染。在一些实施方式中，组合物可以具有小于或等于(约)99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5cfu/g细菌或细菌污染。在一些实施方式中，组合物可具有小于或等于(约)100cfu/g的真菌(fungus)(或真菌(fungi)，诸如酵母和/或霉菌)或真菌污染。在一些实施方式中，组合物可以具有小于或等于(约)99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5cfu/g真菌(或真菌，诸如酵母和/或霉菌)或真菌污染。如本文所用，“cfu/g”是指每克((最终和/或液体)组合物)的(一种或多种微生物的)菌落形成单位。

本公开的说明性实施方式在下表2中呈现。表2描述了说明性组合物的成分，以及所述成分的用途、功能和/或活性。

表2

表2.1呈现了本公开的组合物的另一种说明性制剂。

成分	％w/w
		纯化水	34.12
硫氰酸胍	43.92
		Tris/Trizma碱	2.65
EDTA(二钠盐二水合物)	1.029
		SLS	0.279
SDA 3C	17.73
		FDC Blue No.1	0.00037
HCl	0.4
		N-乙酰基-L-半胱氨酸	0.093
批次总计	100％

表2.1

本公开的额外特征可以从美国专利序列号7,482,116中获知，其全部内容通过援引并入本文。

试剂盒

一些实施方式包括试剂盒，诸如生物样品保存试剂盒。尤其，在一种或多种实施方式中，本发明的组合物可以并入试剂盒中。试剂盒可以包括，例如，如本文所公开和/或描述的组合物，以及样品采集装置。在至少一种实施方式中，组合物可以设置在样品采集装置的一部分中。说明性样品采集装置可以包括具有样品采集部分的容器或小瓶(例如，管)。例如，容器可以包括至少部分地界定内部分隔室的外壁。内部分隔室可以包含可以添加生物样品的组合物。替代地，可以将样品添加至分隔室中，并且在采集后将组合物添加至样品中。例如，该装置可以包括用于在样品采集之前或样品采集之后将组合物添加至分隔室中的组合物分配器。在至少一种实施方式中，分配器可以包括用于封闭或密封装置开口的帽。该开口可通向分隔室或与分隔室流体连通。帽可以具有用于保留组合物直到将它添加至容器的分隔室中的分隔室。

一些实施方式可以包括试剂盒，该试剂盒包括生物样品采集装置(或容器)和本公开的组合物。在至少一种实施方式中，组合物可以设置在装置的一部分中。例如，在一些实施方式中，组合物可以设置在装置的帽或盖子的一部分中。采集装置(或容器)可以被配置为接收生物样品(例如，在其内部分隔室中)并具有添加至其中的组合物。

在一些实施方式中，试剂盒中的组合物可以基本上不含或没有微生物污染(如上所述)。

在以下申请中描述了各种样品采集装置，每个申请的全部内容通过特定援引并入本文：于2015年11月25日提交的美国申请序列号14/952,712；于2016年8月3日提交的美国临时申请序列号62/370,630；于2017年2月1日提交的美国临时申请序列号62/453,459；于2017年5月23日提交的美国临时申请序列号62/510,174；于2017年5月30日提交的美国临时申请序列号62/512,594；于2017年5月31日提交的美国临时申请序列号62/513,235；于2017年7月6日提交的美国临时申请序列号62/529,355；于2017年8月2日提交的美国申请序列号15/667,228；于2017年8月3日提交的国际申请序列号PCT/US2017/045352；于2017年8月31日提交的美国申请序列号15/692,259；以及于2017年11月22日提交的美国临时申请序列号62/590,165，并在要求其优先权的申请中。

本公开的组合物可以并入到任何前述申请中描述的装置中。本公开的实施方式可以包括含有如本文所公开和/或描述的组合物的试剂盒，以及在任何前述申请中描述的样品采集装置。

制造方法

一些实施方式包括制造本公开的组合物的方法。如本文所述，实施方式可以包括提供或获得载体。实施方式可以包括向载体中添加适合量的本文所述的一种或多种组分或成分(例如，至本文所述的最终浓度)。实施方式可以包括向载体中添加描述量的本文描述的一种或多种组分或成分的储备溶液。

至少一种实施方式包括向载体中添加离散剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、醇、酸和/或黏液溶解剂。一种或多种实施方式可以包括向载体中添加视觉指示剂。至少一种实施方式包括向(液体)载体中添加以下项：离散剂至最终浓度为20-50％，w/w，缓冲剂至最终浓度为0.1-5％，w/w，螯合剂至最终浓度为0.01-5％，w/w，表面活性剂至最终浓度为0.01-5％，w/w，醇至最终浓度为5-25％，w/w，酸至pH 7.2-9.5，优选pH～8或8.1，和/或黏液溶解剂至最终浓度为0.005-0.25％，w/w。至少一种实施方式包括向(液体)载体中添加视觉指示剂至最终浓度为0.00005-0.5％，w/w。载体可以包括在qs至100％。

至少一种实施方式包括向(液体)载体中添加以下项：离散剂至最终浓度为(约)43.92％，w/w，缓冲剂至最终浓度为(约)2.65％，w/w，螯合剂至最终浓度为(约)0.81％或(约)1.029％，w/w，表面活性剂至最终浓度为(约)0.279％，w/w，醇至最终浓度为(约)17.73％，w/w，酸，如果需要至pH(约)7.2-9.5，优选约pH8或8.1或至最终浓度为(约)0.4％，w/w，和/或黏液溶解剂至最终浓度为(约)0.093％，w/w。至少一种实施方式包括向(液体)载体中添加视觉指示剂至最终浓度为(约)0.00037％，w/w。载体可以包括在(约)34.12％或qs至100％。

在一些实施方式中，离散剂可以是胍和/或硫氰酸盐或者包括胍和/或硫氰酸盐，缓冲剂可以是Tris或Trizma碱或者包括Tris或Trizma碱，螯合剂可以是EDTA或EDTA二钠(盐)二水合物或者包括EDTA或EDTA二钠(盐)二水合物，表面活性剂可以是SLS或者包括SLS，醇可以是乙醇和/或异丙醇(例如，SDA 3C)或者包括乙醇和/或异丙醇(例如，SDA 3C)，黏液溶解剂可以是N-乙酰基-L-半胱氨酸或者包括N-乙酰基-L-半胱氨酸，酸可以是HCl或者包括HCl，载体可以是水或者包括水，和/或任选的视觉指示剂可以是FD&C Blue No.1或包括FD&C Blue No.1。

制造核酸稳定化和/或保存组合物的方法可以包括将载体添加至容器中(例如，用(过滤的、去离子的等)水填充混合罐)。在一些实施方式中，载体可以以组合物的约34.12％,w/w或qs 100％的最终浓度包括。

在一些实施方式中，可以在将一种或多种额外的组分或成分添加至载体之前激活混合器。在一些实施方式中，可以在将一种或多种额外的组分或成分添加至载体之后激活混合器。在一些实施方式中，可以设置混合器的速度设置为2-8，优选3-7，更优选4-6、更优选5和/或扫频设置为2-8，优选3-6，更好4-6，仍更优选5。在一些实施方式中，可以在将一种或多种额外的组分或成分添加至载体之前将载体加热至合适的混合温度。在一些实施方式中，可以在将一种或多种额外的组分或成分添加至载体之后将载体加热至合适的混合温度。在一些实施方式中，合适的混合温度可以是(约55-95±5°F，优选60-90±5°F，更优选65-85±5°F，仍更优选70-80±5°F，最优选75±5°F。

在一些实施方式中，可以将适合量的离散剂(例如，硫氰酸胍)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约43.92％,w/w)。在一些实施方式中，离散剂可以混合一段时间(例如，30-300分钟之间，优选60-240分钟，更优选120-180分钟，仍更优选140-160分钟，最优选150分钟，或直到离散剂溶解(在溶液中)在载体中。

在一些实施方式中，可以将适合量的缓冲剂(例如，Tris或Trizma碱)添加到载体中(例如，至最终浓度为组合物的约2.65％,w/w)。在一些实施方式中，缓冲剂可以混合一段时间(例如，1-90分钟之间，优选5-60分钟，更优选10-45分钟，仍更优选12-30分钟，仍更优选15-25分钟，最优选(约)20分钟，或直到缓冲剂溶解(在溶液中)在载体中。

在一些实施方式中，可以将合适量的螯合剂(例如，EDTA、EDTA二钠盐、EDTA二钠盐(盐)二水合物)添加至载体中(例如，至最终浓度为组合物的约0.81％或约1.029％w/w(无水或二水合物))。在至少一种实施方式中，螯合剂可以混合一段时间(例如，1-90分钟之间，优选5-60分钟，更优选10-45分钟，仍更优选12-30分钟，仍优选15-25分钟，最优选(约)20分钟，或直到螯合剂溶解(在溶液中)在载体中。在至少一种实施方式中，可以在(大约)同时间，同时期，伴随，和/或(基本上)并行(或同时)，预先或不预先混合在一起下，将缓冲剂和螯合剂一起添加至载体中。在一些实施方式中，可以将缓冲剂和螯合剂分别添加至载体中。

在一些实施方式中，可以将适合量的表面活性剂(例如，SLS)添加至载体中(例如，至最终浓度为组合物的约0.279％,w/w，或其等价物——例如0.93％的30％ SLS溶液)。在一些实施方式中，表面活性剂可以混合一段时间(例如，1-90分钟之间，优选5-60分钟，更优选10-45，仍更优选15-35分钟，仍优选20-30分钟，最优选(约)25分钟，或直到表面活性剂溶解(在溶液中)在载体中。

在一些实施方式中，可以将适合量的醇(例如，乙醇、乙醇和另一种化学品(诸如异丙醇或SDA，优选SDA 3C)的混合物添加至载体中(例如，至最终浓度为组合物的约17.73％，w/w，或其等效物)。在一些实施方式中，醇可以混合一段时间(例如，5-90分钟之间，优选10-75分钟，更优选15-60分钟，仍更优选25-45分钟，仍更优选30-40分钟，最优选(约)35分钟，或直到醇溶解(在溶液中)在载体中。

在一些实施方式中，可以将适合量的任选的视觉指示剂(例如，着色剂、染料，优选蓝色染料诸如FD&C Blue No.1)添加至载体中(例如，至最终浓度为组合物的约0.00037％，w/w)。在一些实施方式中，视觉指示剂可以混合一段时间(例如，5-90分钟之间，优选10-60分钟，更优选15-45，仍更优选10-30分钟，仍优选15-25分钟，最优选(约)20分钟，或直到醇溶解(在溶液中)在载体中。

在一些实施方式中，可以将适合量的酸(例如盐酸)添加至载体中(例如，至最终浓度为组合物的约0.4％，w/w或组合物的pH 8.0)。在一些实施方式中，酸可以混合一段时间(例如，5-90分钟之间，优选10-60分钟，更优选15-45，仍更优选10-30分钟，仍优选15-25分钟，最优选(约)20分钟，或直到酸溶解(在溶液中)在载体中和/或混合物在期望的pH下平衡。

在一些实施方式中，可以将适合量的黏液溶解剂(或还原剂)(例如，N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸)添加至载体中(例如，至最终浓度为组合物的约0.093％，w/w)。在一些实施方式中，酸可以混合一段时间(例如，5-90分钟之间，优选10-60分钟，更优选15-45，仍更优选10-30分钟，仍优选15-25分钟，最优选(约)20分钟，或直到酸溶解(在溶液中)在载体中和/或混合物在期望的pH下平衡。

一系列说明性的制造批次程序呈现在表3中。

表3

质量控制测试可以在制造期间的任何适合的时间点进行。例如，在完成每批次的批量制造过程后，使用清洁和消毒、经批准和适当的工具从批量共混罐中无菌获得两(2)个样品(每个大约4盎司)，用于从以下位置获得样品：靠近罐中心的批次顶面、靠近罐侧壁的批次顶表面，靠近罐中心批次的中部，靠近罐侧壁批次的中部，靠近罐中心批次的底部，靠近罐侧壁批次的底部。将每个样品置于无菌杯中并贴上标签。

测试每个样品的适当外观、比重和pH。另外，进行了测定以测试螯合剂、醇和黏液溶解剂的协调性和/或有效性。另外，通过测量有氧平板总计数、酵母和霉菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来测试污染(微生物限度)。表4呈现了各种质量控制措施的测试规范。

测试	方法	说明
			外观	SOP 403	可与标准相比
比重@25℃	SOP 405	仅报告
			pH	STM M403	7.9-8.3
测定——EDTA二钠	Cornerstone	0.73–0.89％
			测定——SDA醇3C	Cornerstone	15.96–19.50％
测定——N-乙酰半胱氨酸	Cornerstone	0.084–0.102％
			微生物限度	STM M429	小于100cfu/g
酵母和霉菌	STM M429	小于100cfu/g
			金黄色葡萄球菌	STM M429	不存在
铜绿假单胞菌	STM M429	不存在

表4

在一些实施方式中，该方法可以包括将组合物密封在适合的储存容器或样品采集装置的一部分(例如，容器或小瓶(例如，管)的组合物储存部分)中。样品还在储存容器和样品采集装置中进行受控室温(CRT)和加速(ACC)稳定性测试。

在一些实施方式中，该方法可产生或得到基本上不含或没有微生物污染的组合物(如上所述)。

使用方法

一些实施方式包括保存和/或稳定核酸，优选病毒核酸(例如，RNA或DNA)的方法。该方法可以包括提供包含核酸的生物样品并将本公开的组合物与生物样品组合。在至少一种实施方式中，生物样品可以是含黏蛋白的体液或组织，诸如痰或唾液。该方法可以包括降低含黏蛋白的体液或组织的粘度(例如，通过用黏液溶解剂或还原剂还原黏蛋白固有的二硫键)。

在至少一种实施方式中，核酸是DNA或RNA。在一些实施方式中，组合物可以稳定核酸、DNA或RNA(例如，抗降解)。在一些实施方式中，该组合物可以使核酸、DNA或RNA稳定第一时间段。在一些实施方式中，第一时间段可以大于或等于约14天、30天、60天、90天、120天、240天、300天或365天。在一些实施方式中，组合物可以在室温、-20℃至50℃之间或其他适合的温度或温度范围下使核酸、DNA或RNA稳定第一时间段。在一些实施方式中，组合物可以稳定第二时间段。在一些实施方式中，第二时间段可以大于或等于约12个月、18个月、24个月、30个月或36个月。在一些实施方式中，组合物可以在室温、-20℃至50℃之间或其他适合的温度或温度范围下稳定第二时间段。

至少一种实施方式包括从痰中回收核酸的方法，包括：i)从受试者获得痰或唾液，ii)使痰或唾液与本公开的组合物接触以形成样品混合物，iii)任选地使混合物与蛋白酶接触，和iv)从混合物中回收核酸。

在一些实施方式中，当组合物以适合的量添加至生物样品中时，组合物不显著抑制或干扰随后的核酸分析，诸如如RNA逆转录、DNA扩增(经由PCR)、(下一代)测序等。

样品采集

本公开的一些实施方式包括获得、提供和/或采集生物样品(例如，来自受试者，诸如人受试者)。在一些实施方式中，生物样品可以是(人)唾液或包括(人)唾液。在一些实施方式中，生物样品可以是(人)唾液或包括咳出的(人)唾液。(人)样品可以无菌采集(以避免(微生物)污染)。在一种或多种实施方式中，可以将样品采集到样品采集装置或其样品容器中。在一些实施方式中，样品采集装置或容器可以是试剂盒的部分和/或可以包括本公开的组合物。实施方式可以包括使样品与本公开的组合物接触。

核酸提取与分析：

本公开的一些实施方式包括从生物样品中提取核酸。以下是适用于与本公开的组合物一起使用的各种提取模式或提取程序的非穷举罗列或描述。

提取化学

有机——苯酚氯仿提取仍然是研究和临床实验室两者中采用的一种机制，并且在涉及组织来源时取决于样品类型。手动苯酚/氯仿提取，随后进行氯仿反提取，来帮助去除任何有机溶剂污染，以提取高分子量基因组DNA或RNA。

盐析——家庭酿造和商业盐析化学物质两者都广泛用于高分子量核酸提取。该方法需要将高浓度的盐添加至唾液样品中，以便在添加乙醇下将核酸分解。在分析之前进行一系列洗涤以从样品中去除多余的盐。

固相——多种技术供应商提供旋转柱和真空歧管解决方案，用于将核酸结合到用于核酸纯化的固体负载体上。一旦核酸附着到负载体上，就进行一系列洗涤。最终核酸以小体积从固体负载体上洗脱下来用于分析。旋转柱化学经常用于研究和临床实验室两者。

基于珠粒——珠粒或(顺)磁珠粒用各种结合部分或通过电荷制备以结合高分子量核酸。珠粒被磁场捕获，因此未与珠粒结合的任何物质都可以作为纯化过程的一部分被洗涤掉。一旦洗涤完成，将核酸用溶解核酸的溶液从珠粒上洗脱下来，留下珠粒，随后通过重新施加磁场将珠粒去除。在研究和临床环境中，这种方法有小体积和大体积的自动化解决方案。

说明性提取物

将先前从包含本公开的组合物的唾液采集试剂盒中提取的十个核酸样品和来自现有唾液采集试剂盒的多达六个样品用于测试。使用本发明的唾液采集试剂盒新采集了额外23个样品。23个样品中的每一个均以700ul等分样品一式两份提取。进行标准QC以评估核酸的质量。

提取23/23个样品，每个样品两个重复品。所有样品通过UV分光光度法(Nanodrop)的平均组合产量为20.4ug(2.8-111.4)。20/23的提取物具有的260/280比率高于期望值1.7，尽管低于1.7的三个样品可能在下游分析中表现良好。所有样品都具有高分子量核酸，如图1A中示出。

使用用于MSM1(Chemagen)提取系统的Perkin Elmer试剂提取700ul唾液样品溶液。通过UV分光光度法(Nanodrop)测定所有样品的浓度。用UV分光光度法通过测量A260/A280吸光度比率来测定对纯度的估计。额外地，在琼脂糖凝胶上分析样品以显现样品完整性。每个凝胶上都包括分子量分级梯(L)和大于50kb(C)的对照样品。用于定性凝胶的Bionexus通用HI-LO核酸标志物(参见图3B)。

分析方法

一些实施方式包括分析提取的核酸。几种方法可用于分析提取的核酸。以下是用于分析可能适合与本公开的组合物一起使用的提取的核酸的各种方法的非详尽列表或描述。

逆转录

例如，如本领域已知的，可以进行逆转录以基于提取的病毒RNA产生DNA。然后可以将逆转录的“病毒”DNA用于任何适合的DNA分析技术。

PCR

聚合酶链反应(PCR)分析是用于评估DNA模板保真性和洁净度的快速且经济有效的方式。一系列PCR反应(的不同大小的扩增子)将从所有DNA模板中生成，并经由电泳解析正确大小的扩增产物。PCR扩增子大小的范围将提供所有DNA提取产物保真性的信息。

qPCR

定量PCR(qPCR)使用双标记荧光探针对PCR扩增子进行定量。利用Taqman化学的等位基因鉴别将用于确定在所有提取方法中采集和提取的所有DNA的特定基因型。将测量受试者中每一位的基因型，以确保所有被分析变量的一致性。所有定量测量将一式三份进行。

RT-PCR

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)可以实现用于经由RNA提取(例如，使用(基于珠粒的)核酸提取)随后通过定量PCR(使用双标记探针化学)来进行病毒检测，优选用于检测核酸，诸如SARS-CoV-2病毒转录物。

dPCR

数字CR(dPCR)是新兴技术，采用其用于敏感检测具有有限量和/或有限质量的样品中的基因型。同样的Taqman测定将用于确定提取的每个DNA样品的绝对灵敏度。考虑到dPCR的灵敏度，我们将能够确定所分析的每个变量的最终灵敏度。

微阵列

当涉及到单个DNA样品的发现和临床分类两者时，同时测量数十万或数百万个SNP具有巨大的意义。灵敏度和特异性要求与基于QPCR的分析完全不同，并且SNP检测方法也不同，因为该分析方法使用基于杂交的机制来鉴别DNA变体。使用不同DNA提取化学方法处理的供体的检出率(call rate)和SNP一致性将是关键的分析终点。

桑格(Sanger)测序

变体分析的金标准将用于本研究中的所有样品。用于分析的靶标区域将覆盖QPCR、dPCR和微阵列的相同扩增子，以交叉验证所有其他分析方法的基因型。进行高质量桑格碱基调用(以及因此变体)的能力高度取决于核酸的质量。这种方法经常用于临床分析。

下一代测序

如本文所用，“下一代测序”(NGS)，也称为高通量测序，是指基于非桑格的高通量DNA测序技术。通过NGS，可以并行测序数百万或甚至数十亿条DNA链，产生可观地更高的通量并使得基因组的桑格测序中通常使用的片段克隆方法的需求最小化。NGS是用于描述以下项的总括术语：许多不同的现代测序技术或平台，包括例如焦磷酸测序、合成测序、连接测序、离子半导体测序以及本领域已知的其他测序。

如本领域技术人员所理解的，NGS通常允许比桑格测序快得多和经济得多的大量DNA和RNA测序。在NGS中，大量的短读长(read)在一次中测序。为此，首先可以将输入样品切割成短的部分。这些部分的长度取决于所使用的特定测序机制。具体NGS技术的说明性实例包括，例如

(Solexa)测序、Roche 454^TM测序、Ion torrent^TM：Proton/PGM测序、SOLiD测序等。

在Illumina测序中，使用100-150bp读长。将稍微较长的片段连接到通用衔接子上，并使用衔接子退火到载玻片上。进行PCR以扩增每个读长，创建具有相同读长的多个拷贝的点。然后将它们分成单链以进行测序。载玻片上充满了核苷酸和DNA聚合酶。将这些核苷酸荧光标记，颜色对应于碱基。它们还具有终止子，因此一次只添加一个碱基。拍摄载玻片的图像。在每个读长位置，都会有一个荧光信号指示已添加的碱基。然后为下一个循环准备载玻片。去除终止子，允许添加下一个碱基，并去除荧光信号，防止信号污染下一张图像。重复该过程，一次添加一个核苷酸并在其之间成像。然后使用计算机以检测每个图像中每个位点的碱基，并使用这些来构建序列。所有序列读长都将具有相同的长度，因为读长的长度取决于进行的循环数目。

Roche 454^TM测序通常可以测序比

更长的读长。与

一样，它通过在添加碱基时读取光信号，同时对多个读长进行测序来实现此目的。与

一样，使DNA或RNA片段化为较短的读长，在这种情况下可达1kb。将通用衔接子添加至末端，并且将它们退火至珠粒，每个珠粒一个DNA片段。然后使用衔接子特异性引物通过PCR扩增片段。然后将每个珠粒放置在载玻片的单个孔中。因此，每个孔将包含单个珠粒，覆盖在单个序列的许多PCR拷贝中。这些孔还包含DNA聚合酶和测序缓冲液。载玻片上充满了四种NTP种类之一。如果该核苷酸在序列中的下一个位置，则将其添加至序列读长中。如果该单个碱基重复，则将添加更多碱基。因此，如果我们用鸟嘌呤碱基充满，并且序列中的下一个是G，将添加一个G，但是如果序列的下一部分是GGGG，则将添加四个G。每个核苷酸的添加都会释放光信号。这些信号位置被检测并被用于确定将核苷酸添加到哪些珠粒上。洗涤掉这种NTP混合物。现在添加下一个NTP混合物并重复该过程，循环通过四个NTP。这种测序为每个序列读长生成图表，示出每个核苷酸洗涤的信号密度。然后可以从每次洗涤中的信号密度来计算确定序列。我们从454获得的所有序列读长都将具有不同的长度，因为每个循环将添加不同数目的碱基。

与

和Roche 454^TM不同，Ion torrent^TM和Ion质子测序不使用光信号。相反，它们利用了在DNA聚合物中添加dNTP会释放H+离子这一事实。与其他类型的NGS一样，输入的DNA或RNA是片段化的，这次为～200bp。添加衔接子并将一个分子放置在珠粒上。分子通过乳液PCR在珠粒上扩增。将每个珠粒放置在载玻片的单个孔中。与Roche 454^TM一样，载玻片上充满了单一种类的dNTP，连同缓冲液和聚合酶，一次一个NTP。检测孔的每一个的pH，因为释放的每个H+离子都会降低pH。pH的变化使我们能够确定是否将碱基添加到序列读长中以及添加多少碱基。洗涤掉dNTP，并且该过程在不同的dNTP种类中重复循环。将pH变化(如果有)用于确定每个循环添加了多少碱基(如果有)。

额外地或替代地，测序可以更一般地通过基于荧光的测序技术和/或任何基于电流的测序技术进行。基于荧光的测序技术的说明性实例包括结合与荧光团缀合的核苷酸的任何技术，诸如，例如使用基于

的测序方法和系统的测序。基于电流的测序技术的说明性实例包括任何测序技术(包括链测序方法)，其在多核苷酸穿过插入到带电荷膜中的孔时测量多核苷酸的电流，或者以其他方式特别地干扰传感器和/或带电荷膜的电流。基于电流的测序技术的非限制性实例包括纳米孔DNA测序系统和Oxford NanoPore

的方法。

链测序系统，诸如由Oxford NanoPore

提供的那些，在确定核酸的拷贝数目变异，特别是可能包含来自赘生性和/或癌细胞的DNA(或其他核酸)的样品的拷贝数目变异时提供了一些优势。例如，在链测序技术中，将基因组的单个部分连续测序，这允许直接分析拷贝数目变异，而不是在分析由样品核酸被切割成小片段用于测序的其他测序方法提供的测序数据时可能发生的拷贝数目变异的隐含分析。这对于序列覆盖低的实施方式可能特别有利。也就是说，在一些实施方式中，低序列覆盖运行可能会返回一组不完整的基因组数据。除了每个测序区域的隐含拷贝数目之外，还可以从序列数据推断基因组区域的存在和/或不存在。然而，在链测序方法中，产生的长序列读长可能允许对拷贝数目变异进行更明确的评估，特别是对于重复或缺失的区域。如果由于测序运行的低覆盖而无法获得完整序列，则可能难以确定基因组的哪些部分缺失(拷贝数目变异的一种形式)与基因组的哪些部分没有基于统计概率(即随机抽样)表示。

作为说明性实例，生成具有0.5X覆盖的数据的测序运行理论上将留下一半的样品未表示。使用将核酸“切碎”成小片段进行测序的测序方法，最终产物可能是代表总参考基因组约一半的序列文库，其中比对的参考基因组中散落着少量较小的核酸匹配。另一方面，使用链测序方法，同样在低覆盖(例如，0.5X)下，结果可能是序列文库再次代表总参考基因组的约一半。然而，当与参考基因组比对时，匹配部分要长得多，并且可能提供更明确的信息，诸如哪些序列已缺失、复制、插入等。这也可能证明是有问题的。虽然基因组的较长连续部分可以通过链测序方法表示，但基因组的长连续部分也是未知的。因此，尽管链测序方法可能允许对基因组部分进行更高清晰度的视图，但较小的测序读长有可能提供整个基因组的更全局的图。通过这种方式和其他方式，链测序可以为分析拷贝数目变异提供稳健的模型。

尽管前述说明了已知的测序技术及其对本文公开的本发明方法和系统的应用，但应当理解，这并不排除在本发明的范围内应用尚未发现或以其他方式未公开的测序方法。也就是说，在许多实施方式中，测序方法本身并不是必要的创造性步骤(除非，例如，通过使用特定的测序技术对方法和/或系统提供了改进)；相反，如何处理由测序方法提供的测序数据和/或如何应用这些数据通常包括创造性步骤。因此，应当理解，未来的测序技术(以及本文未明确列出的那些测序技术)，如果在所公开的方法或系统中用作工具，则包括在本申请的范围内。

额外地，任何前述测序技术可以以任何数目或容量并与以下项一起使用：任何数目的流通池或影响为每个测序反应/运行提供的测序读长的总数目的其他类似输入。

下一代测序可能最终成为分析DNA和RNA靶标两者的标准。通过标准文库制备过程，为所有DNA样品创建了靶向组(panel)，包括由qPCR、dPCR和基于阵列的靶标所覆盖的基因组区域。样品在NextGen平台上进行条形码化和多路复用，以进行变体分析。将数据解复用并分析，以便跨所有其他平台上直接比较基因型调用。

测试了几种上述和其他基于DNA的下游方法，以评估从使用包含本公开的核酸保存组合物的2mL唾液采集试剂盒采集的样品中提取的DNA的质量和可用性。额外地，将从两种现有产品中提取的少量DNA样品用于比较一些下游方法。以下是测试的几种下游方法的非详尽罗列或描述，包括使用

格式检测单个核苷酸多态性(SNP)的

化学(n＝120个SNP/样品)、使用

化学(CYP2D6基因)的拷贝数目变体(CNV)、全外显子组下一代测序(WES)(Thermo Fisher)和染色体微阵列分析(CMA)(Affymetrix CytoScan HD)。选择这些方法以包括分子遗传学实验室中使用的各种各样的常用方法。除了下游分析外，还使用定量PCR(qPCR)测定来测量细菌DNA含量占总DNA的百分比。不受任何理论约束，已知唾液样品具有高浓度的细菌DNA，这可能是一些方法的干扰物质。

Open

SNP基因分型：

使用

基因分型测定来完成单核苷酸多态性的基因分型。

测定是使用PCR扩增和一对靶向SNP的荧光染料检测器的等位基因鉴别测定。一种荧光染料连接到与第一个等位基因(例如“A”核苷酸)完美匹配的检测器，以及另一种荧光染料连接到与第二个等位基因(例如“C”核苷酸)完美匹配的检测器。在PCR期间，聚合酶会将荧光探针释放到溶液中，在其中使用Life Technologies,Inc.中的端点分析对其进行检测。具体来说，

技术是用于小体积溶液相反应的纳升流体平台。

技术使用具有3,072个通孔的显微镜载玻片大小的板。每个通孔的直径为300μm，以及深度为300μm，并经过亲水和疏水涂层处理。用于单次测定的

化学品在每个通孔中预加载并干燥。

是通过Life Technologies设计并制造获得的。使用Life Technologies的Taqman Genotyper v1.0.1软件测定基因型。

在118-120个SNP/样品的44个样品上测定了总共5234种基因型。44个样品包括3个样品的重复，每个样品来自本发明和现有试剂盒两者的提取物。对来自本发明试剂盒的样品的基因分型非常成功，并且超出了对此类测定的已知性能预期。不受任何理论的约束，Taqman基因分型有望成功地对超过99％的样品进行基因分型。在本实验中，99.75％的样品产生了基因型(5221/5234)。本发明溶液DNA提取物与现有提取物之间的基因分型率无显著差异，分别为99.74％和99.87％。在本发明溶液DNA提取物和现有提取物两者中重复的6个样品中，所有基因型都是一致的。

拷贝数目变体检测：

将

拷贝数目测定(CYP2D6-Hs00010001_cn)用于检测CYP2D6基因的拷贝数目，CYP2D6基因是在药物基因组学中评价的具有良好表征的CNV。

拷贝数目测定采用

MGB探针化学来评价基因组DNA靶标的拷贝数目。该测定使用Applied

7900HT实时PCR仪器和拷贝调用软件来确定拷贝数目。将每个样品扩增3次并针对标准曲线作图以确定拷贝数目。

对33个提取的核酸样品和5个现有的提取样品分析了CYP2D6基因中的良好表征的拷贝数目变体。30/33的发明溶液提取的核酸样品产生了CNV结果。5/5竞争者提取的样品产生了CNV结果。未产生CNV结果的3个样品均来自同一天采集的3个独立样品的同一个人(“B”)。在不同天采集并从现有唾液试剂盒中提取的同一个体的样品确实产生了正常的CNV结果，排除了潜在的干扰突变。

全外显子组测序(WES)：

使用Ion AmpliSeq^TM外显子组试剂盒来制备外显子组文库。将文库试剂盒与Ampliseq外显子组组引物库相组合，其中包含12个引物库中的大约294,000对引物。然后用试剂处理靶向得到的扩增子以部分消化引物并使扩增子磷酸化。然后将扩增子连接到带有条形码的Ion衔接子上并进行纯化。在完成外显子组文库制备后，通过实时PCR对纯化的、富含外显子组的文库进行定量。然后将量化的文库稀释至100pM，并用于制备模板化的IonPI^TM Ion Sphere^TM颗粒(ISP)以用于测序。然后使用Ion PI^TM Chip v3在Ion Proton系统上对样品进行测序。将Ion Hi-Q测序200V2化学用于对多达200个碱基对平均插入文库进行测序。

用完整的外显子组文库制备(AmpliSeq Exome,Thermo Fisher)来评价四个样品，其中3个是从本发明的唾液试剂盒中提取的，一个是从现有的唾液试剂盒中提取的，随后在Ion Proton仪器(Thermo Fisher)上进行下一代测序。通常预期的结果是＞3000万个读长，平均覆盖深度大于80X以及＞80％的碱基覆盖深度≥20X。四个样品中的三个符合这些标准。存在一个发明唾液试剂盒提取的样品不符合三个QC指标中的两个，其具有＜3000万个读长以及平均深度覆盖低于80X。应当注意，表现不佳的样品是同样没有成功进行CNV分析的样品之一。对DNAQC谱的检查确实指出了该样品的任何异常之处。符合所有QC指标。尽管该样品表现不佳，但产生了足够的外显子组测序结果以用于评价。

染色体微阵列(CMA)：

按照制造商的方案，使用Affymetrix CytoScan HD进行CMA分析。在GenomeAnalyzer 3000上扫描样品。将染色体微阵列用于以比核型分析更高的分辨率检测染色体畸变。该测定由以下组成：DNA制备，随后与CytoScan HD芯片杂交，该芯片在整个基因组中包含大约270万个CNV。使用Affymetrix ChAS软件来评价样品。

一个样品选自光谱唾液试剂盒提取的DNA。它在染色体微阵列(Affymetrix,CytoScan HD)上成功评价。样品具有的MAPD值≤0.25(0.18)，SNPQC值≥15(16.47)，波纹度值≤0.12(0.09)以及QC调用率≥95％(96.8％)。

使用qPCR测定的细菌DNA含量：

使用文献中描述的修改方案来测定样品中的细菌DNA含量。简而言之，使用连续稀释的大肠杆菌(E.Coli)创建标准曲线，以与生成的实时PCR数据进行比较。PCR引物选自16SrRNA基因的区域，已知其在各种各样的微生物中是保守的，并且在真核生物DNA中不存在。在ThermoFisher 7900HT仪器上使用拷贝调用方软件使用实时qPCR来测试DNA是否存在16SrRNA基因。

细菌DNA含量，作为来自唾液采集样品的DNA总量的百分比，被认为可能抑制或降低下游分析的成功率。对从本发明唾液试剂盒提取的33个DNA样品和从现有唾液试剂盒中提取的5个DNA样品进行了存在的细菌DNA百分比的测试。来自竞争者的先前的数据估计细菌DNA的百分比为大约13％。本发明唾液试剂盒提取物的平均细菌含量为5.5％(1.1-14.3％)。竞争者唾液试剂盒提取物的平均细菌含量为26％(2.1-96.2％)-14.31％)。

进行了一系列上述和/或其他实验测试以支持510K考虑的FDA提交，以获得批准在采集装置中使用本公开的制剂，用于使用以下项的各种各样可获得的化学方法之一来进行核酸提取，该化学方法包括有机、固相、基于珠粒和盐析提取，以及目前使用的多种分子分析中的任何一种，包括PCR、qPCR、dPCR、微阵列、桑格测序和所谓的下一代(或NextGen)测序(NGS)，如下表5中所述。

表5

结果总结

在所有重复品中成功地从所有样品中提取了核酸。一般来说，提取的核酸的大小(和产量)很高。几乎没有降解的迹象。就产量而言，来自样品的重复品非常具有可比性。额外地，假定同一个体的产量表现相似。SNP的基因分型产生了高质量的结果并满足了预期的产量。来自一个个体的样品，4个单独采集的样品，不满足CNV(n＝3)或NGS(n＝1)的QC指标。在本发明的唾液试剂盒核酸提取物中，作为总DNA百分比的细菌DNA含量相对较低。

在表6和7中呈现的另外实例中，将100个样品用于测试本公开(“本发明”)的核酸保存组合物和两种现有产品(“现有1”和“现有2”)的表现。如表6中呈现，本公开的“本发明”核酸保存组合物产生了比“现有”产品中的任一种产品更高的平均核酸浓度和更高的总核酸量(产量)。

表6

如表7中另外呈现，用本公开的“本发明”核酸保存组合物处理的样品具有的非人核酸的平均量显著低于“现有”产品的任何一种。

表7

因此，本公开的组合物令人惊讶地显著优于现有的核酸保存产品。尤其，令人惊讶和出人意料的是，本公开的组合物起到如此好的作用(例如，产生大量核酸和/或具有或呈现出低水平的微生物污染)。进一步令人惊讶和出人意料的是，本公开的组合物与一些实施方式中提供的少量醇一起起到如此好的作用。例如，在一些实施方式中，包括在组合物中的醇的量可以比典型、传统或现有的核酸保存溶液更少(例如，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％更少)。另外，较低量的醇更经济和/或使组合物更易于运输或运输(例如，通过更容易遵守运输要求和规章、降低挥发性等)。

采集后稳定性

使用(即样品采集)后，将设备在不同温度(室温、4℃、-20℃或-80℃)下储存不同时间段(72小时、6个月、12个月或24个月)。将一些设备在加速老化条件下储存。从13名受试者中的每一名中采集唾液(4个样品)。使用了三个不同批次的采集设备(每个时间点一个批次#)，并根据下表测试结果。受试者13样品在提取之前进行了加速老化条件(在40℃ 56天)。

样品产量——总DNA产量为至少10ng(0.010μg)；DNA浓度为2ng/μL或更高。

样品纯度——DNA纯度(A260/A280)在1.2和2.3之间。

最低一致性水平——在任何重新测试后为100％。

基因型一致性(受试者重复品)——100％。

基因型一致性(桑格测序与QPCR)——100％。

使用的材料：唾液采集设备、唾液QiaSympony DNA提取试剂盒、用于定量PCR的双标记探针和引物、用于桑格测序的Big Dye终止子反应混合物、用于QPCR分析的Taq聚合酶、用于吸收池光谱法测量的Luantic板、用于分子生物学应用的通用实验室设备。

使用的测量装备：核酸提取——QiaSymphony(Qiagen)，核酸定量/纯度——Unchained Lunatic(Unchained Labs)*无吸收池光谱法，等位基因鉴别——ViiA 7实时PCR仪器(Life Technologies)，桑格测序——ABI 3730DNA测序装置(Life Technologies)

ARM 2b AQC测试总结(表8)

表8

Arm 2b基因型一致性测试总结(表9)

表9

对于所有受试者，来自桑格测序的全血基因型与来自QPCR的血液基因型之间的一致性为100％。

测试证明了唾液DNA采集装置的性能，并确定了该装置在批次、受试者、温度和时间方面的采集后稳定性。该设备符合要求的验收标准和规格。

通过采集试剂盒中的组合物确认Sars-CoV-2病毒灭活/杀死

方案：

第1天用BA-PBS制备1:10稀释的SARS-2WA-1毒株

裂解缓冲液+BA-PBS(1:3)

分为3个条件：

1)3mL光谱裂解+BA-PBS+100ul SARS-2(1:10)(示出裂解的病毒无感染性)

2)3mL BA-PBS(无裂解缓冲液)+100ul SARS-2(1:10)(示出过滤后病毒仍然存活)

3)3mL BA-PBS+裂解缓冲液(细胞对照)

置于RT下10分钟

将500ul各自加载到预冲洗的amicon离心过滤器单元50K截止

旋转14k rpm x 5分钟，弃去流过

用500ul PBS洗涤3x(14K x 5分钟)

倒置离心单元并采集保留的级分。

用BA-PBS来使QS至原始500ul体积

过滤和QS后取50ul的RT-PCR样品：

1)SARS-2/光谱裂解/amicon(10^0稀释第0天)

2)SARS-2/无裂解/amicon(10^0稀释第0天)

连续稀释：10^0、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5

1)SARS-2/光谱裂解/amicon

2)SARS-2/无裂解/amicon

3)BA-PBS/光谱裂解/amicon

4)SARS-2(无amicon)

5)SARS-2/光谱裂解(无amicon)

将Vero细胞第3天预接种96孔平底板：

去除培养基

除了将100ul BA-PBS添加至细胞对照孔中之外,将50ul BA-PBS添加至所有其余孔中

从上面添加50ul稀释剂，一式两份

在BSC(RT)中静置20分钟

添加150ul MEM Hanks培养基

用板密封器密封板并将盖子置于顶部

置于37C加湿培养箱

第4-6天：读取CPE：

1)SARS-2/光谱裂解/amicon——无CPE任何稀释剂(裂解缓冲液或病毒对细胞层没有影响)

2)SARS-2/无裂解/amicon——CPE+++到10^-3(病毒感染性)

3)SARS-2(无amicon)——CPE+++到10^-3(病毒对照符合预期)

4)BA-PBS/光谱裂解/amicon——无CPE(通过amicon来去除裂解缓冲液)

5)SARS-2/光谱裂解(无amicon)——细胞层在＜10^-2-3时死亡(裂解缓冲液杀死细胞)

取RT-PCR样品：

SARS-2/光谱裂解/amicon(10^0稀释第3天)

第5天：传代到预先接种的96孔板中：

去除培养基

添加200ul新鲜的MEM-Hanks和50ul来自平板的上清液

密封并在37C温育

在第7天再次读取CPE：

1)SARS-2/光谱裂解/amicon——无CPE任何稀释剂(无感染性传代)

2)SARS-2/无裂解/amicon——CPE+++到10^-3.5(感染性病毒传代)

3)SARS-2(无amicon)——CPE+++到10^-3.5(病毒对照CPE如预期)

4)BA-PBS/光谱裂解/amicon–无CPE

5)SARS-2/光谱裂解(无amicon)——细胞层在＜10^-1时死亡

取50ul RT-PCR：

1)SARS-2/光谱裂解/amicon(10^0稀释第1天第3天)

RT-PCR结果：使用N1和N2的CDC EUA RT-PCR平均

SARS-2/光谱裂解/amicon(10^0稀释第0天)Ct＝29

SARS-2/无裂解/amicon(10^0稀释第0天)Ct＝17

SARS-2/光谱裂解/amicon(10^0稀释第3天)Ct＝32

SARS-2/光谱裂解/amicon(10^0稀释传代1d3)Ct＝33

结果：通过CPE读出或RT-PCR，在裂解缓冲液的存在下，没有病毒生长的证据。

培养基：

1X封闭系统培养基(10％ FBS、90％ MEM Hanks')每100ml

75.6ml 无菌Milli-Q水

10.0ml 10x极限必需培养基Eagle与Hanks盐(Sigma M9288)

10.0ml 胎牛血清(灭活30min@56℃)(Atlanta Biologicals)

1.2ml 碳酸氢钠7.5％(GIBCO 25080-094)

2.0ml 200mM L-谷氨酰胺(GIBCO 25030-081)

1.0ml 青霉素-链霉素(各自为10,000U/ml)(GIBCO)

0.2ml 两性霉素B 250ug/mL(GIBCO 15290-018)

PRNT 稀释剂BA-PBS(0.75％牛白蛋白在PBS中pH7.4)

制备溶液A和B的10X溶液：

用于PRNT的病毒稀释和血清稀释

10X溶液A：

溶液A：在1L烧杯中：

80g NaCl

2g KCl

1g MgCl₂.6H₂0

10mL 10％ CaCl₂.2H₂0

8mL 0.5％酚红

990mL Milli-Q水

用搅拌棒搅拌直到溶解

分配在100mL玻璃瓶并用加压釜灭菌

10X溶液B:称量到1L锥形瓶中：

11.5g Na₂HPO₄

2g KH₂PO₄

添加992mL Milli-Q水。旋转或搅拌直到溶解。

添加8mL 0.5％酚红溶液。

用搅拌棒搅拌直到溶解。

分配在100mL玻璃瓶并用加压釜灭菌

在室温下储存

制备1L 1X BA-PBS稀释剂(附录A)

100mL 10X溶液A

100mL 10X溶液B

100mL 7.5％ BSA(Gibco)

20mL Pen/Strep(10,000U/mL Gibco)

680mL无菌milli Q水

结论

应当理解，某些实施方式(例如，组合物、试剂盒、方法等)可以包括、并入或以其他方式包括本文公开和/或描述的其他实施方式中描述的特征(例如特性、组分、成分、元素、部件、部分、步骤等)。因此，一种实施方式的的各种特征可以与本公开的其他实施方式兼容、与本公开的其他实施方式组合、包括在本公开的其他实施方式中和/或并入到本公开的其他实施方式。相对于本公开的一种实施方式的某些特征的公开不应被解释为将所述特征的应用或包括限制于特定实施方式。相反，应当理解，其他实施方式也可以包括所述特征，而不必脱离本公开的范围。此外，除非将特征描述为需要与其组合的另一特征，否则本文描述的任何特征可以与本文公开的相同或不同实施方式的任何其他特征组合。

所描述的实施方式在所有方面都应被认为仅是说明性的而不是限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述描述指示。在权利要求的等效含义和范围内的所有变化都应包含在其范围内。在不背离由权利要求所限定的本发明的精神和范围下，可以对所说明的实施方式进行相关领域的技术人员和拥有本公开内容的技术人员所想到的本文说明特征的各种改变和/或修改以及额外应用，并且将其考虑在本公开的范围内。尽管本文已经公开了各种特征和实施方式，但也可以考虑其他特征和实施方式。例如，本文没有尤其详细地描述众所周知的特征和实施方式，以避免模糊所描述的实施方式的方面。然而，本文也考虑这样的特征和实施方式。

Claims

1.一种在离体唾液样品中保存病毒核酸的方法，所述方法包括：

获得包含病毒核酸的离体唾液样品；和

使所述离体唾液样品与核酸保存组合物接触，所述组合物包括：

20-50％离散剂，w/w；

1-5％缓冲剂，w/w；

0.05-2.5％螯合剂，w/w；

0.05-2.5％表面活性剂，w/w；

5-25％醇，w/w；

0.005-0.25％黏液溶解剂，w/w；

任选的视觉指示剂；

载体qs至100％；以及

pH 7.1-9.5。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物具有pH 7.2-9.0，优选pH 7.2-8.8，优选pH 7.5-8.5，更优选7.8-8.4，仍更优选pH 7.9-8.3，仍更优选pH 8.0-8.2。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中：

所述离散剂包括硫氰酸胍；

所述缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)；

所述螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)，优选EDTA二钠盐，更优选EDTA二钠盐二水合物；

所述表面活性剂包括月桂酰肌氨酸钠(SLS)；

所述醇包括乙醇和第二化学品的混合物，其中，所述第二化学品优选为异丙醇；

所述黏液溶解剂包括N-乙酰基-L-半胱氨酸；

所述视觉指示剂包括着色剂，更优选有色染料，仍更优选蓝色染料，仍更优选FD&CBlue No.1；和/或

所述载体是水性载体，优选包括过滤水、纯化水、蒸馏水和/或去离子水，

所述组合物优选包括：

43.92％，w/w，±10％的所述离散剂；

2.65％，w/w，±10％的所述缓冲剂；

1.029％，w/w，±10％的所述螯合剂；

0.279％，w/w，±10％的所述表面活性剂；

17.73％，w/w，±10％的所述醇；和/或

0.093％，w/w，±10％的所述黏液溶解剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述组合物的各组分的量在±10％下进一步是±9％，优选±8％，更优选±7％，仍更优选±6％，仍更优选±5％，仍更优选±4％，仍更优选±3％，仍更优选±2％，仍更优选±1％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离体唾液样品包括咳出的人唾液。

6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括分析所述离体唾液样品和所述核酸保存组合物的混合物以检测病毒核酸的存在。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述分析包括病毒RNA的逆转录以产生DNA和/或DNA的聚合酶链反应。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物：

(i)基本上不含或没有除了N-乙酰基-L-半胱氨酸或除N-乙酰基-L-半胱氨酸以外的一种、额外的或任何黏液溶解剂；

(ii)基本上不含或没有除了以下项或者除以下项以外的额外的或者任何一种或多种抗微生物剂、一种或多种杀菌剂和/或一种或多种抑菌剂：一种或多种醇、一种或多种离散剂、一种或多种表面活性剂/一种或多种洗涤剂和/或一种或多种黏液溶解剂；

(iii)基本上不含或没有除了一种或多种离散剂或者除一种或多种离散剂以外的额外的或者任何一种或多种核糖核酸酶抑制剂或者核糖核酸酶的一种或多种抑制剂，所述组合物优选基本上没有肝素、硫酸乙酰肝素、低聚(乙烯基磺酸)、聚(乙烯基磺酸)、低聚(乙烯基膦酸)和/或聚(乙烯基磺酸)或者其一种或多种盐；

(iv)基本上不含或没有一种或者任何一种或多种蛋白酶；

(v)基本上不含或没有抗坏血酸、连二亚硫酸盐、异抗坏血酸盐、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、二赤藓糖醇、树脂负载的硫醇、树脂负载的膦、维生素E和/或trolox，或其一种或多种盐；

(vi)基本上不含或没有一种或多种微生物和/或微生物污染；和/或

(vii)具有小于或等于每克所述组合物约100、99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5个菌落形成单位(cfu)的一种或多种微生物(cfu/g)。

9.一种试剂盒，所述试剂盒用于以美国食品药品监督管理局(FDA)授权的方式保存离体唾液样品中的病毒核酸，所述试剂盒包括：

样品采集装置；和

核酸保存组合物，所述核酸保存组合物设置在样品采集装置的一部分中，所述核酸保存组合物包括：

20-50％离散剂，w/w；

1-5％缓冲剂，w/w；

0.05-2.5％螯合剂，w/w；

0.05-2.5％表面活性剂，w/w；

5-25％醇，w/w；

0.005-0.25％黏液溶解剂，w/w；

任选的视觉指示剂；

载体qs至100％；以及

pH 7.2-9.5。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述组合物具有pH 7.2-9.0，优选pH 7.2-8.8，优选pH 7.5-8.5，更优选7.8-8.4，仍更优选pH 7.9-8.3，仍更优选pH 8.0-8.2。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的试剂盒，其中：

所述离散剂包括硫氰酸胍；

所述缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)；

所述表面活性剂包括月桂酰肌氨酸钠(SLS)；

所述黏液溶解剂包括N-乙酰基-L-半胱氨酸；

所述组合物优选包括：

43.92％，w/w，±10％的所述离散剂；

2.65％，w/w，±10％的所述缓冲剂；

1.029％，w/w，±10％的所述螯合剂；

0.279％，w/w，±10％的所述表面活性剂；

17.73％，w/w，±10％的所述醇；和/或

0.093％，w/w，±10％的所述黏液溶解剂。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述组合物的各组分的量在±10％下进一步是±9％，优选±8％，更优选±7％，仍更优选±6％，仍更优选±5％，仍更优选±4％，仍更优选±3％，仍更优选±2％，仍更优选±1％。

13.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述组合物：

(iv)基本上不含或没有一种或者任何一种或多种蛋白酶；

14.一种检测离体唾液样品中病毒存在的方法，其中，所述病毒优选是冠状病毒，更优选严重急性呼吸综合征(SARS)相关冠状病毒(SARS-CoV)，仍更优选SARS-CoV-2，所述方法包括：

获得包含病毒核酸的离体唾液样品；

20-50％离散剂，w/w；

1-5％缓冲剂，w/w；

0.05-2.5％螯合剂，w/w；

0.05-2.5％表面活性剂，w/w；

5-25％醇，w/w；

0.005-0.25％黏液溶解剂，w/w；

任选的视觉指示剂；

载体qs至100％；以及

pH 7.1-9.5；以及

分析所述离体唾液样品和所述核酸保存组合物的混合物以检测病毒核酸的存在，

其中，所述分析任选地包括病毒RNA的逆转录以产生DNA和/或DNA的聚合酶链反应。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述组合物具有pH 7.2-9.0，优选pH 7.2-8.8，优选pH 7.5-8.5，更优选7.8-8.4，仍更优选pH 7.9-8.3，仍更优选pH 8.0-8.2。

16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中：

所述离散剂包括硫氰酸胍；

所述缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)；

所述表面活性剂包括月桂酰肌氨酸钠(SLS)；

所述黏液溶解剂包括N-乙酰基-L-半胱氨酸；

所述组合物优选包括：

43.92％，w/w，±10％的所述离散剂；

2.65％，w/w，±10％的所述缓冲剂；

1.029％，w/w，±10％的所述螯合剂；

0.279％，w/w，±10％的所述表面活性剂；

17.73％，w/w，±10％的所述醇；和/或

0.093％，w/w，±10％的所述黏液溶解剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述组合物的各组分的量在±10％下进一步是±9％，优选±8％，更优选±7％，仍更优选±6％，仍更优选±5％，仍更优选±4％，仍更优选±3％，仍更优选±2％，仍更优选±1％。

18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述离体唾液样品包括咳出的人唾液。

19.根据权利要求14所述的方法，其中，所述组合物：

(iv)基本上不含或没有一种或者任何一种或多种蛋白酶；