KR20230102252A - 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230102252A
KR20230102252A KR1020210192225A KR20210192225A KR20230102252A KR 20230102252 A KR20230102252 A KR 20230102252A KR 1020210192225 A KR1020210192225 A KR 1020210192225A KR 20210192225 A KR20210192225 A KR 20210192225A KR 20230102252 A KR20230102252 A KR 20230102252A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
nucleic acids
biological sample
nucleic acid
stabilizing
Prior art date
Application number
KR1020210192225A
Other languages
English (en)
Inventor
김영훈
정지혜
남경우
임진수
오미진
Original Assignee
주식회사 랩 지노믹스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 랩 지노믹스 filed Critical 주식회사 랩 지노믹스
Priority to KR1020210192225A priority Critical patent/KR20230102252A/ko
Publication of KR20230102252A publication Critical patent/KR20230102252A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 복합적인 조성을 가지는 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 상세하게 킬레이트화제, 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물에 생물학적 샘플을 혼합하여 보관하면 상온에서도 핵산이 장기간 안정적으로 보존될 수 있을 뿐만 아니라, 보관된 샘플 내 핵산은 추가적인 핵산의 추출 및 정제 과정 없이도 안정적으로 핵산 분석에 이용될 수 있다.

Description

생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법 {COMPOSITIONS FOR STABILIZING OR EXTRACTING NUCLEIC ACIDS IN BIOLOGICAL SAMPLES AND METHODS USING THE SAME}
본 발명은 복합적인 조성을 가지는 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 상세하게 킬레이트화제, 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물에 관한 것이다.
인간의 장 속에는 수만 종의 미생물이 살고 있으며, 이 중 각각의 개인은 수백 종 정도의 미생물을 가지고 살아간다. 이러한 장내 미생물은 일생동안 사람과 공생하면서 소화, 분비 등에 많은 영향을 미치고 있는 것으로 나타나고 있다. 최근에는 장-뇌 축(gut-brain axis)이란 이론이 나올 정도로 장내 미생물, 특히 이들의 집합으로서의 장내 미생물군(gut microbiome 또는 gut microbiota)은 인간의 육체적인 건강 및 정신적인 건강에 지대한 영향을 주는 것으로 나타나고 있으며 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Augusto J. et al., Front. Integr. Neurosci., 2013). 또한 장내 미생물이 아토피나 천식과 같은 자가 면역 질환, 자폐나 우울증 같은 정신적인 질환과도 밀접한 관계가 있다는 사실이 생리학, 면역학, 역학 등 다양한 각도에서 증명되고 있다.
이러한 이유로 장내 미생물, 특히 장내 미생물군을 검출 및 분석하고자 하는 요구가 대두되고 있다. 일반적으로 장내에 서식하는 미생물은 혐기성이거나 공생하는 다른 미생물(및 이들이 분배하는 특수한 영양물질) 등의 배양조건을 필요로 하는 등 배양이 쉽지 않은 경우가 많으므로 특히 장내 미생물군 전체를 파악하고자 하는 목적에 배양을 통한 분석은 적합성이 떨어질 수 있다. 이에 따라 이들의 유전물질을 분석하는 방법이 주를 이루고 있다.
유전물질의 분석은 대체로 부피가 큰 장비를 필요로 하고, 산업적으로는 다수의 샘플을 한 번에 처리하는 것이 유리하며, 여러 샘플이 서로 다른 일시에 모이게 되는 등의 이유로 샘플을 운반하고 보관할 필요가 있다. 다만, 대변, 점막 생검 조직 등이 될 수 있는 이러한 생물학적 샘플은 일반적으로 유전물질인 핵산 외에도 다양한 물질과 생물(미생물 등)을 포함하고 있어, 이들에 의한 핵산의 분해가 쉽게 일어날 수 있으므로, 이에 따라 샘플을 안정적으로 보관할 수 있는 기술이 요구된다. 일반적으로는 냉동하는 등 저온 보관을 통해 샘플을 보관하게 되나, 샘플 채취 장소, 운송수단과 분석 장소 모두에 구비하는 것은 비용과 공간 측면에서 부담이 될 수 있다.
본 발명자들은 이처럼 복합적인 조성을 가진 생물학적 샘플 내의 핵산을 상온에서도 장기간 안정적으로 보관할 수 있는 조성물과 키트, 상기 조성물을 이용하여 생물학적 샘플 내의 핵산을 안정화, 추출 또는 분석할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 발명의 목적은 복합적인 조성을 가진 생물학적 샘플 내의 핵산을 상온에서도 장시간 안정적으로 보관할 수 있으며, 이렇게 보관된 핵산의 분석을 위해 추가적인 핵산 추출 및 정제 단계가 필요하지 않은 조성물, 이를 이용한 키트 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 킬레이트화제, 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 킬레이트화제는 상기 조성물 내에 100 내지 300 mM 포함되고, 에틸렌디아민트리아세트산(EDTA), 1,2-사이클로헥산디아민 테트라아세트산 (CDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산 (DOTA), 테트라아자사이클로테트라데칸테트라아세트산 (TETA), 데스페리옥시민, 이들의 킬레이터 유사체 또는 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 0.1 내지 5 %(v/v) 포함되고, 도데실 황산 나트륨(SDS), 라우릴 황산나트륨(SLS) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 비이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 5 내지 15 %(v/v) 포함되고, 폴리소르베이트 20 (TWEEN 20), 폴리소르베이트 40 (TWEEN 40), 폴리소르베이트 60 (TWEEN 60), 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80), 옥실페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100), 이들의 유사체 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 조성물은 pH가 7 내지 11인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 생물학적 샘플은 대변, 소변, 체액, 토양, 물, 공기 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 핵산은 DNA, RNA 및 그 조합에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 조성물은 상기 핵산을 상온에서 30일 이상 안정하게 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 일실시예는 전술한 조성물; 및 재밀봉이 가능한 용기를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 추가로 생물학적 샘플을 상기 용기로 옮기기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 일실시예는 전술한 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출 방법을 제공한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 일실시예는 전술한 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하여 제1혼합물을 수득하는 단계; 및 상기 제1혼합물을 분석하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법을 제공한다.
상기 방법은 추가로 핵산을 추출, 정제하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 분석은 정량, 검출, 유전형 분석 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 분석은 PCR 기반의 방법, NGS, 마이크로어레이, ChIP(chromatin immunoprecipitation), 핵산지문법(nucleic acid fingerprinting), 서던블롯(southern blot) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 분석은 메타게놈 분석인 것을 특징으로 할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 조성물, 이를 포함하는 키트 및 상기 조성물을 이용한 방법은 생물학적 샘플 내의 핵산을 상온에서도 장시간 안정적으로 보관될 수 있도록 한다. 또한, 이렇게 보관된 핵산은 분석을 위해 추가적인 추출이나 정제를 필요로 하지 않아, 생물학적 샘플 내의 핵산의 분석을 좀더 간편하게 진행할 수 있도록 할 뿐만 아니라, 상기 추가 추출/정제 과정에서 일어날 수 있는 핵산의 소실을 방지할 수 있다. 이는 예컨대 대변, 혈액, 토양, 하수 등 복합적인 조성을 가지는 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산을 이용하여 미생물 군집 프로파일, 병원균, 기타 유전정보 등을 검출하고 분석하는 데에 사용될 수 있다. 이는 상기 검출된 정보와 상관성이 높은 질병, 증상, 환경영향 등이 있다면 이를 진단하거나 변화 양상을 예측하고 관련 증상이나 좋지 않은 영향을 예방, 치료, 또는 경감하는 데에 이용될 수 있을 것이다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 pH를 달리한 본 발명의 표 1에 따른 조성물에 균질화한 대변 샘플을 직접 16S rRNA 유전자 증폭 PCR한 산물을 각각 젤 전기영동한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 균질화한 대변 샘플과 동일 대변 샘플에 시판 대변 핵산 추출 키트를 사용하여 얻은 핵산을 각각 16S rRNA 유전자 증폭 PCR한 산물을 각각 젤 전기영동한 이미지이다.
도3은 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 균질화한 대변 샘플과 동일 대변 샘플에 시판 대변 핵산 추출 키트를 사용하여 얻은 핵산에 대해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 alpha rarefaction 분석한 데이터이다.
도 4는 상온에서 서로 다른 기간 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 보관한 대변 샘플(직접 또는 추가로 핵산 추출 및 정제 후)과 동일 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 동일한 기간 보관 후 이로부터 추출 및 정제한 핵산을 각각 16S rRNA 유전자 증폭 PCR한 산물을 젤 전기영동한 이미지이다.
도 5는 상온에서 7일 동안 본 발명의 실시예 1에 따른 조성물에 보관한 대변 샘플과 동일 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 동일한 기간 보관 후 이로부터 추출 및 정제한 핵산에 대해 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 alpha rarefaction 분석한 데이터이다.
도 6은 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 7일 상온 보관한 대변 샘플의 희석 방법 및 희석 배율을 달리 하여 16S rRNA 유전자 증폭 PCR한 산물을 젤 전기영동한 결과를 비교한 이미지이다.
도7은 1일, 4일 및 7일(A)과 30일(B) 상온 보관한 본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 대변 샘플(직접 또는 추가로 핵산 추출 및 정제 후)과 동일 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 각 동일한 기간 보관 후 이로부터 추출 및 정제한 핵산으로부터 각각 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 Bray-Curtis dissimilarity 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예1에 따른 조성물 또는 이로부터 비이온성 계면활성제인 TWEEN 20을 뺀 조성물의 사용 시 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 Bray-Curtis dissimilarity 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따른 조성물 또는 이로부터 비이온성 계면활성제인 TWEEN 20을 뺀 조성물의 사용 시 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 alpha rarefaction 분석한 데이터이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일측면은 킬레이트화제, 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물을 제공한다.
일반적으로 생물학적 샘플, 예컨대 타액, 혈액, 대변 및 소변 등에서 DNA 및 RNA를 화학적으로 안정화시키기 위한 수단의 하나로 금속의 산화환원 사이클링 또는 핵산의 인산 골격으로 금속 이온이 결합하는 것을 방지할 수 있는 킬레이트화제를 들 수 있다. 본 명세서에서 "킬레이트화제“(chelator)는 특정 금속 이온과 안정된 복합체를 형성함으로써 이온을 격리시킬 수 있는 물질을 말한다. 예컨대 위장관에는 췌장 분비물이나 장내 미생물로부터 분비된 핵산을 분해할 수 있는 효소, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 또는 엔도뉴클레아제(예컨대, I, II 및 III 형 제한 엔도뉴클레아제) 및 엑소뉴클레아제(예로, 3'→5' 엑소뉴클레아제)가 다량 존재하는데, 이들 효소는 예컨대, Ca2+, Zn2+, Mg2+ 등과 같은 2가의 금속 이온에 의존적으로 핵산 분해 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 금속 이온은 핵산과 쉽게 결합하는 것으로 알려져 있으며, 특히 서로 다른 몇 가지 산화 상태를 가지는 철(Fe)이나 코발트(Co) 등의 전이금속(transition metal) 이온은 라디칼 형성에 관여하여 핵산을 손상시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며, 킬레이트화제를 통해 이러한 금속 이온을 제거할 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 킬레이트화제는 생물학적 샘플의 핵산 분해효소 및 미생물 성장을 저해할 수 있다.
상기 킬레이트화제는 조성물 내에 50 mM 이상, 바람직하게 100 내지 300 mM, 더욱 바람직하게 150 내지 250 mM 포함될 수 있다. 상기 킬레이트화제는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), (2-하이드록시에틸)에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 니트릴로트리아세트산(NTA), 에틸렌디아민트리아세트산(EDTA), 1,2-사이클로헥산디아민테트라아세트산(CDTA), N,N-비스(카복시메틸)글리신, 트리에틸렌테트라아민(TETA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산(DOTA), 데스페리옥시민, 시트레이트 무수물, 나트륨 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 제2 철 암모늄 시트레이트, 리튬 시트레이트 또는 그 조합 중에서 선택될 수 있다. 상기 킬레이트화제는 바람직하게 에틸렌디아민트리아세트산(EDTA), 1,2-사이클로헥산디아민 테트라아세트산 (CDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산 (DOTA), 테트라아자사이클로테트라데칸테트라아세트산 (TETA), 데스페리옥시민, 이들의 킬레이터 유사체 또는 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "계면활성제"는 친수성과 소수성 부분을 모두 가지고 있는 화합물로, 단백질의 비공유 결합을 손상시켜 이를 원래 가지는 구조를 잃게 만들 수 있는 임의의 유기 화합물을 의미한다. 상기 계면활성화제는 예컨대 도데실 황산 나트륨(SDS), 도데실 황산 리튬, 라우릴 황산 나트륨(SLS), 라우릴 황산 암모늄 등의 음이온성 계면활성제, 사차 암모늄 염(예컨대, 세트리모늄 브로마이드/세틸트리메틸암모늄 브로마이드/헥사데실-트리메틸-암모늄 브로마이드(CTAB), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC)), 세틸피리디늄 클로라이드(CPC), 벤잘코늄 클로라이드(BAC) 등의 양이온성 계면활성제, 베타인, 3-[(3-클로아미도프로파일)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 레시틴 등의 쯔비터이온성(zwitterionic) 계면활성제, Tween, Triton X, Brij 등의 비이온성 계면활성제 등이 있다. 계면활성제는 효소의 복잡한 구조를 파괴함으로써 DNase 등 핵산 분해 효소의 작용을 저해하고, 본 발명의 조성물 내 생물학적 다양한 화학종의 가용화(solubilization)를 도우며, 이를 통해 샘플로부터 핵산 추출이 될 수 있도록 할 수 있다.
상기 이온성 계면활성제는 상기 음이온성 계면활성제, 상기 양이온성 계면활성화제 또는 상기 쯔비터이온성 계면활성화제 중에서 선택된 것일 수 있고, 바람직하게 음이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제 중에서 선택된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게 음이온성 계면활성제인 것일 수 있고, 가장 바람직하게 도데실 황산 나트륨(SDS), 라우릴 황산 나트륨(SLS) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 0.01 내지 10 %(v/v), 바람직하게 0.1 내지 5 %(v/v), 더욱 바람직하게 0.3 내지 1%(v/v) 포함될 수 있다.
상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20 (TWEEN 20), 폴리소르베이트 40 (TWEEN 40), 폴리소르베이트 60 (TWEEN 60), 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80), 옥실페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100), 이들의 유사체 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게 TWEEN 20, Triton X-100 및 그 조합 중에서 선택될 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 1 내지 20 %(v/v), 바람직하게 5 내지 15 %(v/v), 더욱 바람직하게 10 내지 15 %(v/v) 포함될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 후술할 실시예에서 계면활성제 중 이온성 및 비이온성 계면활성제를 모두 포함한 조성물이 이온성 계면활성제만 포함한 조성물에 비해 핵산을 안정적으로 보존하고 잘 추출할 수 있다는 것을 확인하였다.
일반적으로 DNA와 RNA 등 핵산을 안정화하는 데에는 전술한 킬레이트화 외에도 pH가 중요한 역할을 할 수 있다. 일반적으로 핵산은 낮은 pH에서 불안정하고, 이중 가닥(double-stranded)의 DNA는 pH 5 내지 9에서, RNA는 pH 4 내지 5에서 안정한 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 상기 조성물은 pH가 7 이상, 바람직하게 7 내지 11, 더욱 바람직하게 8 내지 10, 가장 바람직하게 8.5 내지 9.5인 것을 특징으로 할 수 있다. 후술할 실시예로부터 확인할 수 있듯 본 발명의 발명자들은 후술할 실시예에서 본 발명에 따른 조성물이 최소한 pH 8 내지 10 범위에서 안정적으로 작용하며, 상기 각 조성물에 생물학적 샘플을 혼합하여 균질화하면 추가적인 핵산의 추출 및 정제 과정 없이도 바로 핵산 분석에 사용 가능하다는 것을 확인하였다. 핵산의 추출 및 정제 과정은 핵산 분석을 방해할 수 있는 불순물을 제거하기도 하나 핵산이 일부 소실되는 원인이 되기도 하며, 특히 이는 샘플 내 카피 수가 낮은 핵산이 포함되어 있는 경우 이의 검출이 되지 않도록 만들 수 있으므로, 기존의 핵산 보관용 조성물에 비해 이러한 과정을 생략할 수 있는 본 발명의 핵산 안정화 및 추출용 조성물은 큰 비교우위를 가질 수 있다.
상기 조성물의 pH는 하나 이상의 버퍼를 이용하여 적절한 범위로 유지할 수 있다. 이때, 버퍼는 전술한 pH 범위, 즉 pH 7 이상을 유지할 수 있도록 pKa가 7 이상인 것을 사용하는 것이 좋다. 그 예로는 EPPS, HEPPS, 트리신, Tris, Gly-Gly, 바이신, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, AES, CHES(2-(사이클로헥실아미노)에탄설폰산), 에탄올아민, 에페드린, CAPSO, 하이드록시프롤린, AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), 류신, 글리신, 히스타민, 트리메틸아민, TETA, 니트릴로트리아세트산, 알파-알라닌, 에틸렌디아민, 아스파트산, 베타-알라닌, 알라닌, 티로신, CAPS(3-사이클로헥실아미노)-1-(프로판설폰산), 시스테인, 감마-아미노부티르산, n-프로필아민, 메틸아민, 에틸아민, n-부틸아민, 프롤린, 오르니틴, CABS(4-(사이클로헥실아미노)-1-부탄설폰산), 트리에틸아민 등이 있다. 상기 버퍼의 농도는 25 내지 500 mM 범위에서 적절하게 선택될 수 있다. 상기 버퍼는 바람직하게 Tris일 수 있고, 상기 조성물 내에 25 내지 300 mM, 바람직하게 150 내지 250 mM로 포함될 수 있다.
상기 조성물은 추가로 거품을 억제하는 소포제가 포함될 수 있으며, 상기 소포제는 실리콘 소포제, 불용성 오일, 스테아레이트, 글리콜 등일 수 있고, 상기 조성물 내에 0 내지 1%(v/v) 포함될 수 있다. 바람직하게 상기 소포제는 실리콘 소포제이고, 상기 조성물 내에 약 0.01 % 이내 포함될 수 있다.
본 명세서 상의 “생물학적 샘플”은 핵산을 포함한 생체분자를 함유하는 시료를 의미한다. 상기 생물학적 샘플은 용액, 세포, 조직, 생검, 분말 또는 그 조합을 포함할 수 있으며, 동물이나 식물 등의 생물에서 유래한 분비물, 체액, 배설물 등일 수 있고, 토양, 물, 공기 등의 환경 샘플일 수 있으며, 그 외에도 식품, 약품, 수사 증거물, 조리시설, 의료시설, 전염병 발발 지역의 시설 등 생체분자로 오염되었거나 오염되었을 가능성이 있는 조성물이나 표면 등으로부터 채취된 것일 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 대변, 소변, 체액, 토양, 물, 공기 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 생물학적 샘플은 다양한 물질을 포함하는 복합적인 샘플이며, 특히 생물 유래의 분해 효소 등을 포함하여 보관을 위해서는 핵산의 안정화를 위한 처리가 필요하다.
상기 핵산은 DNA, RNA 및 그 조합에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게 DNA일 수 있다.
상기 조성물은 상기 핵산을 상온에서 7일 이상, 바람직하게 30일 이상, 더욱 바람직하게 60일 이상 안정하게 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 상온은 15 내지 40°C이며, 이는 일반적으로 핵산 분해 효소를 포함하는 미생물의 생명활동 내지 효소의 활성이 높거나 어느 정도 유지되는 수준의 온도이다. 일반적으로 생체분자가 포함된 샘플은 미생물의 생명활동 내지 효소의 활성이 높을수록 더 쉽게 변성, 분해될 수 있으며, 온도가 지나치게 높아지면 열에 의한 생체분자 손상이 일어날 수 있다. 후술할 실시예에서 확인한 것과 같이 본 발명에 따른 조성물은 상온에서도 최소한 30일 이상 안정적으로 핵산을 보관할 수 있는 것으로 나타났으므로, 이보다 낮은 온도, 예컨대 일반적으로 생물학적 샘플을 보관하는 4℃, -20℃, -80℃ 등의 온도에서는 그보다 장기간 안정적으로 핵산을 보관할 수 있을 것임을 예상할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면은 전술한 조성물; 및 재밀봉이 가능한 용기를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 추가로 생물학적 샘플을 상기 용기로 옮기기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 면봉, 스패츌러(spatula) 또는 스푼 등일 수 있다. 그 외에도, 추가로 샘플을 균질화할 수 있는 수단이나 상기 키트의 사용 지침 등이 포함될 수 있다. 상기 키트에 포함된 구성요소 중 샘플과 닿는 것은 멸균상태로 제공되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일측면은 전술한 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출 방법을 제공한다. 상기 혼합시에는 상기 조성물과 생물학적 샘플이 최대한 균질화(homogenize)되도록 해야 한다. 상기와 같이 상기 조성물과 혼합된 생물학적 샘플 내 핵산은 후술할 실시예에서 확인할 수 있듯이 상온에서도 안정적으로 30일 이상 유지될 수 있으며, 추가적인 추출 및 정제 단계 없이도 핵산 분석 등에 이용되어 신뢰할 만한 결과를 낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면은 전술한 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하여 제1혼합물을 수득하는 단계; 및 상기 제1혼합물을 분석하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법을 제공한다.
상기 방법은 추가로 핵산을 추출, 정제하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 추가로 핵산 추출 및 정제 단계를 포함시켜 불순물을 제거하는 효과를 얻을 수 있으나, 이 경우 핵산이 일부 소실될 수 있다.
상기 분석은 정량, 검출, 유전형 분석 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 정량은 샘플 내 핵산의 양을 확인하는 것으로 대표적으로 260 nm에서의 흡광도나 형광표지 후 측정하는 방법이 이용될 수 있다. 검출은 샘플 내 핵산의 유무를 확인하는 것으로, 일반적으로는 특정 서열을 포함하는 핵산 유무를 확인(동정)하며, 이때 검출은 혼성체화(hybridization) 기반의 방법, 서열 특이적 증폭 기반의 방법 또는 그 조합을 통해서 통상적으로 이루어질 수 있다. 유전형 분석은 관심 유전자의 유전자 차이를 밝히는 것으로, 이는 번역 구간 또는 비번역 구간의 결실, 단일염기변이, 반복서열의 반복수, 전체 서열 등 서열의 변화를 확인할 수 있는 방법을 선택하여 진행할 수 있다.
상기 분석은 PCR 기반의 방법, NGS, 마이크로어레이, ChIP(chromatin immunoprecipitation), 핵산지문법(nucleic acid fingerprinting), 서던블롯(southern blot) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 분석과 관련된 방법은 다양한 문헌에서 다루고 있으며(예컨대, Keer & Birch(2008), “of nucleic acid analysis: a robust approach”& “”“Diagnostic molecular biology” 이 분야의 통상의 기술자가 목적(예컨대 정량, 검출, 유전형 분석)과 구체적인 관심사항에 따라 선택, 조합할 수 있는 사항이므로, 이에 대한 설명은 생략한다.
상기 분석은 메타게놈 분석인 것을 특징으로 할 수 있다. 군유전체 또는 메타게놈(metagenome)은 특정 샘플 내 모든 유전물질로, 해당 샘플에 존재하는 바이러스, 박테리아, 균류(fungi) 등 모든 종으로부터 유래한 유전물질 또는 관심 생물군에 속하는 모든 종으로부터 유래한 유전물질을 의미할 수 있다. 메타게놈 분석은 예컨대 장내 미생물군(gut microbiome), 즉 장내 미생물의 프로파일을 동정하는 것일 수 있으며, 환경단위 내 생물 다양성(biodiversity)을 밝히기 위한 것일 수 있다.
장내 미생물군 동정은 일반적으로 원핵생물(prokaryote)을 관심사로 하는 경우가 많으며, 이 경우 이들에 공통적으로 존재하는 기본 번역체인 리보솜에 포함되는 16S rRNA 유전자 분석을 포함할 수 있다. 장내 미생물군 동정을 위해서는 샘플을 직장에서 직접 채취(장액 흡입, 점막 생검 등)할 수 있고, 대변을 채취하여 샘플로 이용할 수 있다.
상기 메타게놈 분석은 포유동물 유래 샘플, 예컨대 인간 유래 샘플에 대하여 진행할 수 있다.
<실시예 1. 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물의 제조>
생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물을 킬레이트화제로 EDTA, 이온성 계면활성제 도데실 황산 나트륨(SDS), 비이온성 계면활성제로 Tween 20를 포함하도록 하여 하기 표 1과 같은 조성으로 제조하였다. 이때, 상기 조성물의 pH는 NaOH (sodium hydroxide)를 이용하여 9로 조정하였다.
성분 용량
Tween 20 12.5 부피%
sodium dodecyl sulfate (SDS) 0.5 부피%
Ethanol 20 부피%
Tris 200 mM
EDTA 200 mM
<실시예 2. 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물의 대변 샘플에의 적용>
공여자의 대변 샘플을 면봉을 이용하여 약 200 mg 채취한 후 실시예 1에 따른 조성물 3 ml에 접촉시킨 후 큰 덩어리가 보이지 않을 정도로 혼합하여 균질화하였다. 이때, 상기 샘플은 소변이나 변기 물이 섞이지 않도록 채취하였으며, 조성물과 혼합된 상기 샘플은 상온에서 보관하였다.
<실시예 3. 핵산 안정화 또는 추출용 조성물과 혼합된 생물학적 샘플의 16S rRNA 유전자 증폭 PCR>
실시예 2에 따라 조성물과 혼합된 샘플은 직접, 물에 희석하여, 또는 추가로 추출 및 정제한 후에 하기 표 2와 같은 16S rRNA 유전자의 증폭용 PCR 반응액 20 μl 내에 2 μl가 되도록(표 2의 template) 포함시키고, 이렇게 제조된 반응액을 표 3과 같은 조건으로 반응시켰다.
시약 양
template 2 μl
5X PCR Buffer 4 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each) 1.6 μl
Polymerase 0.4 μl
Forward primer (10 pmol/μl) 1 μl
Reverse primer (10 pmol/μl) 1 μl
초순수 10 μl
총량 20 μl
온도 시간 Cycle
95℃ 30 sec 1 cycle
95℃ 10 sec 30 cycles
55℃ 30 sec
72℃ 1 min
72℃ 5 min 1 cycle
4℃ Hold -
<실시예 4. 핵산 안정화 또는 추출용 조성물과 혼합된 생물학적 샘플에 대한 NGS 분석>
실시예 2에 따른 조성물과 혼합된 대변 샘플은 상온에서 보관하다 직접, 물에 희석하여, 또는 추가로 추출 및 정제한 후에 실시예 3에 따라 PCR 후 NGS (next generation sequencing) 라이브러리를 제작한 다음, Nextseq 550Dx 장비를 이용하여 분석하였다. 최종적으로 공여자 대변 샘플 내 미생물 프로파일을 정성적으로 분석할 수 있는 alpha rarefaction 분석법을 이용하여 각 조건에서 공여자 대변 샘플 내 검출된 미생물 개수를 확인하고, 비유사성을 Bray-Curtis dissimilarity 분석을 통해 정량화하여 확인하였다.
<실시예 5. 본 발명에 따른 조성물의 pH가 샘플 내 핵산에 미치는 영향 확인>
표 1의 조성물의 pH를 NaOH를 이용하여 8, 9, 9.5 및 10으로 하여 제조한 후, 각 조성물에 실시예 2에 따라 공여자의 대변 샘플을 혼합하여 균질화하였다. 이렇게 혼합된 샘플을 최종 희석 배율이 1:1000이 되도록 표 2와 같은 PCR 반응액에 직접 혼합하고, 이를 표 3에 따라 증폭시킨 후, 아가로즈 젤에 로딩하여 전기영동한 결과가 도 1과 같았다. 즉, 실험한 모든 pH에서 16S rDNA 증폭이 정상적으로 일어난다는 것을 확인하였다. 이는 상기 pH에서 본 발명의 조성물이 유사한 수준으로 샘플 내 핵산을 안정적으로 유지하고 추출해낼 수 있음을 의미한다. 또한, PCR 반응에서 pH는 비정상적인 반응을 유도할 수 있으나, PCR 전 충분히 희석되어 반응에 영향을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플 및 시판 대변 핵산 추출 키트로 정제한 샘플 유래 핵산의 16S rRNA 유전자 증폭 PCR 결과 비교>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 추후 핵산 분석에 사용될 수 있는지 추가로 확인하기 위해, 상기 혼합된 샘플과, 시판 대변 핵산 추출 키트를 이용하여 동일한 대변 샘플로부터 추출한 핵산에 대해 16S rRNA 유전자 증폭 PCR을 수행하였다. 이때, 시판 대변 핵산 추출 키트는 QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen) 이었으며, 이를 이용하여 제조사 지침에 따라 대변 샘플로부터 핵산을 추출하였다.
본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 혼합된 대변 샘플을 직접 1:1000으로 PCR 반응물에 희석한 경우와 시판 대변 핵산 추출 키트로부터 얻은 핵산(4 ng)을 PCR 반응물에 포함시킨 경우에 대해 각각 실시예 3과 같이 16S rRNA 유전자 증폭 PCR을 수행하고, 각 PCR 결과물을 젤에 로딩 후 전기영동하여 확인한 결과는 도 2와 같았으며, 본 발명의 조성물을 사용한 경우와 시판 대변 핵산 추출 키트를 사용한 경우 모두 16S rRNA 유전자를 충분히 특이적으로 증폭시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 7. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플 및 시판 대변 핵산 추출 키트로 정제한 샘플 유래 핵산의 NGS 분석 결과 비교>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 추후 핵산 분석에 사용될 수 있는지 추가로 확인하기 위해, 상기 혼합된 샘플과, 시판 대변 핵산 추출 키트를 이용하여 동일한 대변 샘플로부터 추출한 핵산에 대해 각각 NGS를 이용해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일을 얻고, 이에 대해 alpha rarefaction 분석하였다. 이때, 시판 대변 핵산 추출 키트는 QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen) 이었으며, 이를 이용하여 제조사 지침에 따라 대변 샘플로부터 핵산을 추출하였다.
본 발명의 실시예1에 따른 조성물에 혼합된 대변 샘플을 직접 1:100 및 1:1000으로 희석한 경우와 시판 대변 핵산 추출 키트로부터 얻은 핵산(4 ng 및 10 ng)에 대해 각각 NGS를 이용해 얻은 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일에 대해 alpha rarefaction 분석한 결과는 도 3과 같았으며, 본 발명의 조성물을 사용한 경우와 시판 대변 핵산 추출 키트를 사용한 경우 모두 사용된 핵산량에 비례하여 검출되는 미생물 프로파일의 정성적 결과의 변화 경향이 유사하게 나타난다는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 조성물에 혼합된 대변 샘플을 직접 PCR 반응액에 혼합한 결과 희석 배율이 높아질수록 검출되는 미생물 프로파일의 결과가 감소되는 양상을 확인할 수 있었다. 좀더 상세하게, depth에 따른 alpha rarefaction 수치를 확인한 결과, 기존 키트로 추출한 핵산 4 ng와 본 발명의 조성물에 혼합된 대변 샘플을 직접 1/1000로 희석하여 NGS 분석한 결과가 서로 거의 동일하고, 기존 키트로 추출한 핵산 10 ng와 본 발명의 조성물에 균질화한 샘플을 직접 1/100로 희석하여 NGS 분석한 결과가 서로 거의 동일하게 나타났다. 이는 동일한 대변 샘플 내의 미생물 프로파일 중 검출된 미생물의 종 수는 시판 대변 핵산 추출 키트를 이용하여 추출한 핵산과 본 발명의 조성물에 균질화한 샘플 간의 차이가 없다는 것을 의미한다. 이를 통해, 본 발명의 조성물은 생물학적 샘플과 혼합 후 추가적인 핵산의 추출 및 정제 과정 없이도 샘플로부터 핵산을 바로 추후 분석이 가능한 수준으로 추출할 수 있음을 추가로 확인할 수 있다.
<실시예 8. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플(직접, 또는 추가 추출 및 정제 후) 및 기존 대변 핵산 안정화 키트에 보관 후 추가 추출 및 정제한 샘플 유래 핵산의 16S rRNA 유전자 증폭 PCR 결과 비교>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 핵산을 안정적으로 보존하는지, 추후 핵산 분석에 사용될 수 있는지 추가로 확인하기 위해, 상기 본 발명에 따른 조성물에 혼합 후 1, 4 및 7일 간 상온에 보관한 샘플 또는 해당 샘플을 추가로 핵산 추출 키트를 이용하여 추출한 핵산과, 동일한 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 각 동일 기간 보관 후 핵산 추출 키트를 이용하여 추출한 핵산(대조군)에 대해 각각 실시예 3과 같이 16S rRNA 유전자 증폭 PCR을 수행하고, 그 PCR 산물을 각각 젤 전기영동하여 확인하였다. 이때, 기존 대변 핵산 안정화 키트는 OMNIgene® (Cat. No. OM-200, DNA Genotek), 핵산 추출 키트는 QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen) 이었다.
그 결과는 도 4와 같이 모든 경우 표적 유전자인 16S rRNA 유전자가 올바르게 증폭되었다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명에 따른 조성물을 이용한 경우, 본 발명에 따른 조성물에 혼합한 샘플을 직접 PCR 반응물에 이용한 경우와 이를 추가로 핵산 추출 키트를 이용하여 추출 및 정제한 핵산을 PCR 반응물에 이용한 경우 모두 표적 유전자를 충분히 특이적으로 증폭할 수 있는 것으로 나타나, 본 발명의 조성물에 보관된 샘플은 추가적인 핵산의 추출 및 정제 없이도 충분히 핵산 분석에 이용될 수 있음을 확인할 수 있다.
<실시예 9. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플 상온 보관 후 NGS 분석 결과의 재현성 확인>
본 발명에 따른 조성물을 이용한 결과가 안정적으로 재현되는지 확인하기 위하여 동일한 공여자로부터 채취한 동일한 대변 샘플을 실시예 2에 따른 조성물과 혼합하여 균질화한 다음 상온에서 7일 보관 후 직접 실시예 3에 따라 PCR 반응액에 투여하여 PCR하고, 반응물을 이용하여 NGS (next generation sequencing) 라이브러리를 제작한 다음, Nextseq 550Dx 장비를 이용하여 분석하는 과정을 각각 10회 진행하였다. 이렇게 얻은 미생물 프로파일 10건을 상관분석(correlation analysis) 방법으로 분석한 결과, 상관계수가 0.9357 (95% CI: 0.8833-0.9881)로 나타나, 결과 간 유사성이 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 조성물 및 이를 이용한 방법으로부터 재현성 높은 핵산 분석 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
<실시예 10. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플 및 기존 대변 핵산 안정화 키트에 보관 후 추가 추출 및 정제한 샘플 유래 핵산의 NGS 분석 결과 비교>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 핵산을 안정적으로 보존하는지, 추후 핵산 분석에 사용될 수 있는지 추가로 확인하기 위해, 상기 혼합 후 7일 간 상온에 보관한 샘플과 동일한 대변 샘플을 기존 대변 핵산 안정화 키트에 7일 보관 후 핵산 추출 키트를 이용하여 추출한 핵산에 대해 각각 NGS를 이용해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일을 얻고, 이에 대해 alpha rarefaction 분석하였다. 이때, 기존 대변 핵산 안정화 키트는 OMNIgene® (Cat. No. OM-200, DNA Genotek), 핵산 추출 키트는 QIAamp PowerFecal Pro DNA kit (Cat. No. 51804, Qiagen) 이었으며, 이를 순서대로 제조사 지침에 따라 이용하여 대변 샘플을 상온에 7일 보관 후 이로부터 핵산을 추출하였다.
분석 결과는 도 5와 같이 동일 샘플을 동일 기간(7일) 보관했을 때 본 발명의 조성물과 기존 대변 핵산 안정화 키트가 유사하게 나타나, 본 발명의 조성물이 대변 샘플 내에 포함된 핵산을 최소한 7일 이상 안정적으로 보관할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 조성물은 기존 대변 핵산 안정화 키트에 비해 추가적인 핵산 추출 및 정제 과정 없이 핵산을 추출할 수 있으며, 이렇게 추출된 핵산은 추후 핵산 분석 시 충분히 신뢰할 수 있는 결과물을 도출할 수 있다는 것 또한 확인할 수 있었다.
<실시예 11. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플의 사용 방법에 따른 16S rRNA 유전자 증폭 PCR 결과 비교>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플을 직접 PCR 반응액에 첨가하여 최종 희석 배율이 되도록 하는 경우와 미리 물에 희석 후 PCR 반응액에 최종 희석 배율이 되도록 하는 경우, 핵산 분석 결과에 차이가 있는지 확인해보았다. 이때, 상기 혼합된 샘플은 상온에서 7일 간 보관한 것을 사용하였으며, 최종 희석 배율은 1:100, 1:1000 및 1:10000으로 하였고, 각각 실시예 3과 같이 PCR 반응을 진행하였으며, 물에 희석하는 경우 멸균된 물을 사용하였다.
그 결과는 도 6과 같이 모든 조건에서 표적 유전자인 16S rRNA 유전자가 올바르게 증폭되었다는 것을 확인할 수 있었으며, 물에 희석시키는 단계를 추가로 포함하는가 여부에 관계없이 희석 비율과 특이적 증폭 밴드의 강도 간 상관 관계를 가지는 것으로 나타났다.
<실시예 12. 본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플(직접, 또는 추가 추출 및 정제 후) 및 기존 대변 핵산 안정화 키트에 보관 후 추가 추출 및 정제한 샘플 유래 핵산의 보관 기간별 NGS 분석 결과 비교>
본 발명에 따른 조성물에 균질화한 샘플이 핵산을 안정적으로 보존하는지 추가로 확인하기 위해 1, 4, 7 및 30일 간 보관 후 직접 또는 추가 추출 및 정제 후 수득된 핵산에 대하여 각각 NGS를 이용해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일을 얻었다. 이를 기존 대변 핵산 안정화 키트에 각 기간별로 보관된 대변 샘플을 핵산 추출 키트로 추출 및 정제하여 얻은 핵산으로부터 각각 얻은 결과와 함께 Bray-Curtis dissimilarity 분석하였다. 단, 30일 보관 후의 결과는 다른 보관 기간의 경우와 다른 샘플을 사용하여 미생물 프로파일이 다른 바, 다른 일자의 결과와 함께 분석할 수 없어 30일 보관 후 결과는 따로 분석하였다.
그 결과는 도 7과 같이, 본 발명에 따른 조성물의 사용 여부나 추가 핵산 추출 및 정제 단계의 포함 여부와 관계없이 유사한 것으로 나타났다. 즉, 1, 4 및 7일 보관 후 수득된 결과는 모두 유사 그룹에 속하는 것으로 나타났으며, 30일 보관 후 수득된 결과 역시 서로 모두 유사 그룹으로 묶을 수 있었다.
<실시예 13. 본 발명에 따른 조성물의 조성 변화 시 NGS 분석 결과 비교>
이온성 및 비이온성 계면활성제를 모두 포함하고 있는 본 발명의 조성물에서 비이온성 계면활성제를 제거했을 때 핵산 분석 결과에 어떤 영향이 있는지 알아보기 위해, 표 1에서 TWEEN 20를 제외한 조성물을 제조하고, 여기에 대변 샘플을 혼합하여 균질화하고 7일간 상온에서 보관한 다음, 상기 샘플을 직접 또는 그로부터 추가로 핵산 추출 키트를 이용한 핵산 추출 및 정제 후 각각 NGS를 이용해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 프로파일을 얻었다.
1) 상기 미생물 프로파일 결과를 동일 기간 단독 보관한 대변 샘플, 표 1의 조성물에 혼합, 보관된 대변 샘플 또는 그로부터 추가 추출 및 정제 과정을 거쳐 얻은 핵산, 및 기존 대변 핵산 안정화 키트에 보관된 대변 샘플을 핵산 추출 키트로 추출 및 정제하여 얻은 핵산으로부터 각각 얻은 미생물 프로파일 결과와 함께 Bray-Curtis dissimilarity 분석하였다.
그 결과는 도 8과 같이, 본 발명에 따른 조성물을 사용한 두 경우와 기존 대변 핵산 안정화 키트를 사용한 경우는 모두 유사한 그룹에 속하는 것으로 나타났으나, 비이온성 계면활성제인 TWEEN 20가 제외된 조성물을 사용한 경우 미생물 프로파일에 차이가 발생하여 앞선 유사 그룹에 함께 묶이지 않았고, 추가로 대변 샘플을 상온에서 그대로 보관할 경우 미생물 프로파일 차이가 더욱 크게 나타남을 확인할 수 있었다.
2) 추가로, 상기와 같은 차이가 어떤 방향으로 나타나는지 확인하기 위하여 상기 미생물 프로파일 중 본 발명에 따른 조성물 및 표1의 조성에서 TWEEN 20을 넣지 않은 조성물을 사용하여 각각 직접 NGS 분석한 결과에 대하여 alpha rarefaction 분석하였다. 그 결과 도 9와 같이, TWEEN 20가 제외된 조성물을 사용한 경우 미생물 프로파일이 감소한 것으로 나타나, 이온성 및 비이온성 계면활성제를 모두 포함한 본 발명에 따른 조성물이 핵산을 안정적으로 보존하고 잘 추출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 킬레이트화제, 이온성 계면활성화제 및 비이온성 계면활성화제를 포함하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 킬레이트화제는 상기 조성물 내에 100 내지 300 mM 포함되고,
    에틸렌디아민트리아세트산(EDTA), 1,2-사이클로헥산디아민 테트라아세트산 (CDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산 (DOTA), 테트라아자사이클로테트라데칸테트라아세트산 (TETA), 데스페리옥시민, 이들의 킬레이터 유사체 또는 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 0.1 내지 5 %(v/v) 포함되고,
    도데실 황산 나트륨(SDS), 라우릴 황산나트륨(SLS) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비이온성 계면활성제는 상기 조성물 내에 5 내지 15 %(v/v) 포함되고,
    폴리소르베이트 20 (TWEEN 20), 폴리소르베이트 40 (TWEEN 40), 폴리소르베이트 60 (TWEEN 60), 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80), 옥실페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100), 이들의 유사체 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 pH가 7 내지 11인 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 대변, 소변, 체액, 토양, 물, 공기 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA 및 그 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 핵산을 상온에서 30일 이상 안정하게 유지하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물.
  9. 제1항의 조성물; 및
    재밀봉이 가능한 용기를 포함하는,
    생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 키트는 추가로 생물학적 샘플을 상기 용기로 옮기기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 키트.
  11. 제1항의 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하는 단계를 포함하는,
    생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출 방법.
  12. 제1항의 조성물과 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 혼합하여 제1혼합물을 수득하는 단계; 및
    상기 제1혼합물을 분석하는 단계를 포함하는,
    생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 방법은 추가로 핵산을 추출, 정제하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 분석은 정량, 검출, 유전형 분석 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 분석은 PCR 기반의 방법, NGS, 마이크로어레이, ChIP(chromatin immunoprecipitation), 핵산지문법(nucleic acid fingerprinting), 서던블롯(southern blot) 및 그 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 분석은 메타게놈 분석인 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플 내 핵산의 분석 방법.

KR1020210192225A 2021-12-30 2021-12-30 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법 KR20230102252A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210192225A KR20230102252A (ko) 2021-12-30 2021-12-30 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210192225A KR20230102252A (ko) 2021-12-30 2021-12-30 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230102252A true KR20230102252A (ko) 2023-07-07

Family

ID=87155067

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210192225A KR20230102252A (ko) 2021-12-30 2021-12-30 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230102252A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6652692B2 (ja) 核酸保存溶液ならびに製造方法および使用方法
RU2717644C2 (ru) Способ, композиция и набор для стабилизации дезоксирибонуклеиновых кислот в биологических образцах
WO2010134246A1 (ja) 核酸含有試料の調製方法
WO2010024251A1 (ja) 糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液、及び採便用キット
WO2010064634A1 (ja) 糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液、及び採便用キット
CN109971749A (zh) 用于从生物样品中采集和分离核酸的组合物和方法
de Vargas Wolfgramm et al. Simplified buccal DNA extraction with FTA® Elute Cards
CN111378719A (zh) 用于保存人类唾液中核酸完整性的试剂组合物和方法
CN108949748B (zh) 一种痰液液化及核酸保护试剂
CN112725406A (zh) 一种免核酸提取的灭活型病毒保存液及其应用
JP5710969B2 (ja) 糞便試料からの核酸回収方法
WO2010064628A1 (ja) 核酸含有試料の調製方法、試料調製用溶液、及び核酸の解析方法
KR101777168B1 (ko) 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물 및 이의 용도
Nieves‐Colón et al. Ancient DNA analysis of archaeological remains
JP2006087394A (ja) 核酸抽出方法および核酸抽出キット
WO2007049326A1 (ja) 核酸抽出方法および核酸抽出キット
KR20230102252A (ko) 생물학적 샘플 내 핵산의 안정화 또는 추출용 조성물 및 이를 이용한 방법
WO2010134245A1 (ja) 哺乳細胞由来核酸の回収方法、核酸解析方法、及び採便用キット
EP4188082A1 (en) Aqueous solution to preserve nucleic acids
CN115397453A (zh) 用于检测病毒核酸的产品和方法
JP5377298B2 (ja) 輸送培地に曝露した組織、細胞、またはウイルスから増幅可能な核酸を取得するための方法および組成物
JP2004201558A (ja) Ｄｎａ遊離方法
JP4092139B2 (ja) 核酸抽出法
WO2007116450A1 (ja) 核酸抽出方法及び核酸抽出キット
AU2013205379A1 (en) Methods and compositions for obtaining amplifiable nucleic acids from tissues, cells, or viruses exposed to transport media

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal