KR20040007620A - 핵산 증폭 또는 검출용 시약의 안정화 방법 및 보존 방법 - Google Patents

핵산 증폭 또는 검출용 시약의 안정화 방법 및 보존 방법 Download PDF

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Abstract

키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 샘플중 표적 핵산을 고감도로 특이적으로 증폭시키기 위한 반응 시약을 안정화시키는 방법 및 장기간동안 보존하는 방법 및 병원성 미생물 및 바이러스를 고감도로 검출하는 방법.

Description

핵산 증폭 또는 검출용 시약의 안정화 방법 및 보존 방법{Method of stabilizing reagent for amplifying or detecting nucleic acid and storage method}
DNA 합성은 유전 공학분야의 검토에서 다양한 목적으로 사용된다. 단쇄 DNA(예: 올리고뉴클레오티드)의 합성을 제외한 대부분의 DNA 합성은 DNA 폴리머라제를 사용하는 효소적 방법에 의해 수행된다. 상기 방법의 예는 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202호, 및 4,800,159호에 상세히 기재된 중합효소 연쇄반응(PCR)이다. 또다른 예는 (Trends in Biotechnology, 10:146-152(1992))에 기재된 역전사 효소 반응의 배합인 역전사-PCR 방법이다.
또한, 유럽 특허 제 320,308 호에 기재된 리가아제 연쇄반응(ligase chain reation(LCR)) 방법 또는 문헌(PCR Protocols, Academic Press Inc., 1990, pp.245-252)에 기재된 전사-기초 증폭 시스템(transcription-based amplication system(TAS))을 사용할 수 있다. 상기 언급된 4개의 방법은 다음 증폭 사이클을 위한 싱글-스트랜드 표적 분자를 재생시키기 위해 고온 및 저온에서 반응을 여러 차례 반복시키는 것을 필요로 한다. 상기 기재된 바와 같이 반응은 온도에 의해 제한되기 때문에 반응 시스템은 불연속 상 또는 사이클을 사용하여 수행되어야 한다. 따라서, 상기 방법들은 시간동안 광범위한 범위의 온도를 엄격히 조정할 수 있는 고가의 열 싸이클러(thermal cycler)의 사용을 필요로 한다. 또한, 반응은 두개 또는 3개의 예정된 것으로 온도를 조정하기 위한 시간을 필요로 한다. 사이클 수에 비례하여 낭비되는 시간은 증가한다.
상기 문제점을 해결하기 위해 등온에서 수행될 수 있는 핵산 증폭 방법이 개발되었다. 그의 예는 JP-B 7-114718호에 기재된 스트랜드 치환 증폭(SDA) 방법, 자립복제(self-sustained sequence replicaiotn(3SR)) 방법, 일본 특허 제 2650159 호에 기재된 핵산서열 기초 증폭(NASBA) 방법, 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification(TMA)) 방법, 일본 특허 제 2710159호에 기재된 Qβ레플리카아제(replicase) 방법 및 미국 특허 제 5,824,517 호, WO 99/09211, WO 95/25180 및 WO 99/49081에 기재된 다양한 개량 SDA 방법을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 등온 효소적 합성 방법은 미국 특허 제 5,916,777호에 기재되어 있다. 등온 핵산 증폭 또는 올리고뉴클레오티드의 합성 방법의 반응에서 프라이머로부터의 신장 및/또는 프라이머로부터의 신장전에 수행되는 프라이머의 싱글-스트랜드 신장 산물(원 표적 서열)에의 어닐링은 등온에서 인큐베이션된 반응 혼합물중에서 동시에 수행된다.
등온 핵산 증폭 방법중에서, SDA 방법이 DNA를 최종적으로 증폭시키는 시스템의 한 예이다. SDA 방법은 DNA 폴리머라제 및 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여더블 스트랜드를 치환하여 샘플중에서 핵산 서열(및 그의 상보적 스트랜드)를 증폭시키는 방법이다. 상기 방법은 증폭용 4개의 프라이머를 필요로 하고, 이중 2개는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하도록 작제되어야 한다. 이 방법은 DNA를 대량으로 합성하기 위해 기질로서 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다. 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 예는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황 원자(S)로 치환된 (α-S) 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트이다. 예를 들면, 유전자 시험을 위해 상기 반응을 항상(routinely) 수행하는 경우, 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용과 관련된 러닝코스트(running cost) 문제는 심각하다. 또한, 예를 들면, 제한 효소 단편 장다형(restriction enzyme fragment length polymorphism(RELP)) 분석시, 본 발명에서 (α-S) 데옥시리보클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드를 증폭된 DNA 단편에 도입시킴으로써 제한 효소를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 절단하는 것을 생략할 수 있다.
미국 특허 제 5,824,517 호에 기재된 바와 같은 개량 SDA 방법은 RNA 및 DNA로 구성되고 필수 요소로서 DNA가 적어도 3'-말단에 위치한 구조를 갖는 키메라성 프라이머를 사용하는 DNA 증폭 방법이다. WO 99/09211에 기재된 바와 같은 개량 SDA 방법은 5'-팽창형의(Protruding) 단(end)을 제조하는 제한 효소의 사용을 필요로 한다. WO 95/25180에 기재된 개량된 SDA 방법은 적어도 두쌍의 프라이머의 사용을 필요로 한다. WO 99/49081에 기재된 개량된 SDA 방법은 적어도 2쌍의 프라이머 및 적어도 하나의 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용을 필요로한다. 한편, 미국 특허 제 5,916,777호에 기재된 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 3'-말단에 리보뉴클레오티드를 갖는 프라이머를 사용하여 DNA를 합성하고, 프라이머를 사용하여 반응을 종결시키고, 프라이머-신장된 스트랜드중의 프라이머 및 신장된 스트랜드 사이에 엔도뉴클레아제로 닉(nick)를 도입하여 그들을 분리하고, 주형을 분해하고 그것을 재사용하기 위해 프라이머를 회수하는 것을 포함한다. 본 발명에서 반응 시스템으로부터 프라이머를 분리한 후 그것을 주형에 다시 어닐링하여 프라이머를 재사용하는 것이 필요하다. 또한, WO 00/28028에 기재되어 있는 루프-매개 등온 증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplificatin(LAMP))는 증폭을 위해 4개의 프라이머를 필요로 하고 상기 방법을 사용하여 증폭된 산물은 증폭을 위한 표적 부위가 반복된 다양한 크기를 갖는 DNA 이다.
추가로, WO00/56877 또는 WO02/7139에 기술된 바와 같은 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 사용하는 등온 핵산 증폭 방법, 이소터말 앤드 키메라 프라이머-이니시에이트 앰플리케이션 오브 뉴클레익 엑시드(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids(ICAN)) 방법이 공지되어 있다.
상기 방법을 위해 사용되는 다수의 반응 시약은 실온에서 불안정하기 때문에 대부분의 경우 공정하는 동안 시약을 얼음 냉각시키면서 사용한다. 추가로, 대부분의 반응 시약은 4℃ 이하, 또는 -20℃ 이하에 보존되어야 하기 때문에 보존 방법에 특히 주의를 기울여야 한다. 따라서, 보존용 냉장고 또는 냉각기를 필요로 하지 않고 반응 시약을 실온에서 장기간동안 안정시키고 보존하는 방법이 요구되고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 샘플중 표적 핵산을 고감도로 특이적으로 증폭시키는 표적 핵산 증폭 방법용 반응 시약의 안정화 방법 및 장기간 보존 방법, 및 병원성 미생물 또는 바이러스의 고감도 검출 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
집중적으로 검토한 결과, 본 발명자는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제의 존재하에 관심의 대상이 되는 DNA 부위를 증폭시키는 방법을 사용하는 바이러스 또는 병원성 미생물의 고감도 검출 방법을 발견하였다. 본 발명자들은 추가로, 관심의 대상이 되는 DNA 부위를 증폭시키는 방법을 위한 시약을 안정화시키고 장기간 보존하는 방법을 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명은 완성되었다.
본 발명의 제 1면은
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(b) 반응 산물을 생성시키기 위해 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭시키는 것을 포함하고,
(i) 마그네슘 염, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 효소(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 시약 성분을 반응전에 다른 시약 성분으로부터 분리시키고;
(ii) 효소(들)를 포함하는 시약 용액중 효소 농도(들)는 증가시키지만, 상기 용액중 염 농도는 증가시키지 않고, 시약 용액을 서로 혼합한 후 증폭 단계를 위한 염의 농도가 최적이 되도록 또다른 시약 용액중 염 농도를 조절하는, 표적 핵산 증폭 및/또는 검출 방법에 사용하기 위한 반응 시약을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
제 1면에 따라, 반응 시약은 하기 2개의 시약 용액으로 구성될 수 있다: 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 시약 용액; 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H) 및 마그네슘 염을 포함하는 시약 용액을 사용할 수 있다. 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 염 농도는 증폭 단계를 위한 최적의 염 농도와 동일하거나 그보다 낮을 수 있다. 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 효소(들)의 농도는 증폭 단계를 위한 효소(들) 농도보다 높을 수 있다. 분리된 시약 용액을 서로 혼합한 후 증폭 단계를 위한 염의 농도가 최적이 되도록 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 효소(들)의 농도를 조절한다.
본 발명의 제 2면은
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(b) 반응 산물을 생성시키기 위해 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭시키는 것을 포함하고,
(i) 마그네슘 염, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 효소(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 시약 성분을 반응전에 다른 시약 성분으로부터 분리시키고;
(ii) 효소(들)를 포함하는 시약 용액중 효소 농도(들)는 증가시키지만, 상기 용액중 염 농도는 증가시키지 않고, 시약 용액을 서로 혼합한 후 증폭 단계를 위한 염의 농도가 최적이 되도록 또다른 시약 용액중 염 농도를 조절하는, 표적 핵산 증폭 및/또는 검출 방법에 사용하기 위한 반응 시약의 키트에 관한 것이다.
제 2면에 따라, 반응 시약은 하기 2개의 시약 용액으로 구성될 수 있다: 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 시약 용액; 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H) 및 마그네슘 염을 포함하는 시약 용액을 사용할 수 있다. 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 염 농도는 증폭 단계를 위한 최적의 염 농도와 동일하거나 그보다 낮을 수 있다. 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 효소(들)의 농도는 증폭 단계를 위한 효소(들) 농도보다 높을 수 있다. 분리된 시약 용액을 서로 혼합한 후 증폭 단계를 위한 염의 농도가 최적이 되도록 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 효소(들)의 농도를 조절한다. 키트는 분리된 시약 용액의 혼합물의 염 농도를 조절하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
본 발명의 제 3면은
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드
유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(b) 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭시킴으로써 반응 산물을 생성하고;
(c) 단계 (b)에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는
(여기에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 식으로 나타낸 병원성 미생물을 검출하기 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 병원성 미생물은 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis), HCV, 클라미디아(chlamydia), 마이코박테리움 아비움(M.avium) 컴플렉스, 고노코쿠스(gonococcus), HBV, HIV, 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcusaureus), 마이코플라스마(Mycoplasma) 및 MRSA로 구성된 그룹으로부터 선택된다:
일반식 : 5'-dNa-Nb-dNc3'
(a: 11이상의 정수이고; b: 0 또는 1이상의 정수이며 c: 0 또는 1이상의 정수이고(단, b 및 c는 동시에 0이 아니다); dN: 데옥시리보뉴클레오티드이며; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드이다(여기에서, dNa중 dNs는 Ns에 의해 치환될 수 있고, 3'-말단의 뉴클레오티드는 변형되어 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 3'-말단으로부터의 신장을 발생하지 않을 수 있다), 샘플중 병원성 미생물 및/또는 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
제 3면에 따라, 반응 혼합물은 추가로 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 4면은
(1) 서열번호:7, 8, 21, 22, 162, 163, 170 및 171로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(2) 서열번호:15, 16, 81-86 및 88-91로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HCV에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(3) 서열번호:17-20, 121-127, 130-135, 167 및 167로 구성된 그룹으로부터선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아(chlamydia)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(4) 서열번호:25-31로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코박테리움 아비움(M.avium) 컴플렉스에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(5) 서열번호:38-63, 164 및 165로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 고노코쿠스(gonococcus)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(6) 서열번호:71-78로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HBV에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(7) 서열번호:95-103로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HIV에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(8) 서열번호:108-117로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(9) 서열번호:139-146로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코플라스마(Mycoplasma)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(10) 서열번호:152-155로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 MRSA에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 병원성 미생물 및/또는 바이러스를 검출하기 위한 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 제 5면은
(1) 서열번호:11, 12 및 172로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하기 위한 프로브;
(2) 서열번호:87 및 92로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HCV을 검출하기 위한 프로브;
(3) 서열번호:128, 136 및 168로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클라미디아(chlamydia)을 검출하기 위한 프로브;
(4) 서열번호:32 및 33으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마이코박테리움 아비움(M.avium) 컴플렉스을 검출하기 위한 프로브;
(5) 서열번호:64-68로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 고노코쿠스(gonococcus)을 검출하기 위한 프로브;
(6) 서열번호:79 및 80로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV을 검출하기 위한 프로브;
(7) 서열번호:104 및 105로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HIV을 검출하기 위한 프로브;
(8) 서열번호:118 및 119로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프로브;
(9) 서열번호:147-149로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마이코플라스마(Mycoplasma)을 검출하기 위한 프로브;
(10) 서열번호:156 및 157로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MRSA을 검출하기 위한 프로브로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 병원성 미생물 및/또는 바이러스를 검출하기 위한 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 제 6면은 제 9면의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 제 3면의 병원성 미생물 및/또는 바이러스 검출 방법을 위해 사용되는 키트에 관한 것이다.
제 6면의 키트는 제 5면의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 실시간 검출을 나타낸 차트이다.
도 3은 본 발명의 방법을 위해 사용되는 시약의 보존 안정성 시험 결과를 나타낸 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸 도이다.
도 4은 본 발명의 방법을 위해 사용되는 시약의 보존 안정성 시험 결과를 나타낸 자가방사기록법을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 방법을 위해 사용되는 시약의 보존 안정성 시험 결과를 나타낸 아가로스 겔 전기영동을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 방법을 위해 사용되는 시약의 보존 안정성 시험 결과를 나타낸 아가로스 겔 전기영동을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 증폭 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동을 나타낸 도이다.
본 발명은 유전공학 및 임상의학 분야에서 유용한 표적 핵산 증폭 또는 검출용 시약의 안정화 방법 및 보존 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, 데옥시리보뉴클레오티드(또한 dN으로서 언급됨)는 당 부위가 D-2-데옥시리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 티민을 갖는 것들을 포함한다. 추가로, 데옥시리보뉴클레오티드는 또한 7-데아자구아노신과 같이 변형된 염기를 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 및 데옥시이노신 뉴클레오티드와 같은 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드(또한 N으로서 언급됨)는 당 부위가 D-리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 우라실 갖는 것들을 포함한다. 또한 리보뉴클레오티드는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황원자로 치환된(또한 (α-S)로서 언급됨) 변형된 리보뉴클레오티드와 같은 변형된 리보뉴클레오티드 또는 다른 유도체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머의3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 갖고, 본 발명의 방법에서 핵산 스트랜드를 신장시키기 위하여 사용할 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 스트랜드 치환 반응을 위해 사용될 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 3'-말단측은 예를 들면, 프라이머와 같이 핵산의 중심으로부터 3'-말단까지의 부위를 언급한다. 또한, 5'-말단측은 핵산의 중심으로부터 5'-말단까지의 부위를 언급한다.
키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다. 그러한 프라이머는 또한 변형되지 않는 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 프라이머는 주형으로서의 핵산의 일부의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머이다. 사용되는 조건하에서 DNA 스트랜드를 신장시킬 수 있다. 또한, 리보뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치한다. 프라이머는 일반적으로 증폭되는 영역의 상류, 즉, 주형으로서 핵산중에 증폭되는 부위에 대응하는 뉴클레오티드 서열의 3' 부위에 상보적으로 작제된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열"은 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서 DNA에 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하나 이상의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치할 수 있고 엔도뉴클레아제에 의해 인식되거나 절단되는 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드중 어느 하나일 수 있다. 리보뉴클레오티드는 상기 언급된 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및 변형된 리보뉴클레오티드 둘 모두를 포함할 수 있다. 변형되지 않은 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 그의 혼합물이 프라이머의 기능을 없애지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 위해 사용할 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드의 예로는 제한되는 것은 아니지만, 인산 그룹에 결합된 산소원자가 황 원자로 치환된 (α-S) 리보뉴클레오티드, 및 리보오스의 2번-위치에 하이드록시 그룹이 메톡시 그룹으로 치환된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 즉, 하나 이상의 뉴클레오티드(들)는 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 3'-말단으로부터의 중합 신장 반응시키는 프라이머의 작용이 제거되지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 포함될 수 있다. 여러 형태의 뉴클레오티드 유사체가 배합되어 사용될 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 뉴클레오티드 유사체의 예로 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드, 7-데아자구아닌과 같이 변형된 염기를 갖는 뉴클레오티드 유사체, 리보스 유사체를 갖는 뉴클레오티드 유사체 등을 포함한다. 또한 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 데옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 상기 기술된 작용을 갖는 한 표지된 화합물을 추가하는 것과 같은 다양한 변형을 갖는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 유사체를 프라이머내로 도입하는 것이 프라이머 자체의 고차 구조 형성을 억제하고 주형과의 어닐링 형성을 안정화시키는데 효과적이다. 리보클레오타이드를 동일한 방법으로 프라이머내로 도입할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, (α-S) 리보클레오타이드와 같이 변형된 리보뉴클레오타이드를 바람직하게 사용하여 비-특이 엔도뉴클레아제(RNase)에 의한 프라이머의 분해를 방지할 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 그러한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들면, 미국특허 제 5,003,097 호에 기술된 황화 반응제(Glen Research), 또는 2-OMe-RNA-CE 포스포르아미다이트제(Glen Research)를 사용하는 방법에 의해 제조된 (α-S) 리보뉴클레오티드를 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 증폭 방법에서 사용될 수 있는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 엔도뉴클레아제를 사용하는 절단에 대하여 내성을 갖도록 하기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하도록 디자인될 수 있다. 그러한 프라이머는 증폭 반응 단계동안 그것이 엔도뉴클레아제로 절단 부위를 조정할 수 있게 하는데 유용한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 길이는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게 약 12 뉴클레오티드 내지 약 100뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 약 15 뉴클레오티드 내지 약 40 뉴클레오티드이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서 핵산에 어닐링할 수 있도록 실질적으로 주형으로서 핵산과 상보적인 것이 바람직할 수 있다. 프라이머는 하기에 기재된 단계에서 사용되는 엔도뉴클레아제에 의해 3'-말단 또는 3'-말단측에서 인식되는 서열을 포함한다.
예를 들면, 하기 일반식으로 표시되는 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 DNA 합성 방법에서 프라이머로서 사용할 있지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 것은 아니다:
일반식 : 5'-dNa-Nb-dNc3'
(a: 11이상의 정수이고; b: 0 또는 1이상의 정수이며 c: 0 또는 1이상의 정수이고(단, b 및 c는 동시에 0이 아니다); dN: 데옥시리보뉴클레오티드이며; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드이다(여기에서, dNa중 dNs는 Ns에 의해 치환될 수 있고, 3'-말단의 뉴클레오티드는 변형되어 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 3'-말단으로부터의 신장을 발생하지 않을 수 있다).
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 엔도뉴클레아제가 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 포함하는 위치에서 DNA 폴리머라제(프라이머-신장 스트랜드)를 사용하여 프라이머로부터 신장된 DNA 스트랜드를 인식하거나 절단하는 구조를 갖는다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만 예를 들면, 주형으로서 핵산에 어닐링된 일반식에 의해 표시된 키메라성올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA에 RAas H를 작용시키는 경우, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 리보뉴클레오티드 부위에서 절단된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 신장에 의해 합성된 DNA 스트랜드 사이에 닉(nick)이 도입된 더블-스트랜드가 제조된다. 이어서, 닉 부위로부터 DNA 폴리머라제로 스트랜드 치환 반응을 수행한다. 따라서, 프라이머의 3'-말단으로부터 핵산 스트랜드를 신장시키기 위해 사용될 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 그것과 함께 DNA 폴리머라제로 스트랜드 치환시킬 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 추가로, 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 3'-말단이 변형되어 DNA 폴리머라제에 작용에 의한 신장은 발생하지 않고 DNA 신장은 엔도뉴클레아제에 의한 절단시 생성된 3'-말단으로부터 발생하는 것을 포함한다.
추가로, RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열은 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'-말단측상에 포함될 수 있다. 그러한 RNA 폴리머라제은 T7 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제에 의해 예시된다.
예를 들면, 포스포르아미다이트 방법에 따라 어플라이드 바이오시스템사(Appliced Biosystems Inc. (ABI))의 394형 DNA 합성기를 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어느 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성할 수 있다. 또한, 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법 및 티오포스포네이트 방법을 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성할 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이 주형으로서 핵산에 어닐링되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA상에 작용하고 스트랜드를 치환시키기 위해 신장된 스트랜드를 절단하는 효소를 본 발명에서 사용할 수 있다. 즉, 효소는 더블-스트랜드 DNA의 키메라성 올리보뉴클레오티드 부위에 닉을 제조하는 효소이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 엔도뉴클레아제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 리보뉴클레아제들이다. 이들중에서, DNA 및 RNA로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 RNA 부분에 작용하는 엔도리보뉴클레아제 H(RNase H)를 바람직하게 사용할 수 있다. 중온성 및 열-내성의 것을 포함하고, 상기 언급된 활성을 갖는 어느 리보뉴클레아제를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법에서 E.Coli로부터의 RNase H를 약 50℃ 내지 약 70℃에 반응을 위해 사용할 수 있다. 열-내성 리보뉴클레아제를 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용할 수 있다. 바람직하게 사용될 수 있는 열-내성 리보뉴클레아제는 제한하는 것은 아니지만, 상업상 사용가능한 열-내성의 리보뉴클레아제, HybridaseTMThermostable RNase H(Epicenter Technologies) 및 바실러스(Bacillus) 속의 고온성 세균, 써무스(thermus) 속 세균, 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균, 써모토가(Thermotoga) 속 세균, 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균, 메타노코쿠스(Methanococcus) 속 세균, 써모코쿠스(Thermococcus) 속 세균 등으로부터의 RNase H를 포함한다. 추가로 자연발생된 리보뉴클레아제 및 변이체가 바람직하게 사용될 수 있다.
RNase H는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 한 특정의 것으로 제한되지 않는다. 예를 들면, RNase H는 다양한 바이러스, 파지, 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 세포성 RNase H 또는 바이러스성 RNase H일 수 있다. 세포성 RNase H는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNase HI에 의해 바이러스성 RNase H는 HIV-1에 의해 예시된다. I형, II형 또는 III형 Rnase H는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase HI, 또는 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균 또는 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균으로부터의 RNase H가 제한되지 않고 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 RNase H와 같은 엔도뉴클레아제를 사용하는 절단 반응의 효율은 프라이머의 3'-말단 주위의 뉴클레오티드 서열에 따라 달라질 수 있고 원하는 DNA의 증폭 효율에 영향을 줄 수 있다. 그러므노, 사용되는 Rase H 를 위해 최적의 프라이머를 작제하는 것이 적절하다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "닉의 도입" 또는 "닉킹(nicking)"은 더블-스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나를 내부적으로 절단하는 것을 의미한다. 예를 들면, RNase H는 DNA 및 리보뉴클레오티드-포함 DNA로 구성된 하이브리드 더블-스트랜드 핵산에 작용하여 두개의 스트랜드중에서 리보뉴클레오티드 부분에서 리보뉴클레오티드-포함 스트랜드를 선택적으로 절단한다.
DNA 폴리머라제는 특정 조건하에서 RNase H 활성과 같은 엔도뉴클레아제 활서을 갖는 것으로 공지되어 있다. 그러한 DNA 폴리머라제를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 일면으로, Mn+2의 존재하에서와 같이 RNase H의 활성을 발현시킬 수 있는 조건하에서 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 방법은 RNase H를 가하지 않고 수행될 수 있다. 본 발명자는 최초로 Mn+2을 포함하는 완충액에서 Bca DNA 폴리머라제가 RNase 활성을 보였고, 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법은 Bca DNA 폴리머라제외의 다른 효소는 포함하지 않는 반응 혼합물중에서 수행될 수 있다는 것을 입증하였다. 상기 언급한 면은 Bca DNA 폴리머라제의 사용을 제한하지 않는다. 써무스 써모필러스(Thermus stearothermophilus)로부터의 Tth DNA 폴리머라제와 같이 RNase H 활성을 갖는 것으로 공지된 DNA 폴리머라제를 본 발명에서 사용할 수 있다.
따라서, RNase H 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 RNase H 활성이 나타나는 조건하에서 사용할 수 있다.
PCR 방법에 사용되는 dNTPs 등(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)등을 방법중에서 신장 반응에서 기질로서 뉴클레오티드 트리포스페이트로서 바람직하게 사용할 수 있다. dNTPs는 그것이 사용되는 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용하는 한 7-데자(deaza)-dGTP와 같은 dNTP 유사체를 포함할 수 있다. dNTP 또는 dNTP 유사체의 유도체를 사용할 수 있다. 아미노 그룹을 갖는 dUTP와 같은 작용 그룹을 갖는 유사체를 포함할 수 있다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명에서 사용할 수 있다. 상기 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 표준 올리고뉴클레오티드 프라이머를 배합하여 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
사용되는 효소의 활성이 반응과정에서 감소하는 경우 본 발명의 방법에서 반응하는 동안 추가로 효소를 가할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면 RNase H이 사용되는 반응시 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 RNase H를 추가로 가할 수 있다. 첨가된 효소는 반응 시작시 반응 혼합물에 포함된 것과 동일할 수 있거나 동일한 활성을 보이는 상이한 효소일 수 있다. 따라서, 첨가되는 효소의 타입 또는 성질은 반응시 첨가가 검출 감수성의 증가 또는 증폭 산물 양의 증가와 같은 효과를 제공하는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바, DNA 폴리머라제는 주형으로서 DNA 스트랜드를 사용하여 새롭게 DNA 스트랜드를 합성하는 효소를 언급한다. DNA 폴리머라제는 자연발생적 DNA 폴리머라제 및 상기 언급한 활성을 갖는 변이체 효소를 포함한다. 예를 들면, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제 및 역전사효소 활성을 갖거나 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "스트랜드 치환 활성"은 스트랜드를 치환할 수 있는 활성, 즉, DNA 스트랜드를 치환하여 주형 스트랜드에 어닐링된 상보적인 스트랜드를 분리시키면서 주형으로 뉴클레오티드 서열에 기초하여 DNA를 복제할 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 본 명세서에서 스트랜드 치환으로부터 수득한 주형으로서 뉴클레오티드 서열로부터 분리된 DNA 스트랜드를 "치환된 스트랜드"로서 언급한다.
본 발명에서 DNA상에 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제가 사용될수 있다. 특히, 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제가 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 스트랜드 치환 활성을 갖는 어느 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 그의 예는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)(이하, B. ca로서 언급함) 및 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)(이하, B. st로서 언급함)와 같은 바실러스 속의 고온성 세균으로부터 유래된, 그들의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제, 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 거대 단편(클레나우 단편)의 변이체를 포함한다. 중온성 및 열-내성 DNA 폴리머라제 둘 모두를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다.
B. ca는 약 70℃의 최적 성장 온도를 갖는 고온성 세균이다. 이 세균으로부터의 Bca DNA 폴리머라제가 DNA-의존 DNA 폴리머라제 활성, RNA-의존 DNA 폴리머라제 활성(역전사 활성), 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다고 공지되어 있다. 효소는 그의 기원으로부터의 정제된 효소 또는 유전 공학 기술에 의해 생산된 재배합 단백질일 수 있다. 효소를 유전 공학 기술 또는 다른 방법을 사용하여 치환, 결실, 첨가 또는 삽입에 의해 변형시킬 수 있다. 변형된 효소의 예는 그의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bca DNA 폴리머라제인 Bca BEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 포함한다.
본 발명의 방법에서 주형으로서 사용되는 핵산(DNA 또는 RNA)은 핵산을 포함할 수 있는 어느 샘플로부터 분리하거나 제조할 수 있다. 또한, 샘플은 본 발명에따른 핵산 증폭 반응에서 직접 사용할 수 있다. 핵산을 포함할 수 있는 샘플의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층(buffy coat), 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액(예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리아성 세포 배양액)과 같이 유기체로부터의 샘플, 비로이드(viroid), 바이러스, 박테리아, 진균, 효모, 식물 및 동물과 같이 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 오염되거나 감염감염된 것으로 예측되는 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같이 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 상기 샘플은 공지된 방법에 따라 상기 기재된 바와 같은 샘플을 공정화하여 수득된 핵산을 함유하는 샘플(preparation)일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 샘플의 예는 세포 파괴 산물 또는 상기 산물을 분별하여 수득한 샘플, 샘플중에 핵산, 또는 mRNAs가 풍부한 샘플과 같은 특이적인 핵산 분자들을 포함한다. 또한, 샘플중에 포함된 핵산을 공지된 방법에 따라 증폭시켜 수득한 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 바람직하게 사용할 수 있다.
핵산을 포함하는 샘플을 제한하지 않고, 예를 들면, 세제를 사용하는 세포 용해, 초음파 처리, 글래스 비드 또는 프렌치 프레스(French press)를 사용하는 진탕/교반을 사용하여 상기 언급된 물질로부터 제조할 수 있다. 일부 경우에는, 추가로 샘플을 공정하여 핵산을 정제하는 것이 유리하다(예: 엔도뉴클레아제가 존재하는 경우). 그러한 경우에, 핵산은 공지된 방법, 예를 들면, 페놀 추출, 크로마토그래피, 이온 교환, 겔 전기 영동 또는 밀도-구배 농축에 의해 정제된다.
RNA로부터 유래된 서열을 갖는 핵산을 증폭시켜야 하는 경우, 주형으로서RNA를 사용하는 역전사반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로서 사용하여 본 발명의 발명을 수행할 수 있다. 샘플중에 mRNA, tRNA 및 rRNA와 같은 RNA 분자 및 특이 RNA 종을 포함하여, 역전사 반응용 프라이머를 제조할 수 있는 어느 RNA도 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
상기와 같이 분리된 게놈 DNA 또는 PCR 단편과 같은 더블-스트랜드 DNA, 및 총 RNA 또는 mRNA로부터의 역전사 반응에 의해 제조된 cDNA와 같은 싱글-스트랜드 DNA 둘 모두, 및 DNA 및 RNA로 구성된 하이브리드 더블 스트랜드를 본 발명에서 주형 DNA로서 바람직하게 사용할 수 있다. 더블-스트랜드 DNA는 그것을 싱글-스트랜드 DNA로 변성시킨 후 사용하거나 변성시키기 않고 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
(1) 본 발명의 표적 핵산을 증폭 또는 검출하는 방법을 위한 반응 시약의 안정화 및 장기간 보존 방법
본 발명에 따른 반응 시약을 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제중 적어도 하나를 사용하는 표적 핵산 증폭 또는 검출 방법을 위해 사용할 수 있다.
두개의 프라이머, 즉, 주형으로서의 핵산에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 치환된 스트랜드에 상보적인 또다른 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머을 사용하여 수행하는 표적 핵산을 증폭시키는 방법에 본 발명의 반응 시약을 사용할 수 있다. 하나의 프라이머는 주형인 DNA 스트랜드에 결합하여 스트랜드 치환 반응시키는 반면, 또다른 프라이머는 스트랜드 치환 반응 결과 분리된치환된 스트랜드에 결합하여 또다른 스트랜드 치환 반응을 개시한다. 이면을 사용하는 경우 하나의 프라이머와의 반응 산물이 또다른 프라이머에 대한 주형으로서 작용할 수 있다는 것은 자명하다. 따라서, 비-선형 방법에서 주형의 양이 증가함에 따라 증폭산물의 양이 증가한다.
주형으로서 더블-스트랜드 DNA 및 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 방법을 위한 반응 시약이 또다른 일면을 구체화한다. 이 방법에서, 반응 조건 등에 따라 다양하지만, 신장 반응동안 주형-신장된 스트랜드 중간체중 주형의 교환(switching)이 발생하여 서로 어닐링되는 합성 프라이머-신장 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 생성할 수 있다. 더블-스트랜드 핵산은 양쪽 끝에 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 갖는다. 이어서 스트랜드 치환을 포함하는 상보적 스트랜드를 신장하는 반을 양쪽 끝으로부터 다시 시작할 수 있다. 반응 결과, 한쪽 끝에서 프라이머 서열을 갖는 증폭 산물을 생산된다. 추가로, 반응시 주형의 변환이 발생하는 경우 상기 기술된 것과 유사한 더블-스트랜드 핵산을 다시 생산된다.
스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형 변환 반응시키는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법에 본 발명의 반응 시약을 사용할 수 있다. 주형으로서 더블-스트랜드 핵산, 각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제의 존재하의 주형 변환 반응에서 주형에 상보적인 두개의 프라이머-신장 스트랜드가 합성된다.프라이머-신장 스트랜드 합성시 주형으로부터 다른 프라이머-신장 스트랜드로의 각 프라이머-신장 스트랜드의 주형 변환이 일어난다.
본 명세서에서 사용되는 바, 주형 변환 반응은 상보적 스트랜드가 스트랜드 치환 반응에 의해 더블-스트랜드 핵산의 양측으로부터 합성되는 경우, DNA 폴리머라제가 주형을 변환하고 이후 또다른 DNA 폴리머라제에 의해 새로 합성된 다른 상보적 스트랜드를 주형으로서 사용하여 상보적 스트랜드를 합성하는 것 반응을 언급한다. 즉 주형 변환 반응 주형으로서 더블-스트랜드 핵산을 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제로 처리하여 주형에 상보적인 신장 스트랜드를 생성하는 반응을 언급하고, 여기에서, 프라이머-신장 스트랜드를 합성하는 DNA 폴리머라제는 신장 스트랜드의 합성시 원 주형으로부터 다른 프라이머-신장 스트랜드로 주형을 활발하게 변환한다. 주형 변환 반응시키는 DNA 폴리머라제의 능력은 예로서 하기 참고예 3에 기술되는 방법에 따라 측정할 수 있지만, 이는 본 발명의 제한하는 것은 아니다.
스트랜드 치환 반응시 주형 변환 반응시킬 수 있는 DNA 폴리머라제가 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다. 예로서, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bca DNA 폴리머라제의 다양한 효소가 특히 바람직하게 사용된다. 그러한 효소는 상업적으로 BcaBEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)로서 이용할 수 있다. 일본 특허 2978001에 기술된 방법에 따른 효소에 대한 유전자를 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101/pU1205 (FERM BP-3720)으로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 반응 시약을 사용하는 표적 핵산 증폭 방법에서, 증폭시키고자 하는 영역이 서로 연결된 폴리머가 생성될 수 있다. 폴리머는 증폭시키고자 하는 다수의 영역이 동일한 방향으로 반복된 구조를 갖는다. 폴리머는 증폭 산물의 전기영동 분석시 래더 밴드(laddered band)로서 관찰된다. 폴리머 생성은 증폭시키고자 하는 영역, 영역의 크기, 측면 영역, 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열, 반응 조건 등에 의해 영향을 받는 것으로 판단된다.
상기 기재된 바와 같이 폴리머는 증폭시키고자 하는 다수의 영역을 포함한다. 예로서, 폴리머는 적절한 프로브를 사용하여 하이브리드화시키는 경우 다수의 프로브와 하이브리드하고 강한 시그날을 발생시키기 때문에 증폭시키고자 하는 영역을 포함하는 핵산을 검출하고자 하는 경우 유용하다. 증폭시키고자 하는 영역 또는 그의 일부는 제한 효소 등에 의한 분해에 의해 모노머로서 또는 그의 배합물로서 폴리머로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 방법의 하나의 특성은 상기 방법은 핵산 합성동안 온도를 상하로 조정할 필요가 없다는 것이다. 따라서, 본 발명은 등온으로 뉴클레오티드 서열을 합성하는 방법을 제공하는 것이다. 다수의 통상적인 핵산 증폭 방법은 합성된 스트랜드로부터 표적을 해리시키기 위하여 온도를 상하로 조절하는 것을 필요로 한다. 이들 방법은 이 목적을 위해 열 싸이클러(열 싸이클러)와 같은 특별한 반응 장치를 필요로 한다. 그러나, 본 발명의 방법은 단지 온도를 일정하게 유지시킬 수 있는 장치만을 사용하여 수행된다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 단일 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 프라이머의 비-특이적인 어닐링을 감소시키고 프라이머가 특이적으로 주형으로서 뉴클레오티드 서열에 어닐링할 수 있도록 반응 온도 및 엄격한(stringency) 수준을 선택하여 수행한다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 상기 기재된 열-내성 효소를 사용하여 고온 조건하에서 수행될 수 있다. 또한, 사용되는 효소의 활성을 충분히 유지하기 위한 적절한 온도에서 본 발명의 방법을 수행하여 반응 효율을 고수준으로 유지시키는 겻이 바람직할 수 있다. 따라서, 반응 온도는 사용되는 효소에 따라 달라질 수 있지만, 바람직하게, 20℃ 내지 약 80℃, 더욱 바람직하게 약 30 ℃ 내지 약 75℃, 가장 바람직하게 약 50℃ 내지 약 70℃이다. 특히 고온 조건하에서 반응을 수행하는 경우, 표준 온도에서의 반응을 위한 것보다 더욱 긴 프라이머를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 반응 온도를 승온시킴으로써 얻은 효과의 예는 주형으로서 DNA의 2차 구조 형성의 문제를 해결한 것이다. 높은 GC 함량을 갖는 핵산을 주형으로서 사용하여도, 반응 온도를 승온시킴으로써 원하는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 또한, 그것은 유사하게 장쇄의 영역을 증폭시키는데 효과적이다. 그러한 효과는 약 60bp 내지 약 20 kbp 사이, 특히 약 60bp 내지 약 1500bp 사이 범위에서 관찰된다.
증폭 효능은 주형으로서의 핵산의 GC 함량에 따라 반응 온도를 조절하여 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 낮은 GC 함량을 갖는 핵산을 주형으로서 사용하는 경우 온도는 증폭하고자 하는 쇄의 길이 및 프라이머의 Tm 값에 따라 달라질 수 있지만 본 발명의 증폭 반응은 50 내지 55℃에서 수행될 수 있다.
RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계 (역전사 반응)를 통상적으로 수행하는 것을 포함하여, 본 발명의 방법에서 역전사 효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라제(예: Bca BEST DNA 폴리머라제)를 사용하여 RNA로부터 핵산을 증폭시킨다. 또한, RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계를 독립적으로 수행하여 수득한 산물(즉, cDNA)을 본 발명의방법에서 주형 DNA로서 사용할 수 있다.
각 경우에서, 적절한 방법, 예를 들면, 효소를 불활성시키거나 반응 온도를 낮추어 그것이 종결될 때까지, 또는 반응에서 기질중 하나가 부족할 때까지 본 발명의 방법에서 반응을 반복한다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 핵산의 검출, 표지 및 서열화를 포함하는 핵산 증폭을 사용하는 다양한 실험 방법을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 증폭 방법은 DNA 칩과 같은 고체 기질상의 핵산을 증폭시키는 방법인 인시츄(in situ)에서의 핵산 증폭 방법, 또는 다수의 영역을 동시에 증폭시키는 멀티플렉스 핵산 증폭 방법을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에서 프라이머의 사용 효율은 PCR 방법과 같은 통상의 방법에서 것보다 5- 내지 10배 높은 약 100%이다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 주형 핵산의 뉴클레오티드 서열에 고도로 동일한 증폭 산물을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에서 DNA 합성의 오차 빈도수를 생성된 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 확인했을 때, 본 발명의 방법에 의해 수득횐 증폭 산물에서 발견된 오차 빈도수는 고도로 동일하게 증폭시킬 수 있는 것으로 공지된 LA-PCR에 의한 것과 동일하였다. 다시 말해, 본 발명의 방법은 LA-PCR의 것과 동일한 고도의 동일성을 갖는다.
본 발명의 표적 핵산 검출 방법은 핵산을 포함하는 샘플로부터 직적 표적 핵산을 증폭시켜 수행할 수 있다. 이러한 경우, 증폭시키고자 하는 표적 핵산의 쇄 길이는 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, 200이하, 바람직하게 150 bp이하의 영역이 표적 핵산의 감수성 검출에 효과적이다. 샘플중 표적 핵산는 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 작제하여 고감수성으로 검출하여 상기 기재된 바와 같이 증폭시키고자 하는 쇄를 얻을 수 있다.
또한, 표적 핵산은 완충 성분으로서 Bicine, Tricine, HEPES, 포스페이트 또는 트리스를 포함하는 반응 완충액 및 상기 (4)에 예시된 스퍼미딘 또는 프로필렌디아민을 포함하는 어닐링 용액을 사용하여 본 발명의 검출 방법에서 미량의 핵산 샘플로부터도 더욱 감수성으로 검출될 수 있다. 이 경우, 사용하는 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제를 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균 또는 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균 및 Bca BEST 로부터의 RNae H의 배합물이 바람직하게 사용된다. 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제의 바람직한 유니트수는 효소의 형태에 따라 달라질 수 있다고 예상된다. 그러한 경우, 완충액의 조성 및 첨가되는 효소의 양은 인덱스로서 증폭 산물의 양 또는 검출 감수성의 증가를 사용하여 조정될 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서 표적 핵산의 증폭시 dUTP가 기질로서 삽입될 수 있다. 따라서, dUTP가 기질로서 사용되는 경우, 우라실 N-글리소키다아제 (UNG)를 사용하여 증폭 산물을 분해시켜 증폭 산물의 캐리-오버(glycosidase) 오염을 방지할 수 있다.
핵산 검출을 위한 공지된 방법을 표적 핵산 검출을 위해 사용할 수 있다. 그러한 방법의 예는 전기영동에 의해 특정 크기를 갖는 반응산물의 검출, 및 프로브와 하이브리다이제이션시키는 검출을 포함한다. 에티디윰 브로마이드와 같은 형광 물질을 사용하여 전기 영동에 의한 검출에서 사용한다. 또한, 자기 비드를 배합하여 사용하는 검출 방법을 바람직하게 사용할 수 있다. 표적 핵산 증폭 단계에서 형성된 피로린산은 마그네슘 염과 같은 불용성 염으로 전환될 수 있고, 이어서 탁도를 측정할 수 있다. 프로브를 사용하는 하이브리다이제이션을 전기영동에 의한 검출과 배합시킬 수 있다. 프로브는 방사성 동위 원소로 표지할 수 있거나 바이오틴과 같은 비-방사성 동위 원소 물질 또는 형광 물질로 표지할 수 있다. 또한, 거출 단계에서 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 증폭 산물의 검출을 촉진시킬 수 있다. 또한, 형광 편광법, 형광 에너지 전이(FERT) 등을 검출을 위해 사용할 수 있다. 적절한 검출 시스템을 구측하여 핵산을 자동적으로 검출하거나 측량화할 수 있다. 또한 하이브리드 크로마토그래피에 의해 나안(naked eye)으로 검출하는 것이 바람직하게 사용될 수 있다.
소광 상태가 되는 거리에 위치한 두개 이상의 형광 물질로 표지된 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 리보뉴클레오티드(RNA) 프로브를 본 발명의 검출 방법에 사용할 수 있다. 프로브는 형광을 발산하지 않는다. 그것이 프로브에 상보적인 핵산으로부터 증폭된 DNA에 어닐링되는 경우, RNase H가 프로브를 분해한다. 이어서, 프로브상에 형광 물질사이에 거리를 증가시켜, 형광을 발산시킨다, 발산은 핵산의 존재를 나타낸다. RNase H를 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 사용하는 경우, 단지 프로브를 반응 혼합물에 첨가하여 표적 핵산을 검출할 수 있다. 예를 들면, 형광 물질, 6-카복시플루오레슨(6-FAM) 및 N,N,N',N'-테트메틸-6-카복시로다민(TAMRA)(FRET에 대한 라벨 쌍)의 혼합물, 또는 6-카복시플루오레슨 및 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL)(비-FRET에 대한 쌍)을 프로브 표지용으로 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 언급한 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용되는 프로브를 제공한다. 본 발명의 프로브는 정상 하이브리드화 조건하에서 본 발명의 핵산 증폭 방법에 의해 증폭된 표적 핵산에 하이브리드될 수 있는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. 증폭 산물의 특정 검출과 관련하여 조건 예를 들면, 본 분야의 기술자에거 엄격한(stringent) 조건으로 공지되어 있는 조건하에 혼성화하는 프로브가 바람직할 수 있다. 엄격한 하이브리드 조건은 예를 들면 [T. Maniatis et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술되어 있다. 특히 엄격한 조건은 하기와 같이 예시된다: 사용되는 프로브의 Tm보다 낮은 약 25℃의 온도에서 4시간 내지 밤새도록 0.5% SDS, 5 x Denhardt's(0.1% 소혈청 알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% Ficoll 400) 및 100μg/㎖ 살몬 정자 DNA를 포함하는 6 x SSC(1 x SSC : 0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트, pH 7.0)중에서 인큐베이션. 상기 기재된 바와 같은 라벨을 갖는 프로브를 표적 핵산의 검출을 촉진하는 프로브로서 사용할 수 있다.
본 발명의 등온 조건하에서 핵산 증폭 방법은 열 싸이클러와 같은 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. 본 발명의 증폭 방법에서 사용되는 프라이머의 수는 통상의 방법에서 사용되는 것보다 적은 하나 또는 둘이다. PCR용 dNTPs 등과 같은 시약을 본 발명의 방법에 사용하기 때문에, 통상의 방법과 비교하여 러닝 코스트(running cost)를 감소시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 검출을 항상 수행하는 유전자 시험을 포함하는 분야에서 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 PCR 방법보다 더욱 단시간에 증폭 산물을 대량으로 제공한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 편리하고 신속하고 민감한 유전자 검출 방법으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하는 반응 혼합물을 제조하기 위한 반응 시약으로서 반응 혼합물중 포함되는 각 성분을 따로따로 보존할 수 있다. 또한, 여러 성분을 함께 혼합하기 앞서 프리믹스 용액을 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 상기와 같은 반응 시약의 경우 시약의 안정성과 관련하여 용액중 키메라성 올리고 뉴클레오티드 프라이머의 프라이머로서의 기본 작용을 폐지할 수 있는 반응을 저해시키는 조성물을 갖도록 프리믹스 용액을 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 프리믹스 용액은 바람직하게 키메라성 올리고 뉴클레오티드 프라이머가 폴리머화 및/또는 분해되지 못하게는 조성물을 갖는다. 본 발명의 방법에서 사용되는 핵산 합성 반응에 필요하고 관여하는 프리믹스 용액중 적어도 하나의 성분을 차단하거나(exclude) 역으로 불활성화시키는 것이 바람직하다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, DNA 폴리머라제, 키메라성 올리고 뉴클레오티드 프라이머, 마그네슘 염 및 dNTPs로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나는 차단되거나 불활성화될 수 있다. 상기 언급한 방법에 의해 본 발명의 방법에 사용되는 반응 시약은 어느 온도에서나 안정화될 수 있다. 추가로, 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)는 분리되어 효소의 불활성화를 억제시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 분리된 성분(분리된 성분들)를 포함하는 것 및 다른 성분들을 포함하는 또다른 것, 이 2개의 프리믹스 용액으로 구성된 반응 시약을 포함한다. 임의로, 반응 시약은 3개 이상의 프리믹스 용액으로 구성될 수 있다.
상기 언급한 안정화 방법을 본 발명의 방법에 사용하는 반응 시약의 장기간 보존 방법으로서 사용할 수 있다. 장기간동안 보존하기 위한 형태와 관련하여 특별히 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 반응 시약을 2부, 즉 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 용액 및 효소(들), 마그네슘 염 및 dNTPs를 포함하는 반응 완충액으로 구성된 형태로 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명의 장기간 보존법의 한 일면으로 반응 완충액은 염을 포함하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 바, 염 농도는 완충 성분을 포함하는 염, 마그네슘 염 및 이온 세기를 조절하는 염(예: 아세트산칼륨)의 농도를 의미한다. 포함된 염의 농도는 사용하는 DNA 폴리머라제 및 RNase H의 형태에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 바람직하게, 염 농도를 조절하여 이온 세기가 효소(들)를 안정화시키도록 한다. 이러한 경우, 염 농도는 실시예 4에 기술된 방법을 사용하여 최적화될 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 효소(들)를 포함하는 반응 완충액내 포함된 염의 농도는 대략 반응시의 최종 염 농도, 예를 들면, 반응시 최종 염 농도의 5배 미만, 바람직하게 3 배미만, 더욱 바람직하게 1.5 배미만이다. 농도는 반응시 최종 염 농도와 동일하거나 그 이하일 수 있다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속에 속하는 세균으로부터의 RNase H 및 Bca DNA 폴리머라제를 사용하는 반응 시스템의 경우, HEPES-수산화칼륨 완충액의 농도는 0 mM 이상 및 160 mM 이하, 바람직하게 30 mM 내지 120 mM 범위, 더욱 바람직하게 32 mM 내지 102 mM 범위일 수 있다. 마그네슘 아세테이트를 마그네슘 염으로 사용하는 경우, 농도는 0 mM 이상 20 mM 이하, 바람직하게 3 mM 내지 15 mM 범위, 더욱 바람직하게 4 mM 내지 13 mM 범위이다.
아세트산칼륨을 이온 세기 조절을 위해 사용하는 경우, 농도는 0 mM 이상 및 500 mM 이하, 바람직하게 90 mM 내지 360 mM 범위, 더욱 바람직하게 100 mM 내지 317 mM 범위일 수 있다. 임의로, 염 농도를 조절하기 위하여 사용되는 염 농도 조절 시약은 별개로 포함될 수 있다.
키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 용액은 반응 혼합물의 염 농도를 조절하기 위한 염을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 반응 혼합물은 두개의 프리믹스 용액을 사용하여 제조할 수 있다.
유전자 증폭 반응을 위한 시약을 제조하고자 하는 경우, 프라이머를 일반적으로 저염 용액(예: TE 완충액)의 멸균수에 용해시키고, 그의 필요량을 반응 혼합물 제조에 사용한다(참조 Molecular Cloning, 2nd ed., 14.18).
본 발명에 따라, 효소(들)를 포함하는 프리믹스 용액의 염 농도는 프라이머 용액중 반응 혼합물의 성분인 염을 포함하여 효소(들)의 안정화에 적절하도록 만들 수 있다.
본 발명의 장기간 보존 방법의 또다른 일면으로 반응 시약은 두개의 분리된 부분(즉, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 용액 및 효소들, 마그네슘 염 및 dNTPs를 포함하는 반응 완충액)으로 구성된 형태로 존재하는 경우, 반응 완충액의 효소 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 포함된 효소의 농도는 사용되는 DNA 폴리머라제 및 RNase H의 유형에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 이러한 경우, 농도는 실시예 4에 기술된 방법을 사용하여 최적화될 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 아키오글루부스(Archaeoglobus) 속 또는 써모코쿠스(Thermococcus) 속에 속하는 세균으로부터의 RNase H 및 Bca DNA 폴리머라제를 사용하는 반응 시스템의 경우, 포함된 효소가 불활성화되지 않는 한, 바람직하게는 반응 완충액에 포함된 효소의 농도를 증가시킨다.
주형으로서의 핵산에 따라 용이하게 교환될 수 있는 프라이머를 포함하는 반응 시약의 일면으로 프라이머를 용해시키기 위한, 프라이머를 포함하지 않는 용액을 프라이머 용액을 대신하여 사용할 수 있다.
또다른 일면으로, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머외의 dNTPs를 다른 성분으로부터 분리할 수 있고, 두개의 프리믹스 용액의 염 농도는 효소의 안정성을 고려하여 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 효소-포함 프리믹스 용액의 염 농도와 효소 농도(들) 사이의 관계로서 반응시 효소 또는 염의 최종 농도를 1로 정의할 때 염의 농도율을 약 1로 유지시키면서 효소의 농도율은 1 초과로 세팅하는 것이 바람직하다.
바람직하게, 효소의 농도율(E)/염의 농도율(S)의 비는 1 초과이다. 비는 바람직하게 100≥E/S>1, 더욱 바람직하게, 10≥E/S>1, 가장 바람직하게 5≥E/S>1이다.
방부제 또는 항진균제를 본 발명의 방법에 다른 반응 시약에 가할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 방부제 또는 항진균제를 이용할 수 있다. 바람직하게 사용할 수 있는 그의 예는 제한하는 것은 아니지만, 소듐 아지드, 파라옥시벤조산 및 그의 유도체 및 염, 티메로살(Thimerosal) 및 프로클린(ProClin)을 포함한다. 방부제 또는 항진균제의 농도는 보존 또는 반응시 반응 시약에 포함된 효소가 불활성화되지 않도록 결정된다.
반응 시약은 본 발명의 장기간 보존 방법에 따라 약 1개월 이상동안 보존될 수 있다. 이러한 경우, 보존 온도와 관련하여 특별히 제한하는 것은 아니지만, 온도는 50℃ 이하, 바람직하게 30℃ 이하이다.
(2) 본 발명의 병원성 미생물 및/또는 바이러스 검출 방법에 사용되는 프라이머.
본 발명의 핵산 증폭 방법을 사용하여 샘플중 표적 핵산을 검출할 수 있다. 본 발명은
(a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드
유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
(b) 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭시킴으로써 반응 산물을 생성하고;
(c) 단계 (b)에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함한다.
상기 단계 (a)에서, 주형으로서 RNA를 사용하는 경우 1단계에서 역전사 반응 및 핵산 증폭 반응이 수행될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예로서, AMV RTase, MMLV RTase 또는 RAV-2 RTase 및 BcDNA 폴리머라제의 배합물을 리버스 트랜스크립타제 및 스트랜드 치환형 DNA 폴리머라제의 배합물로서 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 표적 핵산 검출 방법은 서열 표적 핵산의 뉴클레오티드의 사이를 식별하기 위하여 사용될 수 있다. 이 일면에서, 사용하고자 하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 3'-말단 부위가 식별하고자 하는 표적 뉴클레오티드 서열의 특정 염기에 가깝게 위치하도록 작제한다. 예를 들면, 수소 결합이 프라이머의 3'-말단 부위 및 염기사이에 형성되도록 작제한다. 프라이머의 3'-말단 부위의 뉴클레오티드 서열 및 주형의 뉴클레오티드 서열 주형사이에 불일치가 존재하는 경우, 표적 핵산으로부터 증폭은 발생하지 않고 상기 언급한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭 산물은 생성되지 않는다. 점돌연변이(point mutation) 또는 단일염기변이 (SNP)와 같은 유전자의 특정 염기와 관련된 정보를 상기 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예를 들면, 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 본 발명의 병원성 미생물 및/또는 바이러스 검출을 위한 프라이머를 본 발명의 표적 핵산을 검출하는 방법에 바람직하게 사용할 수 있다:
(1) 서열번호:7, 8, 21, 22, 162, 163, 170 및 171로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(2) 서열번호:15, 16, 81-86 및 88-91로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HCV에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(3) 서열번호:17-20, 121-127, 130-135, 167 및 167로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아(chlamydia)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(4) 서열번호:25-31로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코박테리움 아비움(M.avium) 컴플렉스에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(5) 서열번호:38-63, 164 및 165로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 고노코쿠스(gonococcus)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(6) 서열번호:71-78로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HBV에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(7) 서열번호:95-103로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HIV에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(8) 서열번호:108-117로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(9) 서열번호:139-146로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코플라스마(Mycoplasma)에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(10) 서열번호:152-155로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 MRSA에 대한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 본 발명의 병원성 미생물 및/또는 바이러스 검출을 위한 프로브를 본 발명의 표적 핵산을 검출하는 방법에 바람직하게 사용할 수 있다:
(1) 서열번호:11, 12 및 172로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하기 위한 프로브;
(2) 서열번호:87 및 92로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HCV을 검출하기 위한 프로브;
(3) 서열번호:128, 136 및 168로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클라미디아(chlamydia)을 검출하기 위한 프로브;
(4) 서열번호:32 및 33으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마이코박테리움 아비움(M.avium) 컴플렉스을 검출하기 위한 프로브;
(5) 서열번호:64-68로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 고노코쿠스(gonococcus)을 검출하기 위한 프로브;
(6) 서열번호:79 및 80로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV을 검출하기 위한 프로브;
(7) 서열번호:104 및 105로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HIV을 검출하기 위한 프로브;
(8) 서열번호:118 및 119로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프로브;
(9) 서열번호:147-149로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마이코플라스마(Mycoplasma)을 검출하기 위한 프로브;
(10) 서열번호:156 및 157로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MRSA을 검출하기 위한 프로브.
(3) 본 발명의 키트
본 발명의 키트는 상기 (2)에 기술된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법 또는 핵산을 검출하기 위한 방법에서 사용되는 키트를 제공한다. 일례에서, 키트는 패키지형태(packaged form)이고 스트랜드 치환 반응과 관련하여 DNA 폴리머라아제 및 엔도뉴클레아제의 사용과 관련된 안내서를 포함한다. 또한, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제, 및 스트랜드 치환 반응용 완충액을 포함하는 키트가 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용된다. 또한, 상업적으로 사용가능한 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 및/또는 엔도뉴클레아제을 안내서에 따라 선택하고 사용할 수 있있다. 또한, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 키트는 사용되는 역전사 반응용 시약을 포함할 수 있다. DNA 폴리머라아제는 상기에 기재된 바와 같이 본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라아제들로부터 선택될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 상기에 기재된 바와 같은 엔도뉴클레아제들로부터 선택할 수 있다. 스트랜드 치환 반응용 완충액은 어닐링 용액 및 완충 성분으로서 Bicine, Tricine, HEPES, 포스페이트 또는 tris를 포함하는 반응 완충액을 포함할 수 있다. 또한 키트는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체를 포함할 수 있다.
"안내서"는 키트 사용법, 예를 들면, 스트랜드 치환 반응용 시약 용액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
표적 핵산을 검출하기 위하여 사용되는 키트는 증폭 반응용 시약 및 안내서외에 표적 핵산 증폭에 적절한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 증폭된표적 핵산의 검출을 위한 시약(예: 프로브)을 포함할 수 있다. 본 발명의 반응 시약을 안정화시키고 장기간 보존하기 위한 방법에 따라 구성된 반응 시약을 성분으로서 포함하는 키트를 바람직하게 사용할 수 있다. 추가로, 본 발명의 키트는 위음성(false negative) 확인을 위한 내부 컨트롤(IC, internal control)으로 작용하는 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 대표적인 키트는 서열번호: 170 및 171의 뉴클레오티드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 172의 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 검출용 프로브, 서열번호 169의 뉴클레오티드 서열을 갖는 내부 컨트롤으로서의 플라스미드, 및 서열번호 173의 뉴클레오티드 서열을 갖는 내부 컨트롤 검출용 프로브를 포함한다. 병원성 미생물 및/또는 바이러스 검출용 키트의 또다른 예는 유사하게 내부 컨트롤을 포함할 수 있다.
본 발명을 실시예에 따라 더욱 구체적으로 설명하며, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
참고예 1
(1) 본 발명의 방법에 사용되는 열-내성 RNase H의 유니트 값을 하기와 같이 측정하였다:
1 mg의 poly(rA) 또는 poly(dT) (Amersham Pharmacia Biotech로부터 모두 입수)를 1 mM EDTA를 포함하는 1 ml의 40 mM tris-HCl (pH 7.7)에 용해시켜 poly(rA) 용액 및 poly(dT) 용액을 제조하였다.
poly(rA) 용액(20μg/㎖의 최종 농도) 및 poly(dT)(30μg/㎖의 최종 농도)을 이어서 4mM MgCl2, 1mM DTT, 0.003% BSA 및 4% 글리세롤를 포함하는 40mM tris-HCl 완충액(pH 7.7)에 가하였다. 혼합물을 10분동안 37℃에서 반응시킨 후 4℃으로 냉각시켜 켜 poly(rA) 용액-poly(dT) 용액을 제조하였다. 1㎕의 효소 용액을 100㎕의 poly(rA) 용액-poly(dT) 용액에 가하였다. 혼합물을 40℃에서 10분동안 반응시켰다. 10㎕의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서 10㎕의 0.5M EDTA를 가하고 생성된 혼합물을 10분동안 40℃에서 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. EDTA가 존재하지 않은 반응에서의 흡광도로부터 대조군의 흡광도를 감하여 값(흡광도 차)을 수득하였다. 따라서, 효소 반응에 의한 poly(rA) -poly 하이브리드으로부터 유리된 뉴클레오티드의 농도를 흡광도 차에 기초하여 측정하였다.
유니트 = [흡광도 차 x 반응 용량(㎖)] / 0.0152 x (110/100) x 희석율
참고예 2: RNase H 제조
An RNase H used 본 발명에 따라 사용되는 RNase H를 WO 02/22831에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 재조합 세포를 배양하고 관심의 대상이 되는 RNase H를 하기와 같이 세포로부터 제조하였다.
(1) 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 유래된 RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드
RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pPFU220으로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pPFU220으로 명명하여 2000년 9월 5일(원기탁일)에 수탁 번호 BP-7654하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다. pPFU220으로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM 109를 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 66.0㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 60℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 따라서, 61.5㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase HII는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
60.0㎖의 이동(flow-through) RNase HII 분획을 완충액 A으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(AmershamPharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 150mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다. 2.0㎖의 RNase H 분획을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA을 포함하는 50mM tris-HCl(pH 8.0)으로 평형화된 Superdex 200 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HII가 분자량 17킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 그렇게 수득한 표본의 효소 활성을 참고예 1에서와 같이 측정화였다. 결과, RNase H 활성이 상기 표본에 대하여 관찰되었다.
(2) 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터 유래된 RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드
피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii)로부터 유래된 RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pPHO238로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pPHO238로 명명하고 2001년 2월 22일(원기탁일)에 기탁번호 BP-7692하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다. pPHO238로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM 109를 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 1L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 34.3㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 80℃에서 가열하였다. 이어서 다시 10분동안 12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 따라서, 33.5㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase H는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
35.0㎖의 이동(flow-through) RNase H 분획을 2L의 완충액 B[50mM tris-HCl(pH 7.0), 1mM EDTA]을 2시간동안 투석하였다. 투석을 2회 더 반복하였다. 34.5㎖의 투석 효소 용액을 완충액 B로 으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 155mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
완충액 B를 4.0㎖의 분획에 가하여 최종 농도를 50mM으로 하였다. 혼합물을 50mM NaCl을 포함하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 50 내지 550mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 160mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
6.9㎖의 RNase HIII 분획을 한외여과에 의해 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 250㎕의 농축액으로 각각 분리된 2분량을 100mM NaCl 및 0.1mMEDTA를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화된 Superose 6 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HIII가 분자량 24.5 킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase H II의 것과 일치한다. 그렇게 수득한 표본의 효소 활성을 참고예 1에서와 같이 측정화였다. 결과, RNase H 활성이 상기 표본에 대하여 관찰되었다.
(3) 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 유래된 RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드
아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 유래된 RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pAFU204로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pAFU204로 명명하여 2001년 2월 22일(원기탁일)에 수탁번호 FERM 7691하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다. pAFU204로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37 ℃에서 16 시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 37.1 ㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 12000 rpm에서 10 분간 초음파 처리된현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 70 ℃에서 15 분간 가열하였다. 그 후, 12000 rpm에서 10 분간 다시 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 따라서, 40.3 ㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.
가열된 상층액을 완충액 A[50 mM tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HII는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
이동(flow-through) RNnase HII 분획을 완충액 A로 평형화된 RESOURSE S 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HII는 RESOURSE S 칼럼을 통해 이동하였다.
40.0㎖의 이동 RNnase HII 분획을 50 mM NaCl을 포함하는 2L의 완충액 B[50 mM tris-HCl(pH 7.0), 1 mM EDTA]을 2 시간동안 투석하였다. 투석을 2 회 더 반복하였다. 40.2 ㎖의 투석 효소 용액을 50 mM NaCl를 포함하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap\-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 50 내지 550 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 240 mM NaCl로 용출된 RNase HII를 포함하는 분획을 수득하였다.
7.8㎖의 RNase HIII 분획을 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다. 약 600 ㎕의 농축액으로부터 각각 분리된 4 개의 분량을 100 mMNaCl 및 0.1 mM EDTA를 포함하는 50 mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화된 Superose 6 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HIII가 분자량 30.0 킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase HII의 분자량과 일치한다. 그렇게 수득한 표본의 효소 활성을 참고예 1에서와 같이 측정화였다. 결과, RNase H 활성이 상기 표본에 대하여 관찰되었다.
(4) 써모코쿠스 리토라리스(Thermococcus litoralis)로부터 유래된 RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pTLI204로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)/pTLI204로 명명하여 2001년 2월 22일(원기탁일)에 수탁번호 FERM-7693하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다. pTLI204로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)을 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 10mL의 LB 배지내로 접종하고 37 ℃에서 밤새도록 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 상기와 같이 처리하고 가열된 상층액을 수득하였다. 그렇게 수득한 표본의 효소 활성을 참고예 1에서와 같이 측정화였다. 결과, RNase H 활성이 상기 표본에 대하여 관찰되었다.
(5) 써모코쿠스 셀러(Thermococcus celer)로부터 유래된 RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드
써모코쿠스 셀러(Thermococcus celer)로부터 유래된 RNase H 활성을 갖는 폴리펩티드을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pTCE207로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)/pTCE207로 명명하여 2001년 2월 22일(원기탁일)에 수탁번호 FERM-7694하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다. pTCE207로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)을 배양하고, 생성된 세포를 정제하여 (4)에 기술된 바와 같이 가열된 상층액을 수득하였다. 그렇게 수득한 표본의 효소 활성을 참고예 1에서와 같이 측정화였다. 결과, RNase H 활성이 상기 표본에 대하여 관찰되었다.
참고예 3
본 발명의 증폭 방법을 검토하였다.
(1) pUC19 어퍼 150 PCR 프라이머(서열번호 1), pUC19 로어 PCR 프라이머(서열번호 2), 및 주형으로서 pUC19 플라스미드 DNA 100pg를 사용하여 PCR을 수행하였다. 생성된 증폭 단편을 마이크로콘-100으로 정제한 후, DNA 블런트 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 평활말단화(blunt-end)하고, pUC19 플라스미드의 HincII 사이트에 서브클로닝하였다. 삽입된 증폭 단편을 갖는 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 형질전환시켰다. 이 형질전환체를 배양하였다. 삽입된 DNA를 갖는 플라스미드, pUC19-150을 QIAGEN 플라스미드 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 세포로부터 정제하였다. 주형으로서 삽입된 DNA를 갖는 플라스미드 및 프라미어 MCS-F (서열번호:3) 및 MCS-R (서열번호:4)을 사용하여 PCR을 수행하였다. Microcon-100 (Millipore)을 사용하여 반응 혼합물을 정제하여 534-bp PCR 증폭 단편을 수득하였다. 15 ng의 PCR 단편, 5' 말단에 인산화하여 [γ-32P]ATP로 표지된 30 pmol의 프라이머 MR2 (서열번호:5) 및 5㎕로 멸균 증류수를 포함하는 반응 혼합물, 및 추가로 30 pmol의 프라이머 MR1(서열번호:6)을 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 55℃로 냉각시켰다. 1U의 BcaBEST DNA 폴립머라제를 포함하는 20㎕의 반응 혼합물(42.5mM 트리신 완충액(pH 8.7), 12.5mM 염화칼륨, 12.5mM 황산암모늄, 0.0125% BSA, 1.25% DMSO, 5mM 마그네슘 아세테이트, 0.625mM 각각의 dNTPs)를 각 반응 혼합물에 가하였다. 생성된 혼합물을 15분동안 55℃에서 반응시켰다. 반응 후, 2.5㎕의 반응 종결 용액(95% 포름아미드, 20mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루, 0.5% 크실렌 시아놀)을 5㎕의 각 반응 혼합물에 가하였다. 상기 혼합물을 3분동안 98℃에서 열-변성시켰다. 1.6㎕의 각 반응 혼합물을 8M 우레아를 포함하는 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시키고 시그날을 BAS2000(Fujix)를 사용하여 판독하고 프라이머 MR1로부터 신장된 산물을 검출하였다. 결과를 도 1A에 나타내었다. 도 1A의 서열 래더는 인산화하여 [γ-32P]ATP로 표지된 프라이머 MF2를 사용하여 M13mp18 싱글 스트랜드 DNA(Takara Shuzo)를 서열화하여 제조하고 신장 산물의 길이 측정을 위해 사용하였다. 래인 : 프라이머 MF2 및 MR1의 조합물; 래인 2: MR1.
도 1A에 나타낸 바와 같이, 프라이머 MR1만을 주형에 가하여 신장 반응을 수행한 경우에 프라이머 MR1로부터 주형의 말단으로 신장된 448-bp 밴드가 검출되었다. 한편, 상기 언급한 밴드외에, 추가로 프라이머 MF2를 가하여 프라이머 MR1 및 MF2에 결합한 373-bp 밴드가 검출되었다. 따라서, BcaBEST DNA 폴리머라제 작용에 의해 주형으로서 PCR 증폭 단편을 사용하는 MR1 프라이머로부터의 신장은 주형 교환에 기인하여 주형으로서 프라이머 MF2로부터 신장된 스트랜드를 사용하는 신장으로 바뀌었다. 또한, 유사한 조건하에서 스트랜드 치환 활성을 갖는 중온성 DNA 폴리머라제로서 클레나우(Klenow) DNA 폴리머라제를 사용할 때 주형 교환이 관찰되었다. 한편, 스트랜드 치환 활성을 갖지 않는 TaKaRa Taq DNA 폴리머라제 (Takara Shuzo) 또는 PyroBEST DNA 폴리머라제 (Takara Shuzo)을 사용할 때는 주형 교환이 관찰되지 않았다.
(2) 주형 DNA 스트랜드와 그에 어닐링된 프라이머를 사용하여 주형 교환 반응을 검토하였다. 프라이머 MF2 및 MR1에 어닐링된 DNA 단편을 하기와 같이 제조하였다. 주형으로서 플라스미드 pUC19 및 프라이머 MCSF 및 RV (Takara Shuzo) 또는 프라이머 M4 (Takara Shuzo) 및 MCSR를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 혼합물을 Microcon-100를 사용하여 정제하여 PCR 증폭 단편 MSCF-RV (236 bp) 및 M4-MCSR (271 bp)를 수득하였다. 프라이머 M4 및 RV에 결합한 부위는 두개의 PCR 증폭 단편에 공통적으로 존재하였다.
이어서, 그에 어닐링된 프라이머를 갖는 주형 DNA 스트랜드가 서로 어닐링하지 않는 주형-프라이머 (2)-1, 및 그에 어닐링된 프라이머를 갖는 주형 DNA 스트랜드가 서로 어닐링하는 주형-프라이머 (2)-2를 하기와 같이 제조하였다.
(2)-1
30ng의 단편 MCSF-RV, 5' 말단에 인산화하여 [γ-32P]ATP로 표지된 40 pmol의 프라이머 MF2 및 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민 및 5㎕로 멸균 증류수를 포함하는 반응 혼합물, 및 추가로 30 ng의 단편 M4-MCSR, 40 pmol의 프라이머 MR1, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민 및 5㎕로 멸균 증류수를 포함하는 반응 혼합물을 따로따로 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 55℃로 냉각시켰다. 2.5㎕의 각 반응 혼합물을 혼합하고 주형-프라이머를 제조하였다.
(2)-2
15ng의 단편 MCSF-RV, 15ng의 단편 M4-MCSR, 5' 말단에 인산화하여 [γ-32P]ATP로 표지된 20 pmol의 프라이머 MF2, 20pmol의 프라이머 MR1, 최종 농도 0.01%의 프로필렌디아민 및 5㎕로 멸균 증류수를 포함하는 반응 혼합물을 2분동안 98℃에서 열-변성시킨 후, 55℃로 냉각시켰다. 2.5㎕의 각 반응 혼합물을 혼합하고 주형-프라이머를 제조하였다.
1U의 BcaBEST DNA 폴립머라제를 포함하는 20㎕의 반응 혼합물(42.5mM 트리신 완충액(pH 8.7), 12.5mM 염화칼륨, 12.5mM 황산암모늄, 0.0125% BSA, 1.25% DMSO, 5mM 마그네슘 아세테이트, 0.625mM 각각의 dNTPs)를 각 반응 혼합물에 가하였다. 생성된 혼합물을 15분동안 55℃에서 반응시켰다. 반응 후, 2.5㎕의 반응 종결용액(95% 포름아미드, 20mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루, 0.5% 크실렌 시아놀)을 5㎕의 각 반응 혼합물에 가하였다. 상기 혼합물을 3분동안 98℃에서 열-변성시켰다. 1.6㎕의 각 반응 혼합물을 8M 우레아를 포함하는 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시키고 시그날을 BAS2000(Fujix)를 사용하여 판독하고 프라이머 MR1로부터 신장된 산물을 검출하였다. 결과를 도 1B에 나타내었다. 도 1B의 서열 래더는 인산화하여 [γ-32P]ATP로 표지된 프라이머 MR1을 사용하여 M13mp18 싱글 스트랜드 DNA(Takara Shuzo)를 서열화하여 제조하고 신장 산물의 길이 측정을 위해 사용하였다. 래인 : 서로 어닐링하지 않는 주형 DNA 스트랜드; 래인 2: 서로 어닐링하는 주형 DNA 스트랜드.
도 1B에 나타낸 바와 같이, 그에 어닐링된 프라이머를 갖는 주형 DNA 스트랜드가 서로 어닐링하지 않는 주형-프라이머에 대하여 프라이머 MF2로부터 주형의 말단으로 신장된 161-bp 밴드만이 검출되었다. 한편, 상기 언급한 밴드외에, 추가로 그에 어닐링된 프라이머를 갖는 주형 DNA 스트랜드가 서로 어닐링하는 주형-프라이머에 대하여 프라이머 MF2 및 MR1에 결합한 223-bp 밴드가 검출되었다. 따라서, 그에 어닐링된 프라이머를 갖는 주형 DNA 스트랜드가 서로 어닐링하는 경우 주형 교환 반응이 일어난다는 것을 확인하였다.
실시예 1
마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 대상으로 하여 본 발명의 검출 방법을 검토하였다. 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacteriumtuberculosis) 게놈중 상대적으로 낮은 GC 함량을 갖는 부위를 증폭시키기 위한 프라이머 K-F-1033-2 (서열번호:7) 및 K-F-1133-2 (서열번호:8)를 기탁번호 AL123456하에 GeneBank에 등록된 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 프라이머 부위를 포함하는 프라이머쌍에 의해 인접한 부위의 길이는 105 bp였다. 통상의 방법에 따라 주형으로서 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈 DNA을 건성 BCG 백신 (Nippon BCG Seizo) 으로부터 추출하였다. 1 ㎕의 멸균수당 100 fg 내지 1fg의 게놈 DNA을 포함하는 일련의 희석액을 제조하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 최종 농도로 하기를 포함하는 25㎕ 최종 용량의 반응 혼합물을 제조하였다: 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% 소 혈청 알부민(BSA), 1% 디메틸설폭시드(DMSO), 500μM 각 dNTPs, 50pmol의 프라이머 K-F-1033-2 및 K-F-1133-2; 9.375U의 Pfu RNase HII, 4.375U의 Afu RNase H 또는 4U의 Tli RNase H; 2.75U의 BcaBEST DNA 폴리머라제; 1 ㎕의 주형중 하나; 및 멸균수. 반응 혼합물을 62℃으로 세팅된 열 싸이클러 Personal상에 방치하고 60분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. 반응후, 3 ㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과, 각 RNase HII 및 각 양(100fg 내지 10pg)의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 증폭 산물을 관찰하였음을 확인하였다.
실시예 2
(1) RNA 프로브를 사용하여 표적 핵산 검출 방법을 검토하였다. 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 대상으로 선택하였다. 주형으로서 실시예 1에서 제조된 BCG 게놈 DNA 1ng 또는 100pg를 50㎕ 반응 혼합물에 가하였다. 프라이머 MTIS2F(서열번호:162) 및 MTIS2R(서열번호:163) 및 검출용 RNA 프로브 MTIS (서열번호: 11) 및 MTIS-2(서열번호:12)를 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 각 프로브는 각 5' 및 3' 말단에 형광 표지 6-FAM(Glen Research) 및 TAMRA(Glen Research)을 가졌다. 4 U의 BcDNA 폴리머라제 및 18.75U의 Pfu RNase HII를 사용한 것을 제외하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. 5pmol의 RNA 프로브를 각 반응 혼합물(최종 용량 50㎕)에 가하였다. 50㎕의 각 반응 혼합물중 25㎕을 58℃에서 ICAN 반응에 사용하였다. Smart Cycler(Takara Shuzo)를 ICAN 반응 및 증폭 산물 검출에 사용하였다. 결과를 도 2A에 나타낸다. 도 2A, B, C에서, 세로축은 형광 세기, 가로축은 시간을 나타낸다. 도 2A에 나타낸 바와 같이 Smart Cycler를 사용하여 분석한 결과 관심의 대상이 되는 증폭 단편은 1ng 또는 100 pg의 주형 DNA를 사용하여 관찰할 수 있었다.
(2) 삽입시약(intercalator)을 사용하는 원-스텝 RT-ICAN 검출 시스템을 검토하였다. HCV 게놈을 대상으로 하였다. 주형으로서 RNA를 하기와 같이 제조하였다. 시약에 첨부된 안내서에 따라 TRIzol 시약(Life Technologies)를 사용하여 사전 동의서에 동의한 C형 간염 바이러스를 갖는 환자로부터 유래된 300 ㎕의 혈청으로부터 제조하고 연속하여 20 ㎕의 주사 용수(Otsuka Pharmaceutical)로 최종 희석하였다. RT-PCR을 상기 RNA 주형을 주형으로서 사용하여 수행하였다. 원-스텝 PCR 키트(Takara Shuzo)에 첨부된 매뉴얼에 따라 2 ㎕의 RNA 샘플 및 20pmol의 각 프라이머 SP6-HCV(서열번호 13) 및 T7-HCV-R(서열번호 14) 및 원-스텝 PCR 키트(TakaraShuzo)를 사용하여 50 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 열 싸이클러 Personal상에 방치하고 하기와 같이 반응시켰다: 50℃에서 15분; 94℃에서 2분; 및 94℃에서 30초; 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초에서 40 싸이클. 반응 후, 반응 혼합물을 2% SeaPlaque GTG 아가로스겔상에서 전기영동시켰다. 관심의 대상이 되는 350bp 증폭 산물을 겔로부터 절단하였다. DNA를 키트에 첨부된 안내서에 따라 EASYTRAP Ver. 2에 따라 회수하였다. 트랜스크립트 RNA를 주형으로서 회수된 DNA 및 Competive RNA 전시 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 키트에 첨부된 안내서에 따라 합성하였다. RNA를 주형으로 사용하여 원-스텝 RT-ICAN 검토하였다.
0, 1 x 105, 1 x 106또는 1 x 107개 카피에 상응하는 주형 RNA를 가하였다. 최종 농도로 하기를 포함하는 50㎕ 최종 용량의 반응 혼합물을 제조하였다: 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% BSA, 1% DMSO, 500μM 각 dNTPs, 서열번호 15 및 16으로 나타낸 프라이머 각각 50pmol, 5U의 Afu RNase HII, 4U의 BcaBEST DNA 폴리머라제, 20U의 RNase 저해제, 2.5U의 AMV RTase XL(Takara Shuzo), 주어진 카피수에 상응하는 트랩스크립트 RNA 1㎕, 및 삽입 시약으로서 SYBR Green I(SYBR Green I 핵산 Gel Stain, BioWhittaker Molecualr Applications) 보존액을 멸균수로 3000배 희석시킨 희석액 5㎕. 25㎕의 각 반응 혼합물을 53℃에서 ICAN 반응에 사용하였다. ABI PRISMTM7700 시스템(Applied Biosystem)을 ICAN 반응 및 검출에 사용하였다. 결과를 도 2B에 나타낸다. 도 2B에 나타낸 바와 같이 원-스템 RT-ICAN 방법을 사용하여 표적 핵산을 실시간으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
(3) 삽입 물질을 사용하는 ICAN 검출 방법을 검토하였다.
클라미디아(Chlamydia) 게놈을 대상으로 하였다. 프라이머 CT2F (서열번호 17) 및 CT2R (서열번호 18)를 기탁번호 X06707하에 GeneBank에 등록된 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis) 플라스미드의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 프라이머 부위를 포함하는 프라이머쌍에 의해 인접한 부위의 길이는 109 bp였다. 추가로, 프라이머 CT-FB19-3 (서열번호 19) 및 CT-RB23-2 (서열번호 20)를 클라미디아(Chlamydia)를 증폭시키기 위한 플라스미드로서 사용하였다. 프라이머 부위를 포함하는 프라이머쌍에 의해 인접한 부위의 길이는 107 bp였다. 최종 농도로 하기를 포함하는 50㎕ 최종 용량의 반응 혼합물을 제조하였다: 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 0.01% BSA, 1% DMSO, 4mM 마그네슘 아세테이트, 500μM 각 dNTPs, 프라이머 CT2F 및 CR2R 또는 프라이머 CT-FB19-3 및 CT-RB23-3 각각 50pmol, 35U의 Afu RNase HII, 8U의 BcaBEST DNA 폴리머라제, 1㎕의 샘플 및 멸균수. 삽입 시약으로서 SYBR Green I 보존액의 3000배-희석액 2.5㎕를 각 반응 혼합물 22.5㎕에 가하고 반응 혼합물을 55℃에서 ICAN 반응에 사용하였다. Smart Cycler을 ICAN 반응 및 검출에 사용하였다. 결과를 도 2C에 나타낸다. 도 2C에 나타낸 바와 같이 클라미디아(Chlamydia)를 검출하는 시스템에서 삽입 물질을 사용하여 표적 핵산을 실시간으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하여 실시간으로 표적 핵산을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3
본 발명의 방법에 사용된 시약의 보존 안정성을 하기와 같이 검토하였다.
(1) 하기를 포함하는 ICAN 반응용 프리믹스 용액을 제조하고 4℃ 또는 30℃에서 약 1개월동안 보존하였다: 1.6mM의 각 dNTPs, 101mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 317mM 아세트산칼륨, 12.7mM 아세트산 마그네슘, 0.03% 소 혈청 알부민(BSA), 3.2% 디메틸설폭시드(DMSO), 0.56U/㎕의 Afu RNase HII 및 0.35U/㎕의 BcaBEST DNA 폴리머라제.
마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하기 위한 프라이머,프라이머 K-F-1033(68)(서열번호 21) 및 K-F-1133(68)(서열번호: 22) 각각 50pmol을 포함하는 16.125㎕의 수용액을 ICAN 반응을 위해 7.875㎕의 프리믹스 용액에 가하였다. 추가로, 실시예 1에서 100pg/㎕ 또는 10pg/㎕의 농도로 제조된 BCG 게놈 DNA를 포함하는 1㎕의 수용액을 혼합물에 가하였다. 생성된 혼합물을 64℃에서 1시간동안 ICAN 반응시켰다. 반응 후, 증폭 확인을 위해 5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 적절한 기간(일수)동안 보존시킨 후 상기 공정을 반복하고, 전기영동에서 관찰되는 ICAN 증폭 산물에 기초하여 ICAN 반응용 프리믹스 용액의 안정성을 평가하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3은 본 발명의 프리믹스 용액의 보존 안정성을 나타낸 도이다. 도 3A는 4℃에서 보존한 결과이다. 레인 1: 프리믹스 제조후 즉시, 100pg의 BCG 게놈 DNA; 레인 2: 제조 후 즉시, 10pg; 레인 3: 제조 후 9일, 100pg; 레인 4; 제조 후 9일, 10pg 레인 5: 제조 후 18일, 100pg; 레인 6; 제조 후 18일, 10pg 레인 7: 제조 후 28일, 100pg; 레인 8; 제조 후 28일, 10pg.
도 3B는 30℃에서 보존한 결과이다. 레인 1: 프리믹스 제조후 즉시, 100pg의 BCG 게놈 DNA; 레인 2: 제조 후 즉시, 10pg; 레인 3: 제조 후 6일, 100pg; 레인 4; 제조 후 6일, 10pg 레인 5: 제조 후 10일, 100pg; 레인 6; 제조 후 10일, 10pg.
도 3에 나타낸 바와 같이, 프리믹스 용액을 제조한 후 28일 이상동안 4℃에서 보존한 후 프리믹스 용액을 사용하여 ICAN 반응을 안정하게 수행할 수 있음을 확인하였다. 또한, 프리믹스 용액을 제조한 후 10일 이상동안 30℃에서 보존한 후 프리믹스 용액을 사용하여 ICAN 반응을 안정하게 수행할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 증폭을 위한 ICAN 방법을 위한 시약을 상기 기술된 바와 같은 조건하에서 반응용 프리믹스 용액을 제조하고 보존하여 장기간동안 보존할 있음을 확인하였다.
추가로, 3-, 10- 또는 30-배 양의 Afu RNase HII를 포함하는 ICAN 프리믹스 용액을 제조하고 상기 기술한 바와 같은 조건하에서 보존 시험을 한 경우에도 유사한 결과를 얻었다.
실시예 4
본 발명의 방법에 사용되는 시약의 안정성 및 장기간 보존성을 하기와 같이 검토하였다.
(1) 보존용 프리믹스 용액 조성에 대하여 검토하였다. 구체적으로, 142mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 444mM 아세트산칼륨, 0.044% 소 혈청 알부민(BSA), 4.44% 디메틸설폭시드(DMSO), 0.8U/㎕의 Afu RNase HII 및 0.5U/㎕의 BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 용액 (I)을 제조하였다. 5.625㎕의 용액(I)에 하기를 가하여 프리믹스[A], 프리믹스[B], 프리믹스[C] 및 프리믹스[D]를 제조하였다: 프리믹스[A](프라이머 없음): 1㎕의 100mM 아세트산 마그네슘 및 1.25㎕의 dNPTs; 프리믹스[B](dNTPs 없음): 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하기 위한 프라이머, 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68) 각각 1㎕(50pmol㎕) 및 1㎕의 100mM 아세트산 마그네슘; 프리믹스[C](아세트산 마그네슘 없음): 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68) 각각 1㎕(50pmol㎕) 및 1.25㎕의 10mM dNPTs; 및 프리믹스[D]: 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68) 각각 1㎕(50pmol㎕), 1㎕의 100mM 아세트산 마그네슘 및 1.25㎕의 10mM dNPTs. 프리믹스 용액을 30℃에서 2시간동안 보존하였다. 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68) 각각 1㎕(50pmol㎕)을 7.875㎕의 프리믹스 [A]에 가하고; 1.25㎕의 10mM dNPTs을 8.625㎕의 프리믹스 [B]에 가하고; 1㎕의 100mM 아세트산 마그네슘을 8.875㎕의 프리믹스 [C]에 가하였다. 이어서, 프리믹스[A], 프리믹스[B], 프리믹스[C] 또는 9.875㎕의 프리믹스[D]에 24㎕의 용량으로 주사용수를 가하였다. 100pg/㎕의 농도로 1㎕의 BCG 게놈 DNA를 각 혼합물에 가하였다. 생성된 혼합물을 1시간동안 64℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 증폭 확인을 위해 5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과, 프리믹스[A], 프리믹스[B], 프리믹스[C]의 조성이 시약의 안정성을 위해 바람직하다는 것을 확인하였다.
(2) ICAN 반응에 필요한 모든 성분을 포함하는 보존용 프리믹스 용액 및 프라이머, 프라이머, Mg2+등이 제거된 보존용 프리믹스 용액을 사용하여 보존하는 동안의 변화를 검토하였다. 구체적으로, 69mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 215mM 아세트산칼륨, 0.022% 소 혈청 알부민, 2.2% 디메틸설폭시드, 8.6mM 아세트산 마그네슘, 1.1mM 각 dNPTs, 0.38U/㎕의 Afu RNase HII, 0.24U/㎕의 BcaBEST DNA 폴리머라제, 80kBq/㎕의 [α-32P]-dATP(Amersham Pharmacia Biotech), 및 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하기 위한 프라이머, 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68) 각각 5.2μm을 포함하는 프리믹스(I)을 제조하였다. 추가로, 프리믹스(I)로부터 프라이머를 제거한 프리믹스(II), 프리믹스(I)로부터 아세트산 마그네슘을 제거한 프리믹스(III)을 제조하였다. 2, 5, 또는 20시간동안 30℃에서 보존한 후 3㎕의 샘플을 각 프리믹스로부터 채취하고 -20℃에서 냉동시켰다. 샘플을 15% 아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켰다. 겔을 1.5시간동안 이동시키고 건조시킨 후 자가방사기록법에 사용하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는 자가방사기록을 나타낸 도이다. 레인 1: 2시간동안 보존된 프리믹스(III); 레인 2: 5시간동안 보존된 프리믹스(III); 레인 3: 20시간동안 보존된 프리믹스(III); 레인 4: 2시간동안 보존된 프리믹스(II); 레인 5: 5시간동안 보존된 프리믹스(II); 레인 6: 20시간동안 보존된 프리믹스(II); 레인 7: 2시간동안 보존된 프리믹스(I); 레인 8: 5시간동안 보존된 프리믹스(I); 레인 9: 20시간동안 보존된 프리믹스(I).
도 4에 나타낸 바와 같이, 프리믹스(I)로부터 프라이머 또는 아세트산 마그네슘이 제거된 프리믹스(II) 또는 프리믹스(III)의 것으로 조성을 변화시켜 프리믹스(I)에 대하여 검출된 바와 같이 보존하는 동안 거대분자 DNA의 형성을 억제시킬수 있음을 확인하였다. 따라서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 부반응(side reaction)을 억제할 수 있고, 반응 혼합물로부터 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 마그네슘 염 또는 dNTPs를 제거하여 반응을 안정화시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
(3) ICAN 반응에 필요한 모든 성분중 프라이머가 제거된 보존용 프리믹스 용액의 농도율(염 농도)을 검토하였다. 구체적으로 하기를 포함하는 ICAN 반응용 프리믹스 용액 A, ICAN 반응용 프리믹스 용액 B, ICAN 반응용 프리믹스 용액 C를 제조하고 30℃에서 보존하였다: 프리믹스 용액 A: 1.6mM의 각 dNPTs, 102mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 317mM 아세트산칼륨, 13mM 아세트산 마그네슘, 0.03% 소 혈청 알부민, 3.2% 디메틸설폭시드, 0.556U/㎕의 Afu RNase HII 및 0.349U/㎕의 BcaBEST DNA 폴리머라제; 프리믹스 용액 B: 1mM의 각 dNPTs, 64mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 200mM 아세트산칼륨, 8mM 아세트산 마그네슘, 0.02% 소 혈청 알부민, 2% 디메틸설폭시드, 0.35U/㎕의 Afu RNase HII 및 0.22U/㎕의 BcaBEST DNA 폴리머라제; 프리믹스 용액 C: 0.57mM의 각 dNPTs, 36mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 114mM 아세트산칼륨, 4.5mM 아세트산 마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민, 1.1% 디메틸설폭시드, 0.2U/㎕의 Afu RNase HII 및 0.125U/㎕의 BcaBEST DNA 폴리머라제.
마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하기 위한 프라이머, 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68) 각각 50pmol 및 24㎕으로 주사용수를 7.875㎕의 프리믹스 용액 A, 12.5㎕의 프리믹스 용액 B, 또는 22㎕의 프리믹스 용액 C에 가하였다. 100pg/㎕ 또는 10pg/㎕의 농도로 1㎕의 BCG 게놈 DNA 수용액을 그에 가하였다. 생성된 혼합물을 1시간동안 64℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 증폭 확인을 위해 5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 적절한 간격으로 하기 과정을 수행하고, 전기영동에서 관찰되는 ICAN 증폭 산물에 기초하여 평가하였다. 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5는 본 발명의 프리믹스 용액 A, 프리믹스 용액 B, 및 프리믹스 용액 C의 보존 안정성을 나타낸 전기영동을 나타낸 도이다. 레인: 1: 프리믹스 용액 A, 제조 후 13일, 100pg의 BCG 게놈 DNA; 레인: 2: 프리믹스 용액 A, 제조 후 13일, 10pg; 레인: 3: 프리믹스 용액 B, 제조 후 13일, 100pg; 레인: 4: 프리믹스 용액 B, 제조 후 13일, 10pg; 레인: 5: 프리믹스 용액 C, 제조 후 13일, 100; 레인: 6: 프리믹스 용액 C, 제조 후 13일, 10pg; 레인: 7: 프리믹스 용액 B, 제조 후 18일, 100pg; 레인: 8: 프리믹스 용액 B, 제조 후 18일, 10pg; 레인: 9: 프리믹스 용액 C, 제조 후 18일, 100; 레인: 10: 프리믹스 용액 C, 제조 후 18일, 10pg.
도 5에 나타낸 바와 같이, 프리믹스 A 및 B는 각각 약 2 및 3주동안 30℃에서 보존할 수 있음을 확인하였다. 제조후 18일 이후에도 프리믹스 C를 사용하여 ICAN 반응을 안정하게 수행할 수 있었다.
따라서, 효소를 포함하는 반응 완충액중에 포함된 염 농도는 바람직하게는 대략 반응시의 최농 염 농도이다. 구체적으로 바람직한 염 농도는 반응시 최종 염 농도의 1.5 배 미만임을 확인하였다.
(4) 효소를 포함하는 용액을 보존하고자 하는 경우, 통상적으로는 효소 농도를 증가시켜 효소의 안정성을 증가시킨다. 보존용 프리믹스의 안정성을 검토하였다. ICAN 반응의 결정을 상쇄하기 위하여 반응 직전 염 농도를 저하시키고 염을 가함으로써 효소의 농도를 고도로 유지하지 하도록 보존용 프리믹스를 디자인하였다. 구체적으로 하기를 포함하는 ICAN 반응용 프리믹스 용액을 제조하고 30℃에서 보존하였다: 2.5mM의 각 dNPTs, 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4mM 아세트산 마그네슘, 0.05% 소 혈청 알부민, 0.0.875U/㎕의 Afu RNase HII 및 0.55U/㎕의 BcaBEST DNA 폴리머라제.
마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하기 위한 프라이머, 프라이머 K-F-1033(68) 및 K-F-1133(68) 각각 50pmol, 33.64mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 105.22mM 아세트산칼륨, 4.21mM 아세트산 마그네슘 및 1.32% 디메틸 설폭시드를 포함하는 19㎕의 수용액을 5㎕의 ICAN 반응용 프리믹스 용액에 가하였다. 100pg/㎕ 또는 10pg/㎕의 농도로 1㎕의 BCG 게놈 DNA 수용액을 그에 가하였다. 생성된 혼합물을 1시간동안 64℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 증폭 확인을 위해 5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다.
적절한 간격으로 하기 과정을 수행하고, 전기영동에서 관찰되는 ICAN 증폭 산물에 기초하여 평가하였다. 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6은 본 발명의 프리믹스 용액의 보존 안정성을 나타낸 전기영동을 나타낸 도이다. 레인: 1: 프리믹스 용액 제조 후 즉시, 100pg의 BCG 게놈 DNA; 레인: 2: 제조 후 즉시, 10pg; 레인: 3: 제조 후 21일, 100pg; 레인: 4: 제조 후 21일, 10pg; 레인: 5: 제조 후 25일, 100pg; 레인: 6: 제조 후 25일, 10pg; 레인: 7: 제조 후 32일, 100pg; 레인: 8: 제조 후 32일, 10pg.
도 6에 나타낸 바와 같이, 프리믹스 용액은 32일 이상동안 30℃에서 보존할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 증폭을 위한 ICAN 방법을 위한 시약을 상기 기술된 바와 같은 조건하에서 반응용 프리믹스 용액을 제조하고 보존하여 장기간동안 보존할 있음을 확인하였다.
BcaBEST DNA 폴리머라제 및 Tli RNase H의 배합물을 사용하여 상기 (1) 내지 (4)에 기술한 같이 검토하였을 때 유사한 결과를 얻었다.
따라서, 반응시 효소(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H) 또는 염의 최종 농도를 1로 정의할 때 농도율 비(효소 농도율/염 농도율의 비)는 바람직하게 1 초과임을 확인하였다.
사용되는 RNase HII의 양을 3-, 10- 또는 30-배까지 증가시켜 상기 (1) 내지 (4)에 기술한 같이 검토하였을 때 유사한 결과를 얻었다.
실시예 5
본 발명의 방법을 사용하여 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium) 컴플렉스 검출을 검토하였다. 우선, 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium) 및 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)에 대한 양성 대조군을 제조하였다. 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium) 및 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)로부터의 16S RNA 유전자의 서열중 일부에 상응하는 560-bp 증폭 산물은 신장 반응용 Ex Taq DNA 폴리머라제를 사용한 후 [BioTechniques, 9(3):298-300 (1990)]에 기술된 방법에 따라 10개의 74-mer 합성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 증폭 산물을 DNA 결찰(Ligation) 키트 Ver. 2 (Takara Shuzo)을 사용하여 pT7 Blue T 벡터내로 도입하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 E. coli JM109을 형질전환시켜 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium) 및 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)에 대한 양성 대조군으로서 플라스미드를 제조하였다. 서열번호 25 내지 31의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 Myco-F-1, Myco-F-2, Myco-F-3, Myco-R-1, Myco-R-1-2, Myco-R-2I 및 Myco-R-2A를 합성하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 최종 농도로 하기를 포함하는 25㎕의 최종 용량의 반응 혼합물을 제조하였다: 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4mM 아세트산 마그네슘, 0.01% BSA, 1% DMSO, 500μM의 각 dNPTs, 4.4U의 Afu RNase HII 또는 4U의 Tli RNase H, 4U의 BcaBEST DNA 폴리머라제, 주형으로서 카피수 105개의 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium) 및 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)에 대한 양성 대조군, 및 상향 프라이머 및 하향 프라이머 각각 25pmol. 반응 혼합물을 65℃로 세팅된 열 싸이클러 Personal상에 방치하고 60분동안 인큐베이션시켰다. 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium)에 대한 양성 대조군을 주형으로 사용하였을 때, RNase H 및 프라이머 쌍: Myco-F-1 및 Myco-R-1; Myco-F-1 및 Myco-R-1-2; Myco-F-1 및 Myco-R-2A; Myco-F-2 및 Myco-R-1; Myco-F-2 및 Myco-R-1-2; Myco-F-2 및 Myco-R-2A; Myco-F-3 및 Myco-R-1; Myco-F-3 및 Myco-R-1-2; 또는 Myco-F-3 및 Myco-R-2A를 사용하여 아가로스 겔 전기영동에서 관심의 대상이 되는 101-bp, 96-bp, 96-bp, 101-bp, 96-bp, 96-bp, 106-bp, 101-bp 및 101-bp 증폭 산물이 관찰되었다. 프라이머 쌍 Myco-F-1 및 Myco-R-2I; Myco-F-2 및 Myco-R-2I; 또는 Myco-F-3 및 Myco-R-2I을 사용하였을 때 증폭 산물은 관찰되지 않았다.
마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)에 대한 양성 대조군을 주형으로 사용하였을 때, RNase H 및 프라이머 쌍: Myco-F-1 및 Myco-R-1; Myco-F-1 및 Myco-R-1-2; Myco-F-1 및 Myco-R-2I; Myco-F-2 및 Myco-R-1; Myco-F-2 및 Myco-R-1-2; Myco-F-2 및 Myco-R-2I; Myco-F-3 및 Myco-R-1; Myco-F-3 및 Myco-R-1-2; 또는 Myco-F-3 및 Myco-R-2I를 사용하여 아가로스 겔 전기영동에서 관심의 대상이 되는 101-bp, 96-bp, 96-bp, 101-bp, 96-bp, 96-bp, 106-bp, 101-bp 및 101-bp 증폭 산물이 관찰되었다. 프라이머 쌍 Myco-F-1 및 Myco-R-2A; Myco-F-2 및 Myco-R-2A; 또는 Myco-F-3 및 Myco-R-2A를 사용하였을 때 증폭 산물은 관찰되지 않았다.
상기 언급된 결과에 기초하여, 프라이머 Myco-R-2I 또는 Myco-R-2A를 사용하여 주형-특이성 반응에 의해 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium)을 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)로부터 식별할 수 있음을 확인하였다. 각각의 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 아미움-프로브(서열번호 32) 또는 인트라셀룰라르-프로브(서열번호 33)을 사용하여 증폭 단편과의 도트 블랏 하이브리제이션을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 각 반응 혼합물 1㎕를 5분동안 98℃에서 변성시키고 신속하게 얼음상에서 냉각시키고, Hybond-NTM(Amersham Pahrmacia Biotech)상에 스팟팅하였다. UV 검토후, 막을 하이브리제이션 백에 놓았다. 10ml의 하이브리제이션 용액(0.5M 디소듐 하이드로겐포스페이트(pH 7.2)), 1mM 디에틸렌디아민테트라아세트산 및 7% 소듐 라우릴 설페이트)를 그에 가하였다. 프리하이브리제이션을 30분동안 42℃에서 수행하였다. 100ng/㎕의 농도로 아미움-프로브 또는 인트라셀룰라르-프로브를 포함하는 10㎕의 용액을 열변성시키고 프리하이브리제이션 반응 시스템에 가하였다. 60분동안 42℃에서 하이브리제이션한 후, 막을 66.6mM 염화나트륨, 66.6mM 트리소듐 시트레이트 하이드레이트 및 0.1% 소듐 라우릴 설페이트를 포함하는 용액중에 실온에서 5분동안 2회 세척하였다. 5mg/ml의 농도의 호스라디쉬 퍼옥시다아제 스트렙토아비딘 컨쥬게이트(horseradish peroxidase streptoavidin conjugate(Pierce))을 포함하는 2㎕의 용액을 6ml의 세척 완충액(0.3M 염화나트륨, 17.3mM 소듐 디하이드로겐포스페이트 디하이드레이트, 2.5mM EDTA 및 0.1% 소듐 라우릴 설페이트)에 가하여 제조된 혼합물에서 막을 42℃에서 12분동안 인큐베이션시켰다.
막을 실온에서 세척 완충액 이어서 실온에서 10ml의 0.1M 시트레이트 완충액(pH 5.0)으로 2회 세척하고, 에탄올중 2mg/ml 농도의 테트라메틸벤지딘(TMB, Nacalai Tesque)를 포함하는 용액 250㎕, 3% 과산화수소 5㎕ 및 5ml의 0.1M 시트레이트 완충액의 혼합물을 약 10분동안 암실에서 반응시켰다. 발색(color development) 후, 탈이온수를 가하여 반응을 종결시켰다.
결과, 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium)에 대한 양성 대조군으로부터의 증폭 산물에 대한 시그날은 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 아미움-프로브를 사용하였을 때만 관찰할 수 있었고, 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 인트라셀룰라르-프로브를 사용하였을 때는 어느 시그날도 관찰할 수 없었다. 한편, 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)에 대한 양성 대조군으로부터의 증폭 산물에 대한 시그날은 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 인트라셀룰라르-프로브를 사용하였을 때만 관찰할 수 있었고, 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 아미움-프로브를 사용하였을 때는 어느 시그날도 관찰할 수 없었다. 이 결과에 기초하여, 이들 프로브를 사용하여 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium)을 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)로부터 식별할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6
본 발명의 방법을 사용하여 고노코쿠스(gonococcus) 검출을 검토하였다. 서열번호 34 내지 37의 뉴클레오티드 서열을 갖는 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) CppB 유전자, 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) 플라스미드 pJD4 유전자 및 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) DNA 시토신 메틸트렌스퍼라제(M. NgoMIII) 유전자로부터 증폭된 560-bp 단편을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수득하였다. 10개의 67-mer 합성 프라이머를 사용하여 유사한 방법으로 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) N-4 시토신-특이 메틸트렌스퍼라제 유전자로부터 490-bp 단편을 증폭시켰다. 증폭 산물을 pT7 Blue T 벡터내로 도입하여 양성 대조군 A, B, C 및 D를 작제하였다.
서열번호:38-63 및 164-165의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 NEI-5103, NEI-5150, CppB-F1, CppB-F2, CppB-F3, CppB-R1, CppB-R2, CppB-R3, pJDB F-1, pJDB F-2, pJDB R-1, pJDB R-2, pJDB R-3, M.Ngo F-1, M.Ngo F-2, M.Ngo F-3, M.Ngo R-1, M.Ngo R-2, M.Ngo R-3, M.Ngo R-4, 시토신 F-1, 시토신 F-2, 시토신 F-3, 시토신 R-1, 시토신 R-2, 시토신 R-3, pJDB10F 및 pJDB10R을 합성하였다. 주형으로서 카피수 106개의 양성 대조군 B 및 프라이머 쌍 NEI-5105 및 NEI-5150을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 결과, 69-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 증폭 단편을 나일론 막에 스팟팅하고, 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 NEI-5130(서열번호 64)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
유사하게, 주형으로서 카피수 106개의 양성 대조군 A 및 프라이머 쌍: CppB-F1 및 CppB-R1; CppB-F1 및 CppB-R2; CppB-F1 및 CppB-R3; CppB-F2 및 CppB-R1; CppB-F2 및 CppB-R2; CppB-F2 및 CppB-R3; CppB-F3 및 CppB-R1; CppB-F3 및 CppB-R2; 또는 CppB-F3 및 CppB-R3을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 60-bp 증폭 단편이 모든 경우에서 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 증폭 단편의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 NEI-CppB 프로브-1(서열번호 65)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
주형으로서 카피수 106개의 양성 대조군 A 및 프라이머 쌍: pJDB F-1 및 pJDB R-1; pJDB F-1 및 pJDB R-2; pJDB F-1 및 pJDB R-3; pJDB F-2 및 pJDB R-1; pJDB F-2 및 pJDB R-2; 또는 pJDB F-2 및 pJDB R-3을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 91-bp 증폭 단편이 모든 경우에서 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 프라이머 쌍: pJDB10F 및 pJDB10R을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 71-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 증폭 단편을 나일론 막에 스팟팅하고, 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 NEI-CppB 프로브-2(서열번호 66)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
유사하게, 주형으로서 카피수 106개의 양성 대조군 C 및 프라이머 쌍: M.Ngo F-1 및 M.Ngo R-1; M.Ngo F-1 및 M.Ngo R-2; M.Ngo F-1 및 M.Ngo R-3; M.Ngo F-1 및 M.Ngo R-4; M.Ngo F-2 및 M.Ngo R-1; M.Ngo F-2 및 M.Ngo R-2; M.Ngo F-2 및 M.Ngo R-3; M.Ngo F-2 및 M.Ngo R-4; M.Ngo F-3 및 M.Ngo R-1; M.Ngo F-3 및 M.Ngo R-2; M.Ngo F-3 및 M.Ngo R-3; 또는 M.Ngo F-3 및 M.Ngo R-4을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 60-bp 증폭 단편이 모든 경우에서 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 증폭 단편의 도트 블랏 하이브리제이션을5' 말단에 바이오틴으로 표지된 M.Ngo-프로브(서열번호 67)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다. 추가로, 주형으로서 카피수 106개의 양성 대조군 D 및 프라이머 쌍: 시토신 F-1 및 시토신 R-1; 시토신 F-1 및 시토신 R-2; 시토신 F-1 및 시토신 R-3; 시토신 F-2 및 시토신 R-1; 시토신 F-2 및 시토신 R-2; 시토신 F-2 및 시토신 R-3; 시토신 F-3 및 시토신 R-1; 시토신 F-3 및 시토신 R-2; 또는 시토신 F-3 및 시토신 R-3을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 70-bp 증폭 단편이 모든 경우에서 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 시토신-프로브(서열번호 68)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
실시예 7
본 발명의 방법을 사용하여 인간 B형 간염 바이러스(HBV)의 검출을 검토하였다. 구체적으로 서열번호 69 및 70으로 나타낸 HBV X 단백질 유전자의 560-bp를 실시예 5에 기술외 방법에 따라 증폭시키고, pT7 Blue T 벡터에 도입하고, HBV 양성 대조군 1-T 및 HBV 양성 대조군 1-G으로서 사용하였다. 서열번호 71 내지 78의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 HBV-F-1, HBV-F-2, HBV-F-3, HBV-F-4, HBV-R-1, HBV-R-2, HBV-R-3 및 HBV-R-4를 합성하였다. 주형으로서 카피수 106개의 HBV 양성 대조군 1-G 또는 HBV 양성 대조군 1-T 및 프라이머 쌍: HBV-F-1 및 HBV-R-1; HBV-F-1 및 HBV-R-2; HBV-F-2 및 HBV-R-1; 또는 HBV-F-2 및 HBV-R-2을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 81-bp, 76-bp, 76-bp 및 71-bp 증폭 단편이 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다.
주형으로서 카피수 106개의 HBV 양성 대조군 1-T 및 HBV 양성 대조군 1-G 및 프라이머 쌍: HBV-F-3 및 HBV-R-3; HBV-F-3 및 HBV-R-4; HBV-F-4 및 HBV-R-3; 또는 HBV-F-4 및 HBV-R-4을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 84-bp, 79-bp, 78-bp 및 73-bp 증폭 단편이 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 프라이머 HBV-F-1 및 HBV-R-1; HBV-F-1 및 HBV-R-2; HBV-F-2 및 HBV-R-1; 및 HBV-F-2 및 HBV-R-2를 사용하여 수득한 증폭 단편을 나일론 막에 스팟팅하고, 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 HBV-프로브 1(서열번호 79)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다. 유사하게, 프라이머 HBV-F-3 및 HBV-R-3; HBV-F-3 및 HBV-R-4를 사용하여 수득한 증폭 단편의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 HBV-프로브 2(서열번호 80)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
실시예 8
본 발명의 방법을 사용하여 HCV 검출을 검토하였다. 최종 농도로 하기를 포함하는 50㎕의 최종 용량의 반응 혼합물을 제조하였다: 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4mM 아세트산 마그네슘, 0.01% BSA, 1% 디메틸 설폭시드, 500μM의 각 dNPTs, 50pmol의 각 프라이머 HCV-A2-S 및 HCV-A2-A; HCV-A4-S 및 HCV-A4-A; HCV-A4-S19 및 HCV-A4-A19; HCV-F1 및 HCV-R1; 또는 HCV-F2 및 HCV-R2(서열번호 81-86 및 88-89), 20U의 Afu RNase HII 또는 4U의 Tli RNase H, 4U의 BcaBEST DNA 폴리머라제, 20U의 RNase H 저해제, 1.25U의 AMV RTase XL, 및 주형으로서 카피수 105개의 실시예 2-(2)에 기술된 바와 같은 RNA 트랜스크립트. 반응 혼합물을 53℃로 세팅된 열 싸이클러 Personal상에 방치하고 60분동안 인큐베이션시켰다. 반응 후 3㎕의의 각 반응 혼합물을 3% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과, 관심의 대상이 되는 74-bp, 76-bp, 78-bp, 61-bp 및 61-bp 증폭 산물이 RNase H를 사용할 때 관찰되었다. 프라이머 HCV-A2-S 및 HCV-A2-A; HCV-A4-S 및 HCV-A4-A; HCV-A4-S19 및 HCV-A4-A19를 사용하여 수득한 증폭 단편의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 HCV-C 프로브(서열번호 87)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다. 유사하게, HCV-F1 및 HCV-R1; 또는 HCV-F2 및 HCV-R2를 사용하여 수득한 증폭 단편의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 HCV-D 프로브(서열번호 92)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
실시예 9
원-스텝 증폭 방법에 본 발명의 방법을 적용시키는 것에 대하여 검토하였다. HIV를 대상으로 사용하였다.
(1) 트랜스크립트 RNA 제조
주형으로서 트랜스크립트 RNA를 제조하였다. HIV gag 영역이 도입된 플라스미드(ATCC 40829)를 구입하였다. HIV gag 영역중 일부에 상응하는 약 1.4kbp의 PCR 증폭 산물을 주형으로서 플라스미드, 프라이머 쌍 SP6-HIV-F (서열번호:93) 및 HIV-R (서열번호:94) 및 Ex Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 수득하였다. 트랜스크립트 RNA는 Kit에 첨부된 안내서에 따라 주형으로서 PCR 증폭 산물 및 Competitive RNA Transcription Kit(Takara Shuzo)를 사용하여 합성하였다. RNA를 원-스텝 RT-ICAN 검토용 RNA 주형으로서 사용하였다.
(2) 원-스텝 RT-ICAN를 사용한 HIV 검출용 프라이머의 검토
서열번호 95 내지 103의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 HIV-F1, HIV-F2, HIV-F3, HIV-F4, HIV-R1, HIV-R2, HIV-R3, HIV-R4 및 HIV-R4M를 합성하였다. 반응을 하기와 같이 수행하였다. 간단하게, 최종 농도로 하기를 포함하는 25㎕의 최종 용량의 반응 혼합물을 제조하였다: 32mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 7mM 아세트산 마그네슘, 0.01% BSA, 1% DMSO, 500μM의 각 dNPTs, 2.2U의 Afu RNase HII 또는 4U의 Tli RNase H, 5.5U의 BcaBEST DNA 폴리머라제, 0.625U의 AMV RTase XL, 카피수 105개의 트랩트크립트 DNA 및 상향 프라이머 및 하향 프라이머 각각 25pmol. 반응 혼합물을 55℃로 세팅된 열 싸이클러 Personal상에 방치하고 60분동안 인큐베이션시켰다. 100-bp, 74-bp, 76-bp, 72-bp, 72-bp, 72-bp, 74-bp, 70-bp, 70-bp, 76-bp, 78-bp, 74-bp 및 74-bp 증폭 단편이 RNase H 및프라이머 쌍 HIV-F1 및 HIV-R1; HIV-F2 및 HIV-R2; HIV-F2 및 HIV-R3; HIV-F2 및 HIV-R4; HIV-F2 및 HIV-R4M; HIV-F3 및 HIV-R2; HIV-F3 및 HIV-R3; HIV-F3 및 HIV-R4; HIV-F3 및 HIV-R4M; HIV-F4 및 HIV-R2; HIV-F4 및 HIV-R3; HIV-F4 및 HIV-R4; 및 HIV-F4 및 HIV-R4M를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 HIV-A 프로브(서열번호 104) 또는 HIV-B 프로브(서열번호 105)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 HIV-A 프로브의 경우에는 프라이머 쌍 HIV-F1 및 HIV-R1을 사용하여 수득한 증폭 사물에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었고, 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 HIV-B 프로브의 경우에는 프라이머 쌍 HIV-F2 및 HIV-R2; HIV-F2 및 HIV-R3; HIV-F2 및 HIV-R4; HIV-F2 및 HIV-R4M; HIV-F3 및 HIV-R2; HIV-F3 및 HIV-R3; HIV-F3 및 HIV-R4; HIV-F3 및 HIV-R4M; HIV-F4 및 HIV-R2; HIV-F4 및 HIV-R3; HIV-F4 및 HIV-R4; 및 HIV-F4 및 HIV-R4M를 사용하여 수득한 증폭 사물에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
실시예 10
본 발명의 방법을 사용하여 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출을 검토하였다. 증폭시키고자 하는 관심의 대상이 되는 영역은 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자로부터 선별하였다. 우선, 프라이머 coa-PCR-F (서열번호:106) 및 coa-PCR-R (서열번호:107), 주형으로서 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 게놈 및 Ex Taq DNA폴리머라제를 사용하여 PCR에 의해 221-bp 증폭 산물을 수득하였다. 증폭 산물을 pT7 Blue T 벡터내로 도입하여 coa 유전자에 대한 양성 대조군을 제조하였다.
서열번호:108-117의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 coa-F1, coa-F2, coa-F3, coa-F4, coa-F5, coa-R1, coa-R2, coa-R3, coa-R4 및 coa-R5를 합성하였다. 주형으로서 카피수 106개의 양성 대조군 및 프라이머 쌍 coa-F1 및 coa-R1; coa-F1 및 coa-R2; coa-F2 및 coa-R1; coa-F2 및 coa-R2; coa-F3 및 coa-R3; coa-F3 및 coa-R4; coa-F3 및 coa-R5; coa-F4 및 coa-R3; coa-F4 및 coa-R4; coa-F4 및 coa-R5; coa-F5 및 coa-R3; coa-F5 및 coa-R4; 또는 coa-F5 및 coa-R5을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 59-bp, 69-bp, 75-bp, 85-bp, 95-bp, 101-bp, 98-bp, 89-bp, 95-bp, 92-bp, 107-bp, 113-bp 및 110-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 프라이머 쌍 coa-F1 및 coa-R1; coa-F1 및 coa-R2; coa-F2 및 coa-R1; 및 coa-F2 및 coa-R2을 사용사여 수득한 증폭 산물의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 coa-A 프로브(서열번호 118)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 모든 스팟에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다. 유사하게, 프라이머 쌍 coa-F3 및 coa-R3; coa-F3 및 coa-R4; coa-F3 및 coa-R5; coa-F4 및 coa-R3; coa-F4 및 coa-R4; coa-F4 및 coa-R5; coa-F5 및 coa-R3; coa-F5 및 coa-R4; 및 coa-F5 및 coa-R5를 사용사여 수득한 증폭 산물의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 coa-B 프로브(서열번호 119)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 모든 스팟에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
실시예 11
본 발명의 방법을 사용하여 클라미디아(Chlamydia) 검출을 검토하였다. 클라미디아(Chlamydia) 유전자(서열번호 120)의 부위에 상응하는 560-bp 증폭 산물을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 pT7 Blue T 벡터내로 도입하여 클라미디아(Chlamydia) 양성 대조군을 제조하였다. 서열번호:121-127의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 CT-FB19, CT-FB19-3, CT-FB-19-3-21, CT-FB19-3-23, CT-RB21, CT-RB23-2 및 CT-RB23-2-24를 합성하였다. 주형으로서 카피수 106개의 클라미디아(Chlamydia) 양성 대조군 및 프라이머 쌍 CT-FB19 및 CT-RB21; CT-FB19 및 CT-RB23-2; CT-FB19-3 및 CT-RB21; CT-FB19-3 및 CT-RB23-2; CT-FB19-3 및 CT-RB23-2-24; CT-FB-19-3-21 및 CT-RB23-2; CT-FB-19-3-21 및 CT-RB23-2-24; CT-FB19-3-23 및 CT-RB23-2; 또는 CT-FB19-3-23 및 CT-RB23-2-24을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 125-bp, 116-bp, 116-bp, 107-bp, 107-bp, 107-bp, 107-bp, 107-bp 및 107-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 증폭 산물의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 CT-프로브(서열번호 128)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 모든 스팟에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
(2) 표적으로서 또다른 영역을 사용하여 클라미디아(Chlamydia) 검출을 검토하였다. 클라미디아(Chlamydia) 잠적(cryptic) 유전자의 일부에 상응하는 560-bp 증폭 단편을 상기 (1)에 기술된 방법에 따라 pT7 Blue T 벡터내로 도입하여 클라미디아(Chlamydia) 양성 대조군 2를 제조하였다. 서열번호:130-135 및 서열번호: 166-167의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 CT-F1212-20, CT-F1212-21, CT-F1212-22, CT-R1272-20, CT-R1272-21, CT-R1272-22, CT-F1215-4R-22 및 CT-R1267-3R-18를 합성하였다. 주형으로서 카피수 106개의 클라미디아(Chlamydia) 양성 대조군 2 및 프라이머 쌍 CT-F1212-20 및 CT-R1272-20; CT-F1212-20 및 CT-R1272-21; CT-F1212-20 및 CT-R1272-22; CT-F1212-21 및 CT-R1272-20; CT-F1212-21 및 CT-R1272-21; CT-F1212-21 및 CT-R1272-22; CT-F1212-22 및 CT-R1272-20; CT-F1212-22 및 CT-R1272-21; 또는 CT-F1212-22 및 CT-R1272-22를 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 결과, 모든 경우에서 관심의 대상이 되는 61-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 증폭 산물의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 CT-1234 프로브(서열번호 136)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 모든 스팟에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다. 추가로, 프라이머 쌍 CT-F1215-4R-22 및 CT-R1267-3R-18을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 53-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 증폭 산물의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 CT-1236 프로브(서열번호 168)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 모든 스팟에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
실시예 12
본 발명의 방법을 사용하여 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) 검출을 검토하였다. 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) ATPase 오페론 유전자 일부(서열번호 137 및 138)에 상응하는 560-bp 증폭 산물을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 pT7 Blue T 벡터내로 도입하여 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) 양성 대조군 A 및 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) 양성 대조군 B를 제조하였다. 서열번호:139-146의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 Myco-140, Myco140-22, Myco-706, MPF-910, Myco-190, Myco-190-22, Myco-850 및 MPR-1016을 합성하였다. 주형으로서 카피수 106개의 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) 양성 대조군 A 및 프라이머 쌍 Myco-140 및 Myco-190; Myco140-22 및 Myco-190; Myco140-22 및 Myco-190-22; 또는 Myco-140 및 Myco-190-22를 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 결과, 모든 경우에서 관심의 대상이 되는 63-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 주형으로서 카피수 106개의 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) 양성 대조군 B 및 프라이머 쌍 Myco-706 및 Myco-850; 또는 MPF-910 및 MPR-1016을 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 85-bp 및 107-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 프라이머 쌍 Myco-140 및 Myco-190; Myco140-22 및 Myco-190; Myco140-22 및 Myco-190-22; 및 Myco-140 및 Myco-190-22을 사용하여 수득한 증폭 산물의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 Myco-170-프로브(서열번호 147)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 모든 스팟에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다. 추가로, 프라이머 쌍 MPF-910 및 MPR-1016을 사용하여 수득한 증폭 산물의 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 Myco-952-프로브(서열번호 149)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 모든 스팟에 대하여 관심의 대상이 되는 시그날이 관찰되었다.
실시예 13
본 발명의 방법을 사용하여 메티실린-내성 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(RMSA) 검출을 검토하였다. 증폭시키고자 하는 관심의 대상 영역을 MecA 유전자로부터 선별하였다. MecA 유전자, MecA-A 및 MecA-B(서열번호 150 및 151)의 일부에 상응하는 560-bp 증폭 산물을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 pT7 Blue T 벡터내로 도입하여 MecA 양성 대조군 A 및 B를 제조하였다. 서열번호:152-15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 MecA-S525, MecA-A611, MecA-S1281 및 MecA-A1341을 합성하였다. 주형으로서 카피수 106개의 MecA 양성 대조군 A 및 프라이머 쌍 MecA-S525 및 MecA-A611, 또는 주형으로서 카피수 106개의 MecA 양성 대조군 B 및 프라이머 쌍 MecA-S1281 및 MecA-A1341를 사용하여 실시예 5에 기술된 조건하에서 ICAN 반응을 수행하였다. 결과, 106-bp 및 83-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다.
프라이머 쌍 MecA-S525 및 MecA-A611을 사용하여 수득한 증폭 산물에 대한 ICAN 반응 혼합물 1㎕을 나일론 막 Hybond-N상에 스팟팅하고, 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 MecA-A 프로브(서열번호 156)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 추가로, 프라이머 쌍 MecA-S1281 및 MecA-A1341을 사용하여 수득한 증폭 산물을 유사한 방식으로 나일론 막상에 스팟팅하고, 도트 블랏 하이브리제이션을 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 MecA-B 프로브(서열번호 157)을 사용하여 실시예 5에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 결과, 두개의 프로브를 사용하여 시그날을 관찰하고, 관심의 대상이 되는 영역의 증폭을 확인하였다.
실시예 14
본 발명의 방법에 사용할 수 있는 RNase H를 검토하였다.
(1) 서열번호:158 및 159의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 pDON-AI-1(22) 및 pDON-AI-2(23)를 벡터 플라스미드 pDON-AI (Takara Shuzo)의 패키지(packaging) 영역의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 10 fg의 pDON-AI DNA 또는 음성 대조군을 위하여 물을 포함하는 용액 1 ㎕, 100 pmol의 각각 프라이머, 0.5 mM 각각의 dNTPs, 32 mM HEPES-수산화칼륨 완충액 (pH 7.8), 100 mM 아세트산칼륨, 4.0 mM 아세트산마그네슘, 0.01% 송아지 혈청 알부민, 1.0% 디메틸 설폭시드, 2.64 U의 Bca DNA 폴리머라제 및 8.75, 4.38, 2.19, 1.09, 0.55 또는 0.27 U의 Afu RNase HII, 4.69, 2.34, 1.17, 0.59, 0.29, 0.15 또는 0.07 U의 Pfu RNase HII, 또는 14, 7, 3.5, 1.75, 0.875 또는 0.438 U의 Pho RNase HII을 포함하는 총 용량 25㎕의 반응 혼합물을 64℃에서 1시간동안 열 싸이클러에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 5 ㎕ 각각의 반응 혼합물을 3% 아가로스 겔 전기영동시켰다.결과, 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 유니트 값과 상관없이 Afu RNase HII를 사용하여 관찰하였다. 추가로, 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 0.59 내지 4.69 U의 Pfu RNase HII 또는 1.75 내지 14 U의 Pho RNase HII을 사용하여 관찰하였다. 이 결과에 기초하여, 모든 열-내성 RNase HII를 본 발명의 방법에 바람직하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
(2) 마우스 유발가능 NO 합성 효소(inducible NO synthase (iNOS))의 mRNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성된 서열번호:160 및 161의 뉴클레오티드 서열을 갖는 각각의 프라이머 50pmol, 1 ㎕의 cDNA prepared according to a conventional method from 상업적으로 이용가능한마우스 세포로부터 통상의 방법에 따라 제조된 cDNA (50ng의 RNA에 상응), 5 ㎕의 10 x Ex Taq 완충액 (Takara Shuzo), 1.25 U의 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 및 0.2 mM 각각의 dNTPs을 포함하는 총 용량 50 ㎕의 반응 혼합물을 열 싸이클러를 사용하여 반응시켰다. 프로그램음 하기와 같다: 94℃에서 2분동안 1싸이클; 94℃에서 30초동안, 55℃에서 30초동안및 72℃에서 30초동안 30 싸이클; 72℃에서 5분동안 1싸이클. 마우스 iNOS cDNA로부터의 PCR 증폭 단편을 본 발명의 방법에서 주형으로서 사용되는 플라스미드 벡터 pT7 Blue T-벡터 (Novagen)내로 클로닝하였다. 주형으로서 10 fg의 플라스미드 DNA 또는 음성 대조군으로서 1 ml의 물을 포함하는 1 ㎕ 용액, 100 pmol 각각의 프라이머 NS5 (SEQ ID NO:9) 및 NS6 (SEQ ID NO:10), 0.5 mM 각각의 dNTPs, 32 mM HEPES-수산화칼륨 완충액 (pH 7.8), 100 mM 아세트산칼륨, 4.0 mM 아세트산마그네슘, 0.01% 송아지 혈청 알부민, 1.0% 디메틸 설폭시드, 2.64 U의 Bca DNA 폴리머라제 및 10, 5, 2.5, 1.25, 0.25, 0.125 U의 메탄노코쿠스 자나시(Methanococcus jannashi)(Mja) RNase HII, Tce RNase HII 또는 Tli RNase HII를 포함하는 최종 용량 25 ㎕의 반응 혼합물을 62℃에서 1시간동안 열 싸이클러에서 인큐베이션시켰다. Mja RNase HII를 Structure, 8:897-904에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 반응 후, 5 ㎕ 각각의 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7은 3가지 형태의 RNase H를 사용하여 수득한 증폭 산물의 아가로스 겔 전기영동을 나타내는 도이다. 도 7A, 7B 및 7C에 각각 메탄노코쿠스 자나시(Methanococcus jannashi) RNase HII, 써모코쿠스 셀러(Thermococcus celer) RNase HII 및 써모코쿠스 리토라리스(Thermococcus litoralis) RNase HII를 사용하여 얻은 결과를 나타낸다. 레인 1: 10 U의 RNase HII; 레인 2: 10 U의 RNase HII, 음성 대조군; 레인 3: 5 U의 RNase HII; 레인 4: 5 U의 RNase HII, 음성 대조군; 레인 5: 2.5 U의 RNase HII; 레인 6: 2.5 U의 RNase HII, 음성 대조군; 레인 7: 1.25 U의 RNase HII; 레인 8: 1.25 U의 RNase HII, 음성 대조군; 레인 9: 0.25 U의RNase HII; 레인 10: 0.25 U의 RNase HII, 음성 대조군; 레인 11: 0.125 U의 RNase HII; 및 레인 12: 0.125 U의 RNase HII 음성 대조군.
도 7에 나타낸 바와 같이, 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 0.125 내지 10 U의 Mja RNase HII, 1 내지 5 U의 Tce RNase HII, 또는 0.125 내지 5 U의 Tli RNase HII를 사용하여 관찰하였다. 이 결과에 기초하여, 모든 열-내성 RNase HII를 본 발명의 방법에 바람직하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
(3) RNase H의 양 및 상이한 유형을 달리하여 본 발명의 방법을 추가로 실시예 5에 기술된 반응 조건하에서 검토하였다. 1 U의 써모코쿠스 리토라리스(Thermococcus litoralis) RNase HII 또는 8.75 U의 써모코쿠스 셀러(Thermococcus celer) RNase HII를 RNase H로서 사용하였다. 주형으로서 카피수 106개의 HBV 양성 대조군 1-T 실시예 7에서 제조된 프라이머 쌍 HBV-F-2 및 HBV-R-1을 사용하여 증폭 반응을 수행하였다. 결과, 관심의 대상이 되는 76-bp 증폭 단편이 RNase H를 사용한 아가로스 겔 전기영동상에서 관찰되었다. 이 결과에 기초하여 두개의 RNase HII 모두를 본 발명의 방법에 바람직하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 15
본 발명의 검출 방법을 내부 컨트롤을 포함하는 반응 시스템을 사용하여 검토하였다. 우선, 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 내부 컨트롤을 실시예 5에 기술된 방법으로 제조하였다. 서열번호:169의 뉴클레오티드 서열을 갖는 169-bp 증폭 산물은 신장 반응용 Ex Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 [BioTechniques, 9(3):298-300 (1990)]에 기술된 방법에 따라 4개의 60-mer 합성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. 증폭 산물을 DNA 결찰 Kit Ver. 2 (Takara Bio)을 사용하여 pT7 Blue T 벡터에 도입하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 E. coli JM109을 형질전화시켰다. 생성된 플라스미드를 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 내부 컨트롤로서 사용하였다. 서열번호:170 및 171의 뉴클레오티드 서열을 갖는 MTIS2F16 및 MTIS2RAAC를 합성하였다. 프라이머 부위를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 증폭된 영역의 길이는 98 bp이다.
하기와 같이 반응을 수행하였다. 최종 농도로 하기를 포함하는 최종 용량 25 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다: 32 mM HEPES-수산화칼륨 완충액 (pH 7.8), 100 mM 아세트산칼륨, 1% DMSO, 0.01% BSA, 0.1% 프로필렌디아민, 4 mM 아세트산마그네슘, 500 μM 각각의 dNTPs, 25 pmol 각 프라이머 MTIS2F16 및 MTIS2RAAC, 카피수 103개의 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 내부 컨트롤, 2.2 U의 Afu RNase HII 또는 8 U의 Tli RNase HII, 11 U의 BcaBEST DNA 폴리머라제, 1 ㎕의 주형 및 물. 실시예 1에서 사용된 BCG 게놈 DNA 0, 1 또는 10 pg을 주형으로서 사용하였다. 반응 혼합물을 60℃로 세팅된 열 싸이클러 Personal에 방치하고 60분동안 인큐베이션시켰다. ICAN 반응 후 수득한 샘플을 나일론 막상에 스팟팅하고 도트 블랏 하이브리제이션을 실시예 5에 기술된 바와 같이 5' 말단에바이오틴으로 표지된 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 검출용 프로브 MTIS-S-PROBE (서열번호:172) 또는 5' 말단에 바이오틴으로 표지된 내부 컨트롤 검출용 프로브 INTER-PROBE (서열번호:173)를 사용하여 수행하였다. 결과, BCG 게놈 DNA이 첨가된, ICAN 반응 후 수득한 샘플을 스팟팅하였을 때, MTIS-S-PROBE을 사용했을 때는 어느 시그날도 관찰되지 않았지만 INTER-PROBE을 사용했을 때는 시그날이 관찰되었다. 1 pg의 BCG 게놈 DNA이 첨가된 , ICAN 반응 후 수득한 샘플을 스팟팅하였을 때 MTIS-S-PROBE 및 the INTER-PROBE 모두를 사용하여 시그날이 관찰되었다. 10 pg의 BCG 게놈 DNA이 첨가된 , ICAN 반응 후 수득한 샘플을 스팟팅하였을 때 MTIS-S-PROBE을 사용했을 때는 시그날이 관찰되었지만 INTER-PROBE을 사용했을 때는 시그날이 관찰되지 않았다. 이 결과에 기초하여 주형으로서 BCG 게놈을 증폭시킨 경우 MTIS-S-PROBE을 사용하여 시그날이 관찰되었고 내부 컨트롤을 증폭시킨 경우에는 INTER-PROBE을 사용하여 시그날이 관찰되었음을 확인하였다. 따라서, 표적 핵산은 본 발명의 방법에 따른 내부 컨트롤의 존재하에서도 특이적으로 검출될 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명은 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 특정 증폭을 위해 적절한 영역을 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 DNA 합성 반응에 의해 증폭시키는 표적 핵산 증폭 방법, 또는 증폭 방법에 의해 수득한 단편을 검출하는 단계를 포함하는 표적 핵산 검출 방법을 위한 반응 시약의 안정화 및 장기간 보존 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 미생물(특히, 병원성 미생물) 예를 들면, 바이러스, 세균, 진균 또는 효모를 고감도 및 특이적으로 검출 또는 측량하는데 사용할 수 있는 표적 핵산 검출 방법 및 상기 방법을 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 제공한다.
서열 목록 프리 텍스트
서열번호. 1: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 pUC19 어퍼 150 으로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호. 2: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 pUC19 로어 NN로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호. 3: 장쇄의 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MCR-F로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호. 4: 장쇄의 DNA 단편을 증폭시키기 위한 MCR-R로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호. 5: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 MF2로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호. 6: 플라스미드 pUC19의 부위를 증폭시키기 위한 MR1로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 7: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 일부를 증폭시키기 위한 K-F-1033-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 8: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 일부를 증폭시키기 위한 K-F-1133-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 9: 마우스로부터 INOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 10: 마우스로부터 INOS-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 11: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 서열 일부를 증폭시키는 DNA 단편을 검출하기 위한 MTIS로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 12: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 서열 일부를 증폭시키는 DNA 단편을 검출하기 위한 MTIS-2로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열번호. 13: HCV의 일부를 증폭시키기 위한 SP6-HCV-F로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호. 14: HCV의 일부를 증폭시키기 위한 T7-HCV-R로서 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 15: HCV의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-A2-S 로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 16: HCV의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-A2-A 로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 17: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적(cryptic) 플라스미드 DNA 일부를 증폭시키기 위한 CT2F로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 18: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드 DNA 일부를 증폭시키기 위한 CT2R로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 19: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드 DNA 일부를 증폭시키기 위한 CT-FB19-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 20: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드 DNA 일부를 증폭시키기 위한 CT-RB23-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 21: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 일부를 증폭시키기 위한 K-F-1033(68)로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 22: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 일부를 증폭시키기 위한 K-F-1133(68)로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 23: 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium)으로부터의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열
서열 번호 24: 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)으로부터의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열
서열 번호 25: 마이코박테리움 16S rRNA의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-F-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 26: 마이코박테리움 16S rRNA의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-F-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 27: 마이코박테리움 16S rRNA의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-F-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 28: 마이코박테리움 16S rRNA의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-R-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 29: 마이코박테리움 16S rRNA의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-R-1-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 30: 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)으로부터의 16S rRNA-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-R-2I로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 31: 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium)으로부터의 16S rRNA-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-R-2A로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 32: 마이코박테리움 아미움(Mycobacterium avium)으로부터의 16SrRNA-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편 검출을 위한 아비움-프로브로서 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 33: 마이코박테리움 인트라셀룰라르(Mycobacterium intracellulare)으로부터의 16S rRNA-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편 검출을 위한 인트라셀룰라르-프로브로서 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 34: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자 뉴클레오티드 서열
서열 번호 35: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 pJD4 플라스미드 DNA 뉴클레오티드 서열
서열 번호 36: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자 뉴클레오티드 서열
서열 번호 37: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 시토신 메틸트랜스퍼라제의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 38: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 pJD4 플라스미드 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 NEI-5103으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 39: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 pJD4 플라스미드 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 NEI-5150으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 40: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 NEI-CppB-F1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 41: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 NEI-CppB-F2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 42: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 NEI-CppB-F3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 43: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 NEI-CppB-R1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 44: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 NEI-CppB-R2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 45: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 NEI-CppB-R3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 46: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 pJDB F-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 47: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 pJDB F-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 48: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 pJDB R-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 13 내지 15는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 49: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 pJDB R-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 14 내지 16는 리보뉴클레오티드이고-다른뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 50: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 cppB 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 pJDB R-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 15 내지 17는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 51: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 M.Ngo F-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 52: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 M.Ngo F-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 53: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 M.Ngo F-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19S는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 54: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 M.Ngo R-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 55: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 M.Ngo R-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 56: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 M.Ngo R-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 57: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 M.Ngo R-4로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 58: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 메틸트랜스퍼라아제의 일부를 증폭시키기 위한 시토신 F-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 59: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 메틸트랜스퍼라아제의 일부를 증폭시키기 위한 시토신 F-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 60: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 메틸트랜스퍼라아제의 일부를 증폭시키기 위한 시토신 F-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 61: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 메틸트랜스퍼라아제의 일부를 증폭시키기 위한 시토신 R-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 62: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 메틸트랜스퍼라아제의 일부를 증폭시키기 위한 시토신 R-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 63: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 메틸트랜스퍼라아제의 일부를 증폭시키기 위한 시토신 R-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 64: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 pJDB4 플라스미드 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 NEI-5130으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 65: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 CppB-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 NEI-CppB 프로브-1로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 66: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 CppB-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 NEI-CppB 프로브-2로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 67: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 M.NgoMIII 유전자-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 M.Ngo-프로브로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 68: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터의 메틸트랜스퍼라제-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 시토신-프로브로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 69: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 70: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 71: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HBV-F-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22 내지 24는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 72: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HBV-F-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 73: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HBV-F-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 74: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HBV-F-5로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22 내지 24는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 75: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HBV-R-1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 76: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HBV-R-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 77: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HBV-R-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 78: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HBV-R-4로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22 내지 24는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 79: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 HBV-프로브 1로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 80: B형 간염 바이러스로부터의 X-단백질-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 HBV-프로브 2로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 81: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-A2-S로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 82: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-A2-A로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 83: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-A4-S로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 15 내지 17는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 84: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-A4-A로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 85: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-A4-S19로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 86: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-A4-A19로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 87: C형 간염 바이러스의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 HCV-C로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 88: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-F1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 89: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-R1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 90: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-F2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 91: C형 간염 바이러스로부터의 X-단백질의 일부를 증폭시키기 위한 HCV-R2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 92: C형 간염 바이러스의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 HCV-D로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 93: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 SP6-HIV-F로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 94: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-R로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 95: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-F1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 96: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-F2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 97: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-F3으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 98: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-F4로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 99: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-R1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 100: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-R2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 101: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-R3으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 102: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-R4로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 103: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 HIV-R4M으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 104: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 HIV-A로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 105: HIV로부터의 gag 서열의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 HIV-B로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 106: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-PCR-F로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 107: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-PCR-R로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 108: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-F1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 109: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-F2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 110: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-F3으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 111: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-F4로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 112: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-F5로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 113: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-R1로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 114: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-R2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 115: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-R3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 116: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-R4로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 117: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 coa-R5로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 118: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 coa-A로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 119: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈장응고효소 유전자 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 coa-B로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 120: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 121: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-FB19로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 17 내지 19은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 122: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-FB19-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 123: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-FB19-3-21로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 124: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-FB19-3-23로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-다른뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 125: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-RB21로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 126: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-RB23-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 127: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-RB23-2-24로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 22 내지 24은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 128: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 CT-프로브로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 129: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 130: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-F1212-20로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 131: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-F1212-21로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 132: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-F1212-22로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 133: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-R1272-20로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 134: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-R1272-21로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 135: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-R1272-22로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 136: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-1234로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 137: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-1234로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 138: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 139: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-140로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 140: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-140-22로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 141: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-706로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 142: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 MPF-910로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 143: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-190로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 144: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-190-22로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 145: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 Myco-850으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 146: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 MPR-1016으로 명시되는 작제된 키메라성올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 147: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편 검출을 위한 Myco170-프로브로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 148: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편 검출을 위한 Myco730-프로브로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 149: 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)로부터의 ATPase 오페론의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편 검출을 위한 Myco952-프로브로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 150: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 MecA 유전자의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 151: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 MecA 유전자의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 152: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 MecA 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 MecA-S525으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 153: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의MecA 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 MecA-A611으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 154: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 MecA 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 MecA-S1281으로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 155: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 MecA 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 MecA-A1341로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 156: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 MecA 유전자의 일부를 증폭시키기 DNA 단편을 검출하기 위한 MecA-A 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 157: 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 MecA 유전자의 일부를 증폭시키기 DNA 단편을 검출하기 위한 MecA-B 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 158: pDON-AI 플라스미드 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 pDON-AI-1(22)로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 159: pDON-AI 플라스미드 DNA의 일부를 증폭시키기 위한 pDON-AI-2(23)로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 160: 마우스로부터의 iNOS-코딩서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 161: 마우스로부터의 iNOS-코딩서열 일부를 증폭시키기 위한 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열 번호 162: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 서열 일부를 증폭시키기 위한 MTIS 2F로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 163: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 서열 일부를 증폭시키기 위한 MTIS2R로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 164: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) cppB 유전자 일부를 증폭시키기 위한 pJDB10F로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 165: 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) cppB 유전자 일부를 증폭시키기 위한 pJDB10R로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 15 내지 17은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 166: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-F1215-4R-22로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 19 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 167: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 CT-R1267-3R-18로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 16 내지 18은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 168: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 잠적 플라스미드의 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 CT-1236으로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 169: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 에세이용의 내부 컨트롤로서 작제된 뉴클레오티드
서열 번호 170: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 MTIS2F16로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 14 내지 16은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 171: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 MTIS2RAAC로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 18 내지 20은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호 172: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 MTIS-S-PROBE로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호 173: 마이코박테리움 투버클로시스(Mycobacterium tuberculosis) DNA 일부를 증폭시키기 위한 DNA 단편을 검출하기 위한 INTER-PROBE로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프로브

Claims (11)

  1. (a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
    (b) 반응 산물을 생성시키기 위해 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭시키는 것을 포함하고,
    (i) 마그네슘 염, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 효소(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 시약 성분을 반응전에 다른 시약 성분으로부터 분리시키고;
    (ii) 효소(들)를 포함하는 시약 용액중 효소 농도(들)는 증가시키지만, 상기 용액중 염 농도는 증가시키지 않고, 시약 용액을 서로 혼합한 후 증폭 단계를 위한 염의 농도가 최적이 되도록 또다른 시약 용액중 염 농도를 조절하는, 표적 핵산 증폭 및/또는 검출 방법에 사용하기 위한 반응 시약을 안정화시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 반응 시약은 2개의 시약 용액: 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 시약 용액; 및 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)및 마그네슘 염을 포함하는 시약 용액으로 구성되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 염 농도가 증폭 단계를 위한 최적의 염 농도와 동일하거나 그보다 낮은 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 효소(들)의 농도가 증폭 단계를 위한 효소(들) 농도보다 높은 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 분리된 시약 용액을 서로 혼합한 후 증폭 단계를 위한 염의 농도가 최적이 되도록 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 효소(들)의 농도를 조절하는 방법.
  6. (a) 주형으로서 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 프라이머 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다);
    (b) 반응 산물을 생성시키기 위해 충분한 시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭시키는 것을 포함하고,
    (i) 마그네슘 염, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 효소(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 시약 성분을 반응전에 다른 시약 성분으로부터 분리시키고;
    (ii) 효소(들)를 포함하는 시약 용액중 효소 농도(들)는 증가시키지만, 상기 용액중 염 농도는 증가시키지 않고, 시약 용액을 서로 혼합한 후 증폭 단계를 위한 염의 농도가 최적이 되도록 또다른 시약 용액중 염 농도를 조절하는, 표적 핵산 증폭 및/또는 검출 방법에 사용하기 위한 반응 시약의 키트.
  7. 제 6항에 있어서, 반응 시약은 2개의 시약 용액: 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 시약 용액; 및 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H) 및 마그네슘 염을 포함하는 시약 용액으로 구성된 키트.
  8. 제 6항에 있어서, 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 염 농도가 증폭 단계를 위한 최적의 염 농도와 동일하거나 그보다 낮은키트.
  9. 제 6항에 있어서, 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 효소(들)의 농도가 증폭 단계를 위한 효소(들) 농도보다 높은 키트.
  10. 제 9항에 있어서, 분리된 시약 용액을 서로 혼합한 후 증폭 단계를 위한 염의 농도가 최적이 되도록 효소(들)(DNA 폴리머라제 및/또는 RNase H)을 포함하는 시약 용액의 효소(들)의 농도를 조절하는 키트.
  11. 제 6항에 있어서, 분리된 시약 용액 혼합물의 염 농도를 조절하기 위한 시약을 포함하는 키트.
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