CN112941208B - 一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法 - Google Patents

一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法是先从待测食品样品中直接提取沙门氏菌基因组DNA，或将待测食品样品与培养基混合后进行增菌培养，再提取沙门氏菌基因组DNA，然后在重组酶聚合酶扩增的试剂和核酸引物中加入提取的沙门氏菌基因组DNA进行扩增，继后将扩增产物转移至光敏显色液中，用LED灯光照使之显色，随后通过分光光度计测定吸收，并进行定性分析。本发明使用的扩增核酸引物与光敏显色技术结合，不仅可检测低至5000CFU/mL的沙门氏菌样品，且经预增菌还能够检测低至3CFU/mL的沙门氏菌样品，检测灵敏度高，能满足快速检测需求，降低对仪器设备的依赖，可广泛用于资源缺乏地区食品中的沙门氏菌监测。

Description

一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法
技术领域
本发明属于食品细菌检测分析技术领域，具体涉及一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法。
背景技术
沙门氏菌是一种以食品为主要媒介的食源性致病菌，感染者常常伴随呕吐、头晕、腹泻等症状，严重的感染者，甚至可能引发死亡。在高度全球化的今天，各国之间食品贸易频繁，让沙门氏菌的防治工作异常困难。据最新的研究统计报告，仅在2017年，全球的沙门氏菌爆发案例就达到了9510万，直接引发的死亡人数也高达50771人(LancetInfect.Dis.2019,19,1312-1324)。由此可见，沙门氏菌对大众的健康造成严重损害，同时也给各个国家带来了财力和物力损失。
对食品中的沙门氏菌进行准确可靠的检测，是防治沙门氏菌工作中必不可少的环节。目前，国际上检测食品中沙门氏菌的标准方法仍然是基于细菌培养的ISO 6579-1(https://www.iso.org/standard/56712.html)。该方法可实现食品中沙门氏菌的准确鉴定和分型，但其需要特定检测场所和较长检测时间(4-7天)，通常适用于在基础条件较好的地区开展，并且以保存时间较长的食品为主要检测对象。然而，沙门氏菌污染严重的贫困地区却因缺乏相关基础设施和技术人员而无法实施相关检测，进而导致沙门氏菌感染事件频发。此外，细菌培养检测的方式不适用于保质期较短的生鲜食品，因此导致大量生鲜食品漏检，这也是沙门氏菌感染事件发生的主要原因之一。
近年来，以聚合酶链式反应为代表的分子生物学方法因具备较高的灵敏度、较快的检测速度而备受关注，但目前其仍然严重依赖精密仪器(特别是信号读出的荧光设备)，致使其受检测场所限制，无法满足对资源贫乏地区或者生鲜食品的检测需求。因此，如何利用分子生物学技术高灵敏度、高特异性的优点，并结合便携、快速的信号转换和读出技术，以降低分子生物学技术对仪器的依赖性，进而实现食品中沙门氏菌的现场快速、准确检测，这将是促进贫困地区加快食品检测、避免生鲜食品漏检需要追求的理想解决方案。
发明内容
本发明目的是针对现有技术存在的不足，提供一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法。
本发明提供一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法，该方法的工艺步骤和条件如下：
(1)取2mL或2g待测食品样品，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取沙门氏菌基因组DNA，用超纯水溶解后4℃保存备用，或者
将待测食品样品与培养基混合后，在37℃进行增菌培养，随后取2mL培养液通过离心的方式去掉上清液，并按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取沙门氏菌基因组DNA，用超纯水溶解后4℃保存备用；
(2)按重组酶聚合酶扩增试剂盒的操作说明，预先将重组酶聚合酶扩增的试剂和100–800nM的核酸引物加入到扩增试管中，再向扩增管中加入1-20μL的提取沙门氏菌基因组DNA，并用超纯水扩增总体积至10-50μL，混匀后，25-42℃恒温扩增4分钟，再次混匀后，25-42℃恒温扩增6-16分钟；
(3)将全部扩增产物转移至2mL的光敏显色液中，用LED灯光照1-5分钟，使无色光敏显色液显色，随后通过分光光度计测定652nm处吸光度，并进行定性分析。
以上方法中所述的待测食品样品与培养基的体积或质量比为1:9，增菌培养时间为6-12小时，优选为6-8小时。
以上方法中所述的核酸引物中正向引物序列为：TGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAA；反向引物序列为：ACCACTCGCATCAAATCAAAATAGACCGTAAA。通过该核酸引物扩增的基因为沙门氏菌高度保守基因(invA)，扩增子长度为344bp。
以上方法中所述的提取沙门氏菌基因组DNA的提取液体积优选5-15μL。
以上方法中所述的核酸引物的浓度优选为120-480nM。
以上方法中所述的RPA扩增体积优选为30-50μL。
以上方法中所述的RPA扩增温度优选为32-42℃。
以上方法中所述的RPA扩增总时间优选为16-20分钟。
以上方法中所述的光敏显色液是由50mM柠檬酸钠、50mM氯化镁、0.2mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和0.25-4X SYBR Green I(SG)核酸染料组成，且光敏显色液的pH为3.5-5.5，优选4.5。
以上方法所述的LED光源为涵盖450-520nm波长的可见光光源，优选为450-495nm。
以上方法中所述的LED灯光照时间优选为2-3分钟。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果：
1.由于本发明方法中提供的扩增核酸引物，对沙门氏菌invA基因扩增具有较高的特异性和灵敏度，再结合光敏显色技术，不仅可检测低至5000CFU/mL的沙门氏菌样品，且通过设定的预增菌过程，还能够检测低至3CFU/mL的沙门氏菌样品，因而检测灵敏度高，能够满足绝大多数样品的检测需求。
2.由于本发明提供的方法是利用RPA和光敏显色技术对沙门氏菌进行检测分析，因而既继承了分子生物学技术高灵敏度的优点，同时降低了对仪器设备依赖，适用于在绝大多数情况下的沙门氏菌现场的快速检测。
3.由于本发明提供的方法所使用的试剂，包括与基因组DNA提取、基因组DNA扩增和光敏显色的相关试剂，均易于保存和运输，因而可广泛适用于资源缺乏地区食品中的沙门氏菌监测。
附图说明
图1为本发明方法用不同浓度的核酸引物分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图2为本发明方法用不同体积的基因组DNA提取液(其中基因量相同)分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图3为本发明方法用不同RPA扩增体积分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图4为本发明方法用不同恒温扩增温度分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图5为本发明方法用不同恒温扩增总时间分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图6为本发明方法用不同增菌培养时间分析样品组和控制组(30CFU/mL)的光敏显色结果。
图7为本发明方法用不同SYBR Green I核酸染料分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图8为本发明方法用不同波长LED灯分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图9为本发明方法用LED灯光照不同时间分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图10为本发明方法用不同pH的光敏显色液分析样品组和控制组的光敏显色结果。
图11为本发明检测沙门氏菌样品的检测流程示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。值得指出的是，给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍应属于本发明保护范围。
值得说明的是，1)以下实施例中，沙门氏菌菌落总数的定量方法均为平板计数法，参考标准为GB 4789.2-2016。2)对比例仅作为相同分析条件下，实施例定性分析时的阴性或阳性判定的标准。3)在沙门氏菌实施例的定性分析时，是以实施例样品的吸光度和对比例样品的吸光度的比值作为判定标准，当比值小于1.2时，实施例样品被判定为沙门氏菌阴性，当比值大于或等于1.2时，实施例样品被判定为沙门氏菌阳性。
实施例1-4
(1)先各取2mL不同浓度的沙门氏菌模拟牛奶样品，所取浓度具体见表1，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取细菌基因组DNA，用25μL超纯水溶解后4℃保存备用；
(2)按RPA试剂盒的操作说明，预先将重组酶聚合酶扩增的试剂和240nM的核酸引物加入到扩增试管中，再向扩增管中加入20μL的提取沙门氏菌基因组DNA，并用超纯水扩增体积至50μL，混匀后，37℃恒温扩增4分钟，再次混匀后，37℃恒温扩增16分钟；
(3)将全部扩增产物转移至2mL的光敏显色液中，用495nm的LED灯进行2分钟光照，使无色光敏显色液(其中SYBR Green I核酸染料的浓度为2X)显色，随后通过分光光度计测定652nm处的吸光度，并进行定性分析，结果见表1。
对比例1
本对比例采用的方法步骤和条件同实施例1-4，只是在其中未添加沙门氏菌模拟牛奶样品，其在652nm处的吸光度见表1。
表1
Figure BDA0002922267850000051
实施例5-8
(1)先各取2mL不同浓度的沙门氏菌模拟牛奶样品与培养基按1:9的比例混合后，所取浓度具体见表2，在37℃进行增菌6小时培养，随后取2mL培养液通过离心的方式去掉上清液，并按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取沙门氏菌基因组DNA，用25μL超纯水溶解后4℃保存备用；
(2)按RPA试剂盒的操作说明，预先将重组酶聚合酶扩增的试剂和240nM的核酸引物加入到扩增试管中，再向扩增管中加入20μL的提取沙门氏菌基因组DNA，并用超纯水扩增体积至50μL，混匀后，37℃恒温扩增4分钟，再次混匀后，37℃恒温扩增16分钟；
(3)将全部扩增产物转移至2mL的光敏显色液(其中SYBR Green I核酸染料的浓度为2X)中，用495nm的LED灯光照2分钟，使无色光敏显色液显色，随后通过分光光度计测定652nm处吸光度，并进行定性分析，结果见表2。
对比例2
本对比例采用的方法步骤和条件同实施例5-8，只是在其中未添加沙门氏菌模拟牛奶样品，其在652nm处的吸光度见表2。
表2
Figure BDA0002922267850000061
Figure BDA0002922267850000071
实施例9-12
(1)先各取2mL不同浓度的沙门氏菌模拟牛奶样品，所取浓度具体见表3，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取细菌基因组DNA，用25μL超纯水溶解后4℃保存备用；
(2)按RPA试剂盒的操作说明，预先将重组酶聚合酶扩增的试剂和100-800nM的核酸引物加入到扩增试管中，再向扩增管中加入10-20μL的提取沙门氏菌基因组DNA，并用超纯水调整RPA扩增体积至10-50μL，混匀后，25-42℃恒温扩增4分钟，再次混匀后，25-42℃恒温扩增6-16分钟；
(3)将全部扩增产物转移至2mL的光敏显色液(其中SYBR Green I核酸染料的浓度见表3)中，用450-520nm的LED灯进行2分钟光照，使无色光敏显色液显色，随后通过分光光度计测定652nm处吸光度，并进行定性分析，其结果见表3。
对比例3-6
本组对比例采用的方法步骤和条件分别对应不同的实施例9-12，只是在其中未添加沙门氏菌模拟牛奶样品，其在652nm处的吸光度见表3。
表3
Figure BDA0002922267850000072
Figure BDA0002922267850000081
实施例13-16
(1)实施例5-8先各取2mL不同浓度的沙门氏菌模拟牛奶样品与培养基按1:9的比例混合后，所取浓度具体见表4，在37℃进行增菌培养预定时间，随后取2mL培养液通过离心的方式去掉上清液，并按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取沙门氏菌基因组DNA用25μL超纯水溶解后4℃保存备用；
(2)按RPA试剂盒的操作说明，预先将重组酶聚合酶扩增的试剂和100-800nM的核酸引物加入到扩增试管中，再向扩增管中加入10-20μL的提取沙门氏菌基因组DNA，并用超纯水调整RPA扩增体积至10-50μL，混匀后，25-42℃恒温扩增4分钟，再次混匀后，25-42℃恒温扩增6-16分钟；
(3)将全部扩增产物转移至2mL的光敏显色液(其中SYBR Green I核酸染料的浓度见表4)中，用450-520nm的LED灯进行2分钟光照，使无色光敏显色液显色，随后通过分光光度计测定652nm处吸光度，并进行定性分析，结果见表4。
对比例7-10
本组对比例采用的方法步骤和条件分别对应不同的实施例13-16，只是在其中未添加沙门氏菌模拟牛奶样品，其在652nm处的吸光度见表4。
表4
Figure BDA0002922267850000091
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法
<130>四川大学
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<400> 1
tgaagcaaaa cgtagcgccg ccaaacctaa aa 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<400> 2
accactcgca tcaaatcaaa atagaccgta aa 32

Claims (5)

1.一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法，该方法的工艺步骤和条件如下：
（1）取2 mL或 2g待测食品样品，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取沙门氏菌基因组DNA，用超纯水溶解后4℃保存备用，或者
将待测食品样品与培养基混合后，在37 ℃进行增菌培养，随后取2 mL培养液通过离心的方式去掉上清液，并按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取沙门氏菌基因组DNA，用超纯水溶解后4℃保存备用；
（2）按重组酶聚合酶扩增试剂盒的操作说明，预先将重组酶聚合酶扩增试剂和100 -800 nM的核酸引物加入到扩增试管中，再向扩增管中加入1 - 20 μL的沙门氏菌基因组DNA，并用超纯水扩增总体积至10 - 50 μL，混匀后，25 - 42 ℃恒温扩增4分钟，再次混匀后，25 - 42 ℃恒温扩增6 - 16分钟；
（3）将全部扩增产物转移至2 mL的光敏显色液中，用LED灯光照1- 5分钟，使无色光敏显色液显色，随后通过分光光度计测定652 nm处吸光度，并进行定性分析，
其中所述的核酸引物中正向引物序列为：TGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAA；反向引物序列为：ACCACTCGCATCAAATCAAAATAGACCGTAAA；
所述的光敏显色液是由50 mM柠檬酸钠、50 mM氯化镁、0.2 mg/ mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺和0.2 - 4 × SYBR Green I核酸染料组成，且所述光敏显色液pH为3.5 - 5.5；LED光源为涵盖450 - 520 nm波长的可见光光源；所述的LED灯光照时间为2 - 3分钟。
2.根据权利要求1所述的用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法，该方法中所述的待测食品样品与培养基的体积比为1:9或质量/体积比为1:9，增菌培养时间为6 - 12小时。
3.根据权利要求1或2所述的用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法，该方法中所述的核酸引物的浓度为120 - 480 nM。
4.根据权利要求1或2所述的用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法，该方法中所述的提取沙门氏菌基因组DNA的提取液体积为5 - 15μL；RPA扩增体积为30 - 50 μL； RPA扩增温度为32 - 42℃；RPA扩增总时间为16 – 20分钟。
5.根据权利要求3所述的用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法，该方法中所述的提取沙门氏菌基因组DNA的提取液体积为5 - 15μL； RPA扩增体积为30 - 50 μL；RPA扩增温度为32 - 42℃；RPA扩增总时间为16 – 20分钟。
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Recombinase Polymerase Amplification Coupled with a Photosensitization Colorimetric Assay for Fast Salmonella spp. Testing;Xianming Li等;《Anal. Chem》;20210414;第93卷;第6559-6566页 *
沙门氏菌重组酶聚合酶检测方法的建立及应用;刘立兵等;《食品科学》;20190125;第40卷(第2期);摘要,第1.2节 *
纳米光学传感器用于检测汞离子;沈洋等;《化学进展》;20190424(第04期);536-549 *

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