CN110283919A

CN110283919A - 一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法

Info

Publication number: CN110283919A
Application number: CN201910387932.9A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 田洪涛; 罗云波; 张媛; 李舒婷; 田晶晶; 朱龙佼; 杜再慧
Original assignee: China Agricultural University; Hebei Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University; Hebei Agricultural University
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110283919B

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法。该生物传感器包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂。本发明基于重组链替代反应对沙门氏菌的双链核酸进行扩增，得到带有富G序列和切刻酶识别位点的dsDNA。Nt.Bst NBI切刻酶特异性识别酶切位点并进行切割，在Bst DNA聚合酶的作用下，形成切口的DNA链将会延伸，将DNA链上的G‑四联体替换下来。释放出的G‑四联体与Hemin结合，形成G4 DNAzyme，可催化H₂O₂将无色的TMB氧化为肉眼可见的蓝色oxTMB，进而通过颜色变化和吸光值的改变对沙门氏菌进行检测。

Description

一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法。

背景技术

沙门氏菌是可引起人畜共同患病的因素之一，也一直是造成食品加工贮藏中污染的主要致病菌之一。作为一种食源性致病菌，沙门氏菌感染对象十分广泛，当其进入宿主体内后会引起宿主产生发热、腹泻、呕吐等一系列疾病，统称为沙门氏菌病，其在由细菌引起的食源性疾病中居首位。

目前沙门氏菌的检测方法主要包括传统国标法、免疫学检测方法以及分子生物学检测方法等。常见的分子生物学检测方法包括变温核酸扩增技术、等温核酸扩增技术、基因芯片技术等。生物传感器检测方法相对于传统的检测方法具有检验速度快、灵敏度高、能进行现场检测等优点。对于一系列核酸扩增技术，包括：PCR技术、RCA技术、HCR技术、RPA技术等，RPA技术是在多酶体系下进行的一种恒温体外扩增技术，最早是在2006年由英国公司TwistDx研发的，既可以检测DNA又可以检测RNA。自发明以来，RPA技术已经在医疗诊断、食品中致病微生物的检测分析以及生物安全等方面崭露头角。尤其是在2014年以后，RPA商业化试剂盒的问世直接推动RPA技术得到快速的发展。目前为止，RPA的扩增方法主要有三种：基础的RPA扩增、实时荧光定量RPA和侧流层析试纸条RPA。RPA技术一般在20min就可以完成，其灵敏度较高且特异性较强，所用仪器简单便捷，可以满足现场检测的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法。本发明具有操作简便、可视化、通用性、耗时短、敏感性高等特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器，包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂；RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物、序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物、序列如SEQ ID NO：5所示的通用引物、乙酸镁和水。

在SDA技术中，切刻酶Nt.Bst NBI是一种能特异性识别双链DNA但只对特定序列(GAGTC)所在的单链DNA进行切割的一种核酸内切酶。BstDNA聚合酶具有5’→3’的聚合酶活性和强链置换活性，但不具有3’→5’的外切酶活性。在切刻酶和聚合酶的共同作用下，可产生大量的单链DNA片段，实现信号放大。

作为特异性功能性核酸，富含鸟嘌呤(G)的序列与氯高铁血红素(Hemin)组合时可形成配位络合物(G4DNAzyme)，其具有类过氧化物酶催化活性。该复合物的催化活性比单独的Hemin高约10倍，显着改善了Hemin本身的催化性能。G4DNAzyme已广泛用于催化H₂O₂调节的氧化还原反应。例如，它可催化H₂O₂将无色的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)氧化为蓝色的氧化TMB(oxTMB)。该显色原理简单、快速且不需要酶催化，已广泛应用于比色生物传感器的构建。

本发明提供一种沙门氏菌检测方法，将重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和链置换扩增反应(SDA)相结合，构建了一种基于通用接头重组链替代反应检测沙门氏菌的可视化生物传感器。基于重组链替代反应对沙门氏菌的双链核酸进行扩增，得到带有富G序列和切刻酶识别位点的dsDNA。Nt.Bst NBI切刻酶特异性识别酶切位点并进行切割，在Bst DNA聚合酶的作用下，形成切口的DNA链将会延伸，将DNA链上的G-四联体替换下来。释放出的G-四联体与Hemin结合，形成G4DNAzyme，可催化H₂O₂将无色的TMB氧化为肉眼可见的蓝色oxTMB，进而通过颜色变化和吸光值的改变对沙门氏菌进行检测。

在本发明中，序列如SEQ ID NO：5所示的通用引物含有富G序列的互补序列和切刻酶识别位点序列如SEQ ID NO：5所示的通用引物。

在本发明中，SDA反应试剂包括Nt.Bst NBI切刻酶、Bst.DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和水。

在本发明中，显色试剂包括缓冲液、Hemin、TMB显色剂和H₂SO₄。

在本发明中，TMB显色剂中含有TMB和H₂O₂。

本发明还提供了一种沙门氏菌的检测方法，采用上述生物传感器检测沙门氏菌，包括RPA反应、SDA反应和显色反应。

作为优选，RPA反应的体系如下：

优选地，RPA反应的体系如下：

作为优选，RPA反应的条件为：38～40℃反应18～22min。

优选地，RPA反应的条件为：39℃反应20min。

作为优选，SDA反应的体系为：

优选地，SDA反应的体系为：

作为优选，SDA反应的条件为：54～56℃反应38～42min，94～96℃灭活4～6min，3～5℃保存4～6min。

优选地，SDA反应的条件为：55℃反应40min，95℃灭活5min，4℃保存5min。

作为优选，显色反应的体系为：

优选地，显色反应的体系为：

作为优选，显色反应的条件：SDA反应产物、Hemin、缓冲液在36～38℃下孵育14～16min，加入TMB显色剂后在36～38℃下显色6～8min，最后加入H₂SO₄终止反应。

优选地，显色反应的条件：SDA反应产物、Hemin、缓冲液在37℃下孵育15min，加入TMB显色剂后在37℃下显色7min，最后加入H₂SO₄终止反应。

本发明提供了一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法。该生物传感器包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂；RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物、序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物、序列如SEQ ID NO：5所示的通用引物、乙酸镁和水。本发明基于通用接头重组链替代反应的用于检测沙门氏菌的可视化生物传感器具有以下优点：

(1)通用接头的设计：经过RPA扩增后可使扩增产物带有切刻酶的识别序列和富G序列，经过链替代扩增反应可实现信号的放大和输出。

(2)一步法进行反应：在整个链替代扩增过程都在同一个反应体系中进行，可避免外界的污染，减少了假阳性的产生。

(3)可视化：由于通用接头的引入，使扩增产物带有富G序列，经过链替代反应后，富G序列被置换下来，在Hemin的作用下形成G-四联体，可使TMB显色，通过肉眼观察实现对沙门氏菌的半定量检测，通过在450nm处测量样品的吸光值，实现对沙门氏菌的定量检测。

(4)通用性：通过改变RPA的引物序列，再加入构建好的通用接头，实现对其他靶标物质的检测。

(5)耗时短：该生物传感器可在90min左右完成对沙门氏菌的检测。

附图说明

图1为不同比例引物进行RPA扩增的结果；其中，泳道1引物比为SDA-F’：SDA-R：SDA-JT＝1:2:1；泳道2引物比为SDA-F’：SDA-R：SDA-JT＝1:3:2；泳道3引物比为SDA-F：SDA-R’：SDA-JT＝2:1:1；泳道4引物比为SDA-F：SDA-R’：SDA-JT＝3:1:2；泳道5引物比为SDA-F’：SDA-R’＝1:1；泳道6的引物比为SDA-F’：SDA-R’：SDA-JT＝1:1:2泳道7为SDA-F：SDA-R＝1:1；

图2为不同引物长度优化的结果；(A)不同长度引物进行RPA扩增的结果；其中，泳道1所用上游引物为SDA-F1；泳道2所用上游引物为SDA-F2；泳道3所用上游引物为SDA-F’；泳道4所用上游引物为SDA-F3；泳道5所用上游引物为SDA-F4；泳道6所用上游引物为SDA-F5；泳道7所用上游引物为SDA-F；(B)不同长度引物的显色结果；其中，1组所用上游引物为SDA-F1；2组所用上游引物为SDA-F2；3组所用上游引物为SDA-F’；

图3为SDA反应时间的优化结果；

图4为Nt.Bst NBI切刻酶浓度优化结果；

图5为Bst.DNA聚合酶浓度优化结果；

图6为TMB显色时间优化结果；

图7为Hemin孵育时间优化结果；

图8为Hemin浓度优化结果；

图9为可视化生物传感器灵敏度分析结果；(A)不同浓度沙门氏菌在450nm处的吸光值；(B)沙门氏菌的标准曲线；

图10为可视化生物传感器特异性分析结果。

具体实施方式

本发明公开了一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明开发了一种基于通用接头重组链替代反应检测沙门氏菌的可视化生物传感器。基于重组链替代反应(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)对沙门氏菌的双链核酸进行扩增，得到带有富G序列和切刻酶识别位点的dsDNA。Nt.Bst NBI切刻酶特异性识别酶切位点并进行切割，在Bst DNA聚合酶的作用下，形成切口的DNA链将会延伸，将DNA链上的G-四联体替换下来。释放出的G-四联体与Hemin结合，形成G4DNAzyme，可催化H₂O₂将无色的TMB氧化为肉眼可见的蓝色oxTMB，进而通过颜色变化和吸光值的改变对沙门氏菌进行检测。

本发明提供的用于检测沙门氏菌的生物传感器及方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1.实验材料

1.1试验菌株

沙门氏菌(CGMCC 1.0090)、阪崎肠杆菌(CICC 21560)、单增李斯特菌(CMCC55004)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、副溶血性弧菌(CMCC20001)、大肠杆菌(ATCC43889)均由中国农业大学食品科学与营养工程学院食品安全实验室提供。

1.2主要试剂

酵母浸粉、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸铵、无水乙酸钠、七水合硫酸镁、四水合硫酸猛、吐温80、氯化钠、琼脂、乙二胺四乙酸(EDTA)、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、冰乙酸、氯高铁血红素(Hemin)、琼脂糖、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、RPA反应试剂盒、硫酸、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、双链特异性核酸酶(DSN)、dGTP、dATP、DNAmarker、DNA loading buffer、聚丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、SYBRGold、过硫酸铵、硼酸、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钾、Bst DNA聚合酶、Nt.Bst NBI切刻酶、dNTP、SYBRGreenⅠ。

2.引物设计

DNA核酸序列均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，PAGE纯化。

表1 RPA的引物序列

3.DNA提取

取1mL菌液于1.5mL EP管，在4℃条件下，以12000r/min离心5min，弃去上清液。再向管中加入1mL ddH₂O，12000r/min，5min，4℃，离心，弃去上清液。再加入50μL ddH₂O、混匀，并置于电热恒温水浴锅中99℃煮沸10min后，立即置冰上20min。然后以12000r/min，4℃离心5min，取上清，-20℃保存。DNA模板提取完成，可用于进一步的检测，实验中用到的所有菌类DNA均用以上方法进行提取。

4.琼脂糖凝胶电泳

表2琼脂糖凝胶电泳方法与步骤

5.RPA反应

表3 RPA反应体系

6.SDA反应

表4 SDA反应体系

7.TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析

表5 TMB显色体系

8.沙门氏菌检测

本发明检测包含三个反应步骤：(1)RPA扩增；(2)SDA反应；(3)TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析。向RPA系统中引入DNA模板和引物进行扩增，得到带有富G序列和切刻酶识别位点的dsDNA。Nt.Bst NBI切刻酶特异性识别酶切位点并进行切割，在Bst DNA聚合酶的作用下，形成切口的DNA链将会延伸，将DNA链上的G-四联体替换下来。释放出的G-四联体与Hemin结合，形成G4 DNAzyme，可催化H₂O₂将无色的TMB氧化为肉眼可见的蓝色oxTMB，进而通过颜色变化和吸光值的改变对沙门氏菌进行检测。

实施例2

1.RPA反应引物比例的优化

本发明首先用不同浓度比例的引物进行RPA反应，反应条件为39℃、20min。反应结束后用2％的琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。得到，当引物上加入一段通用接头后进行RPA扩增后的产物片段大于普通RPA扩增的产物片段。并且该通用接头添加在上游引物上比添加到下游引物上的扩增效果好，如果上下游引物都添加通用接头，则没有扩增产物生成，可能是由于引物过长，形成引物二聚体不利于RPA扩增。当上游引物：下游引物：通用接头＝1:3:2时(泳道2)，电泳条带亮度比其他的条带亮，说明产物量也最多(图1)。

2.RPA反应引物长度的优化

由于引物的长度会影响RPA反应的扩增结果，因此比较在引物中添加不同长度和序列的G-四联体进行RPA反应的产物量和经过重组链替代反应后的显色情况，找到最适的扩增引物序列。首先用不同长度引物进行RPA反应，反应条件为39℃、20min。利用琼脂糖凝胶电泳分析比较RPA产物。再将前三组RPA产物在0.08U/μL Bst.DNA聚合酶和2.4U/μLNt.Bst NBI切刻酶的作用下55℃反应40min，95℃灭活5min，4℃保存5min。反应产物进行TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析。可以看出，引物的长度会影响RPA扩增产物量，随着引物长度的延长产物量降低(图2A)，外加的G-四联体长度为18个碱基时的吸光值最大(图2B)，因此选择上游引物为SDA-F’作为扩增引物最佳。

3.SDA反应时间的优化

首先进行RPA反应，反应条件为39℃、20min，再将RPA产物在0.08U/μL Bst.DNA聚合酶和2.4U/μL Nt.Bst NBI切刻酶的作用下55℃反应不同的时间，95℃灭活5min，4℃保存5min，最后反应产物进行TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析。得到，随着反应时间的增加，吸光值逐渐增大，在40min时吸光值达到最大，随着时间的延长，吸光值下降。可能是由于反应时间延长造成了非特异性扩增的增多，体系中G-四联体含量减少，致使吸光值下降。因此，选择40min作为最优的链替代反应时间(图3)。

4.Nt.Bst NBI切刻酶浓度的优化

首先进行RPA反应，反应条件为39℃、20min，再将RPA产物在0.08U/μL Bst.DNA聚合酶和不同浓度Nt.Bst NBI切刻酶的作用下55℃反应40min，95℃灭活5min，4℃保存5min，最后反应产物进行TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析。可以看出，随着Nt.Bst NBI切刻酶浓度的增加，SDA反应产物的吸光值逐渐增加，当酶浓度达到2.4U/μL后吸光值增加不大，说明此时酶浓度已接近饱和，增加酶浓度对显色效果影响不大。因此，2.4U/μL的Nt.BstNBI切刻酶浓度最佳(图4)。

5.Bst.DNA聚合酶浓度的优化

首先进行RPA反应，反应条件为39℃、20min，再将RPA产物在不同浓度Bst.DNA聚合酶和2.4U/μL Nt.Bst NBI切刻酶的作用下55℃反应40min，95℃灭活5min，4℃保存5min，最后反应产物进行TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析。可以看出，随着Bst.DNA聚合酶浓度的增加，SDA反应产物的吸光值逐渐增加，在0.08U/μL时达到最大，随后吸光值下降。当Bst.DNA聚合酶浓度0.08U/μL时与2.4U/μL的Nt.Bst NBI切刻酶能形成最优的反应比例，当Bst.DNA聚合酶的浓度过高时，聚合速度远高于切刻速度，形成非特异性扩增产物，最终使产物颜色变浅，吸光值降低。因此，0.08U/μL Bst.DNA聚合酶浓度最佳(图5)。

6.显色反应TMB反应时间的优化

首先进行RPA反应，反应条件为39℃、20min，再将RPA产物在0.08U/μL Bst.DNA聚合酶和2.4U/μL Nt.Bst NBI切刻酶的作用下55℃反应40min，95℃灭活5min，4℃保存5min，最后反应产物进行不同时间的TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析。可以看出，在加入TMB后，随着反应时间的延长，吸光值逐渐增加，当反应时间超过7min后，吸光值增加较少，因此为了达到快速检测的目的，显色时间为7min最佳(图6)。

7.显色反应Hemin孵育时间的优化

首先进行RPA反应，反应条件为39℃、20min，再将RPA产物在0.08U/μL Bst.DNA聚合酶和2.4U/μL Nt.Bst NBI切刻酶的作用下55℃反应40min，95℃灭活5min，4℃保存5min，最后反应产物进行不同Hemin孵育时间的TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析。可以看出，随着与Hemin孵育的时间逐渐增加，吸光值的变化不明显，没有显著的差异，因此说明Hemin可以在短时间内完成与G-四联体的结合，孵育时间对显色反应的影响不大，不是影响显色反应的关键因素。为了实现快速检测，选择15min作为Hemin的最佳孵育时间(图7)。

8.显色反应中Hemin浓度的优化

首先进行RPA反应，反应条件为39℃、20min，再将RPA产物在0.08U/μL Bst.DNA聚合酶和2.4U/μL Nt.Bst NBI切刻酶的作用下55℃反应40min，95℃灭活5min，4℃保存5min，最后反应产物进行不同Hemin浓度孵育的TMB显色反应及紫外-可见吸收光谱分析。可以看出，随着Hemin浓度的增加，处理组的吸光值逐渐增加，浓度超过120μM后，吸光值差值增加十分缓慢，几乎不再增加，说明Hemin浓度在当前的实验条件下已经接近饱和。所以在一定浓度范围内，Hemin浓度的提高能够显著提高催化显色的效率。最终选择Hemin浓度为120μM作为最优显色反应条件(图8)。

9.可视化生物传感器灵敏度分析

选择沙门氏菌进行梯度稀释，选择沙门氏菌浓度为10¹-10⁸CFU/mL的样品进行DNA的提取，在最优反应条件下进行上述反应，通过与TMB反应颜色的变化和吸光值的测定结果，进行检测灵敏度的计算。可以看出，实验组的吸光值随着沙门氏菌浓度的增加而增加，可见的黄色也越来越深(图9A)；沙门氏菌可视化生物传感器检测浓度的线性范围为10¹-10⁴cfu/mL，线性方程为A_450nm＝0.1271lg[沙门氏菌(CFU/mL)]+0.1428，R²为0.991，检测限为4cfu/mL(图9B)。

10.可视化生物传感器特异性分析

为了评价该生物传感器的特异性，用热裂解法提取菌株的DNA作为模板，根据优化实验得出的最佳反应体系和最优反应条件进行上述反应，验证该生物传感器检测沙门氏菌引物的特异性。可以看出，在相同的试验条件下，沙门氏菌在450nm处的吸光值明显高于其他菌种。结果表明构建的检测沙门氏菌的生物传感器具有优异的特异性(图10)。

11.对酸奶发酵剂进行检测

为了验证在实际应用中搭建的生物传感平台的可行性，在酸奶发酵剂中添加不同浓度的沙门氏菌进行了测试。比较构建的生物传感器检测结果与传统菌落计数的结果，计算回收率。可以看出，该方法与通过平板计数法获得的检测结果相近，对实际样本测试的准确性表明该方法在现实病原体监测中的良好适用性。

表6酸奶发酵剂中添加沙门氏菌的回收率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

河北农业大学

<120> 一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法

<130> MP1910111

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccgcgtaaa tggcgatacg gataatatgg gg 32

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctcaatact gagcggctgc tcgcctttgc tgg 33

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccatcccgc ccaaccctga ctccccgcgt aaatggcgat acggataata tgggg 55

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccatcccgc ccaaccctga ctccctcaat actgagcggc tgctcgcctt tgctgg 56

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccatcccgc ccaaccctga ctc 23

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaaccctg actccccgcg taaatggcga tacggataat atgggg 46

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccatcccgg actccccgcg taaatggcga tacggataat atgggg 46

<210> 8

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaaccctc ccatcccgcc caaccctgac tccccgcgta aatggcgata cggataatat 60

gggg 64

<210> 9

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccatcccgc ccatcccgcc caaccctgac tccccgcgta aatggcgata cggataatat 60

gggg 64

<210> 10

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccatcccgc ccaaccctcc catcccgccc aaccctgact ccccgcgtaa atggcgatac 60

ggataatatg ggg 73

Claims

1.一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器，其特征在于，包括RPA反应试剂、SDA反应试剂和显色试剂；所述RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物、序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物、序列如SEQ ID NO：5所示的通用引物、乙酸镁和水。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述SDA反应试剂包括Nt.Bst NBI切刻酶、Bst.DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和水。

3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述显色试剂包括缓冲液、Hemin、TMB显色剂和H₂SO₄。

4.一种沙门氏菌的检测方法，其特征在于，采用权利要求1至3中任一项所述生物传感器检测沙门氏菌，包括RPA反应、SDA反应和显色反应。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述RPA反应的体系如下：

所述RPA反应的条件为：38～40℃反应18～22min。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述SDA反应的体系为：

所述SDA反应的条件为：54～56℃反应38～42min，94～96℃灭活4～6min，3～5℃保存4～6min。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述显色反应的体系为：

所述显色反应的条件：SDA反应产物、Hemin、缓冲液在36～38℃下孵育14～16min，加入TMB显色剂后在36～38℃下显色6～8min，最后加入H₂SO₄终止反应。