CN107267610A - 基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法 - Google Patents

基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107267610A
CN107267610A CN201710482892.7A CN201710482892A CN107267610A CN 107267610 A CN107267610 A CN 107267610A CN 201710482892 A CN201710482892 A CN 201710482892A CN 107267610 A CN107267610 A CN 107267610A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpa
nucleic acid
probe
pad
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710482892.7A
Other languages
English (en)
Inventor
罗云波
许文涛
徐瑗聪
黄昆仑
程楠
王蔚然
卫昱君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201710482892.7A priority Critical patent/CN107267610A/zh
Publication of CN107267610A publication Critical patent/CN107267610A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法，根据致病菌筛选出高特异性毒力基因，建立新型通用接头重组聚合酶扩增技术，组装出基于肽核酸的单链核酸层析试纸条，并依此建立了一种基于功能核酸的通用接头阻断RPA生物传感器检测技术，用于食源性致病菌的现场快速检测，能够高效捕获单链核酸，提高检测灵敏度和稳定性，实现可视化检测。

Description

基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法
技术领域
本发明涉及生物传感检测技术领域，具体地说，涉及一种基于核 酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法。
背景技术
近年来，食源性致病菌引发的食品安全事件频发，相应的检测技 术要求也逐渐严格。传统的检测技术主要依赖于平板培养以及生理生 化鉴定，对于一些难以培养的菌株而言，容易产生检测的假阴性。近 年来兴起的快速检测技术有酶联免疫技术、PCR及定量PCR技术、等 温扩增技术、传感器技术等，综合比较，传感器技术在现场快速检测 中因其高灵敏度和便携性而占有更大的优势。
随着技术的发展，各种各样的传感器都应用于致病菌的检测，例 如光学传感器、电化学传感器、晶体传感器等。大部分传感器都具有 很好的检测性能，但因为检测成本的原因不能在现场进行推广。相比 之下，核酸层析生物传感器的优势就体现出来：成本低、易合成、稳 定性好等，使之成为致病菌快速检测领域的一股新流。
识别元件是核酸层析生物传感器的一个重要部件。传统的信号识 别通过抗原抗体之间的免疫亲和实现，但是抗体的成本高且稳定性 差，不适合推广应用。近年来核酸杂交逐渐应用到信号识别中，体现 出良好的灵敏度和稳定性。肽核酸是一种人工核酸，能够与核酸之间 发生碱基配对，且稳定性更高，因此，将肽核酸应用在核酸传感器的 识别元件中，将会显著提高检测的灵敏度和稳定性。
为了提高检测的灵敏度，信号的放大至关重要，通过分子扩增技 术能够有效实现原始信号的放大。一般用到的预扩增技术有PCR技 术、LAMP技术、RPA技术等，考虑到现场检测的时效性，RPA技术 最能满足检测需求。RPA技术是一种重组聚合酶扩增技术，能够在短时间内实现产物的累积，但是产物是双链核酸，无法用单链核酸试纸 条进行可视化检测。为了提高RPA技术的实用性，将通用接头及核酸 阻断技术引入到RPA技术中，建立一种新型的通用接头阻断重组聚合 酶扩增技术，能够得到带有单链接头的扩增产物，利用单链试纸条实 现可视化检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸层析生物传感技术检测食源 性致病菌的方法。
本发明构思如下：通过建立一种功能核酸全程控制的便携、简单、 封闭式的生物传感器，用于实现食源性致病菌的现场快超灵敏检测。 将通用接头阻断技术应用在RPA技术中实现双链产物向单链产物的 转化，同时也能推广应用到其他的双链分子扩增技术中，拓展了分子 扩增技术的应用范围。本发明构建的基于肽核酸的单链核酸层析试纸 条，能够高效捕获单链核酸，提高检测灵敏度和稳定性，实现可视化 检测。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于构建RPA生物传 感器的通用阻断接头序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种基于肽核酸的核酸层析试纸条，所述试纸条的 制备方法包括以下步骤：
1)纳米金颗粒的制备；
2)肽核酸探针的制备：人工合成质控捕获探针CCP、检测捕获 探针TCP和连接探针P，它们的序列分别为：
质控捕获探针CCP：5’-biotin-TGGTGGTGCTGGTT-3’
检测捕获探针TCP：5’-biotin-AACCAGCACCACCA-3’
连接探针P：5’-Cys-AACCAGCACCACCA-Glu-Glu-Glu-3’
3)纳米金修饰的连接探针P的制备；
4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品 垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设 有至少1条检测线和1条质控线；
①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述 缓冲液为：0.25-0.5％Triton X-100，0.1-0.2M硼酸盐缓冲液，0.15 -0.3M NaCl，pH 8.0；其中，所述结合垫上固定有纳米金修饰的连接 探针P；
②将30-50μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与30-50μL的100μM肽 核酸捕获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1-2h，分别制备出链 霉亲和素-生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝 酸纤维素膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12-14h；
③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜 以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。
步骤1)中利用柠檬酸钠烧金法制备粒径为13nm的纳米金颗粒。
步骤3)具体为：将5-10μM步骤2)的连接探针P与10-20nM步骤 1)的纳米金颗粒在5mM磷酸缓冲液中反应12-14h，然后14000rpm 离心20-30分钟，收集沉淀物，再用5mM磷酸缓冲液冲洗沉淀物，最 后溶解在10mM的磷酸缓冲液中，即得纳米金修饰的连接探针P。
在本发明的一个优选实施方式中，所述基于肽核酸的核酸层析试 纸条的制备如下：
步骤3)具体为：将5μM步骤2)的连接探针P与10nM步骤1)的 纳米金颗粒在5mM磷酸缓冲液中反应12h，然后14000rpm离心20分 钟，收集沉淀物，再用5mM磷酸缓冲液冲洗沉淀物，最后溶解在10 mM的磷酸缓冲液中，即得纳米金修饰的连接探针P。
步骤4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：
①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述 缓冲液为：0.25％Triton X-100，0.1M硼酸盐缓冲液，0.15M NaCl，pH 8.0；
②将30μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与30μL的100μM肽核酸捕 获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1h，分别制备出链霉亲和素 -生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝酸纤维素 膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12h；
③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜 以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。组装好的试纸条 的结构示意图见图5。
继而，本发明提供一种基于核酸层析生物传感技术检测食源性致 病菌的方法，包括以下步骤：
S1、以目标致病菌的高特异性毒力基因为靶序列，设计RPA引物 RPA-UF和RPA-UR；
S2、提取待测样品DNA，以DNA为模板，利用步骤S1的RPA引 物RPA-UF和RPA-UR进行RPA扩增反应；
S3、将步骤S2的RPA扩增产物与分析缓冲液混合，滴加到上述基 于肽核酸的核酸层析试纸条的样品垫上，反应5-8min，判读结果。阴 性反应：质控线显色，检测线不显色；阳性反应：质控线、检测线均 显色；失效反应：若质控线不显色，则检测失败或试纸条失效。
其中，步骤S1具体为：以目标致病菌的高特异性毒力基因为靶序 列，设计RPA扩增引物RPA-F、RPA-R，将所述的通用阻断接头序列 和至少1个C3阻断子顺次连接到引物RPA-F、RPA-R的5’端，得到用于 通用接头阻断RPA扩增技术的引物RPA-UF、RPA-UR。
步骤S3所述分析缓冲液为：4×SSC，2％BSA，0.05％Tween-20， pH 7.0。
步骤S1是将所述通用阻断接头序列和1个、2个或4个C3阻断子顺 次连接到引物RPA-F、RPA-R的5’端，得到用于通用接头阻断RPA扩 增技术的引物RPA-UF、RPA-UR。优选地，将所述通用阻断接头序列 和2个C3阻断子顺次连接到引物RPA-F、RPA-R的5’端。
按照TwistAmp基础试剂盒(TwistDx公司，英国)说明，配制RPA 扩增反应体系，具体如下：
i)根据RPA反应试剂盒说明书，配制混合液：29.5μL复水反应液， 10μM引物RPA-UF和RPA-UR各2.4μL，2.4μL模板DNA，ddH2O补齐 47.5μL；
iI)将上述混合液转移到含有冻干粉的冻存管中，完全溶解后添加 280mM醋酸镁2.5μL。
RPA扩增反应的条件为：38℃反应20分钟。
本发明进一步提供含有上述用于构建RPA生物传感器的通用阻 断接头序列和/或上述基于肽核酸的核酸层析试纸条的试剂盒。
在本发明的一个具体实施方式中，利用上述基于核酸层析生物传 感技术对鼠伤寒沙门氏菌进行了检测(非诊断目的)。具体方法如下：
1、引物及探针设计
选取沙门氏菌的invA基因作为靶序列(GenBank：DQ644633.1)， 根据TwistAmpTM反应试剂盒指导，自行设计RPA扩增引物(RPA-F， RPA-R)。将通用接头以及C3阻断子连接到RPA引物的5’端，用于设 计通用接头阻断重组聚合酶扩增技术(UBLRPA)的引物(RPA-UF，RPA-UR)。为了验证阻断的效果，设置了0、1、2、4个C3阻断子， 在序列中用X表示。根据通用接头设计核酸试纸条上的探针，C线上 的质控探针(CCP)、T线上的捕获探针(TCP)、纳米金的连接探针 (P)，这些探针全部是用肽核酸(PNA)合成。其中CCP和TCP的N 端都修饰有生物素(BIO)，P的N端修饰有半胱氨酸残基，C端修饰有 三个连续的谷氨酸。(表1)
表1
实验前期共设计了5对引物RPA-F和RPA-R，通过RPA扩增后，根 据最终产物电泳图条带的明暗清晰程度来选择最合适的引物对，表1 中的引物RPA-F和RPA-R在5对引物中扩增效果最佳。
2、RPA和UBLRPA反应
利用TwistAmp基础试剂盒进行RPA引物的可行性验证，通过2％ 凝胶电泳发现具有良好的扩增条带，证明引物能够用于RPA反应。为 了验证通用接头不会对RPA扩增产生抑制，分别利用带有接头的引物 进行扩增，结果用2％凝胶电泳验证，具有明显的扩增条带，证明接 头不会影响RPA扩增，能够用于建立UBLRPA技术。随后利用添加阻 断子的引物进行扩增，验证阻断子的数目对阻断效果的影响，阻断的 产物是单双链复合体，在凝胶电泳中难以判断产物大小，因此产物用 毛细管电泳进行分析，结果发现1、2和4个阻断子都有较好的阻断效 果。为了保证阻断的严格性，后续实验选取2个阻断子，成功建立了 UBLRPA扩增技术。
3、纳米金和纳米金探针的制备
利用柠檬酸钠烧金法制备纳米金，利用TEM观察纳米金颗粒的尺 寸，同时测量纳米金的Zeta扫描电位，随后将制备好的纳米金与肽核 酸进行偶联，制备纳米金探针。制备期间，为了防止纳米金聚沉，选 用BSPP缓冲液进行孵育。5-10μM PNA探针与10-20nM Au-NP在5 mM磷酸缓冲液反应12-14h，然后14000rpm离心20-30分钟分离纳 米金探针，再用5mM磷酸缓冲液进行冲洗两遍，最后溶解在10mM 的磷酸缓冲液中，保存使用。制备好的纳米金探针利用TEM观察形态， 同时测量纳米金探针的Zeta扫描电位。
4、基于PNA的核酸试纸条的建立
利用肽核酸制备基于PNA的核酸层析试纸条(PLFD)。该试纸条 分为4部分：样品垫、结合垫、NC膜和吸附垫。样品垫和结合垫(结 合垫上固定有纳米金修饰的连接探针P)浸泡在缓冲液(0.25-0.5％ Triton X-100，0.1-0.2M硼酸盐缓冲液，0.15-0.3M NaCl，pH8.0) 中，然后37℃烘干2-3h。将30-50μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与 30-50μL的100μM捕获探针进行混合，然后在室温下孵育1-2h，制 备出链霉亲和素-生物素化的质控/检测捕获探针(CCP/TCP)。然后分 别用CCP和TCP在NC膜上划C线和T线，37℃烘干12-14h。
5、实际样品检测
利用UBLRPA扩增技术和PLFD试纸条搭建完成的基于功能核酸 的生物传感器，用于实际样品检测。采用加标回收的方式，利用不同 浓度(101、102、103、104)的沙门氏菌人工污染牛奶样品，然后利 用建立的生物传感器进行检测。首先利用UBLRPA扩增沙门氏菌的基因组，得到含有通用接头的单双链复合产物；然后利用PLFD试纸进 行可视化分析，将50μL分析缓冲液(4×SSC，2％BSA，0.05％ Tween-20(pH 7.0))与10-20μL产物混合，滴加到样品垫上，5-8min 判定结果，随后读取红色条带的吸峰值。验证结果良好，回收率在94.7 ±6.9％至107.1±3.4％之间，证明该传感器能够用于沙门氏菌的检测。
本发明具有以下优点：
(一)首次建立了通用接头阻断技术，实现双链向单链产物的转 化。
(二)利用通用接头和C3阻断子建立了通用接头阻断重组聚合酶 扩增技术。
(三)利用PNA探针建立了单链核酸杂交试纸条，实现核酸产物 的可视化分析。
(四)搭建了一个简单、便携、封闭式生物传感器，用于食源性 致病菌的超灵敏检测。
(五)本方法具有通用型，仅需根据检测对象更换引物，即可实 现现场可视化检测。
(六)本方法针对沙门氏菌的检测水平可达4CFU mL-1。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中UBLRPA扩增结果；其中，(A)接头 引物可行性验证；泳道M：DNA Marker DL 2000，泳道1-2：引物RPA-F 和RPA-R，泳道3-4：引物RPA-UF0和RPA-R，泳道5-6：引物RPA-F 和RPA-UR0，泳道7-8：引物RPA-UF0和RPA-UR0，泳道9：阴性 对照；(B)阻断子效果验证，泳道L：DNA Marker DL 150，泳道1： 无接头阳性对照，泳道2：0个C3阻断子，泳道3：1个C3阻断子； 泳道4：2个C3阻断子，泳道5：4个C3阻断子；(C)UBLRPA的特异 性，泳道M：DNA Marker DL 2000，泳道1：Salmonella typhimurium CICC 10420，泳道2：Salmonella enterica ATCC 55105，泳道3： Salmonella spp，CGMCC 1.1552，泳道4：Listeria monocytogenes ATCC 19112，泳道5：Listeria monocytogenes CAU 05021，泳道6：Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085，泳道7：Escherichia coli CICC 10899，泳道8：Staphyloccocus aureus CICC 10306，泳道9：Clostridium perfringens ATCC 10388，泳道10：Bacillus cereus ATCC 21928，泳道11： Enterobacter sakazakii ATCC 51329，泳道12：Shigella sonnei CICC 21535，泳道13：Bifidobacterium longum CGMCC 2265，泳道14： Acetobacter aceti ATCC 15973，泳道15：Zygosaccharomyces bailii ATCC 56075，泳道16：Bacteroides fragilis ATCC 25285，泳道17：阴 性对照。
图2为本发明较佳实施例中纳米金颗粒、PNA以及纳米金探针的 Zeta扫描电位图；其中，(A)AuNPs，(B)PNA探针，(C)纳米金探针。
图3为本发明较佳实施例中ITC数据曲线以及结合等温拟合曲线 (A)PNA和DNA，(B)DNA和DNA。
图4为本发明较佳实施例中利用PLFD核酸层析试纸条分析 UBLRPA产物；其中，(A)灵敏度，条带1：106CFU mL-1，条带2： 105CFU mL-1，条带3：104CFU mL-1，条带4：103CFU mL-1，条带5： 102CFU mL-1，条带6：10CFU mL-1，条带7：1CFU mL-1，条带8： 阴性对照；(B)最低检测限实验.，条带1：10CFU mL-1，条带2：8CFU mL-1，条带3：6CFU mL-1，条带4：4CFU mL-1，条带5：2CFU mL-1， 条带6：阴性对照；(C)标准曲线。
图5为本发明基于肽核酸的核酸层析试纸条的结构示意图。其中， 1-样品垫，2-硝酸纤维素膜，3-结合垫，4-吸收垫，5-检测线，6-质控 线，7-底板。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验 手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法
本实施例中共有16种微生物用于生物传感器的构建，将鼠伤寒沙 门氏菌作为生物传感器构建的模式菌株(表2)。
表2
所有的菌株用LB培养基进行活化，37℃培养16h，其中鼠伤寒 沙门氏菌用0.8％的生理盐水进行梯度稀释，保证终浓度为1-106CFU mL-1。
1、引物及探针设计
选取沙门氏菌的invA基因作为靶序列(GenBank：DQ644633.1)， 根据TwistAmpTM反应试剂盒指导，自行设计RPA扩增引物(RPA-F， RPA-R)。将通用接头以及C3阻断子连接到RPA引物的5’端，用于设 计通用接头阻断重组聚合酶扩增技术(UBLRPA)的引物(RPA-UF，RPA-UR)。为了验证阻断的效果，设置了0、1、2、4个C3阻断子， 在序列中用X表示。根据通用接头设计核酸试纸条上的探针，C线上 的质控探针(CCP)、T线上的捕获探针(TCP)、纳米金修饰的连接 探针(P)，这些探针全部是用肽核酸(PNA)合成。其中CCP和TCP 的N端都修饰有生物素(BIO)，P的N端修饰有半胱氨酸残基，C端修 饰有三个连续的谷氨酸。(表1)
2、RPA和UBLRPA反应
利用TwistAmp基础试剂盒进行RPA引物的可行性验证，通过 2％凝胶电泳发现具有良好的扩增条带，证明引物能够用于RPA反应。 为了验证通用接头不会对RPA扩增产生抑制，分别利用带有接头的 引物进行扩增，结果用2％凝胶电泳验证，具有明显的扩增条带，证 明接头不会影响RPA扩增，能够用于建立UBLRPA技术。随后利用 添加阻断子的引物进行扩增，验证阻断子的数目对阻断效果的影响， 阻断的产物是单双链复合体，在凝胶电泳中难以判断产物大小，因此 产物用毛细管电泳进行分析，结果发现1、2和4个阻断子都有较好的阻断效果。为了保证阻断的严格性，后续实验选取2个阻断子，成 功建立了UBLRPA扩增技术。
3、UBLRPA扩增技术的建立
通用接头是一条富含鸟嘌呤的单链核酸，根据RPA引物设计指 导，富含鸟嘌呤会影响引物的扩增效率。基于此，首先验证通用接头 是否会对扩增产生抑制。设置四组实验进行验证：RPA-F和RPA-R， RPA-UF0和RPA-R，RPA-F和RPA-UR0，以及RPA-UF0和RPA-UR0， 结果用2％凝胶电泳进行分析。结果显示(图1A)接头并没有抑制扩 增，带有一个接头的引物扩增出来的产物比没有接头的长19bp，带 有两个接头的引物扩增出来的产物比没有接头的长38bp。
接头引物验证成功之后，进一步分析阻断子的阻断作用，建立通 用接头阻断技术。设置1、2和4个C3阻断子进行扩增，结果用毛细 管电泳进行分析。结果显示(图1B)C3阻断子具有显著的阻断效果， 产物大小与没有阻断的接头引物具有明显的大小差异。为了保证阻断 效果的稳定性及严格性，选取2个C3阻断子建立UBLRPA扩增技术。 然后利用该技术进行特异性验证，结果证明(图1C)只有沙门氏菌 有扩增条带，其他菌株没有扩增条带，证明该技术具有良好的特异性。
4、纳米金及纳米金探针的制备
纳米金的尺寸会影响纳米金的性能，利用柠檬酸钠烧金法制备出 13nm的纳米金颗粒，能够用于纳米金探针的制备。将5μM连接探 针P(PNA)与10nM Au-NP在5mM磷酸缓冲液中反应12h，然 后14000rpm离心20分钟分离纳米金探针，再用5mM磷酸缓冲液进 行冲洗两遍，最后溶解在10mM的磷酸缓冲液中，保存使用。为了 验证纳米金探针是否制备成功，分析纳米金颗粒、PNA以及纳米金 探针的Zeta扫描电位。结果显示(图2)纳米金和PNA寡链的电位 分别是-35.1mV和-7.32mV，连接之后，纳米金探针的电位变成-15.2 mV，证明连接成功，能够用于试纸条的制备。
5、PNA与DNA的结合验证
肽核酸PNA能够与核酸发生碱基配对，并且与DNA的结合力要 强于DNA与DNA的结合力。为了验证传感器的PNA探针与产物上 的单链DNA的结合效果，利用等温量热滴定法(ITC)进行分析。 利用试纸条的分析缓冲液(4×SSC,2％BSA，0.05％Tween-20(pH 7.0))作为ITC的缓冲液，滴定采用70μM PNA/DNA探针，样品池 采用15μM DNA溶液，全程设置20针，每300s一针。结果显示(图 3)PNA与DNA结合的亲和力常数Kd＝5.599E-5M，结合位点数n 为1.212，DNA与DNA结合的亲和力常数Kd＝3.845E-4M，结合位 点数n为1.096，证明PNA与DNA之间的结合效率更强。其中，E 是数学常数，M表示摩尔浓度单位。
6、生物传感器性能测试
利用肽核酸制备基于PNA的核酸层析试纸条(PLFD)。该试纸条 分为4部分：样品垫、结合垫、NC膜和吸附垫。样品垫和结合垫浸泡 在缓冲液(0.25％Triton X-100，0.1M硼酸盐缓冲液，0.15M NaCl， pH 8.0)中，然后37℃烘干2h。将30μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与30μL的100μM PNA捕获探针进行混合，然后在室温下孵育1h， 制备出链霉亲和素-生物素化的质控/检测捕获探针(CCP/TCP)。然后 分别用CCP和TCP在NC膜上划C线和T线，37℃烘干12h。
利用上述制备的PLFD核酸试纸条，对UBLRPA扩增产物进行 可视化分析，整合形成完整的功能核酸生物传感器，然后分析传感器 的灵敏度。首先制备不同浓度的沙门氏菌：0-106CFU mL-1，然后利 用UBLRPA扩增技术对基因组进行扩增，得到单双链复合产物，最 后用PLFD核酸试纸条进行结果分析。结果显示(图4A)随着菌体 浓度的降低，T线上红色条带的颜色逐渐变浅，定量检测限为10CFU mL-1。随后将沙门氏菌继续稀释为8、6、4、2CFU mL-1，进行最低 检测限分析，结果显示(图4B)低于4CFU mL-1时T线不再出现， 证明该传感器的最低检测限为4CFU mL-1。读取试纸条上T线的吸 光值，利用峰面积与菌体浓拟合定量曲线，结果显示(图4C)在10-106 CFU mL-1范围内具有良好的线性关系，峰面积＝2727.86lg鼠伤寒沙 门氏菌浓度+20032.86(R2＝0.99046)。其中，鼠伤寒沙门氏菌浓度单 位为CFU/mL。
配制RPA扩增反应体系的方法如下：
i)根据RPA反应试剂盒说明书，配制混合液：29.5μL复水反应液， 10μM引物RPA-UF和RPA-UR各2.4μL，2.4μL模板DNA，ddH2O补齐 47.5μL；
iI)将上述混合液转移到含有冻干粉的冻存管中，完全溶解后添加 280mM醋酸镁2.5μL。
RPA扩增反应的条件为：38℃反应20分钟。
7、牛奶中沙门氏菌的检测
为了进一步验证该传感器的适用性，设置了沙门氏菌的加标回收 实验。在2.5mL牛奶中分别添加10、103、105CFU mL-1的沙门氏菌， 混匀1min。然后利用该传感器技术对其中的沙门氏菌进行定量检测 分析，结果显示(表3)回收率在94.7±6.9％至107.1±3.4％之间， 证明该传感器能够用于现场检测。
表3人工污染牛奶中沙门氏菌回收率
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法
<130> KHP171113519.9
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttggtcgtgg tggtggttt 19
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccgcgtaaa tggcgatacg gataatatgg gg 32
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctcaatact gagcggctgc tcgcctttgc tgg 33

Claims (10)

1.一种基于肽核酸的核酸层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：
1)纳米金颗粒的制备；
2)肽核酸探针的制备：人工合成质控捕获探针CCP、检测捕获探针TCP和连接探针P，它们的序列分别为：
质控捕获探针CCP：5’-biotin-TGGTGGTGCTGGTT-3’
检测捕获探针TCP：5’-biotin-AACCAGCACCACCA-3’
连接探针P：5’-Cys-AACCAGCACCACCA-Glu-Glu-Glu-3’
3)纳米金修饰的连接探针P的制备；
4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；
①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述缓冲液为：0.25-0.5％Triton X-100，0.1-0.2M硼酸盐缓冲液，0.15-0.3M NaCl，pH 8.0；其中，所述结合垫上固定有纳米金修饰的连接探针P；
②将30-50μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与30-50μL的100μM肽核酸捕获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1-2h，分别制备出链霉亲和素-生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝酸纤维素膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12-14h；
③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，步骤1)中利用柠檬酸钠烧金法制备粒径为13nm的纳米金颗粒。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，步骤3)具体为：将5-10μM步骤2)的连接探针P与10-20nM步骤1)的纳米金颗粒在5mM磷酸缓冲液中反应12-14h，然后14000rpm离心20-30分钟，收集沉淀物，再用5mM磷酸缓冲液冲洗沉淀物，最后溶解在10mM的磷酸缓冲液中，即得纳米金修饰的连接探针P。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征在于，步骤3)具体为：将5μM步骤2)的连接探针P与10nM步骤1)的纳米金颗粒在5mM磷酸缓冲液中反应12h，然后14000rpm离心20分钟，收集沉淀物，再用5mM磷酸缓冲液冲洗沉淀物，最后溶解在10mM的磷酸缓冲液中，即得纳米金修饰的连接探针P；
步骤4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：
①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述缓冲液为：0.25％Triton X-100，0.1M硼酸盐缓冲液，0.15M NaCl，pH 8.0；
②将30μL的1mg/ml链霉亲和素溶液与30μL的100μM肽核酸捕获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1h，分别制备出链霉亲和素-生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝酸纤维素膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12h；
③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。
5.基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以目标致病菌的高特异性毒力基因为靶序列，设计RPA引物RPA-UF和RPA-UR；
S2、提取待测样品DNA，以DNA为模板，利用步骤S1的RPA引物RPA-UF和RPA-UR进行RPA扩增反应；
S3、将步骤S2的RPA扩增产物与分析缓冲液混合，滴加到权利要求1-4任一项所述试纸条的样品垫上，反应5-8min，判读结果:阴性反应：质控线显色，检测线不显色；阳性反应：质控线、检测线均显色；失效反应：若质控线不显色，则检测失败或试纸条失效；
其中，步骤S1具体为：以目标致病菌的高特异性毒力基因为靶序列，设计RPA扩增引物RPA-F、RPA-R，将通用阻断接头和至少1个C3阻断子顺次连接到引物RPA-F、RPA-R的5’端，得到用于通用接头阻断RPA扩增技术的引物RPA-UF、RPA-UR；其中，所述通用阻断接头的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
步骤S3所述分析缓冲液为：4×SSC，2％BSA，0.05％Tween-20，pH 7.0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1是将所述通用阻断接头序列和2个C3阻断子顺次连接到引物RPA-F、RPA-R的5’端，得到用于通用接头阻断RPA扩增技术的引物RPA-UF、RPA-UR。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1所述待测致病菌为鼠伤寒沙门氏菌，所述高特异性毒力基因为invA。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中引物RPA-F和RPA-R的序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2中配制RPA扩增反应体系的方法如下：
i)配制混合液：29.5μL复水反应液，10μM引物RPA-UF和RPA-UR各2.4μL，2.4μL模板DNA，ddH2O补齐47.5μL；
iI)将上述混合液转移到含有冻干粉的冻存管中，完全溶解后添加280mM醋酸镁2.5μL；
RPA扩增反应的条件为：38℃反应20分钟。
10.含有权利要求1-4任一项所述试纸条的试剂盒。
CN201710482892.7A 2017-06-22 2017-06-22 基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法 Pending CN107267610A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710482892.7A CN107267610A (zh) 2017-06-22 2017-06-22 基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710482892.7A CN107267610A (zh) 2017-06-22 2017-06-22 基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107267610A true CN107267610A (zh) 2017-10-20

Family

ID=60069180

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710482892.7A Pending CN107267610A (zh) 2017-06-22 2017-06-22 基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107267610A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365836A (zh) * 2017-06-22 2017-11-21 中国农业大学 基于核酸层析生物传感技术检测蜡样芽胞杆菌的方法
CN110283919A (zh) * 2019-05-10 2019-09-27 中国农业大学 一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法
CN114672543A (zh) * 2022-04-06 2022-06-28 中国药科大学 一种高特异核酸多重可视化检测的方法
CN114874914A (zh) * 2022-01-18 2022-08-09 吉林大学 一株广谱抑菌自絮凝非酿酒酵母菌株cc-p5及其应用
CN116102626A (zh) * 2023-03-28 2023-05-12 西南交通大学 一种核酸探针及制备方法和用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002282A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 江苏猎阵生物科技有限公司 核酸检测试纸条及其制备方法和检测核酸的方法
US20160097090A1 (en) * 2005-07-25 2016-04-07 Alere San Diego, Inc. Methods for Multiplexing Recombinase Polymerase Amplification
CN106868152A (zh) * 2017-03-14 2017-06-20 宁波海洋研究院 一种食源性致病菌沙门氏菌的检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160097090A1 (en) * 2005-07-25 2016-04-07 Alere San Diego, Inc. Methods for Multiplexing Recombinase Polymerase Amplification
CN105002282A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 江苏猎阵生物科技有限公司 核酸检测试纸条及其制备方法和检测核酸的方法
CN106868152A (zh) * 2017-03-14 2017-06-20 宁波海洋研究院 一种食源性致病菌沙门氏菌的检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN NAN等: "Specific and relative detection of urinary microRNAs signature in bladder cancer for point-of-care diagnostics", 《CHEMICAL COMMUNICATION》 *
MIRIAM JAUSET-RUBIO等: "Aptamer Lateral Flow Assays for Ultrasensitive Detection of β Conglutin Combining Recombinase Polymerase Amplification and Tailed Primers", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
MIRIAM JAUSET-RUBIO等: "Ultrasensitive, rapid and inexpensive detection of DNA using paper based lateral flow assay", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
RAJ CHAKRABARTI等: "Nanocrystals Modified with Peptide Nucleic Acids (PNAs) for Selective Self-Assembly and DNA Detection", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 *
SHANG YING等: "Single universal primer multiplex ligation-dependent probe amplification with sequencing gel electrophoresis analysis", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365836A (zh) * 2017-06-22 2017-11-21 中国农业大学 基于核酸层析生物传感技术检测蜡样芽胞杆菌的方法
CN110283919A (zh) * 2019-05-10 2019-09-27 中国农业大学 一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法
CN110283919B (zh) * 2019-05-10 2021-01-01 中国农业大学 一种用于沙门氏菌定量检测的生物传感器及方法
CN114874914A (zh) * 2022-01-18 2022-08-09 吉林大学 一株广谱抑菌自絮凝非酿酒酵母菌株cc-p5及其应用
CN114874914B (zh) * 2022-01-18 2024-01-26 吉林大学 一株广谱抑菌自絮凝非酿酒酵母菌株cc-p5及其应用
CN114672543A (zh) * 2022-04-06 2022-06-28 中国药科大学 一种高特异核酸多重可视化检测的方法
CN116102626A (zh) * 2023-03-28 2023-05-12 西南交通大学 一种核酸探针及制备方法和用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107267610A (zh) 基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法
Bu et al. Ultrasensitive detection of pathogenic bacteria by CRISPR/Cas12a coupling with a primer exchange reaction
Pal et al. Sensitivity and specificity performance of a direct-charge transfer biosensor for detecting Bacillus cereus in selected food matrices
CN103409546B (zh) 一种用于检测猪链球菌2型的试剂盒及其应用
WO2012006187A2 (en) Methods and devices for the selective detection of microorganisms
CN105092683B (zh) 一种用于检测铅的电化学传感器及其制备方法和应用
CN103436608B (zh) 基于核酸适体的快速检测方法及试剂盒
CN104630869A (zh) 一种检测金黄色葡萄球菌的dna传感器及其制备与应用
CN106755358B (zh) 多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法
CN110186975A (zh) 用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器及制备方法
CN102363815A (zh) 运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法
CN105219874A (zh) 铜绿假单胞菌的psr检测方法及其专用引物与试剂盒
CN107478700B (zh) 用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂及使用方法
CN102220417B (zh) 基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法
Zhang et al. Rapid visualized detection of Escherichia coli O157: H7 by DNA hydrogel based on rolling circle amplification
CN103725686A (zh) 黄曲霉毒素b1的核酸适体afb1-20及其应用
CN102776283A (zh) 一种检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒
Daramola et al. Functionalized inorganic nanoparticles for the detection of food and waterborne bacterial pathogens
CN104792999A (zh) 一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片
CN107102047B (zh) 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器
CN103184283A (zh) Pcr酶切分型检测军团菌试剂盒及其应用
Li et al. A signal-off double probes electrochemical DNA sensor for the simultaneous detection of Legionella and Legionella pneumophila
CN111398388B (zh) 一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法
Xu et al. Sandwich capture ultrasensitive sensor based on biohybrid interface for the detection of Cronobacter sakazakii
CN104031129A (zh) 用于检测金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的肽核酸探针组及其试剂盒、使用方法、用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171020