CN114672543A - 一种高特异核酸多重可视化检测的方法 - Google Patents

一种高特异核酸多重可视化检测的方法 Download PDF

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CN114672543A CN202210357006.9A CN202210357006A CN114672543A CN 114672543 A CN114672543 A CN 114672543A CN 202210357006 A CN202210357006 A CN 202210357006A CN 114672543 A CN114672543 A CN 114672543A
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邹秉杰
王琛
宋沁馨
马漪
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种高特异核酸多重可视化检测的方法，该方法利用针对不同待测核酸靶标序列设计的寡核苷酸探针识别待测靶标，通过核酸酶酶切探针释放不同靶标对应的序列标签片段，进而被侧流层析试纸条上不同位置固定的捕获探针捕获显色，从而实现对核酸靶标的多重可视化检测。本发明提出的方法可对单碱基差异靶标进行高特异检测，侧流层析试纸条对不同靶标具有通用性，检测结果通过肉眼可视化判读，是一种高特异、低成本的核酸多重检测方法。

Description

一种高特异核酸多重可视化检测的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高特异核酸多重可视化检测的方法。
背景技术
核酸检测在疾病诊断、治疗监测及预后评估中显示出重要价值。随着越来越多的核酸标志物被发掘，对核酸检测技术也提出了更高的要求，其中多靶标并行检测与低成本现场检测是核酸检测技术的发展趋势。其中，基于侧流层析试纸条的核酸检测因简便快速成本低而具有很好的应用前景。然而，现有的核酸检测试纸条大都基于抗原抗体捕获原理，即在核酸上标记抗原分子，利用试纸条上固定的抗体来捕获抗原标记的核酸来进行检测，因可标记的抗原种类有限，限制了多重检测的靶标数目。尽管采用在试纸条上固定核酸探针来捕获待测核酸靶标的方法突破了基于免疫层析试纸条的检测靶标数目限制，但需要针对不同待测靶标核酸序列制备固定有不同的捕获探针的试纸条，通用性不够好，并且仅采用核酸杂交原理来识别捕获待测靶标，特异性不够高，难以实现对单碱基差异靶标的区分检测，因而造成核酸检测试纸条难以用于基因分型或基因突变检测中。因此，需要建立一种高特异性的基于侧流层析试纸条的核酸多重检测方法。
发明内容
针对现有基于侧流层析试纸条的核酸多重检测方法特异性不够高、通用性不够好的技术问题，发明的目的在于提供一种高特异核酸多重可视化检测的方法。该方法是一种通过酶切与待测靶标匹配的核酸探针，从而产生能被侧流层析试纸条上的捕获探针捕获显色的序列标签寡核苷酸片段，来对待测靶标进行多重可视化检测的新方法，该方法因酶切反应的高特异性可区分检测含有单个碱基差异的待测靶标，并且固定有捕获探针的侧流层析试纸条对不同待测靶标均可通用，解决了核酸检测试纸条特异性不好通用性差的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种基于侧流层析试纸条的高特异核酸多重可视化检测方法，该方法包括以下步骤：寡核苷酸探针与待测靶标杂交后，核酸酶特异性切割所述探针，释放序列不同的寡核苷酸片段，所述寡核苷酸片段进而与不同序列发夹探针杂交，引发核酸酶切割发夹探针产生序列标签寡核苷酸片段，所述序列标签寡核苷酸片段可与侧流层析试纸条上固定的捕获探针杂交而被捕获，捕获后的序列标签寡核苷酸片段可以与显色剂作用而在试纸条上显色，不同待测靶标对应不同的寡核苷酸探针产生不同的序列标签寡核苷酸片段，在试纸条上不同位置固定的捕获探针捕获而显色，通过观测试纸条上的显色位置从而判断待测靶标种类；所述核酸酶具有单碱基序列差异识别的特异性，因此可高特异性区分检测含有单个碱基序列差异的待测核酸靶标。
作为一种优选技术方案，所述的寡核苷酸探针和发夹探针依据以下设计原则进行设计：
所述的寡核苷酸探针包括上游探针和下游探针，所述上游探针的3’端能够与下游探针和靶标形成的杂交双链之间形成3碱基重叠结构；所述的核酸酶能够特异性切割该3碱基重叠结构，使所述下游探针5’端的核酸片段与下游探针分离释放序列不同的寡核苷酸片段；
所述发夹探针的5’端包含所述的序列标签寡核苷酸片段，所述的寡核苷酸片段能够与所述的发夹探针杂交再次形成3碱基重叠结构，所述的核酸酶特异性切割该3碱基重叠结构，释放出所述发夹探针5’端的序列标签寡核苷酸片段。
所述序列标签寡核苷酸片段的序列与所述试纸条上固定的捕获探针序列全部或部分互补，在侧流层析过程中可被所述固定在试纸条上特定位置的捕获探针捕获。
其中，所述核酸酶包括核酸内切酶、核酸外切酶或切刻内切酶中的一种，优选flap核酸内切酶。它可识别由一条上游探针和一条下游探针与待测靶标核酸杂交后由上游探针3’端与下游探针和靶标形成的杂交双链之间形成的3碱基重叠结构(图1)，并切割下游探针5’端的核酸片段使之与下游探针分离(图1)。该酶的识别特异性高，可区分在3碱基重叠结构附近的单碱基差异待测靶标。
其中，酶切割下游探针产生的下游探针5’核酸片段可与一条与之序列匹配的发夹探针杂交，再次形成flap核酸内切酶识别的结构，使发夹探针被切割，释放出发夹探针5’端的序列标签寡核苷酸片段(图1)，该序列标签寡核苷酸片段可被固定在侧流层析试纸条特定位置的捕获探针杂交捕获，经显色剂显色后会在试纸条上捕获有序列标签寡核苷酸片段的位置处显色(图2)。不同待测靶标对应不同的上下游探针以及发夹探针，因此，每种待测靶标将产生不同序列的序列标签寡核苷酸片段，被试纸条上固定在不同位置的与之对应的捕获探针所捕获，从而在不同位置处显色，由此指示出体系中存在哪种待测核酸靶标。体系中不存在的靶标对应的上下游探针与发夹探针因没有靶标存在而不会被酶切割，保持完好，完整的发夹探针虽然含有序列标签寡核苷酸片段，但因受到发夹探针的空间位阻影响而不能被试纸条上的捕获探针所捕获，进而不能在相应位置显色(图2和图3)。
其中，所述侧流层析试纸条为尼龙膜或硝酸纤维素膜制备的在不同位置固定有捕获寡核苷酸探针的固相支撑核酸检测试纸条，所述不同位置固定的捕获探针序列分别与不同的所述序列标签寡核苷酸片段序列互补。
其中，显色剂为胶体金、乳胶微球或酶标记的蛋白、抗体、核酸，其可与所述序列标签寡核苷酸片段结合，使捕获在侧流层析试纸条上的序列标签寡核苷酸片段显色。
其中，所述的基于侧流层析试纸条的高特异核酸多重可视化检测方法，可与常规的核酸扩增反应相偶联以实现对低浓度靶标的检测，所述核酸扩增反应为聚合酶链式反应、核酸环介导等温扩增反应、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增反应、连接扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应中的任意一种。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明提出的通过酶切靶标特异性探针产生序列标签寡核苷酸片段进而被侧流层析试纸条捕获显色的高特异核酸多重可视化检测方法，因序列标签寡核苷酸片段的序列与待测靶标无关，可实现一种侧流层析试纸条检测不同靶标，无需更换试纸条上的捕获探针序列，检测成本低，克服了目前核酸检测试纸条通用性不好的问题。本发明优选的flap核酸内切酶特异性高，可实现单碱基差异待测靶标的区分检测解决了常规基于核酸杂交检测的试纸条难以进行基因分型或基因突变检测的问题。
附图说明
图1为本发明中的flap核酸内切酶切割探针产生序列标签寡核苷酸片段的原理图示意图；
图2为本发明中的序列标签寡核苷酸片段被试纸条捕获显色的原理示意图；
图3为本发明高特异核酸多重可视化检测的方法的原理示意图；
图4为本发明实施例1检测1、2和3种靶标的试纸条显色结果；
图5为本发明实施例2中检测不同比例单碱基突变靶标的人工合成模板的试纸条显色结果；
图6为本发明实施例3检测不同拷贝数的3种靶标的试纸条显色结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：检测三种人工合成核酸片段
本发明以人工合成的3种序列不同的核酸片段作为检测靶标进行多重检测来验证技术的可行性。
3种靶标及对应的探针序列如下(5’-3’)：
靶标1(SEQ ID NO.1):AACGATAACCAGGACAAATTG GAG GAC AAG AGG TTG GTG A
靶标1对应的上游探针(SEQ ID NO.2)：TCACCAACCTCTTGTCCTCCAT
靶标1对应的下游探针(SEQ ID NO.3)：CGCGCCGAGGATTTGTCCTGGTTATCGTT
靶标1对应的发夹探针(SEQ ID NO.4)：Biotin-ATCGAGGTCCTAACTCGTCTCGGTTTTCCGAGACGAGTCCTCGGCGCGATGAGACTGTAGAGCTGGTA
靶标2(SEQ ID NO.5)：TCGCGACCCAACACTACTCGGCTAGCAGTCTCG
靶标2对应的上游探针(SEQ ID NO.6)：CGAGACTGCTAGCCGAGTAGC
靶标2对应的下游探针(SEQ ID NO.7)：CGCGAGGCCGTGTTGGGTCGCGA
靶标2对应的发夹探针(SEQ ID NO.8)：Biotin-CGGTGAAGTGTAACTCGTCTCGGTTTTCCGAGACGAGTCGGCCTCGCGATGAGACTGTAGAGCTGGTA
靶标3(SEQ ID NO.9)：GCA AAT GTT AAA AGA GAC CAT CAA TGA GGA AGC TGCAGA ATG G
靶标3对应的上游探针(SEQ ID NO.10)：CCATTCTGCAGCTTCCTCATTGT
靶标3对应的下游探针(SEQ ID NO.11)：AGGCCACGGACGATGGTCTCTTTTAACATTTGC
靶标3对应的发夹探针(SEQ ID NO.12)：Biotin-CATCTGCTCACGACTCGTCTCGGTTTTCCGAGACGAGTCGTCCGTGGCCTATGAGACTGTAGAGCTGGTA
反应体系：10mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.05％(v/v)Tween-20，7.5mM MgCl2，30mMNaCl，0.5μM各靶标上下游探针与发夹探针(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12)，80Uflap核酸内切酶(重组flap核酸内切酶1的表达及活性测定方法的建立，盛楠等，生物工程学报)，测试管中分别加入1010拷贝的靶标1(SEQ ID NO.1)、靶标2(SEQ ID NO.5)、靶标3(SEQ ID NO.9)的1种、2种或3种，对照管中以双蒸水作阴性对照(NTC)。
朗基PCR仪运行程序：94℃1min；63℃30min。
反应程序结束后，将侧流层析试纸条插入到反应体系中，待到溶液爬升到试纸条顶端后，将试纸条取出，随后插入到含有2μL胶体金标记链酶亲和素，0.05mol/L phosphatebuffer saline(pH 7.2)，0.5％(v/v)Tween 20，5％sucrose(g/100mL)和1％BSA(g/100mL)的100μL显色液中，10分钟后，观察试纸条上的颜色。
结果示于图4，当加入1种、2种和3靶标时(标记为+)，试纸条在与靶标对应的捕获探针位置显色，不加靶标时(标记为-)不显色，而仅在质控线显色，表明所述方法可实现对多靶标进行可视化检测，各靶标间的相互干扰较小，并且完整的发夹探针没有引起强的背景颜色，不影响检测。
实施例2：检测含有单碱基差异的两条人工合成靶标
本发明以人工合成的2种序列仅相差1个碱基的核酸片段作为检测靶标来验证技术的高特异性。
2种靶标及对应的探针序列如下(5’-3’)：
野生型靶标(SEQ ID NO.13):TGA GAT AGA GAT CAC CCG CCA CAC CTG GCG GCA
野生型靶标对应的上游探针(SEQ ID NO.14)：TGCCGCCAGGTGTGGA
野生型靶标对应的下游探针(SEQ ID NO.15)：AGGCCACGGACG
CGGGTGATCTCTATCTCA
野生型靶标对应的发夹探针同靶标3对应的发夹探针(SEQ ID NO.12)
突变型靶标(SEQ ID NO.16)：TGA GAT AGA GAT CAC CCACCA CAC CTG GCG GCA
突变型靶标对应的上游探针同野生型靶标对应的上游探针(SEQ ID NO.14)
突变型靶标对应的下游探针(SEQ ID NO.17)：CGCGCCGAGG
TGGGTGATCTCTATCTCA
突变型靶标对应的发夹探针同靶标1对应的发夹探针(SEQ ID NO.4)
野生型与突变型靶标序列中加粗碱基序列为两条靶标的单碱基差异序列。
反应体系：10mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.05％Tween-20，7.5mM MgCl2，30mM NaCl，0.5μM各靶标上下游探针与发夹探针(SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.4)，80U flap核酸内切酶(重组flap核酸内切酶1的表达及活性测定方法的建立，盛楠等，生物工程学报)，测试管中分别加入不同比例混合的野生型(SEQ IDNO.13)与突变型(SEQ ID NO.16)靶标的混合物(总拷贝数为1012拷贝，突变靶标所占比例分别为：0％、0.01％、0.1％、1％、10％、50％和100％)，对照管中以双蒸水作阴性对照(NTC)。
朗基PCR仪运行程序：94℃1min；63℃30min。
反应程序结束后，将侧流层析试纸条插入到反应体系中，待到溶液爬升到试纸条顶端后，将试纸条取出，随后插入到含有2μL胶体金标记链亲和素，0.05mol/L phosphatebuffer saline(pH 7.2)，0.5％(v/v)Tween 20，5％sucrose(g/100mL)和1％BSA(g/100mL)的100μL显色液中，10分钟后，观察试纸条上的颜色。
结果示于图5，当突变型靶标比例大于等于0.1％时，均能在试纸条上捕获探针1和捕获探针3位置处看到颜色，而当突变型靶标比例低于0.1％或为100％时，试纸条上仅捕获探针3处或仅捕获探针1处可观察到颜色，阴性反应仅质控线显色，表明所述方法可实现对单碱基差异靶标进行区分检测，并且检测突变型靶标丰度可低至0.1％，非常有利于基因突变检测。
实施例3：与多重PCR相结合对3种人工合成靶标进行高灵敏检测
本发明以人工合成的3种核酸片段作为检测靶标，将所述方法与多重PCR相结合来实现多靶标的高灵敏检测。
3种靶标及对应的引物和探针序列如下(5’-3’)：
靶标4(SEQ ID NO.18):
CAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAAGAACATCAACTACC
靶标4的上游引物(SEQ ID NO.19)：CAAAATTCGCAGTCCCCAAC
靶标4的下游引物(SEQ ID NO.20)：GGTAGTTGATGTTCTTGGA
靶标4的上下游探针与发夹探针序列同靶标1靶标5(SEQ ID NO.21)：
TGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCC
靶标5的上游引物(SEQ ID NO.22)：TGGTCTGCGGAACCGG
靶标5的下游引物(SEQ ID NO.23)：GGGGCACTCGCAAGCA
靶标5的上下游探针与发夹探针序列同靶标2
靶标6(SEQ ID NO.24)：
ATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGAAGC
靶标6的上游引物(SEQ ID NO.25)：ATTATCAGAAGGAGCCACC
靶标6的下游引物(SEQ ID NO.26)：GCTTCTATTTGTTCCTGAAGG
靶标6的上下游探针与发夹探针序列同靶标3
多重PCR体系与程序：20μL多重PCR体系含有0.5U of Go
Figure BDA0003583470090000071
Hot StartPolymerase(5U/μL),1×colorless Go
Figure BDA0003583470090000072
Flexi buffer(Promega,Germany),0.2mMdNTPs,3mM MgCl2,0.2μM 3种靶标的上下游引物,1μL 3种不同拷贝数的合成靶标。PCR扩增在朗基PCR仪上完成，程序为：95℃，2分钟，45个温度循环(95℃10s，57℃20s，72℃30s)，最终72℃3 min。
核酸酶切割反应体系：10mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.05％Tween-20，7.5mM MgCl2，30mM NaCl，0.5μM各靶标上下游探针与发夹探针(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12)，80U flap核酸内切酶(重组flap核酸内切酶1的表达及活性测定方法的建立，盛楠等，生物工程学报)，测试管中分别加入1μL多重PCR扩增产物。
朗基PCR仪运行程序：94℃1min；63℃30min。
反应程序结束后，将侧流层析试纸条插入到反应体系中，待到溶液爬升到试纸条顶端后，将试纸条取出，随后插入到含有2μL胶体金标记链亲和素，0.05mol/L phosphatebuffer saline(pH 7.2)，0.5％(v/v)Tween 20，5％sucrose(g/100mL)和1％BSA(g/100mL)的100μL显色液中，10分钟后，观察试纸条上的颜色。
结果示于图6，当3种靶标在多重PCR体系中的拷贝数低大于等于2拷贝时，各靶标对应的试纸条上的捕获探针位置均能显色，表明与多重PCR相结合后，可检测到低至2拷贝的待测靶标，说明所建立的方法具有很高的灵敏度。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种高特异核酸多重可视化检测的方法
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<400> 21
tggtctgcgg aaccggtgag tacaccggaa ttgccaggac gaccgggtcc tttcttggat 60
caacccgctc aatgcctgga gatttgggcg tgcccccgcg agactgctag ccgagtagtg 120
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<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggtctgcgg aaccgg 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggggcactcg caagca 16
<210> 24
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
attatcagaa ggagccacc 19
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
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Claims (9)

1.一种高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：寡核苷酸探针与待测靶标杂交后，核酸酶特异性切割所述探针，释放序列不同的寡核苷酸片段，所述寡核苷酸片段进而与不同序列发夹探针杂交，引发核酸酶切割发夹探针产生序列标签寡核苷酸片段，所述序列标签寡核苷酸片段可与侧流层析试纸条上固定的捕获探针杂交而被捕获，捕获后的序列标签寡核苷酸片段可以与显色剂作用而在试纸条上显色，不同待测靶标对应不同的寡核苷酸探针产生不同的序列标签寡核苷酸片段，在试纸条上不同位置固定的捕获探针捕获而显色，通过观测试纸条上的显色位置从而判断待测靶标种类；所述核酸酶具有单碱基序列差异识别的特异性，因此可高特异性区分检测含有单个碱基序列差异的待测核酸靶标。
2.根据权利要求1所述的高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，所述核酸酶包括核酸内切酶、核酸外切酶或切刻内切酶中的一种。
3.根据权利要求2所述的高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，所述核酸酶为flap核酸内切酶。
4.根据权利要求1、2或3所述的高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，所述的寡核苷酸探针包括上游探针和下游探针，所述上游探针的3’端能够与下游探针和靶标形成的杂交双链之间形成3碱基重叠结构；所述的核酸酶能够特异性切割该3碱基重叠结构，使所述下游探针5’端的核酸片段与下游探针分离释放序列不同的寡核苷酸片段；
所述发夹探针的5’端包含所述的序列标签寡核苷酸片段，所述的寡核苷酸片段能够与所述的发夹探针杂交再次形成3碱基重叠结构，所述的核酸酶特异性切割该3碱基重叠结构，释放出所述发夹探针5’端的序列标签寡核苷酸片段。
5.根据权利要求1或4所述的高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，所述序列标签寡核苷酸片段的序列与所述试纸条上固定的捕获探针序列全部或部分互补，在侧流层析过程中可被所述固定在试纸条上特定位置的捕获探针捕获。
6.根据权利要求1所述的高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，所述侧流层析试纸条为尼龙膜或硝酸纤维素膜制备的在不同位置固定有捕获探针的固相支撑核酸检测试纸条，所述不同位置固定的捕获探针序列分别与不同的所述序列标签寡核苷酸片段序列互补。
7.根据权利要求1所述的高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，所述的显色剂为胶体金、乳胶微球或酶标记的蛋白、抗体、核酸，所述的显色剂能够与所述序列标签寡核苷酸片段结合，使捕获在侧流层析试纸条上的序列标签寡核苷酸片段显色。
8.根据权利要求1所述的高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，该方法可与常规的核酸扩增反应相偶联以实现对低浓度靶标的检测。
9.根据权利要求8所述的高特异核酸多重可视化检测方法，其特征在于，所述核酸扩增反应为聚合酶链式反应、核酸环介导等温扩增反应、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增反应、连接扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应中的任意一种。
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