CN108949914B - 基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌o157:h7检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌o157:h7检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于食品安全检测分析技术领域，涉及一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括以下组份：(1)转录激活因子样效应物核酸酶；能够特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA；(2)“拟人”分子信标。利用该试剂盒或该检测方法，能够高灵敏的检测大肠杆菌O157:H7。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测分析技术领域，更具体地，涉及一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法。
背景技术
食源性致病菌污染是影响我国食品安全的最主要因素之一。其中大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)因其易发易感源头多而受到广泛关注。大肠杆菌O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属，革兰氏染色阴性，可产生大量的Vero毒素(VT)，也称作类志贺氏毒素(SLT)，是主要致病因子。它的感染剂量极低，通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，严重者可导致死亡。据报道，世界上迄今已有上百次大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的爆发流行，目前大肠杆菌O157:H7病例已波及到五大洲，呈现世界流行之势。
目前，反复增菌实验以及菌落分离鉴别等实验是传统的食源性致病菌检测方法，耗时长，完成一次需要数天甚至十几天以上的时间，而且程序繁琐，也会因为样品细菌浓度过低给培养造成困难。除了传统方法以外，随着科学技术的进步，针对食源性致病菌检测的方法还包括免疫学方法和分子生物学实验法等比传统方法更灵敏、快捷的检测方法。基于免疫学基础建立的检测方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)，该方法准确性高，但过程较为繁琐；基于分子生物学技术建立起来的方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)技术、生物发光检测法以及环介导恒温扩增技术(LAMP)等，这些方法灵敏度高，具备准确、高效、自动化的特点，但需要对致病菌进行灭活处理，还要提取DNA，增加了过程的复杂度。随着人们对食品安全的愈发重视，如何更快更灵敏更便捷地检测食源性致病菌成为一个热门研究领域。
因此，现在亟需一种快速灵敏便捷的现场检测方法来检测大肠杆菌O157:H7，以保障食品安全和人民健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法。利用该试剂盒或该检测方法，能够高灵敏的检测大肠杆菌O157:H7。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，该试剂盒包括以下组份：
(1)转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)；能够特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA；具体地，TALENs能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA中18bp长的一段序列，该序列一条链具有如下碱基序列：
5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’(SEQ ID NO：5)
(2)“拟人”分子信标，由以下部分组成：
发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’(SEQ ID NO：1)；
其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；
左臂：
5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’(SEQ ID NO：2)；
右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’(SEQ ID NO：3)；
左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’(SEQ ID NO：4)；
右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’(SEQ ID NO：5)。
根据本发明，优选地，该试剂盒还包括：
(3)重组酶聚合酶及RPA等温扩增试剂；和/或
(4)RPA等温扩增引物，包括：
5’-GCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAG-3’(SEQ ID NO：6)，和
5’-CCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTA-3’(SEQ ID NO：7)。
所述重组酶聚合酶及RPA等温扩增试剂包括所述重组酶聚合酶以及RPA等温扩增所需要的各种试剂，其可直接以重组酶聚合酶扩增试剂盒的形式提供。
如图1所示，本发明的原理是利用TALENs特异性识别双链DNA的能力，通过设计特殊的“拟人”分子信标，其结构下面连接有可与TALENs特异结合的双链DNA，当体系中存在TALENs时，TALENs会与连接的双链DNA识别并结合，蛋白的空间位阻会把分子信标的发卡结构打开，荧光基团和猝灭基团距离变远，荧光就会恢复。当体系中存在目标物的DNA时，会和发卡结构上的双链DNA竞争性结合TALENs蛋白，因此荧光强度会随着目标物的增多而减弱，从而实现检测的目的。
根据上述原理，荧光基团和与其相应的猝灭基团可以为各种荧光基团-猝灭基团对，优选地，所述荧光基团为FAM；所述猝灭基团为BHQ-1。
本发明中，所述TALENs可以在实验室采用常规的表达载体构建和蛋白原核表达制备，该方法为本领域技术人员公知，也可直接从公司购买。所述“拟人”分子信标的DNA和荧光基团可商购获得，例如由上海生工生物有限公司合成。所述RPA等温扩增试剂盒可商购获得，例如从英国TwistDx公司购买。
本发明的第二方面提供一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，该方法包括：
(1)获取特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA的转录激活因子样效应物核酸酶；
(2)获取“拟人”分子信标，所述分子信标由以下部分经变复性获得：
发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’；
其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；
左臂：
5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’；
右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’；
左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’；
右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；
(3)对大肠杆菌O157:H7的16S rDNA进行RPA等温扩增，获得目标序列；所述目标序列是18bp的双链DNA，为16S rDNA的一部分；目标序列中的一条链具有如下碱基序列：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；
(4)将目标序列、分子信标、转录激活因子样效应物核酸酶混合，震荡反应；测定震荡反应产物的荧光值；
(5)按照上述方法检测一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7，建立大肠杆菌O157:H7浓度与荧光值的标准曲线；
(6)按照上述方法检测未知浓度的含大肠杆菌O157:H7样品，测定荧光值，代入步骤(5)的标准曲线，计算出样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。
根据本发明的方法，优选地，分子信标合成过程包括：将发卡、左臂、右臂、左腿、右腿、双蒸水充分混合，然后高温变性，逐渐降到室温。
具体地，所述高温变性的条件包括：在95℃保持2-5min。所述发卡、左臂、右臂、左腿、右腿的浓度优选均为5-20μM。
检测时，可对TALENs和“拟人”分子信标的浓度进行优化，从而确定最优用量。
所述TALENs的浓度优化方法如下：
5μL目标物与准备好的5μL分子信标(50nM)和纯化浓缩后的50μL TALENs(浓度分别为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL)混合，并添加缓冲液PBS(pH分别为7.8)至总体积为100μL，空白对照为5μL分子信标和95μL缓冲液PBS混合。在37℃缓慢震荡反应4小时，然后用荧光分光光度计在室温下检测，比较不同蛋白浓度下下的荧光值。
根据本发明，所述“拟人”分子信标的浓度优化方法如下：
25μL目标物与准备好的5μL分子信标(浓度分别为10nM、25nM、50nM、100nM、500nM)和纯化浓缩后的50μL TALENs蛋白(0.1mg/mL)混合，并添加缓冲液PBS(pH分别为7.8)至总体积为100μL，空白对照为5μL分子信标和95μL缓冲液PBS混合。在37℃缓慢震荡反应4小时，然后用荧光分光光度计在室温下检测，比较不同分子信标浓度下的荧光值。
根据本发明的方法，一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7的浓度范围为3cfu/mL～1×107cfu/mL。
本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、检测范围宽、操作简单、特异性好等优点，该方法的检出限为3cfu/mL。对大肠杆菌O157:H7的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏检测技术具有很好的指导意义。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明检测方法的原理图。
图2为以大肠杆菌O157:H7浓度的对数为横坐标，各浓度对应的荧光强度恢复值为纵坐标绘制的标准曲线。
图3为基于TALENs检测大肠杆菌O157:H7特异性实验。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的引物、DNA序列及荧光基团均由上海生工生物有限公司合成，RPA扩增试剂盒购自英国TwistDx公司；实验中所用到的大肠杆菌O157:H7标准品购自Sigma公司，能特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA的TALENs由本实验室制备并纯化。荧光分光光度计F97pro购自上海棱光有限公司。
以下实施例中，所述分子信标由以下部分经变复性获得：
发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’；
其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；
左臂：
5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’；
右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’；
左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’；
右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’。
实施例1
基于TALENs的大肠杆菌O157:H7检测方法
1)TALENs的表达与纯化：取活化好的菌液2mL接种于200mL有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm振荡培养4小时。至A600约为0.6-0.8时加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L(加入2mL)，然后在37℃振荡培养6小时。取诱导表达后的菌株用40mL 0.01mol/LpH＝7.5PBS溶液重悬菌体。放置于冰水混合物中用超声破碎仪进行破碎。设置破碎时间为2s，间隔4s，工作总时间为1h。当破碎至菌液呈黄色清亮时，于4℃用10000rpm/min，离心10min。保留菌液和沉淀，然后纯化、浓缩(得到纯化浓缩后的TALENs蛋白)并定量。
2)分子信标的设计与构建：将10μL发卡(10μM)，10μL左臂(10μM)，10μL右臂(10μM)，10μL左腿(10μM)，10μL右腿(10μM)，50μL双蒸水充分混合，然后在95℃保持3min，逐渐降到室温，保存于4℃。
3)RPA等温扩增：取5mL大肠杆菌O157:H7菌液于灭菌的离心管中，10000r/min离心5min，弃上清液。用5mL灭菌的双蒸水洗涤两次，然后加入100μL双蒸水重悬菌体，煮沸10min，急速冷却5min，离心后，上清液即为DNA模板，再将其按十倍梯度稀释。根据目标序列设计RPA扩增的上下游引物：
5’-GCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAG-3’，和
5’-CCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTA-3’。
然后按照试剂盒添加重组酶及聚合酶，放入37℃水浴锅中反应60min。然后用DNA纯化试剂盒对扩增DNA纯化。
4)将经过RPA扩增的目标物25μL与准备好的分子信标5μL(100nM)和纯化浓缩后的TALENs蛋白(0.1mg/mL)50μL混合，并添加缓冲液PBS(pH 7.8)至总体积为100μL，空白对照为5μL分子信标和95μL缓冲液PBS混合。
5)将上述复合物在37℃缓慢震荡反应3小时，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长488nm，狭缝宽度10nm，电压700V)在室温下检测荧光信号，发射波长为520nm。
6)检测了不同浓度的大肠杆菌O157:H7，0cfu/mL(control)、3cfu/mL、1×10cfu/mL、1×102cfu/mL、1×103cfu/mL、1×104cfu/mL、1×105cfu/mL、1×106cfu/mL、1×107cfu/mL、1×108cfu/mL、1×109cfu/mL，并得到了相应荧光图谱。利用软件计算得到其标准曲线为y＝1911.6-149.42x，R2＝0.9913，如图2所示；检测范围是3cfu/mL～1×107cfu/mL，检出限为3cfu/mL。
实施例2
基于本发明的方法检测水中大肠杆菌O157:H7
1)取市场上购买的矿泉水样品分成每份9mL。将经过菌落计数的一定数量的大肠杆菌O157:H7做10倍梯度稀释后，每份矿泉水样品中加入1mL，添加的大肠杆菌O157:H7浓度分别为1×10cfu/mL、1×104cfu/mL、1×105cfu/mL，空白样中加入等量PBS缓冲液。
2)每份样品混匀后，直接煮沸10min，然后急速冷却5min，离心后取上清。
3)取上清液并按照RPA扩增试剂盒添加引物、重组酶及聚合酶，放入37℃水浴锅中反应60min。然后用DNA纯化试剂盒对扩增DNA纯化。
4)将经过RPA扩增的目标物25μL与准备好的分子信标5μL(100nM)和纯化浓缩后的TALENs蛋白(0.1mg/mL)50μL混合，并添加缓冲液PBS(pH 7.8)至总体积为100μL，空白对照为5μL分子信标和95μL缓冲液PBS混合。
5)将上述复合物在37℃缓慢震荡反应3小时，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长488，狭缝宽度10，电压700V)在室温下检测荧光信号，发射波长为520nm。
6)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，回收率的范围为94.2％-105.7％，RSD范围为2.3％-3.9％。结果表明该检测方法可以应用到实际样品检测，并且前处理简单。
实施例3
大肠杆菌O157:H7的TALENs检测方法的特异性实验
1)取活化好的菌液2mL接种于200mL有氨苄青霉素的LB液体培养基中，用37℃，200rpm振荡培养4小时。至A600约为0.6-0.8时加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L(加入2mL)，然后用37℃振荡培养6小时。取诱导表达后的菌株用40mL 0.01mol/L pH＝7.5PBS溶液重悬菌体。放置于冰水混合物中用超声破碎仪进行破碎。设置破碎时间为2s，间隔4s，工作总时间为1h。当破碎至菌液呈黄色清亮时，于4℃用10000rpm/min，离心10min。保留菌液和沉淀，然后纯化、浓缩(得到纯化浓缩后的TALENs蛋白)并定量。
2)将10μL发卡(10μM)，10μL左臂(10μM)，10μL右臂(10μM)，10μL左腿(10μM)，10μL右腿(10μM)，50μL双蒸水充分混合，然后在95℃保持3min，逐渐降到室温，保存于4℃。
3)取5mL大肠杆菌O157:H7菌液于灭菌的离心管中，10000r/min离心5min，弃上清液。用5mL灭菌的双蒸水洗涤两次，然后加入100μL双蒸水重悬菌体，煮沸10min，急速冷却5min，离心后，上清液即为DNA模板，再将其按十倍梯度稀释。然后按照RPA扩增试剂盒添加引物、重组酶及聚合酶，放入37℃水浴锅中反应60min。然后用DNA纯化试剂盒对扩增DNA纯化。
4)将经过RPA扩增的产物25μL与准备好的分子信标5μL(100nM)和纯化浓缩后的TALENs蛋白(0.1mg/mL)50μL混合，并添加缓冲液PBS(pH 7.8)至总体积为100μL，空白对照为5μL分子信标和95μL缓冲液PBS混合。
5)将上述复合物在37℃缓慢震荡反应3小时，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长488，狭缝宽度10，电压700V)在室温下检测荧光信号，发射波长为520nm。
为了验证该检测方法的特异性，选取沙门氏菌(SE)，单增李斯特菌(L.monocytohenes)，金黄色葡萄球菌(SA)以及错配碱基进行检测。
结果如图3所示，图中，Blank为空白组、Mismatch-1代表1个碱基错配、Mismatch-2代表2个碱基错配、Mismatch-3代表3个碱基错配、Mismatch-4代表4个碱基错配，RandomMismatch代表随机错配。
Mismatch-1：5’-TAGCGGACGGGTGAGTAA-3’(SEQ ID NO：8)
Mismatch-2：5’-TGATGGACGGGTGAGTAA-3’(SEQ ID NO：9)
Mismatch-3：5’-TGCTTGACGGGTGAGTAA-3’(SEQ ID NO：10)
Mismatch-4：5’-TGCTAAACGGGTGAGTAA-3’(SEQ ID NO：11)
Random Mismatch：5’-ATCGGTCCTGACTTAACG-3’(SEQ ID NO：12)
由图3可知，该检测方法的特异性良好，能区别只错配一个碱基的双链DNA。其他菌种和设计的错配序列的荧光值没有变化，对荧光几乎没有影响说明几乎没有竞争。而大肠杆菌O157:H7有明显的竞争，荧光值显著下降，可以证明本发明的方法特异性良好。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法
<130> BJI1800645PY
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcaactac tacttggtaa gggttttttt ttttttttcc ctttgtttct ctaattaagg 60
c 61
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggcggacgg gtgagtaatc caagtagtag ttgatc 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccttaatta gagaaacttt actcacccgt ccgcca 36
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttactcaccc gtccgcca 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggcggacgg gtgagtaa 18
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcctaacaca tgcaagtcga acggtaacag 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccctctttgg tcttgcgacg ttatgcggta 30
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagcggacgg gtgagtaa 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgatggacgg gtgagtaa 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgcttgacgg gtgagtaa 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgctaaacgg gtgagtaa 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcggtcctg acttaacg 18
Claims (5)
1.一种非诊断目的的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其特征在于，该方法包括：
（1）获取特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA的转录激活因子样效应物核酸酶，所述转录激活因子样效应物核酸酶特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA中18bp长的一段序列，该序列一条链具有如下碱基序列：
5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；
（2）获取“拟人”分子信标，所述“拟人”分子信标合成过程包括：将发夹、左臂、右臂、左腿、右腿、双蒸水充分混合，然后高温变性，逐渐降到室温；
发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCC CTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’；
其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；
左臂：
5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’；
右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’；
左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’；
右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；
（3）对大肠杆菌O157:H7的16S rDNA进行RPA等温扩增，获得目标序列；所述等温扩增的引物为：
5’-GCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAG-3’，和
5’-CCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTA-3’
（4）将目标序列、分子信标、转录激活因子样效应物核酸酶混合，震荡反应；测定震荡反应产物的荧光值；
（5）按照上述方法检测一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7，建立大肠杆菌O157:H7浓度与荧光值的标准曲线；
（6）按照上述方法检测未知浓度的含大肠杆菌O157:H7样品，测定荧光值，代入步骤（5）的标准曲线，计算出样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其中，所述高温变性的条件包括：在95℃保持2-5min。
3.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其中，所述发夹、左臂、右臂、左腿、右腿的浓度均为5-20 µM。
4.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其中，所述荧光基团为FAM；所述猝灭基团为BHQ-1。
5.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其中，一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7的浓度范围为3 cfu/mL~1×107 cfu/mL。
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