CN113621718A - 一种快速检测食品中沙门氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，包括将待测样品先试用稀释液进行水化，待溶解后将其加入到无菌瓶中，然后再加入100～200mL的缓冲蛋白胨水，用卫视均质器进行拍打2～5min，放置在电热培养箱中，在35.5～37℃下进行培养15～20h，得到预增菌液；将预增菌液取1～1.5mL加入到增菌液中，然后在在35.5～42℃下进行培养24～30h进行增菌，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取沙门氏菌的基因组DNA，用超纯水溶解后在4℃下保存备用；将重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物加入到扩增试管中，加入2～20μL的步骤S2中提取的沙门氏菌基因组的DNA，并加入纯水进行扩增5～10倍，混匀后在36～42℃下扩增5～6min；将全部扩增物转移至2mL的光敏显色剂中，用LED灯光照进行照射，随后用分光光度计测定吸光度，进行分析。
Description
技术领域
本发明属于食品细菌检测技术领域，具体涉及一种快速检测食品中沙门氏菌的方法。
背景技术
沙门氏菌是一种以食品为主要媒介的食源性致病菌，感染者常常伴随呕吐、头晕、腹泻等症状，严重的感染者，甚至可能引发死亡。在高度全球化的今天，各国之间食品贸易频繁，让沙门氏菌的防治工作异常困难。对食品中的沙门氏菌进行准确可靠的检测，是防治沙门氏菌工作中必不可少的环节。目前，国际上检测食品中沙门氏菌的标准方法仍然是基于细菌培养的ISO6579-1。该方法可实现食品中沙门氏菌的准确鉴定和分型，但其需要特定检测场所和较长检测时间，通常适用于在基础条件较好的地区开展，并且以保存时间较长的食品为主要检测对象。然而，沙门氏菌污染严重的贫困地区却因缺乏相关基础设施和技术人员而无法实施相关检测，进而导致沙门氏菌感染事件频发。此外，细菌培养检测的方式不适用于保质期较短的生鲜食品，因此导致大量生鲜食品漏检，这也是沙门氏菌感染事件发生的主要原因之一。近年来，以聚合酶链式反应为代表的分子生物学方法因具备较高的灵敏度、较快的检测速度而备受关注，但目前其仍然严重依赖精密仪器，致使其受检测场所限制，无法满足对资源贫乏地区或者生鲜食品的检测需求。因此，如何利用分子生物学技术高灵敏度、高特异性的优点，并结合便携、快速的信号转换和读出技术，以降低分子生物学技术对仪器的依赖性，进而实现食品中沙门氏菌的现场快速、准确检测，这将是促进贫困地区加快食品检测、避免生鲜食品漏检需要追求的理想解决方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其方法包括以下步骤：
S1：将待测样品先试用稀释液进行水化，待溶解后将其加入到无菌瓶中，然后再加入100～200mL的缓冲蛋白胨水，用卫视均质器进行拍打2～5min，放置在电热培养箱中，在35.5～37℃下进行培养15～20h，得到预增菌液。
S2：将预增菌液取1～1.5mL加入到增菌液中，然后在在35.5～42℃下进行培养24～30h进行增菌，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取沙门氏菌的基因组DNA，用超纯水溶解后在4℃下保存备用。
S3：将重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物加入到扩增试管中，然后加入2～20μL的步骤S2中提取的沙门氏菌基因组的DNA，并加入纯水进行扩增5～10倍，混匀后在36～42℃下扩增5～6min。
S4：将全部扩增物转移至2mL的光敏显色剂中，用LED灯光照进行照射，随后用分光光度计测定吸光度，进行分析。
进一步地，所述稀释液为缓冲蛋白胨水，其中待测样品和缓冲蛋白胨水的体积比为(1～2):(13～25)。
进一步地，所述步骤S2中加入的增菌液为四硫磺酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐胱氨酸增菌液；加入量为12～20mL。
进一步地，所述加入重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物的量为1:1。
进一步地，所述核酸提取物由20～100mMTris-HCl，质量/体积比为0.01％～0.5％的SDS、体积比为0.04％～0.4％的曲拉通100、10～500mM硫酸铵和质量/体积比0.01％～2％的DTT组成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明中，将待测样品先试用稀释液进行水化，待溶解后将其加入到无菌瓶中，然后再加入缓冲蛋白胨水，用卫视均质器进行拍打，放置在电热培养箱中，进行培养，得到预增菌液。将预增菌液取加入到增菌液中，然后在培养进行增菌，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取沙门氏菌的基因组DNA，用超纯水溶解后下保存。将重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物加入到扩增试管中，然后加入提取的沙门氏菌基因组的DNA，并加入纯水进行扩增，混匀后扩增。将全部扩增物转移至光敏显色剂中，用LED灯光照进行照射，随后用分光光度计测定吸光度，进行分析快速检测食品中沙门氏菌的方法操作简单、不易受干扰、检测时间短、检测准确度高等优点。
具体实施方式
下面对本发明实施例作具体详细的说明，本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例1
一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，具体包括以下步骤：
S1：将待测样品先试用稀释液进行水化，待溶解后将其加入到无菌瓶中，然后再加入100mL的缓冲蛋白胨水，用卫视均质器进行拍打2min，放置在电热培养箱中，在35.5℃下进行培养15h，得到预增菌液。
S2：将预增菌液取1mL加入到增菌液中，然后在在35.5℃下进行培养24h进行增菌，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取沙门氏菌的基因组DNA，用超纯水溶解后在4℃下保存备用。
S3：将重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物加入到扩增试管中，然后加入2μL的步骤S2中提取的沙门氏菌基因组的DNA，并加入纯水进行扩增5倍，混匀后在36℃下扩增5min。
S4：将全部扩增物转移至2mL的光敏显色剂中，用LED灯光照进行照射，随后用分光光度计测定吸光度，进行分析。
所述稀释液为缓冲蛋白胨水，其中待测样品和缓冲蛋白胨水的体积比为1:13。
所述步骤S2中加入的增菌液为四硫磺酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐胱氨酸增菌液；加入量为12mL。
所述加入重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物的量为1:1。
进一步地，所述核酸提取物由20mMTris-HCl，质量/体积比为0.01％的SDS、体积比为0.04％的曲拉通100、10mM硫酸铵和质量/体积比0.01％的DTT组成。
实施例2
一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，具体包括以下步骤：
S1：将待测样品先试用稀释液进行水化，待溶解后将其加入到无菌瓶中，然后再加入200mL的缓冲蛋白胨水，用卫视均质器进行拍打5min，放置在电热培养箱中，在37℃下进行培养20h，得到预增菌液。
S2：将预增菌液取1.5mL加入到增菌液中，然后在在42℃下进行培养30h进行增菌，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取沙门氏菌的基因组DNA，用超纯水溶解后在4℃下保存备用。
S3：将重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物加入到扩增试管中，然后加入20μL的步骤S2中提取的沙门氏菌基因组的DNA，并加入纯水进行扩增10倍，混匀后在42℃下扩增6min。
S4：将全部扩增物转移至2mL的光敏显色剂中，用LED灯光照进行照射，随后用分光光度计测定吸光度，进行分析。
所述稀释液为缓冲蛋白胨水，其中待测样品和缓冲蛋白胨水的体积比为2:25。
所述步骤S2中加入的增菌液为四硫磺酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐胱氨酸增菌液；加入量为20mL。
所述加入重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物的量为1:1。
进一步地，所述核酸提取物由100mMTris-HCl，质量/体积比为0.5％的SDS、体积比为0.4％的曲拉通100、500mM硫酸铵和质量/体积比2％的DTT组成。
实施例3
一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，具体包括以下步骤：
S1：将待测样品先试用稀释液进行水化，待溶解后将其加入到无菌瓶中，然后再加入150mL的缓冲蛋白胨水，用卫视均质器进行拍打3min，放置在电热培养箱中，在36℃下进行培养17h，得到预增菌液。
S2：将预增菌液取1.2mL加入到增菌液中，然后在在38℃下进行培养28h进行增菌，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取沙门氏菌的基因组DNA，用超纯水溶解后在4℃下保存备用。
S3：将重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物加入到扩增试管中，然后加入10μL的步骤S2中提取的沙门氏菌基因组的DNA，并加入纯水进行扩增7倍，混匀后在39℃下扩增5.5min。
S4：将全部扩增物转移至2mL的光敏显色剂中，用LED灯光照进行照射，随后用分光光度计测定吸光度，进行分析。
所述稀释液为缓冲蛋白胨水，其中待测样品和缓冲蛋白胨水的体积比为1.5:17。
所述步骤S2中加入的增菌液为四硫磺酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐胱氨酸增菌液；加入量为15mL。
所述加入重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物的量为1:1。
进一步地，所述核酸提取物由50mMTris-HCl，质量/体积比为0.2％的SDS、体积比为0.2％的曲拉通100、200mM硫酸铵和质量/体积比1％的DTT组成。
实施例4
一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，具体包括以下步骤：
S1：将待测样品先试用稀释液进行水化，待溶解后将其加入到无菌瓶中，然后再加入180mL的缓冲蛋白胨水，用卫视均质器进行拍打4min，放置在电热培养箱中，在36.5℃下进行培养19h，得到预增菌液。
S2：将预增菌液取1.4mL加入到增菌液中，然后在在41℃下进行培养28h进行增菌，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取沙门氏菌的基因组DNA，用超纯水溶解后在4℃下保存备用。
S3：将重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物加入到扩增试管中，然后加入15μL的步骤S2中提取的沙门氏菌基因组的DNA，并加入纯水进行扩增9倍，混匀后在41℃下扩增5.5min。
S4：将全部扩增物转移至2mL的光敏显色剂中，用LED灯光照进行照射，随后用分光光度计测定吸光度，进行分析。
所述稀释液为缓冲蛋白胨水，其中待测样品和缓冲蛋白胨水的体积比为1.8:22。
所述步骤S2中加入的增菌液为四硫磺酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐胱氨酸增菌液；加入量为18mL。
所述加入重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物的量为1:1。
进一步地，所述核酸提取物由80mMTris-HCl，质量/体积比为0.4％的SDS、体积比为0.3％的曲拉通100、400mM硫酸铵和质量/体积比1.5％的DTT组成。
Claims (5)
1.一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
S1：将待测样品先试用稀释液进行水化，待溶解后将其加入到无菌瓶中，然后再加入100～200mL的缓冲蛋白胨水，用卫视均质器进行拍打2～5min，放置在电热培养箱中，在35.5～37℃下进行培养15～20h，得到预增菌液；
S2：将预增菌液取1～1.5mL加入到增菌液中，然后在在35.5～42℃下进行培养24～30h进行增菌，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取沙门氏菌的基因组DNA，用超纯水溶解后在4℃下保存备用；
S3：将重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物加入到扩增试管中，然后加入2～20μL的步骤S2中提取的沙门氏菌基因组的DNA，并加入纯水进行扩增5～10倍，混匀后在36～42℃下扩增5～6min；
S4：将全部扩增物转移至2mL的光敏显色剂中，用LED灯光照进行照射，随后用分光光度计测定吸光度，进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述稀释液为缓冲蛋白胨水，其中待测样品和缓冲蛋白胨水的体积比为(1～2):(13～25)。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中加入的增菌液为四硫磺酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐胱氨酸增菌液；加入量为12～20mL。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述加入重组酶聚合酶扩增试剂和核酸提取物的量为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述核酸提取物由20～100mM Tris-HCl，质量/体积比为0.01％～0.5％的SDS、体积比为0.04％～0.4％的曲拉通100、10～500mM硫酸铵和质量/体积比0.01％～2％的DTT组成。
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2021
- 2021-08-09 CN CN202110908949.1A patent/CN113621718A/zh active Pending
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