CN101993909A - 一种用于城市剩余污泥中沙门氏菌的定量检测方法 - Google Patents

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符波
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Abstract

一种用于城市剩余污泥中沙门氏菌的定量检测方法，属于生物技术中城市剩余污泥的病原菌检测技术领域。检测步骤如下：①污泥样品的梯度稀释以及前增菌培养；②选择性增菌培养；③显色培养基分离鉴别；④用MPN计数软件计算得出结果。本发明结合了MPN方法和食品安全国家标准中沙门氏菌检测方法，既实现了城市剩余污泥中沙门氏菌检测的需要，又由于选择性效果明显，避免了污泥中大量杂菌的干扰，有利于沙门氏菌的快速定量。本发明为制定和改进城市剩余污泥处理处置以及应用标准等方面具有重要的理论价值和实际指导意义。

Description

一种用于城市剩余污泥中沙门氏菌的定量检测方法
技术领域
一种用于城市剩余污泥中沙门氏菌的定量检测方法，属于生物技术中城市剩余污泥的病原菌检测技术领域。
背景技术
沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，食用后会导致食物中毒。据统计，在世界各国所有种类的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区细菌性食物中毒也以沙门氏菌为首位。2010年8月17日加利福尼亚州卫生部门宣布，加州多个地区暴发沙门氏菌疫情，自6月迄今接到266例患病报告。初步调查显示，多数病人食用鸡蛋后染病。这些鸡蛋被证实遭到沙门氏菌污染。
城市剩余污泥由于来自城市生活污水处理，其中含有大量的肠道细菌、病毒、原生动物、寄生虫等，这些微生物绝大部分都将随污水处理进入污泥，在污泥的农业土地利用过程中，通过污染地表水、地下水、形成气溶胶等多种途径而扩散到环境中，这些随污泥进入环境中的病原微生物对人体健康和环境安全造成了巨大的潜在威胁。而沙门氏菌作为其中主要的病原菌之一，为防止其扩散污染环境，对其进行快速准确的定量检测具有重要的意义。
目前对沙门氏菌的检测多见于食品检测及医疗卫生分析，技术手段也大多数只关注定性鉴定，例如食品安全国家标准中沙门氏菌的检验（GB 4789.4–2010）和广东环凯微生物科技有限公司发明的关于沙门氏菌显色培养基、检验试剂盒及检验方法（专利公开号CN 101180891A）。目前仅有少量关于沙门氏菌定量检测方法的专利申请，例如中科院南京土壤所发明的一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法（专利公开号CN 101613744A），但对于城市剩余污泥中沙门氏菌定量检测的相关技术手段很少报道。本发明利用MPN法（最大或然数，Most probable number）结合选择性增菌和鉴别培养基检测城市剩余污泥中沙门氏菌的数量，只需传统的培养方法和仪器便可达到省力、快速和高灵敏度检测要求。
发明内容
本发明的目的：本发明目的是提供一种定量检测城市剩余污泥中沙门氏菌的方法。
本发明的技术方案：一种用于城市剩余污泥中沙门氏菌的定量检测方法，步骤为：
（1）污泥样品的梯度稀释以及前增菌培养：
称取5g城市剩余污泥，加入盛有45mL缓冲蛋白胨水（BPW）的250mL锥形瓶中，涡旋震荡5-10min，混合均匀得泥水混合物；用缓冲蛋白胨水稀释混匀的泥水混合物，得到各个稀释梯度，设5-7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3-5个重复样，于36℃±1℃培养8 h-18h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液； 
此阶段采用普通高营养、无选择性培养基直接梯度稀释，一方面可以实现MPN法定量检测，另一方面可以使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。
（2）选择性增菌培养：
移取步骤（1）所得各管中菌液0.1-0.5mL加入到装有5mL四硫磺酸钠煌绿增菌液TTB的试管中，42℃培养18-24h；
四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)作为一种沙门氏菌选择性增菌液选择性较强，能促进沙门氏菌的生长，强烈抑制污泥中非沙门氏菌的生长。
（3）显色培养基分离鉴别：
分别用接种环取步骤（2）所得各管中的菌液一环划线接种到亚硫酸铋琼脂BS平板上，36℃±1℃培养40h-48h，观察各个平板上生长的菌落；
根据生化鉴定结果，沙门氏菌菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。
（4）用MPN计数软件计算得出结果：
根据生化鉴定结果，确定最大或然数MPN结果，用MPN Calculator软件计算得出污泥中最大可能的沙门氏菌浓度。
所述缓冲蛋白胨水BPW的配置：配方为蛋白胨 10.0g，氯化钠 5.0g，磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0g，磷酸二氢钾 1.5g，用蒸馏水定容至1000mL。将上述成分搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节最终pH至 7.2±0.2；121℃高压灭菌15min。
所述四硫磺酸钠煌绿增菌液TTB的配置：配方为蛋白胨9g，牛肉膏粉4.5g，氯化钠2.7g，碳酸钙40.5g，无水硫代硫酸钠31.9g，牛胆盐5g，用蒸馏水或去离子水定容至1000mL。取上述成分充分混合，调节最终pH至7.0±0.2。搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于三角瓶中，每瓶100mL。将三角瓶放入灭菌锅中，121℃高压灭菌20min，冷却至30℃，每100mL基础培养基加入四硫磺酸钠煌绿增菌液配套试剂（SR0040）2支，混合均匀。即配即用，不宜放置过久。
所述亚硫酸铋琼脂BS的配置：配方为蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，葡萄糖5g，硫酸亚铁0.3g，磷酸氢二钠4g，琼脂18g，亚硫酸钠6g，柠檬酸铋铵2g，煌绿0.025g。称取上述成分充分混合后的基础培养基，加入蒸馏水或去离子水定容至1000mL，调节最终pH至7.5±0.2。搅拌加热煮沸至完全溶解，冷至55℃，摇匀，倾入无菌平皿中备用，无需高压灭菌。
本发明的有益效果：本发明通过MPN计数方法结合沙门氏菌检验食品安全国家标准方法，仅利用传统培养方法既实现了城市剩余污泥中沙门氏菌定量检测的需要，又由于选择性效果明显，避免了污泥中大量杂菌的干扰，有利于沙门氏菌的准确快速定量。本发明为制定和改进城市剩余污泥处理处置以及应用标准等方面具有重要的理论价值和实际指导意义。
附图说明
图1 城市剩余污泥中沙门氏菌在TTB增菌液中的培养特征。
图2 城市剩余污泥中沙门氏菌在BS培养基上的培养特征。
图3  MPN Calculator初始化时显示结果。
图4 输入脱水前实验数据计算后MPN Calculator显示结果。
图5 输入脱水后实验数据计算后MPN Calculator显示结果。
具体实施方式
测定江苏无锡某污水处理厂二沉池脱水前后剩余污泥中沙门氏菌的数量，具体步骤如下：
⑴污泥样品的梯度稀释以及前增菌培养：称取脱水前后剩余污泥各5g污泥样品加入盛有45mL缓冲蛋白胨水(BPW)的250mL锥形瓶中，涡旋震荡10min，使混合均匀，取混匀的泥水混合液0.5mL加入到盛有4.5mL缓冲蛋白胨水的试管中依次得到各个稀释梯度，设6个稀释度，每个稀释度设三个重复，于36℃培养8 h。
    ⑵选择性增菌培养：分别移取梯度稀释前增菌各管中菌液0.1mL加入到装有5mL四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)的试管中，42℃培养24h。
⑶显色培养基分离鉴别：分别用接种环取各管中的菌液一环划线接种到亚硫酸铋琼脂（BS）平板上，36℃培养40h，观察各个平板上生长的菌落，发现平板上菌落特征唯一，选择性效果比较好，菌落为黑色有金属光泽，菌落周围培养基呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。挑取典型菌落进行生化鉴定（广东环凯研制的生化鉴定盒），证实为沙门氏菌。
⑷用MPN计数软件计算得出结果：根据生化鉴定结果，对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，确定有沙门氏菌的平板为阳性，没有沙门氏菌的平板为阴性，按阴性和阳性反应所对应的稀释度，记录试验结果（见表1、2），将实验数据输入MPN Calculator 软件，计算样品中沙门氏菌的含量。 
表1  脱水前剩余污泥中沙门氏菌试验结果
稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
重复管数 3 3 3 3 3 3
阳性管数 3 3 3 3 3 0
管中污泥含量（g） 0.5 0.05 0.005 0.0005 0.00005 0.000005
表2  脱水后剩余污泥中沙门氏菌MPN结果
稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
重复管数 3 3 3 3 3 3
阳性管数 3 3 3 3 2 0
管中污泥含量（g） 0.5 0.05 0.005 0.0005 0.00005 0.000005
MPN计数是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如1mL）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
以往研究者往往通过相应稀释法测数统计表（如GB/T 4789.38-2008中用MPN计数大肠杆菌数量使用了大肠杆菌MPN检索表）查得细菌近似值。而本发明应用了MPN Calculator 软件，一方面应用此软件使得计数更为简单方便，另一方面MPN检索表只限于3-4个稀释度，而MPN Calculator软件能达到7个稀释度，且稀释度选择并不需要像MPN检索表那样标准化，每个稀释度下的重复管数也可以不同。
在实施例中，具体计算过程如下：选择稀释度为6个稀释度，输入表1、2中的结果，即每个稀释度下重复管数和得出的阳性管数以及各稀释梯度试管中污泥的含量，见图3可通过统计计算即得出污泥中最大可能的沙门氏菌浓度，单位为MPN/g。计算结果为脱水前污泥样品中沙门氏菌的浓度为4.8×104MPN/g湿泥（图4），脱水后污泥样品中沙门氏菌的浓度为1.9×104MPN/g湿泥（图5）。此方法使用单位为MPN/g，主要是与GB/T 4789.38-2008中MPN方法计数大肠杆菌形成统一，大肠菌群的是MPN/100g，MPN是一个估算值，由于方法不一样，和cfu/g或个/g并不能直接换算。

Claims (1)

1.一种用于城市剩余污泥中沙门氏菌的定量检测方法，其特征在于步骤为：
（1）污泥样品的梯度稀释以及前增菌培养：
称取5g城市剩余污泥，加入盛有45mL缓冲蛋白胨水BPW的250mL锥形瓶中，涡旋震荡5-10min，混合均匀得泥水混合物；用缓冲蛋白胨水稀释混匀的泥水混合物，得到各个稀释梯度，设5-7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3-5个重复样，于36℃±1℃培养8 h-18h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；
（2）选择性增菌培养：
移取步骤（1）所得各管中菌液0.1-0.5mL加入到装有5mL四硫磺酸钠煌绿增菌液TTB的试管中，42℃培养18-24h；
（3）显色培养基分离鉴别：
分别用接种环取步骤（2）所得各管中的菌液一环划线接种到亚硫酸铋琼脂BS平板上，36℃±1℃培养40h-48h，观察各个平板上生长的菌落；
（4）用MPN计数软件计算得出结果：
根据生化鉴定结果，确定最大或然数MPN结果，用MPN Calculator软件计算得出污泥中最大可能的沙门氏菌浓度。
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