CN112501324A - 一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的引物、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的引物、试剂盒；本发明中所提供的针对结核分枝杆菌特异性靶序列IS6110及分枝杆菌复合群16S rRNA所设计的引物及鉴定体系，实现了对结核分枝杆菌及NTM的区分，解决现有技术中的方法所需周期长，成本高，现场应用困难的缺陷。使用SYTO9荧光染料进行判读的方式实现了闭管情况下对结果进行判读，避免因开盖造成的气溶胶污染等问题。本方法通过搭配相应试剂可在1h左右实现从样本到结果的判读，操作简便快速，检测成本相对较低。本发明的试剂盒及方法特别适用于中小型单位及现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的引物、试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)是结核病的主要致病菌，然而当前非结核分枝杆菌病(NTM)感染的发病率呈上升趋势，当前临床中对结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群其区分的方法主要是对痰培养阳性的菌株进行对硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)鉴别试验。传统的生化方法操作繁琐，耗时较长，造成传统方法对两种致病菌难以区别，然而两者治疗方案明显不同。因此，快速准确地鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复合群，对相关疾病的早期诊断、治疗以及对两种疾病的防控均具有重要的意义。
近年来，已有相关文献利用核酸扩增技术，如聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR技术快速检测、鉴别结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群。但是，有些方法却易产生假阳性或者假阴性结果。此外PCR检测技术所需仪器昂贵，大大提高了检测成本，限制了其在基层单位以及我国中西部偏远地区的推广应用。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的首要目的是提供一种能够同时鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌引物序列。
本发明的第二个目的是提供含有上述引物序列的试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的引物组，包括MTBC检测引物组和分枝杆菌复合群检测引物组，所述MTBC检测引物组包括IS6110引物OF/OB、IF/IB、LF/LB，序列如SEQ ID NO：1～6所示；分枝杆菌复合群(简称为NTM，下文同)检测引物组包括16S-OF、16S-OB、16S-IF、16S-IB、16S-LF、16S-LB，序列如SEQID NO：7～12所示。
具体地，序列如下所示：
MTBC检测引物组：
IS6110-OF：GGACGGAAGCTCCTATCA(SEQ ID NO：1)
IS6110-OB：GTTGAGCGTAGTAGGCAG(SEQ ID NO：2)
IS6110-IF：CGGCTTGCCGGGATTGATCATTGCACTAGCCGAGTC(SEQ ID NO：3)
IS6110-IB：GACCATCGACGATGTCGAGATGCCGCAGTACTGGTTGACG(SEQ ID NO：4)
IS6110-LF：CAGCTCGGTCTTGTATAGGC(SEQ ID NO：5)
IS6110-LB：TGGGTCGACTGGTTCAAC(SEQ ID NO：6)
分枝杆菌复合群检测引物组：
16S-OF：GCGGTAATACGTAGGGTG(SEQ ID NO：7)
16S-OB：GACTACCAGGGTATCTAATCCT(SEQ ID NO：8)
16S-IF：CGCACGCTCACAGTTAAGCAAGAGCTCGTAGGTGGTT(SEQ ID NO：9)
16S-IB：TGGTGTAGCGGTGGAATGCAGTTACTGCCCAGAGACC(SEQ ID NO：10)
16S-LF：TGAGATTTCACGAACAACGC(SEQ ID NO：11)
16S-LB：CAGATATCAGGAGGAACACCG(SEQ ID NO：12)
本发明还提供一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的试剂盒，包括上述的引物组。
优选地，所述试剂盒还包括扩增反应液A、扩增反应液B。
优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
优选地，所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、DNA提取液。
具体地，扩增反应液A用于检测MTBC的环介导等温扩增反应，扩增反应液A的组分为：Tris-HCl 20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％，甜菜碱0.8M，dNTP(each)1.4mM，IS6110引物OF/OB 0.2μM，IF及IB各1.6μM，LF及LB各0.8μM，SYTO9 1×；
扩增反应液B用于检测分枝杆菌复合群的环介导等温扩增反应，扩增反应液B的组分为：Tris-HCl 20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％，甜菜碱0.8M，dNTP(each)1.4mM，16S-OF/16S-OB 0.2μM，16S-IF及16S-IB各1.6μM，16S-LF及16S-LB各0.8μM，SYTO 9 1×。
具体地，所述阳性对照为目标菌的核酸模板，阴性对照为无菌水。
另外，上述试剂盒还包括密封油和DNA提取液。
优选地，所述试剂盒的反应体系为25μL，包括：反应液22μL，8U Bst DNA聚合酶1.0μL，核酸模板2μL。
优选地，所述试剂盒的反应程序为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号，60个循环。
本发明还提供利用上述试剂盒检测MTBC和NTM的方法，包括以下步骤：
(1)样本处理
样本处理室进行，在痰样中加入3倍体积的4％的NaOH溶液，旋涡震荡均匀，室温下放置15min，然后吸取1mL加入带旋盖的离心管中。12000rpm离心5min，去上清液。加入0.9％的NaCl或生理盐水1mL，混匀，12000rpm离心5min，去上清液。加入100μL的DNA提取液，100℃加热10min，加热后立即冷却10min；12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，上清液即为恒温扩增的DNA模板。若是菌液样本经高速离心后加入DNA提取液，按照上述步骤进行操作，获得上清液即为待测样本的核酸模板。
(2)试剂配制
试剂准备室进行，对于一个样本需要将A管和B管中的反应液同时进行配置，其中A管和B管的每个反应体系的体积为25μL：反应液22μL，Bst DNA聚合酶(8U)1.0μL，加入核酸模板为2μL。
(3)核酸扩增
放置在实时荧光定量PCR仪器中，PCR扩增程序采用如下程序，具体为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号(SYBR Green通道)，45个循环。
(4)结果判定：
阳性样本为典型的“S”型扩增曲线，阴性对照无扩增曲线出现。具体结果判读如下：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中所提供的针对结核分枝杆菌特异性靶序列IS6110及分枝杆菌复合群16S rRNA所设计的引物及鉴定体系，实现了对结核分枝杆菌及NTM的区分，解决现有技术中的方法所需周期长，成本高，现场应用困难的缺陷。
(2)使用SYTO9荧光染料进行判读的方式实现了闭管情况下对结果进行判读，避免因开盖造成的气溶胶污染等问题。本方法通过搭配相应试剂可在1h左右实现从样本到结果的判读，操作简便快速，检测成本相对较低。本发明的试剂盒及方法特别适用于中小型单位及现场检测。
附图说明
图1为实施例1结果图；图1A为A管检测结核分枝杆菌结果，图1B为B管检测非结核分枝杆菌图，其中1为鸟分枝杆菌95001，2为胞内分枝杆菌95002，3为蟾蜍分枝杆菌95003，5为土地分枝杆菌95005，13为堪萨斯分枝杆菌95013，15为亚洲分枝杆菌95016，17为瘰疬分枝杆菌95017，21为龟分枝杆菌脓肿亚种95021，22为偶发分枝杆菌95022，23为耻垢分枝杆菌95023，24为草分枝杆菌95024；
图2为结核分枝杆菌复合群引物筛选结果图，图A，B，C，D依次为第一至第四套引物筛选结果；
图3为非结核分枝杆菌复合群引物筛选结果图，图A，B，C，D依次为第一至第四套引物筛选结果；
图4为特异性结果；图4A为A管检测结核分枝杆菌特异性结果，4B为B管检测NTM特异性验证结果；其中1为鸟分枝杆菌95001，2为胞内分枝杆菌95002，3为蟾蜍分枝杆菌95003，5为土地分枝杆菌95005，13为堪萨斯分枝杆菌95013，15为亚洲分枝杆菌95016，17为瘰疬分枝杆菌95017，21为龟分枝杆菌脓肿亚种95021，22为偶发分枝杆菌95022，23为耻垢分枝杆菌95023，24为草分枝杆菌95024，26为肺炎链球菌CMCCB31001，27为北京棒杆菌CGMCC1727，28为巴西诺卡氏CGMCC41128，53为嗜肺军团菌ATCC33153，54为肺炎克雷伯氏菌CMCCB46117；
图5为灵敏度实验结果；图5A为A管检测结核分枝杆菌灵敏度图，图5B为B管检测结核分枝杆菌灵敏度图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌引物筛选
一、环介导等温扩增技术检测MTBC及NTM的方法
1、DNA提取
本研究中所用细菌包括：结核分枝杆菌CMCC93009(中国医学细菌保藏管理中心)，鸟分枝杆菌95001，胞内分枝杆菌95002，蟾蜍分枝杆菌95003，土地分枝杆菌95005，堪萨斯分枝杆菌95013，亚洲分枝杆菌95016，瘰疬分枝杆菌95017，龟分枝杆菌脓肿亚种95021，偶发分枝杆菌95022，耻垢分枝杆菌95023，草分枝杆菌95024，购自中国食品药品检定研究所。
提取过程：1mL菌液样本以12000rpm转速离心5分钟，弃去上清液。加入100μL的DNA提取液，100℃加热10min，加热后迅速冷却(至于-20℃冰箱)10min。12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，其中2μL上清液用于核酸扩增。
2、MTBC及NTM的环介导等温扩增反应
分别在八连管中配置总体积为25μL的恒温体系：加入反应液22μL，Bst DNA聚合酶1μL，加入密封油，最后加入DNA模板2μL。将八连管放置在实时荧光定量PCR仪器中，PCR扩增程序采用如下程序，具体为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号(SYBR Green通道)，45个循环。
反应液分为反应液A和反应液B，反应液A的组分为：Tris-HCl 20.0mM,硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM,硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％,甜菜碱0.8M,dNTP(each)1.4mM,IS6110引物OF/OB 0.2μM，IF及IB各1.6μM，LF及LB各0.8μM，SYTO 9 1×。
反应液B的组分为：Tris-HCl 20.0mM,硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM,硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％,甜菜碱0.8M,dNTP(each)1.4mM,16S引物OF/OB 0.2μM，IF及IB各1.6μM，LF及LB各0.8μM，SYTO 9 1×。
3、结果判定
结果如图1所示，其中A管反应液在检测结核分枝杆菌为标准的S型曲线(图1A)，阴性对照均无非特异性扩增。B管在检测11种NTM时均为阳性(图1B)，阴性对照无非特异性扩增。如此说明，所设计的引物及构建体系适用于结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的检测。
二、引物设计和筛选
根据结核分枝杆菌IS 6110及分枝杆菌复合群16S rDNA片段保守且特异性片段使用LAMP软件在线进行引物设计(各获得如表1所示的四套引物)，按照上面的方法进行初步筛选。
表1引物设计
结核分枝杆菌引物筛选如图2所示，第一，四套引物在检测阴性样本时出现非特异性扩增，第三套引物阴性样本及阴性对照均无非特异性扩增，第二套引物阴性对照出现非特异性扩增，因此使用第三套引物进行后续实验。
非结核分枝杆菌复合群引物筛选如图3所示。其中第三套引物在检测阴性对照重复实验中出现非特异性扩增。第一套引物阴阳性对照正常，阴性参考品无非特异性扩增，阳性样本3号无法检测出。第二套引物阴阳性对照正常，阴性样本26号出现非特异性扩增。第四套引物阴阳性对照正常，检测11种非结核分枝杆菌及4种非分枝杆菌复合呼吸道致病菌的全基因组DNA，均无非特异性扩增曲线，可进行后续实验。
实施例2环介导等温扩增技术检测MTBC及NTM的特异性
分别使用上述11种NTM及巴西诺卡氏CGMCC41128、北京棒杆菌CGMCC1727肺炎链球菌CMCCB31001，肺炎克雷伯氏菌CMCCB46117，嗜肺军团菌ATCC33153对检测结核分枝杆菌的特异性进行验证。使用巴西诺卡氏CGMCC41128、北京棒杆菌CGMCC1727肺炎链球菌CMCCB31001，嗜肺军团菌ATCC33153，肺炎克雷伯氏菌CMCCB46117对检测NTM的特异性进行验证。细菌DNA模板提取及所使用的体系均按照实施例1中的进行。结果如图4所示，反应管A在检测11中NTM及其他呼吸道常见致病菌均为阴性，仅有检测结核分枝杆菌为阳性。反应管B在检测其他呼吸道常见致病菌均为阴性，仅检测结核分枝杆菌及NTM时为阳性，两者阴性对照均为阴性。如此说明所筛选的引物具有较高的特异性。
实施例3环介导等温扩增技术检测MTBC及NTM的灵敏性
将初始浓度为105CFU/mL的结核分枝杆菌CMCC93009采用十倍浓度稀释法分别稀释至104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL，10CFU/mL。按照实施例1中方法及体系进行操作，对上述两套引物的灵敏度进行评价。结果如图5所示，反应管A在检测结核分枝杆菌复合群时最低检出限为102CFU/mL，反应管B在检测结核分枝杆菌复合群时最低检出限为103CFU/mL；如此说明，该试剂盒在检测结核分枝杆菌最低检出限为102CFU/mL，NTM的检出限为103CFU/mL。
实施例4环介导等温扩增技术检测临床样本中MTBC及NTM
对从临床收集到300例健康人群及300例结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌患者的痰液样本(其中结核分枝杆菌感染患者为260例，非结核分枝杆菌杆菌的为40例)按照实施例1中痰液样本处理方式进行DNA提取，随后分别进行检测。反应体系对结核分枝杆菌的敏感度为97.69％(254/260)，特异性为100％。对NTM检测的敏感度为94％(282/300)，特异性为100％。如此表明，试剂盒对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌具有较高的特异性和敏感度。
序列表
<110> 广州迪澳生物科技有限公司
<120> 一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的引物、试剂盒
<130> ZM201374ZL
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Claims (8)
1.一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的引物组，其特征在于，包括MTBC检测引物组和分枝杆菌复合群检测引物组，所述MTBC检测引物组包括IS6110引物OF/OB、IF/IB、LF/LB，序列如SEQ ID NO：1～6所示；分枝杆菌复合群检测引物组包括16S-OF、16S-OB、16S-IF、16S-IB、16S-LF、16S-LB，序列如SEQ ID NO：7～12所示。
2.一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括扩增反应液A、扩增反应液B。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括Bst DNA聚合酶、DNA提取液。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，扩增反应液A的组分为：Tris-HCl20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％，甜菜碱0.8M，dNTP1.4mM，IS6110引物OF/OB 0.2μM，IF及IB各1.6μM，LF及LB各0.8μM，SYTO 9 1×；
扩增反应液B的组分为：Tris-HCl 20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％，甜菜碱0.8M，dNTP 1.4mM，16S-OF/16S-OB 0.2μM，16S-IF及16S-IB各1.6μM，16S-LF及16S-LB各0.8μM，SYTO 9 1×。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为25μL，包括：反应液22μL，8U Bst DNA聚合酶1.0μL，核酸模板2μL。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应程序为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号，60个循环。
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