CN112522427A - 用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒 - Google Patents

用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒 Download PDF

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CN112522427A CN202011247878.7A CN202011247878A CN112522427A CN 112522427 A CN112522427 A CN 112522427A CN 202011247878 A CN202011247878 A CN 202011247878A CN 112522427 A CN112522427 A CN 112522427A
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陈皇佑
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒，本研究基于基因组序列分析及保守序列的查找获得偶发分枝杆菌特异性较高的核酸序列，并开发基于环介导等温扩增技术检测目标菌株的核酸试剂盒，可在1h左右实现痰液样本到对偶发分枝杆菌检测的准确判读，相比于传统方法的鉴定有效缩短检测时间，操作方法更为简单便捷，检验人员无需经过复杂的培训过程，具有广泛和实际的应用推广价值。

Description

用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，更具体地，涉及用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒。
背景技术
非结核分枝杆菌广泛分布于自然环境中，虽然对健康人无害，但是偶尔感染也表现出感染性而导致机体损伤，更多常见于HIV感染人群和免疫功能缺陷的人群。根据相关流行病学调查显示，NTM近年来临床的分离率也呈上升的趋势。进一步地，由非结核菌引起的疾病因菌的种类不用，治疗法也各有差异，所以确定其菌种也非常重要。然而由于非结核分枝杆菌没有特异的临床症状，所以依据临床表现、病理组织学等无法对非结核分枝杆菌的种类进行确定，因此对其诊断必须通过菌种鉴定。
偶发分枝杆菌作为临床中分离率较高的非结核分枝杆菌之一，当前主要采用培养法结合生理生化实验培养出NTM，再通过hsp65，16S rRNA的PCR限制性片段分析的方法(PCR-RFLP)对偶发分枝杆菌进行鉴定。但此种方法无法实现从痰样到检测结果的直接判读，需要复杂的生理生化实验及精确的核酸测序技术，耗时较长(约40天)，费用昂贵，需要复杂的仪器及专业的技术人员。因此，急需要一种操作简单，耗时较短的方法对其进行鉴别。环介导等温扩增技术在由于特异性较高，操作简单快捷等优势已广泛应用于临床样本中结核分枝杆菌及其他致病菌的检测。然而由于对靶标序列要求较高，尚无利用此方法对偶发分枝杆菌特异性检测的报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的首要目的是提供用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸。
本发明的第二个目的是提供用于特异性检测偶发分枝杆菌的引物组。
本发明的第三个目的是提供用于特异性检测偶发分枝杆菌的试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现：
用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明通过将Mycobacterium fortuitum.(Genebank NO.CVRX01000283.1：22176-23693)的全基因组序列与其他亲缘物种[包括Mycobacterium abscessus.(Genebank NO.NC_010397.1：1-1476)、Mycobacterium asiaticum.(Genebank NO.NZ_HG964938.1：542012-543487)、Mycobacterium avium.(Genebank NO.CP036220.1：5048733-5050267)、Mycobacterium gordonae.(Genebank NO.NZ_LKTM01000337.1：18655-20157)、Mycobacterium kansasii.(Genebank NO.NZ_CP019887.1：3158011-3159555)、Mycolicibacterium phlei.(Genebank NO.NZ_CP014475.1：1-1485)、Mycobacteriumscrofulaceum.(Genebank NO.NZ_LZJW01000147.1：58754-60286)、Mycobacteriumshimoidei.(Genebank NO.UEGW01000001.1：1105578-1107077)、Mycobacterium terrae.(Genebank NO.LT906469.1：1-1473)、Mycobacteroides chelonae.(Genebank NO.NZ_MLCH01000004.1：1005794-1007269)]的基因片段进行比对，发现SEQ ID NO：1所示序列与其他亲缘物种的差异最大，因此推定其为可能的特异性检测位置。
在获得特异性检测偶发分枝杆菌的核苷酸序列后，本发明针对该核苷酸序列设计并筛选获得能够特异性检测偶发分枝杆菌的引物组。
因此，本发明还提供用于特异性检测偶发分枝杆菌的引物组，所述引物组包括内引物IF，IB，外引物OF，OB和环引物LF，LB；其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～7所示。
本发明还提供基于环介导等温扩增技术用于特异性检测偶发分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒含有上述引物组。
优选地，上述试剂盒还包括反应液、Bst DNA聚合酶。
更优选地，上述试剂盒还包括阴性对照，阳性对照，DNA提取液，密封液。
具体地，上述反应液包含以下组分：Tris-HCl 20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％，甜菜碱0.8M，dNTP(each)1.4mM，引物OF/OB 0.2μM，IF及IB各1.6μM，LF及LB各0.8μM，1×SYTO 9染料。
具体地，所述阳性对照为含有如SEQ ID NO.1序列的核苷酸质粒或为偶发分枝杆菌提取的核酸基因组；所述阴性对照为超纯水。
优选地，上述试剂盒的反应体系(25μL)为：反应液22μL，Bst DNA聚合酶(8U)1.0μL，加入核酸模板为2μL。
优选地，上述试剂盒的反应程序为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号(SYBR Green通道)，60个循环。
优选地，上述DNA提取液的组分为：20mM Tris-Base，2mM EDTA，1.2％Triton X-100。
本发明还提供利用上述试剂盒进行检测样本中偶发分枝杆菌的方法，包括以下步骤：
S1、样本处理：
在样本处理室进行，在痰样中加入3倍体积的4％的NaOH溶液，旋涡震荡均匀，室温下放置15min，然后吸取1mL加入带旋盖的离心管中。12000rpm离心5min，去上清液。加入0.9％的NaCl或生理盐水1mL，混匀，12000rpm离心5min，去上清液。加入100μL的DNA提取液，100℃加热10min，加热后立即冷却10min，12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，上清液即为恒温扩增的DNA模板；
若是菌液样本经高速离心后加入DNA提取液，按照上述步骤进行操作，获得上清液即为待测样本的核酸模板。
S2、准备反应体系：反应液22μL，Bst DNA聚合酶(8U)1.0μL，加入核酸模板为2μL；
S3、核酸扩增：放置在实时荧光定量PCR仪器中，PCR扩增程序采用如下程序，具体为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号(SYBR Green通道)，60个循环。
S4、结果判定：出现阳性对照特异性扩增，阴性对照无非特异性扩增，即为阳性；反之则为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本研究基于基因组序列分析及保守序列的查找获得偶发分枝杆菌特异性较高的核酸序列，并开发基于环介导等温扩增技术检测目标菌株的核酸试剂盒，可在1h左右实现痰液样本到对偶发分枝杆菌检测的准确判读，相比于传统方法的鉴定有效缩短检测时间，操作方法更为简单便捷，检验人员无需经过复杂的培训过程，具有广泛和实际的应用推广价值。
附图说明
图1为引物筛选结果，图1A为第一套引物的阴性验证结果，图1B为第二套引物的验证结果，图1C为第三套引物的阴性验证结果，图1D为第三套引物的阴性验证结果；
图2为检测偶发分枝杆菌的特异性结果，其中，标号1为鸟分枝杆菌95001，标号2为胞内分枝杆菌95002，标号3为蟾蜍分枝杆菌95003，标号5为土地分枝杆菌95005，标号13为堪萨斯分枝杆菌95013，标号16为亚洲分枝杆菌95016，标号17为瘰疬分枝杆菌95017，标号21为龟分枝杆菌脓肿亚种95021，标号22为偶发分枝杆菌95022，标号23为耻垢分枝杆菌95023，标号24为草分枝杆菌95024，标号26为肺炎链球菌CMCCB31001，标号27为北京棒杆菌CGMCC1727，标号为28为巴西诺卡氏CGMCC41128，标号53为嗜肺军团菌ATCC33153；
图3为痰液样本中检测偶发分枝杆菌灵敏度结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1引物筛选
1、引物设计
根据Blast结果发现偶发分枝杆菌dnaA序列同其他分枝杆菌差异较大，进一步使用DNAMAN软件进行序列比对，筛选出如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。使用LAMP软件在线进行引物设计(获得如表1所示的四套引物)，并进行初步筛选。
表1
MF-OF-1 GATCGTGATTCCAACAGTGA
MF-OB-1 AGTCCTCGGATTCCTCTG
MF-IF-1 AACGGAGAGCAGAGCAAACCCACTGACTCCTCAGCAAAG
MF-IB-1 CACCCCGTTCGTCCAGAACCTGAGCGCGTTGATGATC
MF-LF-1 TTCACCAGCTTGAGCCAG
MF-LB-1 GAGATCGAACGGCACCTC
MF-OF-2 GATCGTGATTCCAACAGTGA
MF-OB-2 AGTCCTCGGATTCCTCTG
MF-IF-2 CGGAGAGCAGAGCAAACCCCACTGACTCCTCAGCAAAG
MF-IB-2 CACCCCGTTCGTCCAGAACCTGAGCGCGTTGATGATC
MF-LF-2 TTCACCAGCTTGAGCCAG
MF-LB-2 GAGATCGAACGGCACCTC
MF-OF-3 GATCGTGATTCCAACAGTGA
MF-OB-3 AGTCCTCGGATTCCTCTG
MF-IF-3 AAACCCCTCGGCGATGACCACTGACTCCTCAGCAAAG
MF-IB-3 CTGCTCTCCGTTCCCACCCTGAGCGCGTTGATGATC
MF-LF-3 TTCACCAGCTTGAGCCAG
MF-LB-3 GAGATCGAACGGCACCTC
MF-OF-4 TCGTGATTCCAACAGTGATC
MF-OB-4 AGTCCTCGGATTCCTCTG
MF-IF-4 CGGAGAGCAGAGCAAACCCCACTGACTCCTCAGCAAAG
MF-IB-4 CACCCCGTTCGTCCAGAACCTGAGCGCGTTGATGATC
MF-LF-4 TTCACCAGCTTGAGCCAG
MF-LB-4 GAGATCGAACGGCACCTC
2、DNA提取
本研究中所用细菌包括：偶发分枝杆菌95022，购自中国食品药品检定研究所。1mL菌液样本以12000rpm转速离心5分钟，弃去上清液。加入100μL的DNA提取液，100℃加热10min，加热后迅速冷却(至于-20℃冰箱)10min。12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，其中2μL上清液用于核酸扩增。
3、扩增反应
分别在八连管中配置总体积为25μL的恒温体系：加入反应液22μL，Bst DNA聚合酶1μL，加入密封油，最后加入DNA模板2μL。将八连管放置在实时荧光定量PCR仪器中，PCR扩增程序采用如下程序，具体为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号(SYBR Green通道)，60个循环。
4、结果判读
结果如图1所示，其中第一、二、三套引物在60分钟内阴性对照均出现非特异性扩增，第四套引物阳性对照扩增为阳性，阴性对照无非特异性扩增，符合要求可用于后续实验验证。
实施例2特异性实验
本研究所使用细菌包括鸟分枝杆菌95001，胞内分枝杆菌95002，蟾蜍分枝杆菌95003，土地分枝杆菌95005，堪萨斯分枝杆菌95013，亚洲分枝杆菌95016，瘰疬分枝杆菌95017，龟分枝杆菌脓肿亚种95021，偶发分枝杆菌95022，耻垢分枝杆菌95023，草分枝杆菌95024，购自中国食品药品检定研究所。巴西诺卡氏CGMCC41128、北京棒杆菌CGMCC1727肺炎链球菌CMCCB31001，嗜肺军团菌ATCC33153对检测偶发分枝杆菌的特异性进行验证。细菌DNA模板提取及所使用的体系均按照实施例1中的进行。结果如图2所示，试剂盒在检测其他10种NTM及常见呼吸道致病菌检测时均为阴性，仅有检测偶发分枝杆菌时为阳性，如此说明所筛选的引物具有较高的特异性。
实施例3灵敏度实验
将初始浓度为105CFU/mL偶发分枝杆菌接种至健康人的痰液中，使用涡旋震荡仪混匀，随后采用十倍稀释法使用健康人痰液分别将菌液稀释104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL及10CFU/mL，不含有菌的痰液作为阴性对照。在痰样中加入3倍体积的4％的NaOH溶液，旋涡震荡均匀，室温下放置15min，然后吸取1mL加入带旋盖的离心管中。12000rpm离心5min，去上清液。加入0.9％的NaCl或生理盐水1mL，混匀12000rpm离心5min，去上清液。加入100μL的DNA提取液，100℃加热10min，加热后立即冷却10min，12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，上清液即为恒温扩增的DNA模板。结果如图3所示，在痰液中菌样浓度为103CFU/mL及以上时，两次重复检测均可检出。在浓度为102CFU/mL时，两次重复仅有一次可检出，如此说明此试剂盒用于检测痰液样本偶发分枝杆菌的最低检出限为103CFU/mL。
序列表
<110> 广州迪澳生物科技有限公司
广州迪澳医疗科技有限公司
<120> 用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒
<130> ZM201356ZL
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 317
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 1
aacggcgatc gtgattccaa cagtgatccg gcgctcccac cactgactcc tcagcaaaga 60
gcctggctca agctggtgaa acccctcgtc atcgccgagg ggtttgctct gctctccgtt 120
cccaccccgt tcgtccagaa cgagatcgaa cggcacctcc gcgaaccgat catcaacgcg 180
ctcagccgca agcttggtca acgcgtcgag ctgggcgtac gcatcgccac ccccccagag 240
gaatccgagg actcctcctc tgacgctggt ttgtccgacg acgaacgtcc agacgcgagc 300
gctgccacgc cggccgc 317
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 2
tcgtgattcc aacagtgatc 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 3
agtcctcgga ttcctctg 18
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 4
cggagagcag agcaaacccc actgactcct cagcaaag 38
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 5
caccccgttc gtccagaacc tgagcgcgtt gatgatc 37
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 6
ttcaccagct tgagccag 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 7
gagatcgaac ggcacctc 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 8
gatcgtgatt ccaacagtga 20
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 9
aacggagagc agagcaaacc cactgactcc tcagcaaag 39
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 10
gatcgtgatt ccaacagtga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 11
gatcgtgatt ccaacagtga 20
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 12
aaacccctcg gcgatgacca ctgactcctc agcaaag 37
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> mycobacterium
<400> 13
ctgctctccg ttcccaccct gagcgcgttg atgatc 36

Claims (10)

1.一种用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的序列如SEQID NO：1所示。
2.用于特异性检测偶发分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括内引物IF，IB，外引物OF，OB和环引物LF，LB；其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～7所示。
3.基于环介导等温扩增技术用于特异性检测偶发分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液、Bst DNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照，阳性对照，DNA提取液，密封液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有如SEQ ID NO.1序列的核苷酸质粒或为偶发分枝杆菌提取的核酸基因组；所述阴性对照为超纯水。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为25μL，包括：反应液22μL，Bst DNA聚合酶(8U)1.0μL，核酸模板2μL。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应程序为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号，60个循环。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，优选地上述DNA提取液的组分为：20mMTris-Base，2mM EDTA，1.2％Triton X-100。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包含以下组分：Tris-HCl20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％，甜菜碱0.8M，dNTP 1.4mM，引物OF/OB 0.2μM，IF及IB各1.6μM，LF及LB各0.8μM，1×SYTO 9染料。
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