JPH11514522A

JPH11514522A - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｉｓ６１１０に基づく改良型分子検出法

Info

Publication number: JPH11514522A
Application number: JP9517193A
Authority: JP
Inventors: エス．サンドゥ，ガープリート; シー．クライン，ブルース; ストックマン，レスリー; ディー．ロバーツ，グレン; イー．レウィス，マルシア
Original assignee: カイロンダイアグノスティクスコーポレイション
Priority date: 1995-11-01
Filing date: 1996-10-30
Publication date: 1999-12-14
Also published as: US5731150A; DE69619845T2; AU7326896A; WO1997016564A1; DE69619845D1; EP0858514A1; EP0858514B1

Abstract

(57)【要約】臨床標本中のIS6110挿入エレメントの検出は、Mycobacterium tuberculosisによる感染を診断する迅速な方法である。IS6110 DNAに基づく、結核の信頼性のある診断試験を本開示中に記載する。全ての種類の臨床標本から生きた微生物を除去しそして核酸を精製する、「普遍的な」標本調製プロトコルを記載する。ポリメラーゼ連鎖反応において高い特異性でIS6110 DNAを増幅するために設計された、２つの核酸プライマーをも記載する。増幅されたIS6110 DNAは、制限エンドヌクレアーゼおよび電気泳動に基づくアッセイにより同定される。同定プロセスはまた、次のPCRにおいてDNAを増幅不可能にし、それにより他の標本の混入の可能性を減少させる。時間、労働、およびコストは最小化され、一方、使用者の安全および試験の信頼性は最大化される。完全なDNAの抽出、増幅、および分析は、８時間以内で、92％の感度および100％に近い特異性で、容易に達成される。同一の患者から連続的に得られたサンプルの試験によって、総検出率は100％まで増大する。

Description

【発明の詳細な説明】 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSISのIS6110に基づく改良型分子検出法発明の範囲本明細書中に記載およびクレームされる発明は、任意の臨床標本に存在するM. tuberculosis挿入エレメントIS6110を検出することにより、Mycobacterium tub erculosisによる感染を決定するためのアッセイの設計および組成物に関する。本明細書中に記載およびクレームされる発明はまた、全てのタイプの臨床標本から核酸を抽出する「普遍的な」方法の設計および組成物にも関する。本明細書中に記載およびクレームされる発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応においてIS6110 部分を特異的に増幅し得る、２つの核酸プライマーの設計および組成物、ならびに増幅されたIS6110 DNAを同定するための、制限エンドヌクレアーゼおよび電気泳動に基づく試験の設計および組成物にも関する。発明の背景 Mycobacterium tuberculosisのため、1995年中に300万人が死亡すると予測され（Dolinら）、結核は感染因子に起因する死亡の世界最大の原因となっている。毎年新たに感染する人の数は増加し、そして現在880万人と見積もられている。HIV感染の増加、ならびに世界的な移住および旅行様式の変化が、先進国におけるこの疾患の復活を導いている。結核は、M.tuberculosisによる感染（少数はM.bovisによる感染）に起因する。数ダース種のミコバクテリアが知られており、そしてほとんどはヒトに対して非病原性である。早期の結核はしばしば、他の点では健康な個体中で、認識されずに進行する。古典的な初期の診断方法には、抗酸性ミコバクテリアの顕微鏡下での痰スメアの検査、および肺のＸ線診断が含まれる。しかし、大多数の場合において、痰スメア検査は疾患の初期段階におけるMycobacteriaに陰性であり、そして感染後数ヶ月までは、肺の変化はＸ線で明らかでないこともある。別の複雑な要因は、痰スメア中の抗酸菌が、しばしば他の種のミコバクテリアであり得ることである。結核処置のために用いられる抗生物質にはかなりの副作用があり、そして６〜 12ヶ月にわたり、３以上の薬物を併用する形で投与されねばならない。さらに、薬剤耐性結核の出現が誘導される可能性があるため、診断を支持するための確固たる証拠がなければ、治療では投与が行えない。現在、唯一の絶対的に信頼できる診断方法は、臨床標本からM.tuberculosisを培養し、そしてそれを形態学的および生物化学的に同定することに基づく。これは通常３〜６週間を要し、その間に患者は深刻な病状になり得、そして他の個体に感染させ得る。従って、M.tube rculosisの存在を信頼をもって検出できる迅速な試験が、早期検出および処置に不可欠である。近年、いくつかの分子試験が、M.tuberculosisの迅速な検出および同定のために開発されている。市販の試験、Gen-Probe「Amplified Mycobacterium tubercu losis Direct Test」が、Abeら，J．Clin．Microbiol．31:3270-3274（1993）およびMillerら，J．Clin．Microbiol．32:393-397（1994）によって評価されている。この試験は、M.tuberculosisの16SリボゾームRNAを呼吸器標本から増幅し、そして増幅された生成物を検出するために化学発光プローブを用いる。報告された感度は約91％である。リガーゼ連鎖反応(LCR)(Abbott Laboratories)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Roche Diagnostics Systems，Eastman Kodak Co.，Johnso n & Johnson)、Q-βレプリカーゼ（Gene Trak）、および鎖置換増幅（Becton Di ckinson）に基づく他の市販の試験は、Forbesら，J．Clin．Microbiol．31:1688 -1694（1993）の総説で議論されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Saikiら,Science 239:487-491（1988）)の開発により、少量の核酸サンプルからDNAを増幅して検出できるようになり、臨床標本中のM.tuberculosisに特異的な核酸の検出が可能になっている。最初の報告のいくつかは、16SリボゾームRNAまたはその遺伝子の検出に基づいていた。IS6110挿入エレメントの発見（Caveら，Molecular and Cellular Probes 5:73-80（1991 ）、Eisenachら，J．Infectious Diseases 161:977-981（1990）、Thierryら，J ．Clin．Microbiol．28:2668-2673（1990））、およびこの配列がM．tuberculos isコンプレックス（M．tuberculosis、M．bovis、M．bovis-BCG、M．africanum 、およびM．microti）にのみ存在し得るとの確信が、迅速な診断戦略の全ての系統を生み出した（Brisson-Noelら，Lancet 338:364-366（1991）、Clarridgeら，J ournal of Clinical Microbiology 31:2049-2056（1993）、Cormicanら，J．Cli n．Pathology 45:601-604（1992）、Cousinsら，J．Clin．Microbiol．30:255-2 58（1992）、Del Portilloら，J．Clin．Microbiol．29:2163-2168（1991）、Fo lgueiraら，Neurology 44:1336-1338（1994）、Forbesら，J．Clin．Microbiol. 31:1688-1694（1993）、Hermansら，J．Clin．Microbiol．28:1204-1213（1990 ）、Kaltwasserら，Molecular & Cellular Probes 7:465-470（1993）、Kocagoz ら，J．Clin．Microbiol．31:1435-1438（1993）、Kolkら，J．Clin．Microbiol ．30:2567-2575（1992）、Koxら，J．Clin．Microbiol．32:672-678（1994）、L iuら，Neurology 44:1161-1164（1994）、Millerら，J．Clin．Microbiol．32:3 93-397（1994）、Paoら，J．Clin．Microbiol．28:1877-1880（1990）、Reischl ら，Biotechniques 17:844-845（1994）、Schlugerら，Chest 105:1116-1121（1 994）、Shawarら，J．Clin．Microbiol．31:61-65（1993）、Wilsonら，J．Clin ．Microbiol．31:776-782（1993）、Zambardiら，Annales de Biologie Cliniqu e 51:893-897（1993））。これらの試験は、痰からDNAを抽出するための様々な技術を用いる。PCRは抽出されたDNAからIS6110 DNA配列を増幅するために用いられる。このDNAの増幅の成功が、M.tuberculosis感染の存在の指標となると考えられる。米国特許第5,168,039号および同第5,370,998号はCrawfordらに発行されており、これはIS6110に基づく結核の検出についてのものである。欧州特許EP 0 ,461,045はGuesdonに発行されており、これはIS6110に基づく結核の検出についてのものである。IS6110エレメントは、M．tuberculosis、M．bovis、M．bovis- BCG、M．africanum、およびM．microtiに、それぞれ10個、２個、１個、５個、および５個のコピーで存在する（Spargoら，Moleculer and Cellular Probes 7: 395-404（1993））。 IS6110に基づく結核の検出を用いた報告のほとんどが、75％を越える感度および100％に近い特異性を主張している。しかし、Noordhoekら，J．Clin．Microbi ol．32:277-284（1994）により著された、７つの主要な研究所の間の盲検比較研究により、偽陽性の割合が３〜77％で感度が２〜90％の範囲であることが報告されたとき、主要な関心事が提起された。参加した全ての実験施設が、IS6110を同定するための独自の検出戦略の使用を許され、そして最終結果が、現在のプロトコルが感度および特異性の両方に関して極めて不十分であることを明確に示すので、この研究は重要であった。Leeら，J．Neurological Sciences 123:173-179 （1994）による別の研究は、結核性髄膜炎の患者から得た脳脊髄液サンプルの分析において、62％の偽陽性を報告した。同じ実験施設において先に処理されたサンプルに起因する、増幅IS6110 DNAの試料への混入が、いくつかの偽陽性を説明し得る。しかし、ほとんどの研究室は混入を避けるための優れた標本封じ込め手順を維持しているので、これは誤りの主要な原因ではない。別の可能性が存在し、そしてこれはM．tuberculosis以外の微生物におけるIS6110様配列の存在である。IS6110は輸送可能な挿入エレメントであり（CalosおよびMiller，Cell 20:5 79-595（1980））、そしてこれらのDNAフラグメントは「可動性」であるという特性を有する。DNA中の挿入エレメントは、特定の状況下で、微生物ゲノム中の元の位置から「ジャンプ」し、そして同一ゲノムDNA中の別の部位に移動し得る。挿入エレメントがしばしば微生物間を移動して進化して来たことを示す、進化論的データも存在する。この事実は、分子生物学の分野に精通した者には周知である。IS6110はまた、他の微生物起源である（または他の微生物に伝播されて来た）可能性があり、そしてDNAの特定の領域は、進化の間にこれらの微生物の間で保存されて来たかも知れない。これは、いくつかの研究室が、M．tuberculosi sではない微生物由来のIS6110に関係するDNAストレッチを増幅している可能性を提起する。これにより、文献に報告された偽陽性試験のいくつかが説明される。この問題に取りかかるため、本発明者らは、GenBankに寄託された核酸配列の系統的な分析を実行し、そしてM．tuberculosis以外の微生物中のIS6110に類似の配列ストレッチを見出した。これらの微生物の多くが臨床標本中に見出された。 Marianiら，Journal of General Microbiology 139:1767-1772（1993）で公開された報告も、M．tuberculosis IS6110エレメントに関係する配列の、微生物間の水平移動を議論している。さらに、Kentら，J．Clin．Microbiol．33:2290-2293 （1995）は、M．tuberculosis以外のミコバクテリア由来のIS6110に関係する配列を増幅し得、IS6110様の配列が他の微生物にも存在し、そしてそれらはM．tub ercu losisを検出するために設計された、おそらくIS6110に特異的なプライマーを用いて行われたPCRにおいて検出され得るという疑いを確認した。 PCR増幅用プライマーの設計は、IS6110への特異性のために、慎重に選択および最適化されねばならない。プライム特性を考慮されずに設計されたプライマーは、他の微生物由来のIS6110関連配列にハイブリダイズし得、見かけ上は正確なサイズで増幅されたDNAを生じ得る。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイによる、この増幅されたDNAの次の分析は、理想に満たない条件下で行われれば、偽陽性試験を導き得る。Fidlerら，Tubercle and Lung Disease 74:414-415（ 1993）も、IS6110配列に基づくいくつかのプライマーが、IS6110遺伝子に特異的であるかもしれないし、またはそうでないかもしれないと述べている。公開されたプロトコルの別の欠点は、核酸を抽出するために用いられる方法のほとんどが、痰以外の標本にも容易に用いられ得ることである。単調で非効率的なDNA精製を必要とするいずれの核酸抽出も、試験の速度および感度を減少させる。さらに、非痰サンプルでは異なる抽出手順を実行する必要があるので、プロセス全体が高価でかつ時間のかかるものになる。生きたM．tuberculosisを含むサンプルを扱う際の操作者の安全もまた主要な関心事であり、そして多くの公開された核酸精製のためのプロトコルにおいては、全ての生きた微生物を除去することは不可能である。公開された報告から、IS6110に基づく技術で、臨床診断試験に必要な信頼のレベルを提供するものは存在しないことが明らかになった。本発明者らは、核酸抽出に関与する様々なパラメータの系統分析を実行し、そしてプロトコルを開発しそして最適化した。そのプロトコルは安全で、効率的であり、そして改変なしに用いて、あらゆるタイプの臨床標本に存在するいかなる微生物からも核酸を精製し得る。次いで本発明者らは、GenBankから入手可能な既知のIS6110様配列を分析し、そしてIS6110のみを増幅し得、そして関連の遺伝子に由来する他の既知の核酸配列を増幅し得ない、核酸プライマーを開発した。研究室内にあらかじめ存在する増幅DNAの標本への混入は、それが偽陽性の結果を導くために、診断研究室における主要な関心事である。本発明者らの増幅DN Aの同定戦略は迅速であり、そしてまた増幅DNAを、２つの部分に切断することで不活化するように設計されている。これにより、続くPCR増幅においてDNAは増幅し得なくなる。本開示中で、本発明者らは、「普遍的な」標本調製プロトコルを系統的に分析しそして開発し、IS6110特異的PCRプライマーを開発し、そして完全な「結果のための標本」プロトコルを提供する、増幅DNAの同定および不活化戦略を開発した。発明の要旨臨床標本中のIS6110 DNAの検出は、Mycobacterium tuberculosisによる感染を診断する迅速な方法である。IS6110挿入エレメントに基づく、結核についての信頼できる診断試験を本開示中に記載する。全ての種類の臨床標本から生きた微生物を除去し、核酸を精製する「普遍的な」標本調製プロトコルを記載する。ポリメラーゼ連鎖反応において高い特異性でIS6110 DNAを増幅するために設計された、２つの核酸プライマーもまた記載する。増幅されたIS6110 DNAは制限エンドヌクレアーゼと電気泳動とを組み合わせたアッセイにより、同定される。同定プロセスはまた、次のPCRにおいてDNAを増幅不可能にし、それにより他の標本の混入の可能性が減少する。時間、労働、およびコストが最小化され、一方、使用者の安全および試験の信頼性は最大化される。完全なDNAの抽出、増幅、および分析が、８時間以内で、92％の感度および100％に近い特異性で、達成される。同一の患者から連続的に得られたサンプルの試験によって、総検出率は100％に増大する。図面の簡単な説明図１は、M．smegmatisおよびM．tuberculosisの分離株で、IS6110用のプライマー（GGTGCGTAAG TGGGTGCGCC AGGCおよびGCAGATCGAC TCGACACCCC AC）を用いて実行されたPCRでの、正確および不正確なプライミングの例である。図２は、IS611 0の増幅および制限エンドヌクレアーゼ消化を示す。図３は、Crawfordらの特許に記載される、PCRプライマーの位置（下線部）およびSalI（GTCGAC）制限酵素部位を示す。本発明のプライマー配列番号１および配列番号２の位置は、本発明の検出技術において用いられた制限酵素部位BamHI（GGATCC）に沿って、大文字で示される。図４は、Guesdonらの特許に記載される、３つのPCRプライマー（下線部）B、C、およびDの位置を示す。本発明のプライマー配列番号１および配列番号２の位置は、本発明の検出技術において用いられた制限酵素部位BamHI（GGA TCC）に沿って、大文字で示される。発明の詳細この研究の目的は、信頼でき、迅速かつ安全なM.tuberculosisの検出を可能にする、包括的な技術の組合せを開発することである。いかなるPCRに基づく診断スキームにおいても制限的な段階はサンプルの溶解、DNA抽出、特定のDNAの増幅、および増幅DNA（アンプリコン）の同定である。臨床標本（数分前のものから数年も保管されたサンプルまで変動し得る）からの核酸の精製は、困難な仕事である。液体の標本は、尿および脳脊髄液のような水様のものから、膿、凝固した血液および痰のように濃い物質まで、粘度が変動する。固体の標本は、器官の生検から組織切片より作製されるスライドまで、様々であり得る。M．tuberculosisの存在を決定するためのサンプルを調製するための、一般に受け入れられている「標準的な」プロトコルは存在しない。この問題の重大性は、PCRに基づく結核の診断を記載する刊行物が、異なるDNAの抽出技術を多数記載しているという事実から明らかである。普遍的な方法は、細胞を溶解して核酸を抽出するために、１以上の以下の試薬を用いる。標本を、酵素、界面活性剤、アルカリ、有機溶媒、またはカオトロピック試薬を含む試薬中で混合することにより、溶解する。種々の暴露期間の後、これらの溶解試薬から核酸を分離するために、様々な技術を用いる。本発明者らは、酵素、界面活性剤、アルカリ、および有機溶媒によるM．tuberculosis溶解の結果を比較し、そしていかなる溶解試薬を用いるよりも、単に培養M．tuberculosisの細胞懸濁液を純粋な水の中で15分間煮沸させる方が良いことを発見した。一連の実験において、M. t uberculosis培養物の連続希釈液を、酵素、界面活性剤、アルカリ、または有機溶媒のいずれかからなる溶解試薬での処理による溶解に供した後、水浴中で15分間煮沸した。PCRをこれらの溶解液において実行した。驚くべきことに、水に再懸濁させたM．tuberculosisのみを含むコントロールチューブが、任意の溶解試薬を用いた試験よりも10倍大きな検出感度を示した。本発明者らは、２コロニー形成単位と等価量のM．tuberculosisからDNAを増幅できることを見出した。煮沸溶解の安全性を評価し、そして1.5mlポリプロピレンスクリューキャップチューブ中のM．tuberculosis培養物の懸濁液が、煮沸水浴中に置かれると15分で生存不能になることを決定した。従って、煮沸水中での15分間は、全ての生きたM. tuberculosisを完全に死滅させ、そしてさらなる分析のために標本を安全なものにするには十分であった。この発見は、Zwadyk Jr.らにより報告された結果に類似する。 M．tuberculosisの純粋な培養液を煮沸するのは容易であるが、臨床標本を煮沸するのは不得策である。なぜなら、標本中のタンパク質が凝固する傾向があり、そして結果として溶解細胞から放出された全てのDNAが凝固物に捕捉され、核酸をさらに精製することが不可能になるからである。さらなる実験から、グアニジンチオシアネートの付加がタンパク質の凝固を防ぎ、そして臨床標本の煮沸が可能になることが示された。本発明者らはさらに、グアニジンチオシアネートへのアルカリ性フェノール（pH8.0）の付加によって、溶解標本からのDNAの優先的な精製が可能になることを発見した。グアニジンチオシアネートおよびフェノールの存在によって、この試薬の組合せが極めて溶解的かつ殺菌的になる。同じチューブ内でクロロホルム抽出および遠心分離を続けたとき、DNAは優先的に水相に分離され、アルコールに暴露することでそこから容易に沈澱する。本発明者らは、この迅速で単純な、一般的な溶解およびDNA抽出の手順を用いて、1000を超える標本を処理した。標本は、ミコバクテリアおよび真菌の純粋培養液から、痰、気管支肺胞液、組織ホモジネート、脳脊髄液、尿、血液、創傷スワブ、および組織のパラフィン包埋スライドの屑(scrapings)までの範囲にわたる。一般的な溶解は、体液および組織の中に存在し得る、事実上どの微生物からも高い質のDN Aを提供する。従って、特殊な「微生物または標本に特異的な」形態の溶解を実行する必要は除去される。一般的な溶解手順よりも単純な唯一の技術は、水中でサンプルを煮沸する事である。水中での煮沸は純粋培養液にはしばしば具合が良いが、臨床標本中のタンパク質性の物質が凝固し、そして回収不可能なほどにDN Aを捕捉することを防ぐためには、グアニジンチオシアネートのようなカオトロープ(c haotrope)の添加が必要である。PCR増幅を阻害する化学物質の存在も主要な関心事であり、そして本発明の「普遍的な」溶解はこの落とし穴を避けるようである。これには本発明のグアニジンチオシアナートの使用がある程度関係し得る。これは、この化学物質が、PCR阻害剤をさもなければ増幅不可能な標本から除去するという、Brisson-Noelらの報告による。本発明のDNA抽出手順は、ChomczynskiおよびSacchiにより記載される技術に類似し、ここで彼らは、細胞および組織からRNAを優先的に抽出するために、酸性グアニジウムチオシアネート-フェノール-クロロホルムを利用した。本発明の方法は、彼らの技術とはいくつかの点で異なる。彼らの細胞溶解は、RNAの完全性を維持するために、室温（22℃）で実行された。本発明者らは、細胞溶解を100 ℃での煮沸により実行した。煮沸はいくつかの重要な機能を担う。煮沸により、真菌およびミコバクテリアのような病原体の溶解されにくい細胞壁が溶解される。グアニジンチオシアネートの存在下での煮沸は、不溶性の組織断片、およびさもなければDNAを捕捉する凝固したタンパク質性の堆積物を分解する。煮沸により感染因子が死滅し、そして標本は研究所の職員によって扱われるのに安全なものになる。最後に、煮沸は染色体をより小さなDNAフラグメントに分解する。そのフラグメントは、細胞堆積物に捕捉されにくく、従ってより容易に精製される。ChomczynskiおよびSacchiは、酸性グアニジウムチオシアネート-フェノール- クロロホルムを用いて、細胞および組織からRNAを抽出した。一方、本発明者らは、アルカリ性グアニジンチオシアネート-フェノール-トリスを用いて、多様な種類の臨床標本から優先的にDNAを抽出した。アルカリ性フェノールの環境が極めて重大な目的を担う。なぜなら、アルカリ性条件下ではRNAが優先的に有機相に残りそして捨てられるが、一方、DNAは安全に水相へ分離し、そこからイソプロパノール沈澱により回収されるからである。ChomczynskiおよびSacchiにより記載された酸性条件は、DNAの脱プリン化(depurinating)および小さく増幅不可能なフラグメントへの切断により、DNAに不可逆的に損傷を与える。そして酸性の環境はまた、DNAを優先的に有機相へ分離させ、そして水相へのRNAの優先的な分離の間にDNAが捨てられる原因にもなる。少なくとも３つの会社が、グアニジン-フェノール試薬を含むキットを市販しており、それはRNA抽出用（Tel-Test， Frien swood，TXによるRNAzolおよびLife Technologies，Gaithersburg，MDによるTRIz ol）またはRNA/DNA/タンパク質抽出用（Molecular Research Center，Cincinnat i，OHによるTri Reagent）である。全てが室温での抽出を用いており、そして細胞培養物およびホモジネートされた組織において用いられ得る。本発明者らは、臨床標本中の病原性微生物からDNAを抽出するための、アルカリ性グアニジンチオシアネート-フェノール-トリス中での煮沸溶解の使用を記載する報告を、全く見出さない。ChomczynskiおよびSacchiの技術も、これら市販のキットを用いたプロトコルのいずれも、それらの臨床標本への有用性を記載していない。現在の形態では、４つの方法全てが、本発明のプロトコルの容易性および効率で、全ての臨床標本からPCRの質のDNAを提供し得ない。さらに、真菌やミコバクテリアのような病原体は、室温ではこれらの試薬で完全に溶解されず、研究所の職員に潜在的な健康の危機を提起する。本発明の「普遍的な」DNA抽出プロトコルを、記載されるように用いる。痰、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液、尿、または他の体液/滲出液のような、200μlの液体の標本を用いる。濃厚な膿のサンプルについては、100μlの標本を100μlの滅菌水と混合する。尿のような希薄な標本は、遠心分離によって濃縮し得る。10 0μlの血液は、100μlの滅菌水と混合する。（もしあれば）凝血は、ピペットを数回上下させることで分解する。細菌、真菌、ウイルス、またはミコバクテリアの培養液50μlを、150μlの滅菌水で希釈する。平板培養では、１白金耳量の微生物をボルテックスにより200μlの滅菌水に再懸濁する。感染供給源からのスワブを、300μlの滅菌水を含む小型遠心分離チューブに浸し、そしてチューブの側面に寄せて搾り出す。200μlをサンプル調製のために用いる。固体の組織を滅菌水中でホモジネートし、一方スライドに固定された切片を、滅菌したメスを用いて削り取り、そして200μlの滅菌水に再懸濁する。この節に記載される全ての方法の目的は、いかなる臨床標本をも可能な限り細かく分解し、そしてそれを200 μlの容積の水性液体に再懸濁することである。事実上いかなる臨床標本もこれらの方法の一つによって処理され得る。 1.5mlのＯリングシール付きSarsted（Newton，North Carolina）ポリプロピレンスクリューキャップチューブを、抽出のために用いた。200μlの標本を500μl のアルカリ性グアニジンチオシアネート/フェノール/トリス（GPT）試薬（6Mのグアニジンチオシアネートを50mMのトリス（pH8.3）に溶解させ、等容量のトリス（pH8.0）中で緩衝化したフェノールと混合した）に添加した。これをボルテックスによって混合し、即座に煮沸水浴中に15分間置いた。チューブを小型遠心分離器中で５秒間回転させた。250μlのクロロホルム/イソアミルアルコール（容積比24:１）を添加し、ボルテックスにより混合した。液相を、小型遠心分離器中14,000rpm、10分間の遠心分離によって分離し、450μlの水相（上相）を新鮮なチューブに移した。水相を500μlの100％イソプロパノールと混合し、そして-20℃で少なくとも１時間置いた（-20℃で一晩放置され得る）。この期間の終了時に、チューブを小型遠心分離器中で14,000rpm、15分間遠心分離し、そして核酸ペレットを乱さずに上清を除去した。痕跡量のGPT試薬を除去するために、穏やかに２回転倒させ次いで５分間遠心分離することにより、ペレットを、500 μlの氷冷した70％エタノールで洗浄した。エタノールを除去し、そしてペレットを高速吸引機(speed vac)中で10分間乾燥した。DNAペレットを25μlの脱イオン水に再懸濁し、そして５μl（純粋培養の溶解物の場合は１μl）を50μlのPCR 増幅で用いた。「普遍的な」標本溶解およびDNA抽出プロトコルの開発は、事実上任意の所定の臨床標本から、迅速に、安全に、かつ信頼度が高くDNAを精製するという、本発明者らの最初の目的を完了した。本発明の「普遍的な」溶解プロトコルはまた、「真菌の検出および同定のための核酸プローブ」と題された、本発明の米国特許出願（出願番号08/373,127、1995年１月出願）にも記載される。欧州特許EP 0 556 521 A1「殺菌剤を用いたサンプル処理」（Deyら、92年12月）は、ミコバクテリアからのDNAの抽出に用いられるための様々な化学物質を記載する。記載されるいずれの方法も、本発明の「普遍的な」溶解およびDNA抽出戦略に関係しない。本発明の次の目的は、特異性および感度の高いIS6110挿入エレメント由来のDN Aを増幅するために用いられる、一組のPCRプライマーを開発することである。本発明の主要な目的は、他の研究所が直面する落とし穴に挑み、それを回避することであった。研究所はその落とし穴のために、背景の部で議論したように、多数の偽陽性標本を経験した（Noordhoekら、Leeら、Kentら）。特異性のための最初の段階として、本発明者らは、M．tuberculosis IS6110配列と何らかの相同性を有する、他の微生物由来の配列を同定するために、GenBank中の配列を分析した。GenBankから得られた1360塩基対のIS6110配列は、200塩基対の断片へと編集され、そして各200塩基対単位を関連配列についてGenBankを調査するために用いた。目的は、他の微生物由来の遺伝子と共通の配列モチーフを共有するような、IS 6110 DNAの副領域を同定することである。PCRプライマーに誤ったプライム部位を提供するのに十分に大きい相同な領域を有するいくつかの配列には、Mycobact erium smegmatis挿入配列IS1137、Pseudomonas syringae挿入配列IS51、Pseudom onas cepacia挿入配列IS401、Escherichia ColiトランスポゾンTn3411、およびA grobacterium tumefaciens Tiプラスミドが含まれる（GenBankアクセス番号X709 13、M14365、L09108、M19532、X55075）。これらの微生物のいくつかは決して臨床標本中では見出されないが、これらの配列の存在は、気道にコロニーを形成し得る微生物の中で、より関連した配列（まだ発見されていないが）に遭遇する可能性を強く支持する。図１は、M．tuberculosis由来のIS6110を増幅するために用いられるプライマー対が、いかにして異なる微生物由来の非IS6110 DNAを容易に増幅し得るかの、適切な実証である。正しい増幅物および誤った増幅物の両方がゲル上で全く同じに見えるので、非IS6110増幅物をIS6110増幅物であると誤認することは容易であり、それは結核について偽陽性の試験結果をもたらす。図１の写真は、M．smegm atisおよび２つのM．tuberculosisの単離株において、IS6110プライマーを用いて行われたPCRの間に増幅されたDNAを含む、ゲルを示す。プライマーはGGTGCGTA AG TGGGTGCGCC AGGCおよびGCAGATCGAC TCGACACCCC ACの配列を有する。M．smegm atis IS1137挿入エレメントは、これらのプライム部位とわずかな塩基が異なるのみであり、IS6110増幅物において予測されるのとほぼ同じサイズの増幅物を生成する。レーン１はφ X-174 HaeIIIサイズマーカーを示し、レーン２はM．smeg matisを示し、レーン３および４はM．tuberculosisの２つの単離株を示し、レーン５はPCR増幅の陰性コントロールを示す。 PCR増幅に用いるための高度に特異的な核酸プライマーの設計では、プライマーを首尾良く設計することに関する全ての要素を慎重に考慮する必要がある。最も重要な局面の１つは、プライマーの３'末端に存在する最後の数塩基の位置、組成、およびプライム特性である。３'側塩基が完全にDNAストレッチにアニールする限り、プライマーはPCRでの増幅に利用され得る。そして意図されない標的配列は前節で実証されたように増幅され得る。従って、PCR増幅用の両プライマーの３'末端が、所望の標的配列に対して高度に特異的であることが不可欠である。PCRプライマーの３'末端のプライム特異性の重要性は、Sommerらによっても、ヒト遺伝子の変異および多型性を診断する際に実証されている。一旦、他の遺伝子と共通なIS6110の領域が同定されると、これらをPCRプライマーに対する潜在的な部位として除外した。IS6110エレメントと関連配列との徹底的な比較分析を行った。IS6110に特異的で、そして数種の生物由来のDNAの存在下でも作用するのに十分な感度の（ほとんどの臨床標本は、様々な割合で混合しているヒト、細菌、ウイルス、および真菌のDNAを有する）PCRプライマーに対する部位は、明らかではなく、そして本発明者らの知り得る限りは文献中で報告されていなかった。ハイブリダイズ特性、二次構造、および熱プロフィルを分析した後、いくつかの潜在的プライマーをIS6110に「特有な」領域に選択した。次いで潜在的プライマーをGenBank中の全ての遺伝子と比較し、そして他の遺伝子の領域と顕著な相同性を有する全てのプライマーを削除した。わずかに残った潜在的プライマー対を、塩基組成、熱安定性、アニーリング特性、特有の３'末端、ヘアピンの非存在、GC含有量、およびプライマー二量体形成の非存在について再評価した。ほとんどの基準を満たす２つのプライマーを選択した。プライマー配列番号１=TTCGGACCAC CAGCACCTAA CCおよびプライマー配列番号２=CCTTCTTGTT GGCGGGTCCA Gである。気道標本から抽出されたいずれのDNAも、この領域に存在する細菌のDNAとともに、ヒトのDNAを含む。従って、本発明者らは、様々な細菌およびミコバクテリアから単離されたDNAと同様にヒトDNAを増殖させる、本発明のプライマーの能力を試験した。結核歴の無い個体から得た貯留痰(pooled sputum)をまた、プライマーの特異性を決定するために試験した。この貯留痰は、ヒトの気道に存在する可能性のあるほとんどの細菌、真菌、およびウイルスの、典型的なサンプルを含むと予測された。偽陽性試験をもたらし得るいかなるDNAも、貯留痰中に潜在的に検出されるべきである。結核の原因とならないが痰スメア中に抗酸性微生物として存在し得る、いくつかのミコバクテリアもまた試験した。本発明のプライマー対（配列番号１および配列番号２）で増殖され得るいかなる関連配列をも同定する試みで、PCRを行った。PCR試薬を、PCR試薬の調製専用の無菌室で作製しそして分注した。標本、培養液、または精製DNAはどれも、PCR混合室には決して持ち込まれなかった。標的DNAを、増幅DNAに決して暴露していない隔離室の中で、 PCR混合物に添加した。増幅を、Perkin-Elmer 9600熱サイクル装置（Norwalk，C onnecticut）で、個々のキャップの付いた薄壁の200μlのPerkin-Elmerチューブを用いて行った。PCRチューブに添加した最初の溶液は、2.5μlの10×PCR緩衝液（100mMトリス（pH8.3）、500mM KCl、15mM MgCl₂）、5.0μlの50％グリセロール/１mMクレゾールレッド、8.0μlのdNTP混合物（それぞれ1.25mMずつのdATP、d GTP、dTTP、およびdCTP）、2.0μlのプライマー配列番号１=TTCGGACCAC CAGCACC TAA CC（５ピコモル/μl）、プライマー配列番号２=CCTTCTTGTT GGCGGGTCCA G（５ピコモル/μl）、および5.5μlの水を含んでいた。１個のAmpliwax PCR Gem-5 0ワックスビーズ（Perkin-Elmer，Norwalk，CT）を添加し、そしてチューブを加熱ブロックに80℃で30秒間置き、そして室温まで冷却してワックスの隔壁を形成させた。2.5μlの10×PCR緩衝液、5.0μlの50％グリセロール/１mMクレゾールレッド、12.3μlの水、および0.2μlのTaqポリメラーゼ（AmpliTaq ５U/μl，Perk in-Elmer）を含む20μlの溶液を、各チューブに添加した。チューブを混合調製室から移動し、そして「普遍的な溶解」由来の5.0μlのDNA鋳型を、各チューブに添加した。チューブを94℃に予熱された熱サイクル装置中に１分間置き、次いで94℃で30秒間、65℃で30秒間、そして72℃で１分間の増幅を50サイクル行い、そして最後は72℃で10分間延長した。 PCRに続き、10μlずつの各サンプルを、200ボルトで20分間、１×TBE緩衝液（ 0.1Mトリス、0.09Mホウ酸、１mM EDTA、pH8.3）中の５％ポリアクリルアミド小型ゲルに流した。ゲルを、１×TBE中0.5μｇ/mlエチジウムブロミドで４分間染色し、そして短波UVライトボックスで可視化した。表１に示すように、M．tuber culosisおよびM.bovis由来のDNAのみが、適切なサイズの増幅物を生じた。この発見から、本発明のプライマーがIS6110に特異的であり、そして非IS6110標的を偽陽性にしないことが示された。M．smegmatisでは、それがIS6110エレメントに極めて類似する挿入エレメントを含むにも関わらず、偽陽性が全く観察されなかったことに留意するべきである。さらに、M．avium、M．intracellulare、M． fortuitum、M．kansasii、M．xenopi、M．malmoense、またはM．chelonae由来の DNAにおいても偽陽性は全く見られなかった。このことは、これらの微生物由来のIS6110様配列をM．tuberculosis IS6110 DNAを増幅するために設計されたプライマーを用いて増幅し得る能力を実証した、Kentらの発見とは異なる。正確なサイズの増幅物がゲル上に存在することは、増幅物の相同性を証明するためには十分でない。増幅物の同定は、DNAを直接配列決定し、そしてそれを既知のIS6110配列と比較することによって、最も正確に行われる。現在、これは費用効果のある方法ではなく、そして達成には24時間かかる。プローブのハイブリダイゼーションに基づく様々な方式の１つを用いる増幅DNAの分析は、Kohneに発行された米国特許第4,851,330号で議論されるように、効果的な分析手段である。しかしそれは１組のサンプルを処理するのに１日を要し得る。さらに、増幅DNA の過度の取り扱いは、IS6110について試験されている増幅DNAが混入標本となり、そして再増幅され、偽陽性試験の結果をもたらすような、さらなる混入の問題を持ちかける。従って、PCR混入防止戦略を遵守することが重要である。本発明の次の目的は、信頼できる増幅物の同定方法を開発することであり、そしてその方法は、増幅DNAを不活化し、そしてそれが本発明のPCRプライマー配列番号１および配列番号２によってさらに増幅されるのを防ぐ。制限酵素は、高度に特殊化したタンパク質であり、二本鎖DNA上の特定の配列を認識する。制限酵素はDNAのこれらの特異的な部位に結合し、そしてDNAの各鎖のホスホジエステル結合を加水分解し、「断片」を生成する。本発明のプライマー配列番号１および配列番号２により増幅されたIS6110のフラグメントは、GGATCCと読まれる６塩基対DNA配列のストレッチを有する。この配列は、増幅物の一端から約110塩基、他端から約85塩基の位置にある。GGATCC配列は、制限エンドヌクレアーゼ酵素であるBamHIまたはイソシゾマー(isoschizomer)の認識部位および切断部位である。B amHIに対するイソシゾマーは、BamHIと同一の配列でDNAを切断する任意の異なる制限酵素である。配列番号１および配列番号２によって生成されたIS6110増幅物を酵素BamHIと共にインキュベートすると、増幅物は、110および85塩基対の長さの２片に切断される。これら２つのDNAフラグメントをゲル電気泳動によって検出し、そして増幅DNAの相同性が確認される。増幅DNAを２つの部分に切断することによってまた、DNAの完全な線形性が破壊され、そしてプライマー配列番号１および配列番号２を用いて行われたPCRにおいて、DNAがさらなる複製のための鋳型として機能するのが阻止される。これにより事実上、増幅DNAが安全処理(ster ilize)され、そして全長の増幅物に他の標本が混入する可能性が減少する。適切な制限部位の分析と組み合わされた、増幅物のサイズは正確で非常に迅速な分析手段である。一連の40個程度のサンプルを、1.5時間以内に分析し得る。D NAの断片を同定するための制限フラグメントの使用は、当該分野に置いて周知である。 PCRの完了の際に、増幅DNAは固化したワックスの層の下に封印されて残る。制限エンドヌクレアーゼ消化を、7.5μlの10×BamHI緩衝液、16.5μlの水、および１μl（10U）のBamHI制限エンドヌクレアーゼ（Boehringer Mannheim，Indianap olis，Indiana）を含む25μlの混合物をこのワックスの最上部に置くことにより、行う。ワックスの隔壁をピペットチップで破壊し、そして２つの液体を穏やかにピペッティングして混合する。チューブを37℃で20分間放置し、全ての増幅IS 6110 DNAの消化を完了させる。各サンプルのアリコートを、１×TBE（0.1Mトリス、0.09Mホウ酸、１mM EDTA、pH8.3）緩衝液中の５％ポリアクリルアミド小型ゲル上で、200ボルトで20分間、電気泳動する。ゲルを、１×TBE中0.5μg/mlエチジウムブロミドで、４分間染色する。存在する全てのDNAが、短波UVライトボックスで可視化される。110および85塩基サイズの２つのバンドの存在により、I S6110の存在が確認される。図２は、プライマー配列番号１および配列番号２を用いて、ミコバクテリアのパネルにおいて行われた、PCR増幅の結果を示す。M．bovisおよび４つの異なるM ．tuberculosisの単離株のみが、増幅物を生じた。５つ全ての増幅物のBamHI制限エンドヌクレアーゼ消化産物が、２つのDNAフラグメントの相同パターンを示し、そしてこれによりIS6110の存在が確認される。図２は、それぞれ15レーンを含む、２つの近接した５％ポリアクリルアミドゲルの写真である。（レーン１および16：φ X-HaeIIIサイズマーカー。レーン２〜15：M．malmoense、M．intrac ellulare、M．fortuitum、M．gordonae、M．smegmatis、M．phlei、M．nonchrom ogenicum、M．xenopi、M．szulgai、M．kansasii、M．triviale、M．marinum、M ．simiae、M．chelonae。レーン17：M．avium。レーン18：M．bovis。レーン19 〜22：M．tuberculosisの４つの分離株。レーン23〜27：レーン18〜22由来のM． bovisおよび４つのM．tuberculosisの増幅物の、BamHI消化産物。レーン28〜30 ：PCR増幅における陰性コントロール。） PCR手順の感度は、溶解手順の有効性および増幅条件に直接に影響される。前述のように、アルカリ、界面活性剤、有機溶媒、またはプロテアーゼの存在は、純粋な水の中でのサンプルの煮沸に比べ、感度を約10分の１に減少させる。次に、本発明者らは、本発明により記載された様式でワックス隔壁を用いる温態始動 (hot-start)PCR増幅が、従来の冷態始動(cold-start)PCR増幅に比べ、本発明の試験の感度を少なくとも1000倍に増加することを見出した。これは、温態始動および冷態始動の増幅条件下で、連続希釈されたM．tuberculosis DNAを比較することで行われた。冷態始動反応では、全ての試薬が室温でPCRチューブ中で混合される。この低温により、いくらかのプライマーが互いにおよび非特異的なDNA標的とアニールするのが可能になり、そしてTaqポリメラーゼは、これらの誤ってアニールされたプライマーにdNTPを付加して伸長する。このプライマーの損失により、所望の標的遺伝子が増幅されるために残る試薬の量が減少する。温態始動反応では、プライマーおよびdNTPがワックス隔壁によってTaqポリメラーゼおよびDNA鋳型から隔離されたままである。この隔壁は、チューブを熱サイクル装置に置きそして94℃まで加熱すると、溶解する。温帯始動でさえも、サンプルは時折（通常は試験された総標本数の１％未満）プライマー二量体を形成し、これはポリアクリルアミドゲル電気泳動において見られ得る。プライマー二量体の存在により、感度の減少のためにPCRが失敗した可能性が示され、分析の繰り返しが必要とされる。プライマー二量体形成の防止による、増幅におけるこの改良は、元々はChouらにより留意された。本発明の詳細に記載される全てのプロトコルの個々の構成要素は、極めて迅速で、信頼性があり、かつ費用効果のある結核の検出するために設計された、包括的なプロトコルに併用された。この診断プロトコルは８時間以内に完了し得、従って同日中に診断を提供し得る。全てのタイプの臨床標本から生きた微生物を除去しそして核酸を精製する、効率的で「普遍的な」標本調製プロトコルは、ポリメラーゼ連鎖反応において高い特異性でIS6110 DNAを増幅するように設計された２つの核酸プライマーと併用されると、本発明のプロトコルに高い信頼性を与える。同定プロセスもまた、その後のPCRにおいてDNAを増幅不可能にし、それにより他の標本が混入する可能性が減少する。この速度、安全性、感度、および特異性は、使用の容易性および低いコストと合わせて、本発明者らの知り得る限り、いかなる報告にも述べられていない。本発明者らは、信頼性のあるPCRに基づく結核用試験を開発するため、全ての重要な変数を系統的に分析しそして最適化した。本発明者らが取り組んだ変数の重要性、試験結果への貢献、および統合は、自明ではなく、そして、完全な試験手順を提供するための全ての段階のサンプルの取り扱いおよび試験を最適化する目的を伴う包括的な様式では、以前には決して取り組まれていない。米国特許第5,16 8,039号において、Crawfordらは、IS6110遺伝子、およびそのサブクローンの、結核を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。本発明者らは、時間を消費するハイブリダイゼーションに基づく検出の使用を避け、そして代わりに、増幅DNAを迅速に同定するための、BamHIでの制限エンドヌクレアーゼ消化に信頼を置く。これはまた、プローブが間違って増幅されたIS 6110関連配列に誤ってハイブリダイズする可能性も減少させる。Crawfordらに発行されたさらなる米国特許第5,370,998号は、SalI制限酵素部位を含み、IS6110 の123塩基対フラグメントを増幅する２つのPCRプライマーを記載する。１つのタイプの標本（痰）からDNAを抽出するための方法も記載される。痰標本からIS611 0を検出するプロセス全体は、報告によると48時間で達成される。本発明の検出戦略は全ての臨床標本に用いられ得（Crawfordらにより記載される痰標本のみとは対照的に）、そして本発明の検出プロセス全体は８時間以内で完了され得る。 IS6110遺伝子に基づく結核の検出についての欧州特許EP 0 461 045 A1は、Gue sdonに発行されている。彼らは、IS6110を増幅するために様々な組合せ（AとB、 C、またはD、およびHとG）で用いられ得る８つのPCRプライマー（A、B、C、D、E 、F、G、H）を記載している。DNA抽出戦略は記載されておらず、そして請求項は、記載されたプライマーに80％の相同性を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、IS6110もまた首尾良く検出するというものである。これはM．tuberculosis の純粋培養においては真実であるが、高レベルな特異性を有さないプライマーは無関係の遺伝子を増幅する可能性があり得るので、前提が自滅的である。図３は、Crawfordらの特許に記載された、PCRプライマーの位置（下線部）およびSalI（GTCGAG）制限酵素部位を示す。本発明のプライマー配列番号１および配列番号２の位置は、本発明の検出技術で用いられる制限酵素部位BamHI（GGATC C）とともに、大文字で示される。プライマー配列番号１はCrawfordらのプライマーの１つと５塩基対が重複し、そしてCrawfordらのプライマーの３'末端から1 7塩基離れた位置に３'末端を有する。本発明のプライマー配列番号１および配列番号２が、Crawfordらのプライマーに関係しない特有の３'末端を有すること、そしてこの特有のプライム特異性が、高レベルの信頼性でIS6110の検出を可能にすることに留意するべきである。Mycobacterium tuberculosis IS6110配列において、最初の塩基の数は、GenBank配列、アクセス番号X17348およびM29899に示されるとおりである。特許に記載されたCrawfordらのプライマー配列は、GenBan k配列にはない１つのさらなる塩基を有する。この塩基は図中に示された配列に加えられており、そしてプライマー配列中に太字で大文字の「C」で印す。図４は、Guesdonらの特許に記載された３つのPCRプライマー（下線部）B、C、およびDの位置を示す。本発明のプライマー配列番号１および配列番号２の位置は、本発明の検出技術で用いられる制限酵素部位BamHI（GGATCC）とともに、大文字で示す。プライマー配列番号２はGuesdonらのプライマーCおよびDとそれぞれ11および16塩基対が重複し、そしてGuesdonらのプライマーの末端から19および16塩基離れた位置に３'末端を有する。本発明のプライマー配列番号１および配列番号２が、Guesdonらのプライマーのいずれにも関係しない特有の３'末端を有することに留意するべきである。Mycobacterium tuberculosis IS6110配列において、最初の塩基の数は、GenBank配列、アクセス番号X17348およびM29899に示されるとおりである。Guesdonらのプライマー配列B、C、およびDは、それぞれのプライマー配列の両端にBB'、CC'、およびDD'と印し、下線を引くことで示される。特許に記載されたプライマーBは、GenBank配列にはない１つのさらなる塩基を有する。この塩基は図中に示された配列に加えられており、そしてプライマー配列中には太字で大文字の「C」と印す。本発明のさらなる改変は、当業者には明らかである。以下に本発明の様々な局面を例示するが、発明の有用性を限定する意図はない。実施例１．臨床標本における、特異的増幅ならびに制限エンドヌクレアーゼに基づく結核の同定普遍的な溶解を含む結核検出プロトコル、特異的なIS6110増幅、制限ヌクレアーゼによる増幅物の分析、および増幅物の安全処理の組合せを、臨床標本上で試験した。本発明者らは、104の痰標本を培養により試験し、そして48がM．tuberculosis 陽性であることを見出したが、一方、別の24は他のミコバクテリア種について陽性と試験された。次いで、これらの痰標本を、本発明の完全なIS6110に基づく結核検出戦略に供した。この戦略は、それぞれの痰標本の普遍的な溶解およびDNA 抽出、プライマー配列番号１および配列番号２を用いる温態始動PCR増幅、BamHI 制限エンドヌクレアーゼ消化および増幅物の安全処理、ならびにポリアクリルアミド小型ゲル電気泳動から構成されていた。結果を表２に示す。本発明の技術で、培養においてM．tuberculosis陽性であった48標本のうちの、44が検出された。本発明の結果は、培養可能なM．tuberculosisを含む痰の同定に対して、92％（48中44）の感度を示した。しかし、臨床試験では複数のサンプル（数日間にわたって連続的に採取された）を培養によって分析する。類似の様式で、４人の「偽陰性」患者から連続的に得たサンプルをまたIS6110について試験した。各ケースにおいて、これら４人の患者に由来する全ての別のサンプルが、IS6110について陽性と試験された。従って、この試験の実際の検出率は、各患者から複数の標本が試験されれば、100％に達する。さらに、本発明の試験により、以前にM．tuberculosisについての培養試験で陽性であり、そして結核の完全な処置を受けた患者から得た28標本中の、25を検出した。現在、これら28人の患者の痰からは、M．tuberculosisは全く培養されなかった。結核の処置は、M．tuberculosisを死滅させ、培養での増殖を不可能にする。しかし、これらの生存力のない微生物の残物は存続し続け、そして処置後長年にもわたって痰中に流し出される。これらは、生きたミコバクテリアの存在に依存しないPCR増幅に基づく試験の使用によって検出され得、そして以前の結核感染から置き去られたDNAフラグメントの跡を実際に同定し得る。この観察は当業者に公知である。他のミコバクテリア種を含む全ての標本が、IS6110について陰性と試験された。結核歴のない患者の標本の１つが、PCRによってIS6110について陽性と試験された。この患者の痰は、抗酸性桿菌に対して陽性のスメアであり、いくつかのミコバクテリア種の存在を示すが、培養では全く増殖しなかった。もしかすると、この患者は不顕性感染を有しており、その感染は大量の生存力のない微生物を残し、結局ひとりでに解決したのかもしれない。増幅阻害剤の存在は、臨床標本を分析する際の関心事であり、そして多くの研究室では日常的に、試験される各サンプルに内的増幅制御物を添加する。本発明者らは普遍的な溶解に伴う阻害剤の持ち越し(carry over)を観察しておらず、そして偽陰性は阻害剤の持ち越しよりもむしろサンプリングの限界と相関するようである。各PCR増幅反応は、非常に小さな容量の痰を試験するだけであり、一方、培養に基づく同定に利用される痰の容量は、はるかに大きい。内的陽性制御物の添加は、科学的に聞こえるが、それ以外では真のIS6110標的の同定に用いられる増幅試薬を浪費し、それにより増幅の感度が減少し得、そして減少する。１コピーまたは２コピーのIS6110の存在をマスクし得るいかなる内的陽性制御物の付加も、容認されない。本実施例に示すように、完全なDNAの抽出、増幅、および分析が、８時間以内に、92％の感度および100％に近い特異性で、容易に達成される。同一の患者から連続的に得られたサンプルの試験によって、総検出率は100％に増大する。実施例２．DNA配列に基づく結核の同定本発明のプライマー配列番号１および配列番号２の別の有用性は、配列に基づくM．tuberculosisの同定である。これらのプライマーを、任意の臨床標本由来のIS6110 DNAを増幅するために用い、そして増幅DNAを、プライマー配列番号１または配列番号２のいずれかを用いて配列決定する。得られた配列またはそれの相補体が配列番号３と照合する場合は、増幅物の相同性を、M．tuberculosis IS 6110挿入エレメントとして確認する。配列を、現在のDNA配列決定方法またはこの技術の任意の将来的開発もしくは改変を用いて、生成し得る。実施例３．キャピラリー電気泳動に基づく増幅IS6110 DNAの同定プライマー配列番号１および配列番号２は、任意の蛍光部分を用いて標識し得、そして任意の臨床標本由来のIS6110 DNAを増幅するためにPCRにおいて用い得る。増幅に続き、蛍光標識された増幅DNAを制限エンドヌクレアーゼBamHIを用いる制限消化に供する。次いで、生成したDNAのフラグメントをキャピラリー電気泳動によって分離しそしてサイズ分析する。そして110および85塩基対長の２つの断片の存在により、IS6110 DNAの相同性が確認される。実施例４．IS6110 DNAの捕獲および同定本発明で開示される両プライマーは、任意の検出可能部分によっても標識し得る。これには、放射性同位元素、酵素、抗原、抗体、化学発光試薬、および蛍光化学物質が挙げられるが、これらに限定されない。プライマー配列番号１および配列番号２をまた、制限部位または他の有用な配列を取り込むように設計されたヌクレオチドの末端の付加により、それらの目的の本質を変化させることなく改変し得る。これらのIS6110配列、あるいは配列番号１、配列番号２、配列番号３または、それらの相補体とハイブリダイズする任意の配列の、固相捕獲および/ または精製を補助するために設計された付加的な改変としては、常磁性粒子、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、および抗体のような部分が挙げられるが、これらに限定されない。これらの改変のいくつかの有用性としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。プライマー配列番号１または配列番号２を、ビオチンまたは固相捕獲を補助するために設計された任意の部分、例えばストレプトアビジンで覆われた常磁性粒子または他の固相を用いて標識する。臨床標本由来の標的IS61 10 DNAの増幅に続き、固相をDNAを捕獲するために用い、そしてこれを次に検出可能部分で標識された第三のプローブとハイブリダイズさせる。この第三のプローブは、BanHI制限配列と重複し、そしてそれを検出するために設計された配列番号３のサブセットであり得る。あるいは、配列番号１および配列番号２を、検出可能なシグナル部分で標識し、そしてPCRに用いる。それに続き、固相に付着した第三のプローブ（配列番号３またはそのサブセット）を、増幅されて標識されたDNAを分析のために捕獲するために用いる。別の選択肢は、配列番号１および配列番号２を用いて増幅されたDNAを、配列番号３のサブセットとのハイブリダイゼーションにより捕獲することである。配列番号３は、DNAハイブリダイズ「チップ」のような固相に結合し、そして検出部分で標識された別の配列番号３のサブセットを、結合されたDNAの存在を検出するために用いる。配列番号１および配列番号２により増幅されたIS6110配列をまた、BamHI制限部位を横切る２つのオリゴヌクレオチドを連結することによって、同定し得る。これら２つのオリゴヌクレオチドの１つは捕獲で標識され得、もう１つは検出部分で標識され得る。捕獲部分の固相捕獲に続いて検出部分を検出する能力により、２つのオリゴヌクレオチドの連結の成功が確認される。これら２つの付加的なオリゴヌクレオチドは、配列番号３のサブセットである。さらに、本明細書に記載される全ての同定戦略は、十分なシグナルが検出部分によって生じる場合は、PCR増幅なしでも行われ得る。これは、プローブ配列中で多数の検出部分を付着させることによって達成され得る。分枝DNAプローブは、多数の検出可能部分を付加するのに適切であり、直接的な検出を実行可能(fea sable)にする。本発明者らは、現在および将来の技術が、本出願に記載されるように、DNA配列(配列番号１)、(配列番号２)、および（配列番号３）と機能的に等価なRNAまたは改変された合成配列の使用にも適用され得ることを認識する。この技術の他の改変は、当業者には明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クライン，ブルースシー. アメリカ合衆国ミネソタ 55902，ロチェスター，クラインレーンエス．ダブリュー．2315 (72)発明者ストックマン，レスリーアメリカ合衆国ミネソタ 55904，ロチェスター，イーストリバーハイツ 331 (72)発明者ロバーツ，グレンディー. アメリカ合衆国ミネソタ 55902，ロチェスター，ウォルデンレーンエス．ダブリュー．1751 (72)発明者レウィス，マルシアイー. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02025，コハセット，ウィールライトファーム 67

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプル中のMycobacterium tuberculosisまたはMycobacterium bovisの存在を検出するための方法であって、該サンプル中の（配列番号３）またはその相補体からなるDNAセグメントの存在を検出する工程、該サンプル中のMycobacterium tuberculosisまたはMycobacterium bovisの存在を示す工程、を包含し、ここで、該DNAセグメントはMycobacterium tuberculosisまたはMycob acterium bovisのいずれもが存在しない該サンプル中では検出されない、方法。２．前記DNAセグメントの存在を検出する前に、（配列番号３）またはその相補体を増幅する工程、をさらに包含する、請求項１に記載の方法。３．ポリメラーゼ連鎖反応が（配列番号３）またはその相補体を増幅するために用いられ、そして該ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーが（配列番号１）および（配列番号２）またはそれらの相補体である、請求項２に記載の方法。４．前記サンプルが、痰、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液、尿もしくは他の体液、滲出液、または組織である、請求項１に記載の方法。５．（a）グアニジンチオシアネートの存在下で煮沸することにより、前記サンプル中の細胞を溶解する工程；および、（b）該細胞中に含まれるゲノムDNAを単離する工程、をさらに包含し、ここで、工程（a）および（b）が前記DNAセグメントの存在を検出する前に実行される、請求項１に記載の方法。６．（c）（配列番号３）またはその相補体の存在を決定する前に、前記単離されたDNAの一部を増幅する工程、をさらに包含する、請求項５に記載の方法。７．ポリメラーゼ連鎖反応が（配列番号３）またはその相補体を増幅するために用いられ、そして該ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーが（配列番号１）および（配列番号２）またはそれらの相補体である、請求項６に記載の方法。８．（d）工程（c）の後に制限エンドヌクレアーゼ酵素を添加することにより、前記増幅されたDNAを不活化する工程、をさらに包含する、請求項７に記載の方法。９．その中で前記酵素がBamHIまたは同一の核酸配列を認識するイソシゾマーである、請求項８に記載の方法。１０．工程（a）が、さらに有機溶媒およびアルカリ性緩衝液の存在下で、前記サンプル中の細胞を溶解することをさらに包含する、請求項５に記載の方法。１１．前記有機溶媒がフェノールであり、そして前記アルカリ性緩衝液がトリス緩衝液である、請求項１０に記載の方法。１２．工程（a）が、15分間煮沸することにより、前記サンプル中の細胞を溶解することをさらに包含し；工程（b）が、遠心分離および沈澱により、該細胞に含まれるゲノムDNAを単離することをさらに包含し；そして工程（c）が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて該単離されたDNAを増幅することをさらに包含し、ここで、該ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるプライマーが（配列番号１）および（配列番号２）またはそれらの相補体である、請求項６に記載の方法。１３．前記DNAが迅速な小型ゲル電気泳動により分析され、前記DNAセグメントの存在が決定される、請求項５に記載の方法。１４．前記DNAセグメントが、DNA配列（配列番号３）またはその相補体と機能的に等価なRNAまたは改変された合成配列により置換される、請求項１に記載の方法。１５．前記プライマーが、DNA配列（配列番号１）および（配列番号２）またはそれらの相補体と機能的に等価なRNAまたは改変された合成配列により置換される、請求項３に記載の方法。１６．前記プライマーが検出可能な部分で標識される、請求項３に記載の方法。１７．前記検出可能な部分が、放射性同位元素、酵素、抗原、抗体、化学発光試薬および蛍光化学物質から成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。１８．サンプル中のMycobacterium tuberculosisまたはMycobacterium bovisの存在を決定するための、（配列番号３）またはその相補体から成る、DNA配列。１９．臨床サンプル中に含まれる細胞からゲノムDNAを単離するための方法であって、（a）該臨床サンプルをグアニジンチオシアネート、有機溶媒、およびアルカリ性緩衝液の存在下で煮沸することにより、該細胞を溶解する工程；および、（b）該細胞に含まれる該ゲノムDNAを単離する工程、を包含する、方法。２０．工程（b）が、（i）前記DNAを抽出するための有機相および水相を用いて、該DNAを抽出すること；（ii）該DNAを含む該水相を遠心分離すること；および（iii）該DNAを該水相から沈澱させること、をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。２１．前記有機溶媒がフェノールであり、そして前記アルカリ性緩衝液がトリスである、請求項２０に記載の方法。