KR100234975B1

KR100234975B1 - 마이코박테리아의 rpoB 유전자 분절을 표적으로 하는 PCR-RFLP에 의한 마이코박테리아 균종의 탐지 및 동정방법

Info

Publication number: KR100234975B1
Application number: KR1019970035501A
Authority: KR
Inventors: 국윤호; 김범준
Original assignee: 국윤호
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 1997-07-28
Publication date: 1999-12-15
Also published as: US6242584B1; AU8464898A; KR970065731A; WO1999005316A1

Abstract

본 발명은 다른 세균의 rpoB DNA는 증폭시키지 않으면서 마이코박테리아(Mycobacteria) 속(屬) 균종의 rpoB DNA만을 특이적으로 증폭시키는 PCR 프라이머쌍; 그를 이용하여 PCR 증폭된, 각 마이코박테리아 균종의 특징적인 염기서열을 가지는 rpoB 유전자 분절; 및, 전기 rpoB 유전자 분절의 특징적인 염기서열에 의하여, 또는 증폭된 rpoB 유전자 분절 내에 존재하는 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)분석으로, 마이코박테리아 각 균종을 특이적이고도 민감하게 탐지 또는 동정하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서는 표적 DNA로서 rpoB 유전자를 이용하여 TB complex 뿐만 아니라, 최근 급증하고 있는 MOTT를 한꺼번에 증폭시켜 탐지할 수 있는 마이코박테리아 특이 PCR프라이머를 개발하였으며, 또한 본 발명에서 가장 주목할 만한 점은 전기 프라이머를 사용하여 증폭된 rpoB DNA를 Hind-II로 절단하여 TB complex와 MOTT를 구별하고, MOTT인 경우에는 다시 Mva-I로 절단함으로서 MOTT중 인체감염을 가장 흔히 일으키는 MAIS complex를 간단하게 M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum으로 동정할 수 있었다는 것이다. 따라서, rpoB 유전자 분절을 표적으로 한 PCR-RFLP 분석법은 기존의 어떤 방법보다도 간편하고 특이적이며 민감한 마이코박테리아 균종의 탐지 또는 동정 방법이다.

Description

마이코박테리아의 rpoB 유전자 분절을 표적으로 하는 PCR-RFLR에 의한 마이코박테리아 균종의 탐지 및 동정방법

본 발명은 마이코박테리아(Mycobacteria)의 rpoB 유전자 분절(342bp)을 표적으로 하는 PCR-RFLP(polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism)에 의한 마이코박테리아 균종(species)의 탐지 및 동정방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 다른 세균의 rpoB DNA는 증폭시키지 않으면서 마이코박테리아 속(屬) 균종의 rpoB DNA만을 특이적으로 증폭시키는 PCR 프라이머쌍; 그를 이용하여 PCR 증폭된, 각 마이코박테리아 균종의 특징적인 염기서열을 가지는 rpoB 유전자 분절; 및, 전기 rpoB 유전자 분절의 특징적인 염기서열에 의하여, 또는 증폭된 rpoB 유전자 분절 내에 존재하는 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP 분석으로, 마이코박테리아 각 균종을 특이적이고도 민감하게 탐지 및 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

마이코박테리아(Mycobacteria) 속(屬)에는 결핵, 우형결핵, 나병과 같이 사람과 동물에 심각한 질병을 일으키는 균종 뿐만 아니라, 기회감염균으로 일컬어지는 균종, 그리고 자연환경에서 볼 수 있는 사물(死物)기생의 균종(saprophytic species) 등 여러 종류의 균종이 포함되어 있다.(참조 : Murray, P. R., E. J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R. H. Yolken. Manual of Clinical Microbiology 6th Ed. ASM Press, Washington, D. C. Frederick S. N., B. Metchock. p. 400-437(1995)).

최근에는, AIDS 환자가 전세계적으로 급속히 확산되면서, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)이나 나병균(Mycobacterium leprae) 이외의 다른 마이코박테리아 균종(nontuberculous mycobacteria 또는 Mycobacteria Other Than Tubercle bacilli : MOTT)에 의한 감염증이 증가하고 있다.(참조 : Barnes, P., A. B. Bloch, P. T. Davidson, and D. E Snider, Jr. Tuberculosis in patients with immunodeficiency virus infection. N. Engl, J. Med, 324 : 1644-1650(1991)).

한편, 마이코박테리아는 생장속도(growth rate)와 집락(colony)의 착색(pigmentation) 여부에 따라 크게 4가지 그룹으로 분류되어 왔으며(참조 : Runyon, E. H.. Identification of mycobacterial pathogens utilizing colony characteristics. Am. J. Clin. Pathol. 54 : 578-586(1970)), 수치분류학적 분석(numerical taxonomic analysis)(참조 : Sneath, P. H. A., and R. R. Sokal. Nunerical taxonomy. W. H. Freeman & Co., San Francisco(1973)), 면역학적 방법(참조 : Wayne L. G., R. C. Good, A. Tsang, R. Buttler, D. Dawson, D. Groothuis, W. Gross, J. Hawkins, J. Kilburn, M. Kubin, K. H. Schroder, V. A. Silcox, M.-F. Thorel, C. Woodley, and M. A. Yakrus. Serovar determination and molecular taxonomic correlation in Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, and Mycobacterium scrofulaceum : a cooperative study of the international working group on mycobacterial taxonomy. Int. J. Syst. Bacteriol. 43(3) : 482-489(1993)), 세포벽 구성성분의 비교, DNA-DNA 동질성 비교 및 제한효소(restriction endonuclease) 사용에 의한 분석(참조 : Telenti A., F. Marchesi, M. Balz, F. Bally, E. C. Botter, and T. Bodmer. Rapid identification of Mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J. clin. Microbiol. 31(2) : 175-178(1993))등으로 균종 간의 분류를 보다 확실히 규정하고자 하는 노력들이 있어 왔다.

이와 같은 균종 분류 방법들은 번거롭고 복잡하며 장시간이 소요된다는 등의 문제점이 있어, 최근에는 유전자를 표적으로 하는 빠르고 간편한 방법들이 점차 많이 사용되고 있다. 즉, 특정 유전자를 대상으로 속 특이적인(genus specific) 혹은 균종 특이적인(species specific) PCR 프라이머나 핵산 프로브를 이용하는 것이다.

이러한 배경하에서, 균종 감별의 근거를 제공할 수 있는 마이코박테리아의 계통분석은 16S rRNA 또는 그 DNA 염기서열의 비교를 통해 이루어져, 이것이 마이코박테리아 각 균종간의 연관성을 어느 정도 잘 표현하는 것으로 알려지고 있다.(참조 : Stahl, D. A., and J. W. Urbance. The division between fast and slow-growing species corresponds to natural relaionships among the mycobacteria. J. Bacteriol. 172 : 116-124(1990); Rogall T., T. Flohr, and E. C. Bottger. Differentiation of Mycobacterium species by direct sequencing of amplified DNA. J. Gen. Microbiol. 136(Pt9) : 1915-1920(1990a); Rogall, T., J. Wolters, T. Flohr and E. C. Bottger. Towards a phylogeny and definition of species at the molecular level within the genus Mycobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 40 : 323-330(1990b)). 그러나, 16S rRNA를 이용한 계통분석은 균종간의 경계를 명확히 구분짓지 못하는 경우가 종종 있다.(예를 들면, 저속 성장(slow-growing)의 마이코박테리아에서 나타나는 현상)는 단점을 가지고 있었다.(참조 : Fox, G. E., J. D. Wisotzkey, and P. J. Jurtshumk. How close is close : 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species indentity. Int. J. Syst. Bacteriol. 42 : 166-170(1992)).

이에, 그 대체 물질(molecule)로서 스트레스 단백질을 암호화하는 유전자인 dnaJ 유전자기 제시되기도 하였으나(참조 : Takewaki, S., K. Okuzumi, H. Ishiko, K. Nakahara, A. Ohkubo, and R. Nagai. Genus-specific polymerase chain reaction for the mycobacterial dnaj gene and species-specific oligonucleotide probes. J. Clin. Microbiol. 31 : 446-450(1993); Takewaki S., K. Okuzumi, I. Manabe, M. Tanimura, K. Miyamura, K. Nakahara, Y. Yazaki, A. Ohkubo, and R. Nagai. Nucleotide sequence comparison of the mycobacterial dnaJ gene and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacterial species. Int. J. Syst. Bacteriol. 44 : 159-166(1994)),급속 성장(rapid-growing)의 마이코박테리아 균종을 구분하기에는 적합하지 못한 몇가지 문제점이 발견되었다.

상술한 16S rRNA 유전자를 표적으로 하는 핵산 프로브들은 그나마 5가지의 마이코박테리아 균종(M. tuberculosis, M. bovis, MAC, M. kansasii, M. gordonae)에 대해서는 정확한 분류기준이 되고 있어, 현재 전기 핵산 프로브들이 상품화(AccuProbe; Gen-Probe, San Diego, California, USA)되어 있다(참조 : Frederick S. Nolte and Beverly Metchock, Ch. 31. Mycobacterium in Manual of clinical Microbiology, 400-437(1995)).

IS6110 삽입유전자(insertion dlement)도 TB complex(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis)에서 다수의 복제수(copy)로 존재하여 이를 표적으로한 PCR탐지법이 사용되고 있으나, 이 삽입유전자를 갖지 않는 결핵균이 보고되어 위음성의 결과가 나타날 수 있는 것으로 알려져 있다.(참조 : Yuen L. K., B. C. Ross, K. M. Jackson and B. Dwyer. Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains from Vietnamese patients by Southern blot hybridization. J. Clin. Microbiol. 31 : 1615-1618(1993)). 전기 유전자를 증폭시키는 프라이머는 현재 국내에서도 상품화되어 있다(TB-CR, TB Detection kit, (주)바이오니아, 대한민국).

그러나, 이들은 매우 한정적인 균종에만 국한된 것으로 마이코박테리아균의 존재를 탐지하는 것 뿐만 아니라, 균 동정에도 큰 도움이 되질 못하고 있는 실정이다.

다양하지 못하나마 전술한 5종의 프로브를 사용하며, 인체에 질환을 일으키는 대표적인 마이코박테리아 균종들에 대한 동정을 할 수 있으나, 이들 프로브들이 최근 새롭게 분리·동정되는 균종들과 교차-혼성화(cross-hybridization)되는 문제점을 노출시키고 있다.(참조 : Buttler W. R., S. P. O'connor, M. A. Yakrus, and W. M. Gross. Cross-reactivity of genetic probe for detection of Mycobacterium tuberculosis with newly described species Mycobacterium celatum. J. Clin. Microbiol. 32(2) : 536-538(1994)).

또한, 결핵균을 제외한 MOTT들에 의한 감염예가 증가하고, MOTT중 MAIS complex(Mycobacterium avium-intracellulare-scrofulaceum complex)가 인체감염을 가장 흔히 일으킨다는 것 그리고 이전에는 알려지지 않았던 새로운 균종에 의한 감염증이 계속 나타나, 이들의 예방과 치료에 우선적으로 요구되는 질환 유발의 균종을 정확히 규명하는 일이 필요하였고, 이를 위해 각 균종에 특이적인 유전자상의 차이를 나타내는 새로운 핵산 프로브가 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 하기와 같은 보고들에 착안하고, RNA 중합효소 β서브유닛을 암호화하는 rpoB 유전자가 계통분석의 기준으로서 유용한지를 검토하고자 하였다.

전술한 계통분석의 기준들 이외에, RNA 중합효소 16S rRNA 유전자를 대체할 수 있는 또 다른 기준으로 사용되었던 예가 있다. RNA 중합효소의 서브유닛에는 rpoA, rpoB, rpoC, rpoD가 있으며, 이들은 원핵생물(procaryotes) 사이에서 잘 보존되고 있는 것으로 알려져 있다(참조 : Lill, U. I., E. M. Behrendt, and G. R. Hartmann, Eur. J. Biochem. 52 : 411-420(1975)).

이중 rpoB는 RNA 중합효소 β 서브유닛을 암호화하는 유전자로서, 대장균(Escherichia coli)(참조 : Jin, D., and C. A. Gross. Mapping and sequencing of mutations in the Esherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. J. Mol. Biol. 202 : 45-58(1988)), 결핵균(참조 : Telenti, A., P. Imboden, F. Marchesi, D. Lowrie, S. Cole, M. J. Colston, L. Matter, K. Schopfer, and T. Bodmer. Detection of rifampin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet 341 : 647-650(1993)), 나병균(참조 : Honore, N. T., Bergh, S., Chanteau, S., Doucet-Populaire, F., Eiglmeier, K., Garnier, T., Georges, C., Launois, P., Limpaiboon, T., Newton, S., Niang, K, Del Portillo, P., Ramesh, G. R., Reddi, P., Ridel P. R., Sittisombut, N., Wu-Hunter, S. and Cole, S. T.. Nucleotide sequence of the first cosmid from the Mycobacterium leprae genome project : structure and function of the Rif-Str regions. Mol. Microbiol. 7(2) : 207-214(1993)) 및 치구균(M. smegmatis)(참조 : Levin, M. E., Hatfull, G. F.. Mycobacterium smegmatis RNA polymerase : DNA supercoiling, action of rifampin and mechanism of rifampin resistance. Mol. Microbiol. 8(2) : 277-285(1993))의 리팜핀 내성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 아울러, 결핵균이외의 일부 마이코박테리아 간에 rpoB 유전자 부위의 염기서열이 아주 잘 보존되고 있는 것으로 알려져 있다(참조 : Hunt, J. M., G. D. Roberts, L. Stockman, T. A. Felmiee, and D. H. Persing. Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 18 : 219-272(1994); Whelen, A. C., T. A. Felmlee, J. M. Hunt, D. L. Williams, G. D. Roberts, L. Stockman, and D. H. Persing. Direct genotypic detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance in clinical specimens by using single-tube heminested PCR. J. Clin. Microbiol. 33 : 556-561(1995)). 또한, rpoB 유전자는 Archaebacteria(참조 : Puhler, G., H. Leffers, F. Gropp, P. Palm, H. P. Klenk, F. Lottspeich, R. A. Garrett, and W. Zillig. Archaebacterial DNA-dependent RNA polymerases testify to the evolution of the eukaryotic nuclear genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 : 4569-4573(1989); Iwabe N., K. Kuma, H. Kishino, M. Hasegawa, and Miyata. Evolution of RNA polymerases and branching patterns of the three major groups of Archaebacteria. J. Mol. Evol. 32 : 70-78(1991); Klenk, H. P., and W. Zillg. DNA-dependent RNA polymerase subunit B as a tool for phylogenetic reconstructions : branching topology of the archaeal domain. J. Mol. Evol. 38 : 420-432(1994); Zillig, W., H. P. Klenk, P. Palm, G. Puhler, F. Gropp, R. A. Garrett, and H. Leffers. The phylogenetic relations of DNA-dependent RNA polymerases of archaebacteria, eukayrotes, and eubacteria. Can. J. Microbiol. 35 : 73-80(1989)), Staphylococcus aureus와 다른 Eubacteria(참조 : Rowland G. C., M. Aboshkiwa, and G. Coleman. Comparative sequence analysis and predicted phylogeny of the DNA-dependent RNA polymerase beta subunits of Staphylococcus aureus and other eubacteria. Biochem. Soc. Trans. 21 : 40S(1993)) 및 말라리아(참조 : Gardner, M. J., N. Goldman, P. Barnett, P. W. Moore, K. Rangachari, M. Strath, A. Whyte, D. H. Williamson and R. J. Wilson. Phylogenetic analysis of the rpoB gene from the plastid-like DNA of Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitor. 66 : 221-231(1994))등의 계통 확립에 사용되고 있다.

본 발명자들은 마이코박테리아 계통분석의 기준으로서의 rpoB 유전자의 유용성을 알아보고자 하였다. 즉, rpoB 유전자의 일부 분절(342bp; 대장균에서의 아미노산 서열 447∼561에 해당)을 28종의 마이코박테리아로부터 증폭시켜, 양쪽 프라이머 위치를 제외한 부위(306bp)의 염기서열을 결정하고, 계통도(phylogenetic tree)를 작성한 결과, 전기 rpoB DNA 분절의 염기서열이 마이코박테리움 각 균종을 정확히 구분할 수 있음을 확인하였다. 또한, 각 종의 rpoB DNA 분절에서 특정 제한효소로 절단되는 위치(species-specific restriction site)를 찾아, 해당 균종에 대한 특이 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 이은 제한효소 절단과 전기영동의 절차만으로(PCR-RFLP), 1일 안에 마이코박테리움의 각 균종 특히, MOTT중 인체감염을 가장 흔히 일으키는 MAIS complex를 구성하는 3가지 균종을 정확히 구별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 마이코박테리아 속(屬) 균종의 rpoB 유전자 분절(342bp)을 특이적으로 증폭시키는 PCR 프라이머쌍을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 rpoB 유전자 분절의 각 마이코박테리아 균종 특이적인 염기서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 전기에서 증폭된 rpoB 유전자 분절의 특징적인 염기서열에 의하여, 또는 증폭된 rpoB 유전자 분절 내에 존재하는 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP 분석으로, 마이코박테리아 각 균종을 특이적이고 민감, 간단하게 탐지 또는 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

제1도는 마이코박테리아 속(屬)에 특이적인 프라이머쌍을 사용하여 각 균종의 rpoB 유전자 분절(342bp)을 증폭한 후, 3% 아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

제2도는 증폭된 rpoB 유전자 분절(306bp)의 염기서열을 나타낸다.

제3도는 28종 마이코박테리아 rpoB 유전자 분절(306bp)의 염기서열 동질성을 나타내는 그림이다.

제4도는 28종 마이코박테리아 rpoB 유전자 분절(306bp)의 염기서열을 토대로 구성한 마이코박테리아의 계통도를 나타낸다.

제5a도 및 5b도는 증폭된 rpoB DNA 분절(342bp)을 Hind-II로 절단하고 3%아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

제6도는 증폭된 rpoB DNA 분절(342bp)을 Mva-I으로 절단하고 3% 아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

제7a도는 환자에서 분리되어 생화학적 동정을 거친 마이코박테리아 균종을 대상으로 증폭된 rpoB 유전자 분절(342bp)을 3% 아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

제7b도는 제7a도의 증폭 rpoB 유전자 분절(342bp)을 Hind-II로 절단하고 3% 아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

제7c도는 제7a도의 증폭 rpoB 유전자 분절(342bp)을 Mva-I으로 절단하고 3% 아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

제8도는 마이코박테리아 속(屬)에 특이적인 프라이머쌍과 제한효소(Hind-II, Mva-I)를 사용하는 PCR-RFLP 분석으로 인체 감염증을 유발하는 중요 마이코박테리아 균종의 동정과정을 나타내는 요약도이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 본 발명의 발명자들은 마이코박테리아 속의 균종 rpoB DNA만을 특이적으로 증폭시키고 다른 세균의 rpoB DNA는 증폭시키지 않는 특정 프라이머쌍(5'-CGACCACTTCGGCAACCG-3'; 5'-TCGATCGGGCACATCCGG-3')을 고안하여, 결핵균을 포함한 28종 마이코박테리아의 rpoB 유전자 분절(342bp)을 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)으로 증폭하였다. 이어, 프라이머 부분을 제외한 rpoB DNA 분절(306bp)의 염기서열을 분석한 결과, 다른 일반세균(non-mycobacteria)에서는 볼 수 없는, 각 마이코박테리아 균종의 특징적인 염기서열이 있음을 확인하였다.

이 염기서열을 바탕으로 구성한 계통도는 종래의 마이코박테리아 균종분류의 모호한 구분점을 명확히 보여줌으로서, rpoB 유전자 분절(342bp)의 염기서열 결정이 균 동정에 사용될 수 있음을 확인하였다.

한편, 증폭된 rpoB DNA(342bp)내의 제한효소 절단부위 중 Hind-II(또는 동일 염기서열을 인지하는 Hinc II)와 Mva-I(또는 동일 염기서열을 인지하는 EcoR II)의 절단부위를 이용하는 RFLP 분석으로 마이코박테리아 각 균종의 동정이 가능하였다. 이 rpoB 유전자를 표적으로 하는 PCR-RFLP 방법은 지금까지 시도된 바 없으며, 마이코박테리아의 TB complex(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG)와 MOTT의 구별이 다음과 같은 기준에 의해 가능하였다 : 제한효소 Hind-II 혹은 Hinc II에 의해 절단되어 2가지 밴드(110bp, 232bp)로 나타나는 마이코박테리아 균종은 TB complex이고, 제한효소 Hind-II 혹은 Hinc II에 의해 절단되지 않는 마이코박테리아 균종은 MOTT이다. 가장 중요한 점은 결핵균, 우형결핵균과 같이 편성 병원체(strict pathogen)인 TB complex(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis)와 MOTT 감염증 가운데 가장 흔한 원인균인 MAI complex(Mycobacterium avium-intracellulare), 그리고 M. scrofulaceum, M. kansasii, M. fortuitum 등을 다음과 같은 기준에 의해 간단히 감별할 수 있었다 : 제한효소 Mva-I에 의해 절단되어 48bp 및 294bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. intracellulare, 68bp 및 274bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. gastri, 105bp 및 237bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. avium 또는 M. fortuitum; 제한효소 EcoR II에 의해 절단되어 50bp 및 292bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. intracellulare, 66bp 및 276bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. gastri, 103bp 및 239bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. avium 또는 M. fortuitum; 제한효소 Mva-I 혹은 EcoR II에 의해 절단되지 않는 MOTT 균종은 M. kansasii, M. scrofulaceum 또는 M. gordonae이다.

또한, M. terrae complex(M. terrae, M. triviale, M. nonchromogenicum)는 다음과 같은 기준에 의해 구별될 수 있었다; 제한효소 Mva-I에 의해 절단되어 105bp 및 237bp의 2가지 밴드로 나타나는 균종은 M. terrae 또는 M. triviale, 48bp, 105bp 및 189bp의 3가지 밴드로 나타나는 균종은 M. nonchromogenicum; 제한효소 EcoR II에 의해 절단되어 103bp 및 239bp의 2가지 밴드로 나타나는 균종은 M. terrae 또는 M. triviale, 50bp, 103bp 및 189bp의 3가지 밴드로 나타나는 균종은 M. nonchromogenicum이다.

따라서, rpoB 유전자 분절을 표적으로 한 PCR-RFLP 분석법은 기존의 어떤 방법보다도 간단하면서 특이적이고 민감한 마이코박테리아 균종의 탐지 또는 동정 방법임을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1 : 각 균종으로부터의 DNA 분리]

초자구를 이용하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 BB/P(bead-beater/phenol)법을 사용하였다. 즉, 균을 TEN 완충용액(Tris-HCI 10 mM, EDTA 1mM, NaCl 100 mM)에 부유시키고, 그 부유액 100㎕에 초자구(직경 0.1mm,유리구슬 11079-110; Biospec Products, USA)를 100㎕ 넣은 다음, PCI액(phenol : chloroform : isopropyl alcohol = 50 : 49 : 1(v/v/v)) 150㎕를 가하여 Mini beater(74005-0722; Biospec Products, USA)로 1분간 5000rpm에서 진탕하였다. 균체 파쇄 후에 12000rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 수득하고, 그 상층액에 10㎕의 3M 아세트산나트륨 및 250㎕의 에탄올을 가한 다음, -20℃에 10분간 방치하여 DNA 침전물을 수득하였다.

이렇게 수득한 DNA는 60㎕ TE 완충용액에 용해시켜 농도측정 후, 후술하는 실시예의 염기서열 분석과 PCR-RFLP 분석을 위한 주형(template) DNA로 사용하였다.

상기에서, 게놈 DNA의 추출에 사용된 균은 하기 표 1에 나타낸 28종의 마이코박테리아 균종이며, 이들은 대한결핵협회 결핵연구원에서 분양받거나 직접 미국의 ATCC에서 입수되었다. 계통도 작성의 대조군은 계통상 마이코박테리아와 가까운 것으로 알려진 Corynebacterium diphtheriae, Nocardia nova, Rhodococcus erythropolis의 3가지 비마이코박테리아(non-mycobacteria)을 사용하였으며(참조 : 표 1), PCR용의 일반세균은 디프테리아균, 포도상구균, 고초균, 대장균을 사용하였다.

[표 1]

[실시예 2 : rpoB 유전자 분절의 PCR 증폭]

마이코박테리아 간에 rpoB 유전자 부위의 염기서열이 아주 잘 보존되고 있다는 보고에 근거하여, 일반세균의 rpoB 유전자의 증폭없이, 마이코박테리아 속의 모든 균종의 rpoB 유전자만을 증폭시키기 위한 다음과 같은 PCR 프라이머쌍을 고안하였다 :

그런 다음, 실시예 1에서 분리한 각 균종의 게놈 DNA 50ng, 상기 각 프라이머 20 pmol 및 Pre-mix Top(Bioneer, 대한민국)을 혼합하고, 최종 용적이 20㎕가 되도록 증류수를 가하여 반응혼합물을 제조하고 그를 PCR하였다. 이때, PCR은 열순환기(Thermocycler Model 9600,Cetus,USA)를 이용하여 변성(denaturation)(95℃ 30초), 결합(annealing)(60℃ 30초), 연장(extension)(72℃ 45초)을 30회 진행시켰다.

상기에서 증폭된 PCR 산물을 3% 아가로스 젤에 전기영동하였다(참조 : 제1도). 제1도에서, M은 Hae-III로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제1레인 내지 제28레인은 M. tuberculosis H37Rv, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. avium, M. paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. intracellulare, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. triviale, M. gordonae, M. szulgai, M. kansasii, M. ulcerans, M. marinum, M. simiae, M. xenopi, M. haemophilum, M. gastri, M. malmoense, M. fortuitum, M. chelonae, M. smegmatis, M. phlei, M. vaccae, M. celatum, M. genavense을 각각 나타내고; C는 Corynebacterium diphtheriae, S는 Staphylococcus aureus, B는 Bacillus subtilis, E는 Escherichia coli를 각각 나타낸다.

제1도에서 보듯이, 28종의 마이코박테리아 균종 모두에서 증폭된 342bp의 rpoB DNA 분절이 관찰되었으나(1레인∼28레인), 대조군으로 사용된 호흡기에서 분리될 수 있는 일반세균(비항산성균) 즉, C. diphtheriae, S. aureus, B. subtilis, E. coil에서는 rpoB DNA 분절이 관찰되지 않음을 알 수 있었다(레인 C, S, B, E). 따라서, 상기 프라이머쌍은 마이코박테리아 속의 rpoB 유전자만을 증폭시킬 수 있음을 확인하였다.

[실시예 3 : rpoB 유전자 분절의 염기서열 결정]

실시예 2에서 증폭된 PCR산물(증폭된 DNA)은 3% 아가로스 젤에 전기영동한 후, Qiaex(Qiagen, Germany)을 이용하여 정제하였다. 이 정제된 rpoB DNA에서 양쪽 프라이머 위치를 제외한 부위(306bp)의 염기서열을 자동 염기서열 분석기(ABI, USA)로 결정하였다. 또한, 실시예 1에 개시된 3가지 대조군들도 동일한 rpoB 분절을 갖게 증폭한 후 같은 방법으로 염기서열을 결정하였다.

상기에서, 염기서열의 결정은 주형 DNA 60 ng, 속(genus) 특이적 프라이머 3.2 pmol 및 증류수를 혼합하여 총용적이 10.5㎕가 되게 하고, 5X TACS 완충용액 4㎕, dNTP 혼합물 1㎕, 반응종결용 혼합물 4㎕, Taq 중합효소 0.5㎕(5U/㎕)을 첨가하여 PCR을 수행한 다음(95℃ 15초, 50℃ 10초, 60℃ 4분; 30회), 반응이 끝난 샘플을 G50 스핀 컬럼을 이용하여 정제하고, 6.75% 아크릴 아마이드 젤에서 1X TBE 완충용액에 40와트(watt)로 12시간 전기영동하였다.

상술한 바와 같이 결정된 rpoB DNA 분절(306bp)의 염기서열은 제2도에 나타내었다. 제2도에서, Mva-I CC↓A(T)GG 및 HindII GTT(C)↓G(A)AC는 제한효소와 그 절단부위를 나타낸다. 제2도에서 보듯이, 마이코박테리아의 일반적인 특징인 높은 G+C 비율(62∼70%)이 rpoB DNA 분절(306bp)에서도 역시 높음(63∼69%)을 알 수 있었다.

제2도의 염기서열 분석결과, TB complex(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG)와 MOTT 그룹은 각각 특징적인 서열(signature sequence)을 갖는 것을 알 수 있었다. 즉, 대장균 rpoB의 번호체계에 따라 확인한 TB complex의 특징적인 염기서열은 5곳[484(gtG), 488(acA), 513(Caa), 524(Ttg), 529(cgA)]에서 나타났다. 이들은 TB complex에서만 나타나는 특이적인 것이며, 일부 다른 MOTT에서도 같이 나타나는 3곳[512(AGc), 461(caA), 529(tcA)]과 함께 TB complex와 MOTT의 분류, 동정에 사용할 만한 염기서열들이다. 한편, 각 마이코박테리아 균종에서도 서로 구분될 수 있는 특징적인 염기서열이 존재하는 것으로 확인되었다(참조 : 표 2).

[표 2]

한편, 상기에서 결정된 rpoB 염기서열의 마이코박테리아 균종간의 동질성(homology)을 계산한 결과, 예상대로 증폭된 rpoB DNA 분절은 306bp 가운데 212bp가 동일하여(69.3%) 매우 보존되어 있음을 알 수 있었다.(참조 : 제3도).

제3도에서, TUB는 M. tuberculosis H37Rv, BOV는 M. bovis, BCG는 M. bovis BCG, AFR은 M. africanum, LEP는 M. leprae, AVI는 M. avium, PAR은 M. paratuberculosis, SCR은 M. scrofulaceum, INT는 M. intracellulare, TER은 M. terrae, M. nonchromogenicum, TRI는 M. triviale, GOR은 M. gordonae, SZU는 M. szulgai, KAN은 M. kansasii, ULC는 M. ulcerans, MAR은 M. marinum, SIM은 M. simiae, XEN은 M. xenopi, HAE는 M. haemophilum, GAS는 M. gastri, MAL은 M. malmoense, PHL은 M. phlei, VAC는 M. vaccae, CEL은 M. celatum, GEN은 M. genavense, CHE는 M. chelonae, FOR는 M. fortuitum, SME는 M. smegmatis, NNOVA는 Nocardia nova, RERYT는 Rhodococcus erythropolis, CDIPH는 Corynebacterium diphtheriae, BSUBT는 Bacillus subtilis, SAURE는 Staphylococcus aureus, ECOLI는 Escherichia coli을 각각 나타낸다. M. leprae를 표기한 LEP.SEQ^*는 GENE BANK에 등록된 (Z14314) 해당 서열을 인용하였다.

또한, 제3도에서는 기존의 complex로 나누어 그룹지었던 균종끼리도 높은 유사성(similarity value)을 보이는 바, 이는 마이코박테리아 내의 rpoB 염기서열이 상당히 보존되어 있지만, 각 균종의 서로 다른 염기서열로 균종(species)구분이 가능하다는 것을 의미한다고 볼 수 있다.

[실시예 4 : 마이코박테리아의 계통도]

28종 마이코박테리아의 rpoB DNA 분절(306bp)의 염기서열; Gene Bank에 등록된 M. leprae(Z14314; LEP^*), 그람음성의 세균 E. coli(V00340; ECOLI^*), 그람양성의 간균 B. subtilis(L24376; BSUBT^*) 그리고 그람양성의 구균 S. aureus(X64172; SAURE^*)의 rpoB 염기서열; 및, C. diphtheriae, N. nova, R. erythropolis의 rpoB 염기서열을 포함시켜, MegAlign package(Windows Version 3.12e, DNASTAR, Madison, WI, USA)를 이용하여 계통도를 구성하였다(참조 : 제4도)

제4도에서 보듯이, 전반적으로 각 종의 계통상 위치는 이전에 알려진것과 큰 차이가 없으나, 몇가지 매우 특징적인 점이 있다.

첫째, TB complex가 가장 늦게 진화된 것처럼 무리지어 나타나고, 급속성장의 마이코박테리아(M. vaccae, M. phlei, M. smegmatis, M. fortuitum, M. chelonae)가 저속 성장의 마이코박테리아와는 다른 그룹으로 분리되는 것을 볼 수 있다.

둘째, MAIS complex와 최근 알려진 새로운 균종의 위치가 주목할 만한데, M. scrofulaceum을 MAIS complex에서 제외하여야 한다는 의견들(참조 : Rogall, 1990b)과는 달리, 여기서는 그 균종이 M. avium과 함께 무리를 이루고 있다. 또한, M. paratuberculosis는 이 결과로 본다면 M. avium complex로 불리워도 무방할 것이다. 매우 흥미로운 것은 M. intracellulare의 위치인데, 이 균종은 예전부터 M. avium과 아주 가까운 종으로 여겨져서 M. avium-intracellulare라고 까지 불려왔으나, 다른 영역에 M. marinum, M. ulcerans와 같이 위치하여 M. avium과는 거리가 먼 것으로 나타나고 있다.

셋째, M. terrae complex는 기존의 계통도와는 달리 무리를 이루고 있고, 사용한 마이코박테리아 균종 모두가 상술한 3가지 비마이코박테리아 균에 대하여 하나의 무리를 이루고 있다.

따라서, 이와 같은 계통상의 특징으로부터, rpoB 분절의 염기서열 변화를 이용하면 마이코박테리아 균종을 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실시예 5 : RFLP 분석을 통한 균종의 구별]

실시예 3에서 결정된 각 마이코박테리아의 rpoB 염기서열을 컴퓨터 프로그램 Genetyx(Genetyx-MAC 6.02, Genetics Computer Group, Medison, WI, USA)로 각 DNA의 제한효소 절단부위를 비교, 분석하였다. 이 결과에 따라 TB complex를 다른 MOTT들과 구별할 수 있는 효소, 그리고 MAIS complex를 구별할 수 있는 제한효소 Hind-II(또는 Hinc II)와 Mva-I(또는 EcoR II)를 찾았다. 그런 다음, 실시예 2에서 증폭된 rpoB DNA 분절(342bp)의 PCR 산물 10㎕를 다른 튜브에 옮겨 제한효소(Hind-II와 Mva-I) 처리를 하였다. 절단된 DNA 혼합물은 3% 아가로스 젤 상에서 전기영동하여 관찰하였다.

[결핵균(TB complex)과 MOTT의 구별]

TB complex(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG)를 MOTT 균종과 구분할 수 있는 것으로 제한효소 Hind-II가 있다. Hind-II가 인식하는 염기서열은 GTT(C)↓A(G)AC이며, TB complex의 rpoB 분절 DNA에서는 GGG₅₂₃TT↓G₅₂₄ACC₅₂₅로서, 이는 MOTT에서는 볼 수 없는 염기서열이다. 증폭된 TB complex의 rpoB DNA가 Hind-II에 의해 절단되어 2개의 DNA 단편(110bp, 232bp)으로 나뉘어지는 반면(참조 : 제5a도의 레인 1∼4), 같은 크기로 증폭되었더라도 MOTT의 DNA는 절단되지 않기 때문에 그대로(342bp) 남아 전기영동에 의해 쉽게 결핵균(TB complex)과 MOTT를 감별할 수 있다(참조 : 제5a도의 레인 5∼16 및 제5b도의 레인 2∼13).

제5a도에서, M은 Hae-III로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제1 내지 16레인은 M. tuberculosis H37Rv, M. bovis, M. africanum, M. bovis BCG, M. avium, M. paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. intracellulare, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. triviale, M. gordonae, M. szulgai, M. knasasii, M. ulcerans, M. marinum을 각각 나타낸다. 제5b도에서, M은 Hae-III로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제1 내지 13레인은 M. tuberculosis H37Rv, M. simiae, M. xenopi, M. haemophilum, M. gastri, M. malmoense, M. fortuitum, M. chelonae, M. smegmatis, M. phlei, M.vaccae, M. celatum, M. genavense을 각각 나타낸다.

[MAIS complex의 구별]

결핵균군(TB complex) 외에 MOTT들도 결핵과 비슷한 질환을 일으킬 수 있다. 이중 가장 흔한 것이 바로 MAIS complex(M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum)인데, 이들이 MOTT의 약 65%를 차지한다.(참조 : Gail L. W. and J. A. Washington II. Mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis : Review of microbiology and clinical aspects. Rev. Inf. Dis. 9(2) : 275-294(1987); Good R. C. and D. S. Snider, Jr. Isolation of nontuberculous mycobacteria in the united states, 1980. J. Inf. Dis. 146(6) : 829-833(1982)). 기존의 배양방법으로 이들을 분리, 동정하려면 장시간의 배양시간 외에도 혈청학적인 동정과정을 거쳐야 하는 번잡함이 따른다. 그러나, rpoB 분절을 제한효소 Mva-I로 절단하는 본 발명의 방법은 이들 종간의 구별을 간단히 해결한다.

M. paratuberculosis는 M. avium과 아주 비슷한 염기서열을 보이며, 이들 두 균종은 M. scrofulaceum, M. intracellulare와는 쉽게 구분되었다.(참조 : 제6도). Mva-I 또는 동일 염기서열 [CC↓A(T)GG]을 인지하는 EcoR II[↓CCA(T)GG]을 사용하면 이들 균종을 쉽게 구분할 수 있었다.

제6도에서, M은 Hae-III로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커;제1 내지 16레인은 M. tuberculosis H37Rv, M. avium, M. fortuitum, M. terrae, M. triviale, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. chelonae, M. gordonae, M. gastri, M. nonchromogenicum, M. phlei, M. smegmatis, M. ulcerans, 절단되지 않은 M. tuberculosis H37Rv를 각각 나타낸다.

제6도에서 보듯이, M. avium와 M. paratuberculosis의 경우, Mva-I 절단부위가 1곳에 있어(ACC₄₈₁C↓AG₄₈₂GAC₄₈₂) 2개의 DNA 단편(105bp, 237bp)이 생기지만, M. intracellulare에서는 Mva-I 절단부위가 다른 곳이라서(GGC₅₄₄C↓TG₅₄₅GAG₅₄₆) 크기가 다른 2개의 DNA 단편(48bp, 294bp)이 나타났다. 반면, M. scrofulaceum의 rpoB DNA는 Mva-I 절단부위가 없어 절단되지 않은 342bp 크기로서 나타났다.

M. paratuberculosis와 M. avium의 rpoB 분절 염기서열은 매우 비슷하지만, 이들은 2종류의 제한효소로서 구분이 가능하다. 하나는 Pvu-II 제한효소인데, 이 효소는 M. avium의 rpoB DNA 중에서 [CAG₅₁₀↓CTG₅₁₁]서열을 절단하나, M. paratuberculosis의 rpoB DNA는 Pvu-II 절단부위가 없어 절단되지 않은채 그대로 있다. 아울러, M. paratuberculosis에 의한 균 감염이 흔하지 않다는 사실을 감안할 때, 일단 일차로 사용하는 Mva-I의 결과에서 M. avium과 같은 RFLP 양상을 나타내면, M. avium이라고 간주하여도 될 것이다. 한편 M. paratuberculosis와 M. avium의 rpoB 분절에서 염기서열이 상호 상이한 부분이 3군데 있기는 하나 특정 제한효소에 의해 절단되는 위치가 아니기 때문에, 이들을 구별하려면 이곳의 염기서열을 비교하는 수밖에 없을 것이다.

[Terrae complex의 구별]

인체 질환과는 큰 관련이 없으나 주변환경에 널리 분포하는 것으로 알려진 M. terrae complex(M. terrae, M. triviale, M. nonchromogenicum) 중에서, M. terrae와 M. triviale는 M. avium과 같이 Mva-I 절단부위를 1군데 [ACC₄₈₁C↓AG₄₈₂GAC₄₈₃]갖기 때문에 DNA가 2가지 DNA 단편(105bp, 237bp)으로 절단되나(참조 : 제6도의 4 및 5레인), M. nonchromogenicum는 2군데 [ACC₄₈₁C↓AG₄₈₂GAC₄₈₃, GGC₅₅₄C↓TG₅₅₅GAA₅₅₆] 갖기 때문에 DNA가 3가지 DNA 단편(48bp, 105bp, 189bp)으로 절단된다(참조 : 제6도의 12레인).

[결핵균(TB complex)과 Nocardia, Rhodococcus의 구별]

마이코박테리아와 아주 가까운 것으로 알려진 3종류의 균, Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium에 대하여 해당 유전자 rpoB를 증폭시켜 본 결과, Nocardia와 Rhodococcus에서는 증폭이 되었으나 Corynebacterium에서는 증폭되지 않았다. 역시 이들의 염기서열을 결정하여 제한효소 절단부위를 비교 분석한 결과, 마이코박테리아 균종 중에서 TB complex만 갖는 Hind II 절단부위를 갖고 있지 않았으므로, 이들은 쉽게 결핵균과 감별될 수 있음을 알 수 있었다(참조 : 제2도)

[실시예 6 : 국내 환자에서 분리된 마이코박테리아 균종(야생형)의 동정

rpoB DNA 분절을 표적으로 하는 PCR-RFLP 분석법이 야생형(wild type), 즉 환자에서 분리되는 균들에도 정확하게 적용될 수 있는가를 알아보고자, 국내 환자에서 분리되어 생화학적 동정을 거쳐 확인된 마이코박테리아 16균종에 대하여 시험하여 보았다. M. tuberculosis 2주와 MOTT 14주(M. avium-intracellulare 6주, M. terrae complex 2주, M. gordonae 2주, M. fortuitum 2주, M. chelonae 2주)를 대상으로, 실시예2에서 개시된 프라이머쌍을 사용하여 rpoB DNA(342bp)를 증폭하고(참조 : 제7a도), Hind-II, Mva-I 제한효소로 절단하여 3% 아가로스 젤 전기영동하였다.(참조 : 제7b도 및 7c도).

제7a도∼제7c도에서, M은 Hae-III로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커, TB는 M. tuberculosis, MAI는 M. avium-intracellulare, Fort는 M. fortuitum, Che는 M. chelonae, Gor는 M. gordonae, TRC는 M. terrae complex를 각각 나타낸다.

제7b도 및 제7c도에서 보듯이, 결핵균(M. tuberculosis)은 예상대로 Hind-II에 의하여 절단되어 2가지 밴드(110bp, 232bp)로 나타나고(참조 : 제7b도의 1∼2레인), 나머지 MOTT들은 절단되지 않은 상태로 나타남을 알 수 있었고(참조 : 제7b도의 3∼16레인); MAI complex 6균주를 Mva-I 으로 절단한 결과, M. avium은 2균주(참조 : 제7c도의 4 및 8레인)뿐이고, 나머지는 모두 M. intracellulare 균주(참조 : 제7c도의 3레인과 5∼7레인)임을 알 수 있었으며; M. terrae complex 2균주를 Mva-I으로 절단한 결과, 모든 균주는 3밴드로 나타나는 M. nonchromogenicum임을 알 수 있었고(참조 : 제7c도의 15 및 16레인); M. fortuitum(참조 : 제7c도의 9 및 10레인), M. chelonae(참조 : 제7c도의 11 및 12레인), M. gordonae(참조 : 제7c도의 13 및 14레인) 역시 prototype 균주들에서와 같은 양상을 보이고 있음을 알 수 있었다.

따라서, rpoB 유전자를 표적으로 한 PCR-RFLP 분석법은 야생형의 마이코박테리아에 사용할 수 있음을 확인하였다.

이상과 같은 결과들을 토대로 인체에 질환을 일으키는 중요한 마이코박테리아 균종 즉, TB complex에 속하는 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum과 MOTT 감염중 가장 흔한(65%) MAI complex에 속하는 M. avium, M. intracellulare, 그리고 M. kansasii(3.4%), M. scrofulaceum(2.3%)의 rpoB 유전자 분절을 이용한 균종 감별법을 요약하여 제8도에 나타내었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명에서는 표적 DNA로서 rpoB 유전자를 이용하여 TB complex 뿐만 아니라, 최근 급증하고 있는 MOTT를 한꺼번에 증폭시켜 탐지할 수 있는 마이코박테리아 특이 PCR 프라이머를 개발하였으며, 또한 본 발명에서 가장 주목할 만한 점은 전기 프라이머를 사용하여 증폭된 rpoB DNA를 Hind-II(또는 Hinc II)로 절단하여 TB complex와 MOTT를 구별하고, MOTT인 경우에는 다시 Mva-I(또는 EcoRII)로 절단함으로서 MOTT중 인체감염을 가장 흔히 일으키는 MAIS complex를 간단하게 M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum으로 동정할 수 있었다는 것이다. 따라서, rpoB 유전자 분절을 표적으로 한 PCR-RFLP 분석법은 기존의 어떤 방법보다도 간편하며 특이적이고 민감한 마이코박테리아 균종의 탐지 및 동정 방법이라 할 수 있을 것이다.

Claims

마이코박테리아 속(屬) 균종의 rpoB 유전자 분절(342bp)을 특이적으로 증폭시키는 하기와 같은 염기서열을 갖는 프라이머쌍 :
제1항의 프라이머쌍을 이용하여 마이코박테리아 균종의 rpoB 유전자 분절(342bp)을 PCR 증폭시킨 다음, 그 DNA 단편내에 존재하는 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP 분석으로, 마이코박테리아 균종을 탐지 및 동정하는 방법.
제2항에 있어서, 제한효소 Hind-II 혹은 HincII의 처리 후 다음과 같은 기준에 의해 TB complex(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG)와 MOTT를 구별하는 것을 특징으로 하는 방법 : 제한효소 Hind-II 혹은 HincII에 의해 절단되어 2가지 밴드(110bp,232bp)로 나타나는 마이코박테리아 균종은 TB complex이고, 제한효소 Hind-II 혹은 HincII에 의해 절단되지 않는 마이코박테리아 균종은 MOTT이다.
제2항에 있어서, 제한효소 Mva-I 혹은 EcoRII의 처리후 다음과 같은 기준에 의해 MOTT에 속하는 균종을 구별하는 것을 특징으로 하는 방법 : 제한효소 Mva-I에 의해 절단되어 48bp 및 294bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. intracellulare, 68bp 및 274bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. gastri, 105bp, 및 237bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. avium 또는 M. fortuitum; 제한효소 EcoRII에 의해 절단되어 50bp 및 292bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. intracellulare, 66bp 및 276bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. gastri, 103bp 및 239bp의 2가지 밴드로 나타나는 MOTT 균종은 M. avium 또는 M. fortuitum; 제한효소 Mva-I 혹은 EcoRII에 의해 절단되지 않은 MOTT 균종은 M. knasasii, M. scrofulaceum 또는 M. gordonae이다.
제2항에 있어서, 제한효소 Mva-I 혹은 EcoRII의 처리후 다음과 같은 기준에 의해 M. terrae complex(M. terrae, M. triviale, M. nonchromogenicum)에 속하는 균종을 구별하는 것을 특징으로 하는 방법 : 제한효소 Mva-I에 의해 절단되어 105bp 및 237bp의 2가지 밴드로 나타나는 균종은 M. terrae 또는 M. triviale, 48bp, 105bp 및 189bp의 3가지 밴드로 나타나는 균종은 M. nonchromogenicum; 제한효소 EcoRII에 의해 절단되어 103bp 및 239bp의 2가지 밴드로 나타나는 균종은 M. terrae 또는 M. triviale, 50bp, 103bp 및 189bp의 3가지 밴드로 나타나는 균종은 M. nonchromogenicum이다.
제1항의 프라이머쌍을 이용하여 마이코박테리아 균종의 rpoB 유전자 분절 342bp를 PCR 증폭시키고, 양쪽 프라이머 위치를 제외한 306bp DNA 단편의 염기서열을 결정한 다음, 제2도에 나타낸 염기서열에 의하여 마이코박테리아 균종을 탐지 및 동정하는 방법.
Mycobacterium africanum 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium bovis 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium bovis BCG 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium haemophilum 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium avium 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium paratuberculosis 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium intracellulare 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium scrofulaceum 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium kansasii 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium gastri 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium gordonae 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium malmoense 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium xenopi 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium terrae 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium nonchromogenicum 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium triviale 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium marinum 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium ulcerans 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium szulgai 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium celatum 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium genavense 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium simiae 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium fortuitum 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium chelonae 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium phlei 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :
Mycobacterium vaccae 균종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭된 다음과 같은 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절 :