KR20090100460A - 루프-매개 등온 증폭법(ｌａｍｐ)에 유용한 안정적인 시약 및 키트 - Google Patents

루프-매개 등온 증폭법(ｌａｍｐ)에 유용한 안정적인 시약 및 키트 Download PDF

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KR20090100460A
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메리디안 바이오사이언스 인크.
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Abstract

단일의 건식 포맷으로 적어도 하나의 폴리머라제 효소, 표적-특이 프라이머 세트, 및 디뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)를 포함하는, 핵산의 루프-매개 등온 증폭을 위한 시약 제제로서, 여기서, 상기 시약 제제는 수용성이고, 4℃ 초과에서 안정적인 것인 시약 제제를 본원에서 제공한다.
루프-매개 등온 증폭법, 시약 제제, 키트

Description

루프-매개 등온 증폭법(ＬＡＭＰ)에 유용한 안정적인 시약 및 키트{STABLE REAGENTS AND KITS USEFUL IN LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION(LAMP)}
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2007년 1월 17일자로 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제60/880,988호 (그의 전문이 본원에 의해 참고로 인용된다)에 대한 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 핵산 증폭에 유용한 생물학적 물질 및 시약을 장기간 저장하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 핵산의 루프-매개 등온 증폭법(LAMP)에 필요한 생물학적 시약의 건식 조성물 및 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
현장 현시 의료(point-of-care) 진단 장치를 통해 의사들은 환자를 효과적으로 간호하는데 있어서 중요한 정보를 신속하게, 그리고 저렴한 비용으로 얻을 수 있다. 감염성 질환을 진단하는 경우, 유전자 증폭 장치를 통해 이론상으로는 병원체 배양 및/또는 크기가 큰 대규모 생물학적 샘플을 필요로 하지 않으면서 신속하게 고감도로 확인할 수 있다. 또한, 고속의 특정 유전자 증폭 장치를 통해서는 치료학적 요법을 개별적으로 맞춤화시키는 것을 용이하게 해주는 특정 대립유전자 또 는 기타 유전적 위험 인자를 검출할 수 있다. 유전자 증폭 방법으로는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭법(SDA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 및 전사 매개 증폭법(TCA)을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,683,195호; 제4,629,689호; 제5,427,930호; 제5,339,491호; 및 제5,409,818호를 참조한다. 그러나, 이러한 기술은 상기와 같은 증폭을 위해 다양한 안정성을 갖는 다중 시약의 갯수 뿐만 아니라, 값비싼 장비에 대한 의존으로 인하여 제한을 받는다.
루프-매개 등온 증폭법(LAMP)은 신속하게 그리고 특이적으로 DNA를 증폭시킴과 동시에 (열순환을 배제시키고, 기기에 기초한 결과 검출을 필요치 않게 하여) 값비싼 장비에 대한 의존성을 극복한다. 문헌 ([Notomi et al., Nucl . Acids Res . 28:E63 (2000)]; 미국 특허 번호 제6,410,2778호). 일례로, 상기 방법에서는 간단하게 표적 유전자, 4개 또는 6개의 다른 프라이머, Bst DNA 폴리머라제, 및 기질을 혼합한 혼합물을 인큐베이션시켜 등온 조건하에 (60 내지 65℃) 고도로 특이적으로 증폭시킨다. 이어서, 반응 튜브에 보관되어 있는 반응 혼합물의 혼탁도 또는 형광성을 시각적으로 평가함으로써 표적 DNA의 존재 여부를 측정한다. 문헌 [Mori et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 289:150-54 (2001)]. 소량의 DNA를 신속하고, 효율적으로, 그리고 특이적으로 증폭시킬 수 있다는 장점 때문에 LAMP가 임상 연구실에서 바이러스성 및 세균성 감염 질환의 신속한 진단을 위한 유전적 시험을 촉진시키는 강력한 도구로서 부상하였다.
그러나, 진료소에서 LAMP의 유용성은 개별 시약들이 -20℃ 이하에서 글리세롤에 저장된 효소와 함께 다중 튜브 포맷으로 수송되고 저장되어야 하는 바, 여전 히 제한을 받고 있다. LAMP 증폭법의 감응성, 특이성, 및 효능을 충분히 누리기 위해서는 유실(stray) 핵산 또는 DNAse/RNAse 오염없이 상기 시약들이 취급되고 재조합되어야 한다. 전형적으로, LAMP 방법에서 제1 단계는 시약이 있는 다중 튜브를 해동시키고, 마스터 믹스를 제조하는 것이다. 마스터 믹스 제조를 위해서는 마스터 믹스를 얼음 상에서 보관하면서 상기 시약들을 반응 믹스 튜브 및 프라이머 믹스 튜브에서 조합해야 할 뿐만 아니라, 물을 가해야 한다. 이어서, 마스터 믹스를 95℃에서 5분 동안 가열한 후에 다시 얼음 상에서 보관한다. 이어서, 튜브를 다시 열고, 필요하다면, 폴리머라제 효소, 및 리버스 트랜스크립타제 효소를 첨가한다. 이어서, 마스터 믹스를 샘플과 함께 샘플 튜브에 첨가한다. 튜브를 닫고, 약 65℃에 놓고 LAMP 반응이 일어나도록 한다. 도해를 위해서는 도 1을 참조한다.
LAMP 반응 준비 절차에 필요한 다중 단계로 인하여 임상 실험실 설정하에서 그의 용인은 감소하게 될 것이다. 임상 실험실 설정하에서의 편리함은 특히 배치식 또는 다중 샘플을 시험할 경우에 중요한 인자가 된다. 절차가 장황하면 오류 발생이 증가할 수 있다.
다중 단계 이외에도, -20℃에서 저장하는 것은 사용 이전에 제품을 해동시켜야 하기 때문에 시험 실시를 더욱 어렵게 한다. 추가로, 냉동 장치에 대한 공간이 필요하기 때문에 -20℃에서 저장해야 한다는 요건은 실험실에 부담이 된다.
발명의 요약
본원에 개시된 시약 제제를 통해 LAMP 방법은 사실상 어느 임상 설정하에서나 접근가능하며 적당하다. 건식 포맷의 시약 제제는 편리함을 증진시키고, 사용의 오류를 배제시키고, 실온에서 시약을 안정하게 한다. 건식 포맷으로, 불안정한 시약을 단일 용기에서 함께 혼합한 후, 건조시킨다. 각 용기에는 단일 반응을 실시하는데 충분한 정도의 시약이 담겨져 있다. 따라서, 사용자가 간단하게 재구성 완충액과 샘플을 첨가하면 LAMP 방법을 위한 모든 성분들이 존재하게 되는 것이다. 다양한 조합 및 해동 단계를 소거시킴으로써 잘못된 취급이나 오염을 통해 사용자가 범하게 될 오류의 가능성은 감소하게 된다. 게다가, 건식 포맷으로 LAMP 성분은 수송 및 저장시 냉동되어야 할 필요 없이 4℃ 초과에서 저장될 경우에도 안정적이다.
더욱 특히, 하나의 측면에서는 단일의 건식 포맷으로 가닥 치환을 할 수 있는 적어도 하나의 폴리머라제 효소, 표적-특이 프라이머 세트, 및 디뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)를 포함하는, 핵산의 루프-매개 등온 증폭을 위한 시약 제제를 본원에서 제공하며, 여기서 상기 시약 제제는 수용성이고, 4℃ 초과에서 안정적인 것이다. 몇몇 실시태양에서, 폴리머라제 효소는 Bst 효소이다. 표적이 RNA일 경우, 시약 제제는 또한 리버스 트랜스크립타제 효소를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 리버스 트랜스크립타제는 AMV 리버스 트랜스크립타제이다.
추가로, 개시된 건식 포맷으로 시약 제제를 포함하는 키트를 본원에서 제공한다. 키트는 수성의 완충처리된 용액을 포함하는 추가적인 별도의 습식 포맷을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 완충처리된 용액은 25 mM 트리스-HCl (pH 8.8), 12.5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 12.5 mM (NH4)2SO4, 및 0.125％ 트윈 20이다.
또다른 측면에서, (a) (1) 가닥 치환을 할 수 있는 적어도 하나의 폴리머라제 효소, (2) 표적-특이 프라이머 세트, (3) 디뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)로 이루어지며, 글리세롤을 함유하지 않는 완충처리된 수용액을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 용액을 건조시켜 시약 제제를 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 시약 제제는 수용성이고 4℃ 초과에서 안정적인 것인, 핵산의 루프-매개 등온 증폭을 위한 시약 제제를 제조하는 방법을 본원에서 제공한다.
도 1은 핵산의 루프-매개 등온 증폭법(LAMP)을 개략적으로 표현한 것이다. 도 1a. 루프amp 출발 구조물의 생성. 단계 1, 정방향 내부 프라이머 영역 'F2'가 표적 서열 상의 상보적인 서열에 결합한다. 폴리머라제가 표적 상보적인 가닥을 치환하면서 프라이머 신장을 개시한다. 단계 2, 폴리머라제가 표적 서열의 카피를 완성한다. 단계 3, 'F3' 프라이머가 표적 서열 상의 상보적인 서열에 결합하고, 폴리머라제가 프라이머 신장을 개시한다. 단계 4, 'F3' 프라이머로부터의 프라이머 신장이 정방향 내부 프라이머 생성물을 치환시킨다. 치환된 정방향 내부 프라이머 생성물 상의 'F1c' 및 'F1'이 혼성화하여 헤어핀 루프를 형성한다. 단계 5, 역방향 내부 프라이머 영역 'B2'가 치환된 생성물 상의 상보적인 서열에 결합한다. 폴리머라제가 프라이머 신장을 개시한다. 단계 6, 폴리머라제가 헤어핀을 치환하 고, 프라이머 신장을 완성한다. 단계 7, 'B3' 프라이머가 상보적인 서열에 결합하고, 프라이머 신장이 개시된다. 단계 8, 프라이머 신장이 단일 가닥 생성물을 완전하게 치환시키는데, 이 단일 가닥 생성물은 양쪽 말단에서 헤어핀 루프를 형성한다. 이것이 루프amp의 증폭 단계를 위한 출발 구조물이다. 주석: 정방향 내부 프라이머 부위에서 시작되는 프라이머 신장은 대표적인 개시 과정으로서 제시된 것이다 - 상기 과정은 정방향 내부 프라이머 부위 또는 역방향 내부 프라이머 부위, 어디에서나 개시될 수 있다. 도 1b. 루프amp 출발 구조물의 증폭. 정방향 내부 프라이머 및 역방향 내부 프라이머가 루프amp 출발 구조물 상의 상보적인 서열에 결합하고, 폴리머라제에 의한 프라이머 신장 및 가닥 치환이 개시된다. 연속된 정방향 내부 프라이머와 역방향 내부 프라이머의 혼성화에 이어서 프라이머 신장 및 가닥 치환이 이루어짐으로써 길이가 상이한 생성물이 형성되고, 더 많은 루프amp 출발 구조물이 생성된다.
도 2는 핵산 증폭을 위해 다중 튜브 습식 포맷을 사용하는 LAMP 프로토콜을 도시한다.
도 3은 핵산 증폭을 위해 이중 튜브 건식 포맷을 사용하는 LAMP 프로토콜을 도시한다.
본 발명의 수행 모드
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 기술적 용어 및 과학적 용어는 모두 본 발명이 속하는 분야의 통상의 숙련인이 공통적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 언급된 모든 특허, 출원, 공개 출원 및 기타 공개문 헌의 전문이 참고로 인용된다. 본 섹션에서 진술된 정의가 본원에서 참고로 인용되고 있는 특허, 출원, 공개 출원 및 기타 공개문헌에서 진술된 정의와 상반되거나, 또는 다르게는 그와 일치하지 않을 경우, 본 섹션에서 진술된 정의를 본원에서 참고로 인용된 정의보다 우위에 둔다.
본원에서 사용되는 바, "하나"("a" 또는 "an")는 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
루프-매개 등온 증폭법(LAMP 또는 루프amp)은 표적 DNA를 특이적으로 인식하는 2 내지 3개의 "정방향" 프라이머 및 2 내지 3개의 "역방향" 프라이머로 이루어진 4 내지 6개의 프라이머 세트를 사용하는 등온 DNA 증폭 방법이다. 문헌 ([Nagamine et al., Nucleic Acids Res. (2000) 28:e63]; [Nagamine et al., Clin. Chem. (2001) 47:1742-43]; 미국 특허 번호 제6,410,278호; 미국 특허 출원 번호 제2006/0141452호; 제2004/0038253호; 제2003/0207292호; 및 제2003/0129632호; 및 유럽 특허 출원 번호 제1,231,281호)를 참조한다. 요약하면, 하나의 프라이머 세트는, 대략 ½의 프라이머는 양성 가닥이고, 나머지 ½의 프라이머 서열은 음성 가닥이 되도록 디자인된다. 폴리머라제에 의한 가닥 치환 증폭 이후에는 양측에 헤어핀 루프를 갖는 핵산 구조물이 생성된다. 이러한 구조물로부터 증폭이 반복적인 회차로 되풀이되면서 다양한 크기의 생성물이 생성된다. 이러한 증폭의 부산물은 피로인산마그네슘을 형성하는 것인데, 이는 백색의 침전물을 형성하여 반응 용액을 혼탁화시킨다. 이러한 혼탁이 존재하는 것은 양성 반응임을 의미하는 반면, 혼탁이 존재하지 않은 것은 음성 반응인 것이다. 예컨대, 칼세인과 같은 추가의 첨가 제를 통해 기타의 것을 시각화시킬 수 있다; 칼세인의 경우, 이는 형광성을 검출할 수 있다. 도 1을 참조한다. 증폭 반응은 등온 조건 (대략 65℃)하에서 일어나며, 이는 계속 진행되어 1시간 미만의 시간이 경과한 후에는 표적의 카피가 109개 정도 축적된다.
하나의 측면에서, 단일의 건식 포맷으로 가닥 치환을 할 수 있는 적어도 하나의 폴리머라제 효소, 표적-특이 프라이머 세트, 및 디뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)를 포함하는, 핵산의 루프-매개 등온 증폭을 위한 시약 제제로서, 여기서, 상기 시약 제제는 수용성이고, 4℃ 초과에서 안정적인 것인 시약 제제를 본원에서 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 가닥 치환을 할 수 있는 폴리머라제 효소는 Bst 효소이다. 표적이 RNA일 경우, 시약 제제는 또한 리버스 트랜스크립타제를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 리버스 트랜스크립타제는 AMV 리버스 트랜스크립타제이다.
또다른 측면에서, (a) (1) 적어도 하나의 폴리머라제 효소, (2) 표적-특이 프라이머 세트, (3) 디뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)로 이루어지며, 글리세롤을 함유하지 않는 완충처리된 수용액을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 용액을 건조시켜 시약 제제를 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 시약 제제는 수용성이고 4℃ 초과에서 안정적인 것인, 핵산의 루프-매개 등온 증폭을 위한 시약 제제를 제조하는 방법을 본원에서 제공한다. 표적이 RNA일 경우, 본 방법은 추가로 리버스 트랜스크립타제를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 리버스 트랜스크립타제는 AMV 리버 스 트랜스크립타제이다.
가닥 치환을 할 수 있는 임의의 적합한 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "가닥 치환"이라는 용어는 프라이머로 개시된 합성이 이루어지는 동안에 이중 가닥 DNA 분자 중 DNA 가닥을 분리시킬 수 있는 효소의 능력을 지칭한다. 효소는 완전한 효소이거나, 생물학적으로 활성인 그의 단편일 수 있다. 효소는 단리되고 정제될 수 있거나, 재조합 효소일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 효소는 열안정성이다. 그러한 효소는 승온 (>40℃)에서 안정적이며, 사용 온도에서 DNA를 효과적으로 중합화시킬 수 있는 범위까지 내열성을 띤다. 때때로 효소는 폴리머라제 분자 중 오직 활성인 부분, 예로서, Bst 거대 단편일 수 있다. 예시적인 폴리머라제로는 Bst DNA 폴리머라제, 벤트(Vent) DNA 폴리머라제, 벤트 (엑소-) DNA 폴리머라제, 딥 벤트(Deep Vent) DNA 폴리머라제, 딥 벤트 (엑소-) DNA 폴리머라제, Bca (엑소-) DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I 클레나우(Klenow) 단편, φ29 파지 DNA 폴리머라제, Z-Taq™ DNA 폴리머라제, 써모피(ThermoPhi) 폴리머라제, 9°Nm DNA 폴리머라제, 및 KOD DNA 폴리머라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예로서, 문헌 (미국 특허 번호 제5,814,506호; 제5,210,036호; 제5,500,363호; 제5,352,778호; 제5,834,285호; [Nishioka, M., et al. (2001) J. Biotechnol. 88, 141]; [Takagi, M., et al. (1997) Appl . Environ . Microbiol. 63, 4504])를 참조한다.
표적 뉴클레오티드가 RNA일 경우, 임의의 적합한 리버스 트랜스크립타제가 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 리버스 트랜스크립타제는 열안정성이다. RNA 표적을 DNA로 전환시키는데 사용되는 리버스 트랜스크립타제의 예시적인 일례로는 조류 골수아세포증 바이러스(Avian Myeloblastosis Virus)(AMV) 리버스 트랜스크립타제, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus)(M-MuLV, MMLV, M-MLV) 리버스 트랜스크립타제, 몬스터스크립트(MonsterScript) 리버스 트랜스크립타제, 어피니티스크립트(AffinityScript) 리버스 트랜스크립타제, 어쿠스크립트(Accuscript) 리버스 트랜스크립타제, 스트라타스크립트(StrataScript) 5.0 리버스 트랜스크립타제 5.0, 임프롬-II(ImProm-II) 리버스 트랜스크립타제, 써모스크립트(Thermoscript) 리버스 트랜스크립타제 및 써모-X(Thermo-X) 리버스 트랜스크립타제 및 상기 언급된 리버스 트랜스크립타제들의 임의의 유전적으로 변형된 형태 또는 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 제공하는 조성물 및 방법에 적합한 완충처리된 수용액은 핵산을 합성하는 효소의 바람직한 활성은 허용하지만, 글리세롤은 함유하지 않는 것이다. 글리세롤은 전형적으로 효소용의 완충처리된 수용액의 한 성분이며, 안정화제로서의 작용을 한다. 글리세롤이 존재하면 적절히 건조되지 못하고, 따라서, 시약 조성물은 4℃ 초과에서는 불안정하게 된다. 건식 포맷 및 습식 포맷의 완충액은 동일한 완충액일 수 있다. 습식 포맷의 완충액은 또한 재구성 완충액일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 수성 완충액은 25 mM 트리스-HCl (pH 8.8), 12.5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 12.5 mM (NH4)2SO4, 및 0.125％ 트윈 20을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, DNA의 용융을 촉진시켜주는 제제 또한 포함된다. DNA의 용융을 촉진시켜주는 제제 의 예로는 베타인, 트레할로스, 테트라메틸론 설폭시드, 호모엑토인, 2-피롤리돈, 설폴란, 및 메틸 설폰을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "안정적이다"이라는 용어는 생물학적 활성이 적어도 약 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 또는 적어도 18개월 동안 원래 활성 (시약을 최초로 건조시킨 후에 측정됨)의 20％ 미만으로 손실되는 것인 안정성을 지칭한다. 전형적으로, 시약 제제는 4℃ 초과에서 안정적이다. 몇몇 실시태양에서, 시약 제제는 실온 (대략 20-25℃)에서 안정적이다.
시약 제제 중의 프라이머는 표적-특이적이다. 특이적인 프라이머는 LAMP 방법을 사용하여 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시킬 수 있도록 디자인된다. 예로서, 문헌 (미국 특허 번호 제6,410,278호; 미국 출원 번호 제2006/0141452호; 및 [Nagamine et al., Clin . Chem. (2001) 47:1742-43])을 참조한다. 원하는 핵산 서열을 합성하는데 사용되는 프라이머는 그가 필요에 따라 상보적으로 결합하는 한, 길이에 있어 특별한 제한을 받지 않는다. 전형적으로, 4개 또는 6개의 상이한 프라이머가 사용된다.
프라이머는 검출가능한 표지 물질 또는 고체상에 결합할 수 있거나, 그에 결합할 수 있도록 변형될 수 있다. 핵산 서열 합성을 위해 프라이머를 표지화할 때 표지화를 위해서 공지된 물질 및 방법이 사용될 수 있다. 표지 물질의 일례로는 방사성 물질, 형광 물질, 합텐, 비오틴, 및 효소를 포함한다. 이들 표지 물질은 공지된 분자생물학 기법에 따라 프라이머에 첨가될 수 있거나, 앞서 표지된 뉴클레오티드가 프라이머의 화학적 합성 시점에 혼입됨으로써 표지 프라이머를 제조할 수 있다. 적합한 관능기는 상기 언급된 표지 물질 또는 라텍스 입자, 자기 입자, 또는 반응 용기의 내벽에 결합할 수 있도록 프라이머에 도입될 수 있다. 프라이머의 표지 부위는 상보적인 가닥에 대한 어닐링, 또는 차후의 신장 반응을 저해하지 않는 방식으로 선택되어야 한다. 표지 물질은 그의 분자량에 따라서 입체 장애가 일어나지 않도록 하기 위하여 링커로서 염기 서열을 통해 5'측 상에 결합될 수 있다.
시약 제제 중에서 제공되는 디뉴클레오티드 트리포스페이트는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 및 dUTP 뿐만 아니라, 당업계에 공지되어 있는 유용한 유사체 및 유도체를 포함한다.
본원에 개시된 건식 시약 제제의 성분은 건조 과정에 적합한 임의 농도로 존재할 수 있다. 일반적으로 성분은 건조를 촉진시키기 위해 약 5X, 10X, 20X 또는 그보다 높은 농도로 존재함으로써 반응 튜브는 1X 농도의 약 1/5, 1/10, 1/20 또는 그보다 적은 부피를 함유하게 되는데, 여기서, 1X 농도는 LAMP 방법을 실시하는데 사용되는 성분의 농도이다.
추가적인 별도의 습식 포맷의 수성의 완충처리된 용액은 효소 반응에 대해 적합한 pH, 효소의 어닐링에 필요하거나 효소의 촉매 활성을 유지하는데 필요한 염, 효소용 보호제, 및 필요에 따라 융용 온도(Tm) 조절제를 제공하는 것이다. 예시적인 완충액은 중성 내지 약알칼리성 범위에서 완충 작용을 갖는 트리스-HCl이다. pH는 사용되는 DNA 폴리머라제에 따라서 조정된다. 염으로서는 KCl, NaCl, (NH4)2SO4 등이 효소의 활성을 유지시키고, 핵산의 융용 온도(Tm)를 조절하기 위해서 적절히 첨가된다. 효소용 보호제는 소 혈청 알부민 또는 당을 이용한다. 추가로, 디메틸 설폭시드(DMSO) 또는 포름아미드가 융용 온도(Tm) 조절제로서 사용될 수 있다. 융용 온도(Tm) 조절제의 사용에 의해 올리고뉴클레오티드의 어닐링은 제한된 온도 조건하에서 조절될 수 있다. 추가로, 베타인 (N,N,N-트리메틸글리신) 또는 테트라알킬 암모늄 염은 또한 그의 이소안정화(isostabilization)에 의해 가닥 치환율을 향상시키는데 효과적이다. 0.2 내지 3.0 M, 바람직하게는, 0.5 내지 1.5 M의 양으로 베타인을 반응 용액에 첨가함으로써 본 발명의 핵산 증폭에 대한 그의 촉진 작용을 기대할 수 있다. 이러한 융용 온도 조절제는 융용 온도를 강하시키는 작용을 하기 때문에 적합한 엄격도 및 반응성을 제공하는 조건은 염 농도, 반응 온도 등을 고려하여 실험적으로 결정된다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 추가적인 별도의 습식 포맷은 수성의 완충처리된 용액, 예컨대, 25 mM 트리스-HCl (pH 8.8), 12.5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 12.5 mM (NH4)2SO4, 및 0.125％ 트윈 20을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 베타인 또한 포함된다.
임의의 적합한 건조 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 개시된 시약 제제를 건조시키는 것은 건조 챔버, 예컨대, 동결 건조기에서 효과적으로 실시될 수 있다. 시약 제제는, 유리가 필요하지 않기 때문에 플라스틱 제품 중에서 건조될 수 있다. 또한, 몇몇 실시태양에서, 시약 제제는 건조되기 이전에 냉동될 수 있다. 예를 들면, 생성물은 다양한 크기의 플라스틱 미세분리 튜브 및 플라스틱 미량역가 웰 중에서 건조될 수 있다. 수분으로부터 보호하기 위해 건조된 생성물을 밀봉하 는데, 예를 들면, 내부 챔버 모양이 미세분리 튜브와 유사한 유리 튜브의 경우에는 부틸 고무 마개를 사용하거나, 플라스틱 미세분리 튜브 및 미량역가 웰의 경우에는 건조제를 포함하는, 호일로 안을 댄 플라스틱 파우치 또는 용기를 사용한다. 건조 시간은 사용 방법에 따라 달라진다. 전형적인 건조 시간은 2시간 미만이다. 물질이 육안상 건조 상태 (백색 펠릿)에 도달한 후에는 튜브를 닫고, 생성물을 수분으로부터 보호하기 위해 건조 환경에서 저장한다. 몇몇 실시태양에서, 건조에 의해 약 90％ 초과, 때때로 약 95％ 초과의 수분이 제거된다.
건식 및 습식 포맷은 임의의 적합한 용기를 사용할 수 있다. 전형적으로, 개별 포맷은 단일의 플라스틱 튜브로 되어 있다.
추가로, 핵산 샘플 상에서 LAMP 방법을 실시하는데 적합한 것으로서, 본원에서 개시된 건식 포맷의 시약 제제 및 수성의 완충처리된 용액을 포함하는 별도의 습식 포맷 성분을 포함하는 키트를 본원에서 제공한다. 키트는 임의의 적합한 물리적 형태로 존재할 수 있고, 임의로는 설명서를 포함할 수 있다.
실시예 1
LAMP에 필요한 시약을 함유하는 건식 포맷의 기능성을 비교하였다. 포맷상의 차이는 표 1에 제시한다.
Figure 112009049652133-PCT00001
습식 포맷 LAMP. 표준 LAMP 키트에서 키트 성분은 -20℃에서 저장되어야 한다. 권고된 프로토콜은 하기와 같다: -20℃로부터 시약을 제거하고, 실온에서 해동시킨다. 일단 해동되면, 얼음 상에서 보관한다. 0.5 ml 또는 1.5 ml 튜브 중에서 마스터 믹스를 제조한다 (얼음 상에서 제조). 요약하면, 12.5 ㎕ 2x 반응 믹스; 2.5 ㎕ 프라이머 믹스; 및 4.0 ㎕ 증류수를 반응 튜브에 첨가함으로써 마스터 믹스를 제조한다. 약 1초간 3회에 걸쳐 튜브를 가볍게 두드리거나 거꾸로 뒤집거나, 또는 와동시켜 시약을 혼합한 후, 간단하게 원심분리시킨다. 튜브를 95℃에서 5분 동안 가열시켰다. 이어서, 튜브를 얼음 상에서 냉각시켰다. 냉각시킨 후, 1 ㎕의 효소 믹스를 튜브에 첨가하고, 이어서, 와동 및/또는 원심분리시켰다. 일단 마스터 믹스 제제가 완성되고 나면, 20 ㎕의 마스터 믹스를 각각의 샘플 및 대조군 튜브 (0.2 ml PCR 튜브)로 분배하였다. 5 ㎕의 DNA 또는 RNA 샘플을 튜브에 첨가하고, 피펫팅하거나 가볍게 두드려 혼합한 후, 간단하게 원심분리시켰다. 튜브를 약 60℃에서 1시간 동안 가열한 후, 80℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켰다. 혼탁도는 시각적으로 검사하여 측정하였다.
건식 포맷 LAMP. 건식 포맷 LAMP 시약 제제는 단계의 수를 다수 감소시킴으로써 오류를 감소시키고 감응성을 증가시킨다. 건식 포맷의 LAMP 시약 제제 중의 성분은 -20℃ 내지 30℃에서 저장될 수 있다.
건식 포맷 제조. 효소를 함유하는 용액은 접선 유동 미세투석기를 사용하여 글리세롤을 함유하지 않는 효소 저장 완충액에 대하여 투석시켰다. 전형적으로, 투석은 2시간 미만 동안에 일어났다. 동결 건조기를 사용하여 투석된 효소 용액 뿐만 아니라, 투석되지 못한 효소 용액을 건조시켰다. 투석되지 못한 용액은 24시간 후에도 건조되지 못했다. 건조된, 투석되어진 효소를 함유하는 튜브를 건조제를 함유하는 밀봉된 호일 파우치에서 저장하였다.
프로토콜. 건식 시약 제제를 함유하는 반응 튜브를 호일 파우치로부터 제거하였다. 80 ㎕의 반응 완충액 및 20 ㎕의 샘플을 각각의 반응 튜브에 첨가하였다. 완만하게 와동시켜 내용물을 혼합한 후, 약 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혼탁도를 시각적으로 측정하였다.
실시예 2
본 실험의 목적은 Bst 폴리머라제 및 AMV 리버스 트랜스크립타제가 동일 튜브에서 동결건조될 경우, 리버스 트랜스크립타제 LAMP(RT-LAMP)가 작용하는지 여부를 측정하는 것이었다.
물질은 dNTPS (25 mM) (뉴 잉글랜드 바이오랩스((New England Biolabs)); 에이켄(Eiken) 노로바이러스 GI 프라이머 믹스 세트; 투석된 Bst DNA 폴리머라제 (약 37 u/㎕, 글리세롤 무함유); AMV 리버스 트랜스크립타제 (20 u/㎕) (스트라테이진(Stratagene)); AMV 투석 완충액 (200 mM KH2PO4, 2 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.2％ 트리톤 X-100) (pH 7.2); 재구성 완충액 (2X): 40 mM 트리스-HCl (pH 8.8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH4)2SO4, 및 0.2％ 트윈 20; 및 베타인을 포함하였다.
방법 - 효소 믹스의 동결 건조
1. 효소 희석액 제조
a. Bst 8 u/㎕: 2.4 ㎕ 투석된 효소 + 7.6 ㎕ dH2O
b. AMV 0.5 u/㎕: 0.7 ㎕ 투석된 효소 + 9.3 ㎕ dH2O
2. 3개의 0.2 ml 튜브에서 효소 믹스 제조
a. 노로바이러스 GI 프라이머 믹스: 2.5 ㎕/튜브
b. 희석된 Bst 1.0 ㎕/튜브
c. 희석된 AMV 1.0 ㎕/튜브
d. 25 mM dNTP 1.4 ㎕/튜브
3. 효소 믹스를 30분 동안 동결 건조시킨다.
4. 재구성 완충액 성분을 반응 튜브에 첨가한다.
a. 2X 반응 완충액 12.5 ㎕/튜브
b. 베타인 4.0 ㎕/튜브
c. dH2O 3.5 ㎕/튜브
d. 노로바이러스 GI RNA 또는 dH2O 5.0 ㎕/튜브 (1개 양성/2개 음성)
5. 63℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다.
6. 결과를 시각적으로 해석한다.
결과 - 동결 건조된 시약을 사용한 Lamp 반응:
● 노로바이러스 GI 양성 대조군: (+)
● 물 (음성 대조군): (-), (-)
결론: 동일 튜브에서 동결 건조된 AMV 리버스 트랜스크립타제 및 Bst 효소를 사용하여 리버스 트랜스크립타제 LAMP를 성공적으로 실시할 수 있다.
실시예 3
목적: 본 실험의 목적은 동결 건조 이전에 효소 저장 완충액으로부터 글리세롤을 제거해야 하는지 여부를 확인하는 것이었다.
물질은 dNTPS (25 mM) (뉴 잉글랜드 바이오랩스); 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile) TcdB (톡신 B(Toxin B)) 루프amp 프라이머 세트; Bst DNA 폴리머라제 (120 u/㎕) (뉴 잉글랜드 바이오랩스); Bst DNA 폴리머라제 (8 u/㎕) (뉴 잉글랜드 바이오랩스); 및 Bst DNA 투석 완충액 (50 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA, 1 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.1％ 트리톤 X-100) (pH 7.5)를 포함하였다.
방법 - 효소 믹스의 동결 건조: 하기와 같이 하나의 튜브 중 각 효소 조건에 대하여 10.5 반응 부피로 제조하고, 단일 반응 부피를 10개의 튜브에 분취하여 투석되지 못한 효소 및 투석된 효소에 대한 10개의 반응 튜브 각각을 제조하였다:
투석되지 못한 효소: 10.5 부피 반응 튜브당
dNTP 58.8 ㎕ 5.6 ㎕
프라이머 믹스 42 ㎕ 4.0 ㎕
Bst (8 u/㎕) 84 ㎕ 8.0 ㎕
투석된 효소: 10.5 부피 반응 튜브당
dNTP 58.8 ㎕ 5.6 ㎕
프라이머 믹스 42 ㎕ 4.0 ㎕
Bst (37 u/㎕) 21 ㎕ 2.0 ㎕
8분째, 30분째, 45분째, 60분째, 120분째, 및 27.5시간째 (투석되지 못한 효소 시약 튜브의 경우에만)에 유리를 통해 동결 건조를 모니터하였다. 동결 건조한지 2시간이 경과한 후에 투석된 효소를 함유하는 반응 튜브를 제거하였다. 투석되지 못한 효소를 함유하는 반응 튜브는 동결 건조한지 27.5시간이 경과한 후에 제거하였다.
결과 - 효소 믹스의 동결 건조. 8분째 투석된 효소를 함유하는 10개의 시약 튜브는 모두 시각적으로 건식인 것으로 보였다. 시약은 동결 건조한지 2시간이 경과한 후에 건식인 것으로 확인되었다. ("건식"이란 투명 액체로부터 백색 "플러피" 고체로 전이된 물질로서 정의된다). 투석되지 못한 효소를 함유하는 튜브는 모두 동결 건조시 어느 시점에서도 시각적으로 건식인 것으로 보이지는 않았지만, 45분째에는 부피가 시각적으로 현저히 감소된 것이 관찰되었다. 투석되지 못한 효소를 함유하는 튜브는 모두 동결 건조한지 27.5시간이 경과한 후에도 여전히 습윤 상태이고 투명한 것으로 보였다.
결론: 건식 시약을 형성하기 위해서는 Bst 효소와 함께 공급되는 글리세롤은 생성물에 대한 동결 건조 이전에 제거되어야 한다.

Claims (11)

  1. 단일의 건식 포맷으로
    적어도 하나의 폴리머라제 효소,
    표적-특이 프라이머 세트, 및
    디뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)
    를 포함하고, 수용성이며 4℃ 초과에서 안정적인, 핵산의 루프-매개 등온 증폭을 위한 시약 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제 효소가 Bst 효소인 시약 제제.
  3. 제1항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제를 추가로 포함하는 시약 제제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 리버스 트랜스크립타제가 AMV 리버스 트랜스크립타제인 시약 제제.
  5. 제1항의 시약 제제를 포함하는 키트.
  6. 제5항에 있어서, 수성의 완충처리된 용액을 포함하는 별도의 습식 포맷을 추가로 포함하는 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 용액이 25 mM 트리스-HCl (pH 8.8), 12.5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 12.5 mM (NH4)2SO4, 및 0.125％ 트윈 20인 키트.
  8. (a) (1) 적어도 하나의 폴리머라제 효소,
    (2) 표적-특이 프라이머 세트,
    (3) 디뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)
    로 이루어지며, 글리세롤을 함유하지 않는 완충처리된 수용액을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 용액을 건조시켜 시약 제제를 형성하는 단계
    를 포함하며, 여기서 상기 시약 제제는 수용성이고 4℃ 초과에서 안정적인 것인, 핵산의 루프-매개 등온 증폭을 위한 시약 제제를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리머라제 효소가 열안정성인 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리버스 트랜스크립타제가 AMV 리버스 트랜스크립타제인 것인 방법.
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