DD265429A1 - Verfahren zur nichtradioaktiven markierung von polynukleotiden - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von Polynukleotiden beschrieben. Erfindungsgemaess werden an der Seitenkette halogenierte Nukleoside in die Formylverbindungen oder deren geschuetzte Derivate ueberfuehrt, diese durch Phosphorylierung zu den Nukleosidtriphosphaten umgesetzt, die modifizierten Triphosphate enzymatisch in Polynukleotide eingebaut und nachfolgend, gegebenenfalls nach Abspaltung einer Schutzgruppe, mit einer Markergruppe gekoppelt. Die nach diesem Verfahren hergestellten Polynukleotide koennen in Sondentests zum Nachweis von Polynukleotid-Hybridisierungen verwendet werden.

Description

1. Titel der Erfindung

Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von Polynukleotiden

2. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von Polynukleotiden als molekulare Hybridisierungssenden. Diese finden neben der wissenschaftlichen Anwendung auch in Medizin, Landwirtschaft und Lebensmittelindustrie zur viralen und bakteriellen Diagnostik zunehmend praktische Nutzung.

3. Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Allgemein im Gebrauch ist die radioaktive Markierung für den Nachweis von Molekularsonden nach deren Hybridisierung mit der gesuchten Polynukleotidsequenz. Dieses Verfahren erfordert aber apparativen Aufwand, ss ist teuer, birgt gesundheitliche Risiken und erfordert die Beachtung der relativ kurzen Halbwertzeiten. Dazu sind in der wissenschaftlichen und Patentliteratur zahlreiche Alternativen angeboten worden, die i.a an einer speziellen Stelle im Polynukleotid und auf einer bestimmten Stufe der Präparation der Sonde eine Markierung mit einer bestimmten Signalsubstanz (Antigen, Hapten, Antikörper, Enzym, Fluorophor, Chemilumineszenzkatalysator u.a.) vornehmen, die entweder direkt oder indirekt nachweisbar ist. Der direkte Nachweis, z.B. über eine Markierung mit einem Fluorophor, erreicht nicht die Empfindlichkeit, der indirekten Methoden. Für die indirekte Indikation wird i.a. ein Enzym vorgeschlagen, das durch Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Lichtsignal liefert. Das Enzym kann unmittelbar als Marker an der Sonde gebunden sein. Günstiger für die Nachweisempfindlichkeit aber ist der Aufbau einer serologischen Nachweiskette, ausgehend von dem Partner einer immunologischen Reaktion, der die Sonde markiert, und endend an einem Konjugat, das ein Enzym zur Indikation mittels eines Substrates enthält

Für die vorliegende Erfindung sind Publikationen relevant,

die eine Markierung an der 5-Position von Pyrimidinbausteinen der Polynukleotidsonden zum Ziel haben. Derartig modifizierte Nukleotidbausteine lassen sich in vivo und in vitro gut in Sonden einbauen, da die chemisch modifizierten Positionen mit den Erkennungsregionen der für den Einbau verantwortlichen Enzyme und mit der Wasserstoffbrückenbindung zwischen Sonde und Zielsequenz vergleichsweise wenig interferieren". Es gibt zwar auch die Möglichkeit, ein modifiziertes Nukleotid chemisch, z.B. mit einem Syntheseautomaten, in eine Oligonukleotidsondeeinzubauen und dann zu markieren (WO 84/03285, J.L. Ruth), doch der Länge dc3s Oligonukleotides und damit der Stärke der mit ihr angestrebten Hybridisierung sind nach dieser Verfahrensweise Grenzen gesetzt.

Bekannt sind Methoden, die eine chemische Markierung erst an dem unveränderten Polynukleotid vornehmen, wobei vornehmlich Cytosin und Adenin (EP 138357, G.M. Landes), Cytosin (DOS 3431536, H. Graf) oder Guanin (EP 172153, CW. Adams et al.) chemisch derivatisiert werden. Die dazu verwendeten chemischen Reaktionen lassen erwarten, daß die Intaktheit des Polynukleotides und damit auch desse.i Hybridisierung beeinträchtigt werden.

D.C. Ward et al. (FP 63879) beschreiben eine Methode zur Markierung von Nukleotiden an den Basen Thymin, Cytosin und Uracil mit Biotin. Die so markierten Nukleosidtriphosphate werden enzymatisch in die Polynukleotidsonde inkorporiert. Bei der Herstellung der markierten Nukleotide geht man vorzugsweise von UTP oder dUTP aus, an die in C-5 Position über eine metallorganische Zwischenstufe ein Allylamin synthetisiert wird, woran ein aktivierter Biotinylester koppeln kann. Das Syntheseverfahren ist relativ kostspielig und aufwendig. Die enzymatischen Einbauraten der markierten Nukleosidtriphosphate in die Sondensequenz sind nicht sehr hoch bzw. die gewonnenen PoIynukleotidketten nicht ausreichend ling. P. Kourilsky et al. (USP 4581333) koppelten 'u'tec eine Cytochrom C-Brücke z.B. Biotin an das Polynukl&otid. In ähnlicher Weise verknüpfte M. Renz (EMBO J. 3 (1983) 817-822) biotinyliertes Histon Hl und das PolynuUleotid mit Hilfe von Glutardialdehyd. M. Renz und C. Kurz (Nucleic Acids Res. 12 (1984) 3435-3444) ketteten das

Markerenzym an Polyethylenimip m it Hilfe von p-Benzochinon und die resultierenden Konjugate wurden mit Glutaraldehyd an DNA gebunden. Nach diesen Vorschlägen ergibt sich jeweils ein ungünstig hohes Protein/Polynukleotid-Massenverhältnis, das die Hybridisierung erschwer* und damit die Nachweisempfindlichkeit beeinträchtigen kann. Außerdem werden nun die Bedingungen für die Hybridisierung durch die Stabilität der gebundenen Enzyme begrenzt.

D. Engelhardt et al. (EP 97373) beanspruchen die chemische Markierung von Nukleotiden mit einer Signalsubstanz mit dem Ziel, die markierten Nukleotide in ein Polynukleotid einzubauen, sowie den Einbau einer Signalsubstanz über Brückenglieder an nicht modifizierte Polynukleotide. In den Anspruch auf Nukleotide, die mit einer Signalsubstanz markiert sind, werden die Methoden zur Markierung von Nukleotiden ne~h D.G. Ward (EP 63879) mit aufgenommen. Die Technik, bereits das Nukleotid mit einer Signalsubstanz zu versehen, bringt i.a. aufgrund des Volumenbedarfs von Linker oder Spacer und Signalsubstanz Beeinträchtigungen beim enzymatisichen Einbau in ein Polynukleotid mit sich.

Modifizierte Nukleosidtriphosphate, die enzymatisch in ein Polynuklentid inkorporiert werden sollen, müssen neben ihrer späceren Funktion in dem Polynukleotid noch gewisse Voraussetzungen aufweisen, die sie für einen enzymatischen Einbau i ι das Polynukleotid geeignet machen. So dürfen sie die Erkennungsreaktion der für den Einbau verantwortlichen Enzyme nicht stören und sie sollten gegenüber diesen Enzymen keine andere Reaktivität als die eines Substrates besitzen. Diesem Anspruch werden nur Veränderungen am Nukleotid gerecht, die keine sterischen Hinderungen mit sich bringen, d.h. mit der Modifizierung des Nukleotides sollten möglichst nur kleine Gruppen eingeführt werden. Nukleosidtriphosphate mit raumausfüHenden Gruppen wie Biotin werden in unmittelbarer Nachfolge nur sehr langsam enzymatisch eingebaut. Außerdem darf die Reaktivität dieser neuen Gruppen oder Atome die enzymatischem Inkorporation in das Polynukleotid nirht stören bzw. sie muß maskiert (mit Schutzgruppen versehen) vorliegen.

Die Aufgabe der modifizierten Nukleotide im Poiynukleotid besteht darin, eine Markierung für das Poiynukleotid aufzunehmen. Mit der Markierung erreicht man, daß gesuchte PoIynukleotidsequenzen über eine Hybridisierung mit der markierten Polynukleotidsequenz im Falle einer komplementären Basenfolge bestimmbar werden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein kostengünstiges und wenig aufwendiges Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von PoIynukleotiden zu entwickeln. Die' Anwendung der Erfindung für Hybridisierungstests soll den Einsatz radioaktiver Substanzen erübrigen und eine hohe Nachweisampfindlichkcit garantieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Nukleotid so zu modifizieren, daß es sich zum einen leicht enzymatisch in ein Poiynukleotid einbauen läßt und zum anderen im Poiynukleotid mit verschiedenen Markern zur Umsetzung gebracht werden kann, ohne das andere Bausteine oder Bindungen im Poiynukleotid angegriffen werden, um dieses Poiynukleotid für einen Nachweis in einer Testprobe zugänglich zu machen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man an der Seitenkette halogenierte Nukleoside in die Forrnylvertundüngen oder in deren geschützte Derivate überführt. Anschließend werden diese zu den entsprechenden Nukleotiden phosphoryliert und durch weitere Phosphorylierung zu den entsprechenden Nukleosidtriphosphaten umgesetzt. Das Triphosphat wird mit Hilfe von Polymerasen oder anderen metabolisierenden Enzymen in PoIynukleotide eingebaut und im Anschluß wird eine Markergruppe, ggf. nach Abspaltung der Schutzgruppen eingebaut. Die wichtigsten Verfahrensschritte bei der Herstellung eines markierten Polynukleotides werden durch die Zeichnung verdeutlicht.

Die durch Halogenierung erhaltenen Dihalogenalkylderivate, Vorzugs; weise 3',5' -Di-O-acyl-S-dibrommethyl-^ '-desoxyuridine, lassen sich mit einer Vielzahl von Verbindungen zu Produkten umsetzen, die erfindungsgemäß noch eine Reaktivität besitzen,

die zum einen nicht so hoch sein darf, daß sie die nachfolgenden Reaktionen einschließlich des enzymatischen Einbaus in ein Polynukleotid stört, zum anderen aber ausreichend ist, zur Bindung eines Markers. So werden die halogenieren Nukleoside nach an sich bekannten Methoden in die entsprechenden Formylverbindungen überführt, ts ist jedoch günstiger, die Formvlgruppe zu schützen, z.B. als Acetal, als Hydrogensuifitaddukt, als Cyanhydrin u.a.. Es lassen sich die cyclischen Vollacetale auch direkt aus den Halogenverbindungen durch Umsetzung mit vorzugsweise Propandiol oder Glycol herstellen .

Die derart modifizierten Nukleoside werden unter Beachtung der Stabilität des ieweiligen Nukleosides zum Triphosphat gebrac. t. So ist es wichtig, bei der Mono- und Triphosphorylierung ein Arbeiten im Sauren zu umgehen.

Der enzymatische Einbau der modifiziert^n Nukleotide erfolgt nach bekannten Methoden wie der Nick-Translation von DNA unter Verwendung von E. coli DNA-Polymerase, durch Auffüllen zurückgesetzter 3'-Enden, wie sie durch Behandlung mit gewissen Restriktionsenzymen entstehen, durch Verwendung des großen (KIenow)Fragmentes von E.coil· Polymerase oder durch die 3'-terminale Addition der modifizierten Nuklciotide mit Hilfe der terminalen DMA-Tranpferase. Gas so erhaltene modifizierte Polynukleotid ist der Hräkursor für eine breite Vielzahl von markierten Poly !U k lfjo ti den.

Die Markierung der Polynukleoti.de erfolgt erfindungsgemäß nach Einbau der modifizierten Nukleo+ide in Abstimmung mit dem späteren Verwendungszweck der markierten Folynukleotide mit Substanzen, die neben dem Marker selbst eine zur Reaktion mit den modifizierten Orten des Polynukleotides geeignete Gruppe besitzt. Sie erfolgt z.B. mit Biotin, Fluorescin oder einem anderen Marker mit chromophorer oder fluorophurer Gruppe über eine A/omethin-Bindung, die ggf. mit Natriumborhydrid reduziert wird.

In allem Fällen kommt die Reaktion, welche zur Markierung führt, dadurch zustande, dqß das Polynukleotid durch den Einbau rnodifizierier Nukleotide Stellen aufweist, die der Reaktion mit nukleophilen Reagenzien, wie Aminen oder Hydraziden, zugänglich sind, entweder unmittelbar oaer erst nach Entfernen der

Schutzgruppe. Dafür ist die 5-Formylgruppe an einer Pyrimidinbase ein Beispiel.

Der Marker ist mit entsprechenden Agenzien qualitativ und quantitativ nachweisbar. Der Marker kann aber auch so beschaffen sein, daß er selbst Signale für einen Nachweis liefern kann. Das trifft zu für chromophore oder fluorophore Gruppen, doch auch für Proteine wie das Ferritin, das im Elektronenmikroskop als elektronendichtes Material erkennbar wird. Gebräuchlicher sind indirekte Nachweise, die von einem' Marker ausgehen, welcher mit weiteren Agenzien unter Bildung nachweisbarer Signale reagiert. In diesen Fällen sind die Marker Proteine, die nach Kontakt mit Substraten einen spcktroskopischen Nachweis gestatten, odsr es sind Partner einer immunologischen oder Rezeptor-Akzyptor Reaktion, die in bekannter Weise bestimmt werden können. Mit einer immunologischen Nachweiskette, wie man sie z.B. von der ELISA-Technik her kennt» kann eine entsprechende Empfindlichkeit des Testes erreicht werden. Solche Markierungen erlauben z.B. den Nachweis ethioüogischer Agenzien, die ein Polynukleotid enthalten bzw. deren Aktivität mit dem Auftreten eines Polynukleotides korreliert.

Es ist in vielen Fällen von Vorteil, bei der Aufnahme eines Markers mit den genannten Funktionen in das Polynukleotid auch einen entsprechend dimensionierten Spacer zu berücksichtigen, damit eine gewisse Beweglichkeit und Reaktionsbereitschaft des Markers für die weiteren Nachweisreaktionen gegeben sind. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird diesem Spacer ein gewisser Grad an Hydrophilie mitgegeben, um bei Hybridisierungen unspezifische Wechselwirkungen, z.B. mit dem Träger, zu vermeiden.

Ein bevorzugter Weg dieser Erfindung besteht darin, 3' , 5' Di-D-acetylthymin-2'-desoxyribosid zum 3 ' , 5'-Di-O-acetyl-5-dibromrnethyl-2 '-desoxyuridin zu bromieren. Daraus läßt sich hydrolytisch 5-Formyl-2' -desoxyuridxn gewinnen, das zwar als Triphosphat auch direkt in ein Polynukleotid inkorporiert werden kann - es ist jedoch günstiger, die Formylgruppe zu schützen, z.B. als Acetal, als Hydrogensulfitaddukt, als Cyanhydrin u.a..

Nach Einbau des geschützten 5-Formyl-2'-desoxyuridintripbosphates läßt sic'.i die Schutzgruppe leicht wieder abspalten, so daß für die Markierungsreaktion eine reaktive Aldehydgruppe "ur Verfügung steht. So entsteht aus 3',5'-üi-0-acetyl-5-dibrommethyl-2'-deso >yuridin und 1, 3-Propandiol ein cyclisches Vollacetal, das sich phosphorylieren läßt zum 5-(2-(l,3-Dioxany]))-2^l-desoxyuridin-5'-triphosphat.

Die Vorteile des Verfahrens liegen darin, daß die erfindungsgemäß modifizierten Nukleotide die Erkennungsreaktion der für den Einbau verantwortlichen Enzyme nicht stören und auch gegenüber diesen Enzymen keine andere Reaktivität als die eines Substrates besitzen.

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Bei den folgenden Spezifikationen handelt es sich um praktische Beisoiele, die die Besonderheiten des vorliegenden Verfahrens illustrieren, aber den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.

1. Herstellung von 5(2-(1,3-Dioxanyl) )-2'-desoxyuridin

1 mMol 3 ' ,5 '-Di-O-acetyl-2'-desoxythymidin wird in 200 ml Dicliloräthan mit 2,2 mMoi Brom unter Verwendung einer Lichtquelle bromiert. Nach dem Abrotieren des Lösungsmittels wird der Rückstand in 10 ml absolutem Dioxan aufgenommen und in eine Lösung

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von 1,1 mMol Propandinlc'?,5 mMol Diisopropyläthylamin und 10 ml absolutem Dioxan bei 20 ⁰C zugetropft. Nach 16 Stunden wird die Lösung einrotiert. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und mit wässriger Bicarbonatlösung extrahiert. Die getrocknete Chlgroformlösung wird einrotiert, der Rückstand an Kieselgel 60 chromatographiert (100 ^ Kieselgel 60 (Merck), 0,06 - 0,2 mm, Essigsäureäthylester mit 0,5 \ Triäthylamin als Laufmittel). Das reine 5(2-( .1, 3-Dioxanyl) )-2 ' -desoxy-3 ' 5 ' -0-acetyl-uridin hat einen Schmelzpunkt von 168 - 72 ⁰C und einen ⁿf-Wert von 0,6 auf DC-Kieselge Lnlatte (Merck ^F25/p' ^^e Entacylierung wird mit einer 10 %igen Lösung von Triäthylamin in absolutem Methanol bei 2O⁰C in 24 h oder nach 1 h Rückfluß durchgeführt. Nach dem Einrotieren und Kodestillieren mit Toluol kann der Rückstand für die weitere Phosphorylierung direkt eingesetzt werden.

2. Umsetzung zum 5(2-(1,3-Dioxanyl))-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (GdUTP)

0,5 mMol 5(.2-(1, 3-Dioxanyl) )-2 ' -desoxyuridin werden zusammen mit 0,6 mMol Cyanäthylphosphat mit 10 ml absolutem Pyridin je 3 mal einrotiert. Zum Rückstand werden 3 mMol Dicyclohexylcarbodiimid und 0,5 mMol Diisopropyläthylamin in 5 ml Pyridin gegeben. Nach ca. 50 h bei 20 ° werden 1,5 ml H„0 zugegeben. 30 Minuten später wird bis zur Trockne im Vakuum einrotiert, dann in 5 ml Wasser aufgenommen, der unlösliche Rest wird mit 2 weiteren kleinen Wasserportionen gewaschen. Die vereinigten Überstände (10 - 15 ml) werden mit ca. 5 ml Triethylamin versetzt, über Nacht geschüttelt, dann einrotiert und schließlich in wenig 0,5 %iger wäßriger Triethylamin-Lösung aufgenommen. Die Lösung wird an DEAE-Sephadex A fraktioniert mit Hilfe eines Gradienten (0-0,3 mol) von Triethylammoniumhydrogencarbonav. Nach wiederholtem Abrotieren (mit Ethanol)

der gesammelten mit DC als positiv auf Monophosphat getesteten Fraktionen erhält man das Triethylammoniucsalz des Dioxanyldesoxyuridinmonophosphates. Zur Triphosphory1ierung (im wesentlichen nach Hoard u. ütt(1965)) werden 0,4 mMol des 5(2-(1.3-Dioxany1))-2'-desuxyuridin-5'-monophosphat-Triethylammoniumsalzes mit 4 ml Dimethylformamid (DMF) und 0,5 mMol Tributylamin versetzt und unter wiederholter Zugabe von DMF mehrmals einrotiert. Schließlich wird in DMF aufgenommen, 2 niMol Carbonyldiimidazol in 4 ml DMF zugegeben und 4 h geschüttelt. Danach werden 3,2 mM Methanol zugegeben. Nach 30 Minuten werden unter starkem Rühren 2 mM Tributylammoniumphosphat in 20 ml DMF zugegeben und die Mischung wird 1 Tag im Exsiccator belassen. Das ausgefallene Imidazoliumpyrophosphat wird mit mehreren DMF-Portionen gewaschen, die vereinigten Überstände werden im Volumenverhältnis 1:1 mit Methanol behandelt und einrotiert. 0er Rest wird in 0,5 ^iger wäßriger Triethylaminlösung aufgenominen und an DEAE mit einem Gradienten (0-0,5 molar) von Triethylammoniumhydrogencarbonat fraktioniert. Nach Einrotieren der entsprechenden Fraktionen wird noch mehrmals mit Ethanol abrotiert, um das Triethyl· ammoniumhydrogencarbonat zu entfernen. Das erhaltene Triphospha.t kann bei -20 ⁰C ohn ; Abbauerscheinungen gelagert werden. Dir; UV-Absorption hat bei 265 nm ein Maximum, d^s sich beim Ansäuern durch Entacetalisierung zum 5-Formyl-dUyP in Richtung 280 nm verschiebt.

3. Herstellung von Biotin-o-amino-n-hexylamid

2 mMol 1,6-Hexamethylendiamin werden in 30 ml H._?0 gelöst. Dia Lösung wird durch Ansäuern auf einen pH-Wert von B-? nebracht, und es werden 0,2 mMol Biotin-N-hyJroxysuccinimid air; Lösung in 10 ml DMF zugegeben. Man läßt über Nacht bei RT stehen, rotiert dann im Vakuum ein, wäscht mit Ether, nimmt den Rest in wenig Wasser auf und fraktioniert an !Cieselgel 60 (5-40 pm, mit Isopropanol/Ammoniak-Lösung (25 %)/ W₇Q = 50/10/40, obere Phase), so daß das Produkt frei von Hexamethylendiamin isoliert werden kann. Die Fraktionierung wird vorteilhafterweise unter Anwendung von Überdruck durchgeführt (Flash-Chromatographie, HPLC).

4. Einbau von QdLJTP in eine DNA-Hybridisierungssonde mittels UNA-Polymerasen

Zwecks Bietinylierung einer Hybridisierungsprobe wurde ein rekombinantes Plasmid der pUC-Reihe mit einer für spätere Hybridisicrungs-

versuche geeigneten Sequenzinsertion verwendet. Der Einbau des DdUTP erfolgte mittels Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I in einem Reaktionsansatz von 20 μΐ, bestehend aus 0,5 μg denaturierter Plasmid-DNA, 10 ng M13-mp8-Sequenzierungsprimer oder alternativ 500 |jg 01 igonukleotidprimer mit randomisierter Sequenz, 3 μg bovinem Serumalbumin, je 40 μΜ dATP, dGTP und dCTP, 60 μΜ DdUTP, 3 μΜ dTTP, 75 mM Hepes-NaOH pH 7,55, 5 mM MgCl₂, 3,75 mM 2-Merkaptoethanol und 2,5 Einheiten Enzym. Nach einer einstündigen Reaktion wurde durch EDTA-Zugabe auf 5 mM abgestoppt, 15 η Mol Bioti-nhydrazid zugegeben und durch Essigsäurezusatz der pH auf 4 bis 4,5 gebracht. Nach einer Reaktionszeit von 14 bis 16 h wurde mii. Ammoniumcarbonat neutralisiert und über eine 5 ml-G 50-Säule fraktioniert. Die mit dem AusschluOvolumen gesammelte hochmolekulare DNA wurde in Hybridisierungsversuchen nach bekannten Verfahren eingesetzt. Die gebundene biotinylierte Sonden-DNA wurde nach mehreren Waschschrittan in 0,01 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 2 mM CaCl₂, 0,1 % Tween 20 bzw.Q,25 % Magermilchpulver und kurzzeitigem Backen bei 00 ⁰C für 30 min mit 20 pg/ml Streptavidin in gleichem Puffer zur Reaktion gebracht. Nach 3-fachem Waschen in Tris-HCl pH 7,5 erfolgte eine 30-minütige Inkubation in einer Lösung von biotinyliertem Protein A einer zuvor als geeignet bestimmten Verdünnung. Nach weiteren Waschungen und nochmaliger Inkubation mit Streptavidin, nefolgt von nochmaligen Waschschritten wurden die Flächenträger in einer geeigneten Verdünnung biotinylierter alkalischer Phosphatase aus Kälberdorm inkubiert¹. Der Nachweis gekoppelter alkalischer Phosphatase erfolgte nach weiteren Waschungen unter Einsatz von Brom-chlor-indoxylphosph? c und Nitroblfiu-Tetrazoliumsalz entsprechend allgemein üblicher Vorschriften.

5. Einbau von DdUTP in eine DNA-Hybridisierungssonde mittels terminals r Desoxynucleotidyltransferase

Zwecks Bicitinylierung einer Hybridisierungsprobe wurde das im Ausführungsbfiispiel 4 genannte rekombinante Plasmid mittels geeigneter Restrikticmsendonukleasen, die 3' -überhängende EnJen kreieren, geschnitten (in diesem Beispiel mit 5 Einheiten Pst I je [ig Plasmid-DNA). Nach üblichen Deproteinisierungs-, Ruinigungs- und Konzentrierungsiichritten wurde die linearisierte Plasmid-DNA (1 pg) in

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einem Reaktionsvolumen von 20 μΐ unter Einsatz terminaler Desoxy· nucleotidyltransferase mit DdU geschwänzt. Die Reaktion verlief für 30 min bei 37 ⁰C in 40 mM Cacodylatpuffer, pH 6,8 mit 10 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnSO₄, 0,1 mM DdUTP und 4 Einheiten Enzym. Nach Abstoppen der Reaktion wurde das DdU umgesetzt mit Biotin-6-aminohexylaiiid, in der Hybridisierung eingesetzt und zur Detektion geführt wie in Ausführungsbeispiel 4 beschrieben.

Claims (9)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von Polynukleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß man an der Seitenkette halogenierte Nukleoside in die Forrnylverbindungen oder deren geschützte Derivate wie das Hydrogensulfitaddukt, das Cyanhydrin, Thioacetale oder Vollacetale überführt, diese durch Phosphorylierung zu den entsprechenden Nukleotiden und anschließend durch weitere Phosphorylierung zu den Nukleosidtriphosphaten umsetzt, die Triphosphate mit Hilfe von Polymerasen, terminslen Transferasen oder anderen metabolisierenden Enzymen in Polynukleotide einbaut und nachfolgend Markergruppen, gegebenenfalls nach Abspaltung der Schutzgruppen, ankoppelt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, d.g., daß man als an der Seitenkette halogenierte Nukleoside 3', 5 ' -Di-O-acyl-5-dibrommethyl-2 '-desoxyuridin oder 2', 3', 5 ' -Tri-O-acyl-S-dibrommethylur.idin verwendet.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, d.g., daß man als geschützte Formylderivate cyclische Vollacetale durch Umsetzung mit Propandiol erhält.
4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, d.g., daß man cyclischs Vollacetale durch Umsetzung mit Glycol oder Brenzkatechin erhält.
5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, d.g., daß man die Phosphorylierung der geschützten Formylverbindungen zum Nukleotid unter Bedingungen durchführt, die eine saure Abspaltung der FormyI-Schutzgruppen und einen zusätzlichen Schutz der 3'-0H-Gruppe vermeiden.
6. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, d.g., daß man die weitere Phosphorylierung zum Triphosphat unter Bedingungen durchfuhr! , die eine saure Abspaltung der Formyl-Schutzgruppen vermeiden .
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der en7ymatische Hinbau der modifizierten Nukleosidtriphosphate nach Methoden wie z.B. der Nick-Translation, der cDNA-Synthese, der Primerextension, dem gap- oder end-filling unter

   Verwendung der entsprechenden Enzyme erfolgt.
8. 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, d.g., daß die Markierung des Polynukleotides mit einer Biotinverbindung, Fluorescinverbindung oder einem anderen Marker mit chromophorer oder fluophorer Gruppe über eine Azomethin-Bindung erfolgt, die gegebenenfalls mit z.B. Natriumbor,hydrid reduziert wird.

   Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, d.g., daß die Markierung der nach Einbau der modifizierten Nukleosidtriphosphate erhaltenen Polynuklsotide mit einem Partner einer immunologischen Reaktion erfolgt.
9. 10. Verfahren nach Anspruch 8, d.g., daß als Partner einer immunologischen Reaktion ein Hapten wie Biotin eingesetzt wird

   Jl. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, d.g., daß die Bindung des Markers an die modifizierten Strukturelemente im Poly· nukleosid über einen Spacer erfolgt.

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