DD265429A1

DD265429A1 - PROCESS FOR THE NONTRADIOACTIVE MARKING OF POLYNUCLEOTIDES

Info

Publication number: DD265429A1
Application number: DD30742087A
Authority: DD
Inventors: Ernst Reiss; Dieter Baerwolff; Robert-Mathias Leiser; Stephan Heymann
Original assignee: Adl Inst Phytopathologie
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1987-09-30
Publication date: 1989-03-01

Abstract

Es wird ein Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von Polynukleotiden beschrieben. Erfindungsgemaess werden an der Seitenkette halogenierte Nukleoside in die Formylverbindungen oder deren geschuetzte Derivate ueberfuehrt, diese durch Phosphorylierung zu den Nukleosidtriphosphaten umgesetzt, die modifizierten Triphosphate enzymatisch in Polynukleotide eingebaut und nachfolgend, gegebenenfalls nach Abspaltung einer Schutzgruppe, mit einer Markergruppe gekoppelt. Die nach diesem Verfahren hergestellten Polynukleotide koennen in Sondentests zum Nachweis von Polynukleotid-Hybridisierungen verwendet werden.A method for the non-radioactive labeling of polynucleotides is described. According to the invention, halogenated nucleosides are converted into the formyl compounds or their protected derivatives on the side chain, these are converted by phosphorylation to the nucleoside triphosphates, the modified triphosphates are enzymatically incorporated into polynucleotides and subsequently, optionally after cleavage of a protective group, coupled with a marker group. The polynucleotides produced by this method can be used in probe assays to detect polynucleotide hybridizations.

Description

1. Titel der Erfindung1st title of the invention

Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von PolynukleotidenMethod for the non-radioactive labeling of polynucleotides

2. Anwendungsgebiet der Erfindung2. Field of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von Polynukleotiden als molekulare Hybridisierungssenden. Diese finden neben der wissenschaftlichen Anwendung auch in Medizin, Landwirtschaft und Lebensmittelindustrie zur viralen und bakteriellen Diagnostik zunehmend praktische Nutzung.The invention relates to a method for the non-radioactive labeling of polynucleotides as molecular hybridization ends. In addition to scientific application, these are increasingly being used in practical applications in viral and bacterial diagnostics in medicine, agriculture and the food industry.

3. Charakteristik des bekannten Standes der Technik3. Characteristic of the known state of the art

Allgemein im Gebrauch ist die radioaktive Markierung für den Nachweis von Molekularsonden nach deren Hybridisierung mit der gesuchten Polynukleotidsequenz. Dieses Verfahren erfordert aber apparativen Aufwand, ss ist teuer, birgt gesundheitliche Risiken und erfordert die Beachtung der relativ kurzen Halbwertzeiten. Dazu sind in der wissenschaftlichen und Patentliteratur zahlreiche Alternativen angeboten worden, die i.a an einer speziellen Stelle im Polynukleotid und auf einer bestimmten Stufe der Präparation der Sonde eine Markierung mit einer bestimmten Signalsubstanz (Antigen, Hapten, Antikörper, Enzym, Fluorophor, Chemilumineszenzkatalysator u.a.) vornehmen, die entweder direkt oder indirekt nachweisbar ist. Der direkte Nachweis, z.B. über eine Markierung mit einem Fluorophor, erreicht nicht die Empfindlichkeit, der indirekten Methoden. Für die indirekte Indikation wird i.a. ein Enzym vorgeschlagen, das durch Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Lichtsignal liefert. Das Enzym kann unmittelbar als Marker an der Sonde gebunden sein. Günstiger für die Nachweisempfindlichkeit aber ist der Aufbau einer serologischen Nachweiskette, ausgehend von dem Partner einer immunologischen Reaktion, der die Sonde markiert, und endend an einem Konjugat, das ein Enzym zur Indikation mittels eines Substrates enthältGenerally in use, the radioactive label is for the detection of molecular probes after their hybridization with the desired polynucleotide sequence. However, this method requires equipment expenditure, it is expensive, carries health risks and requires attention to the relatively short half-lives. For this purpose, numerous alternatives have been offered in the scientific and patent literature, which generally make a mark with a specific signal substance (antigen, hapten, antibody, enzyme, fluorophore, chemiluminescent catalyst, etc.) at a specific location in the polynucleotide and at a certain stage of preparation of the probe which is either directly or indirectly detectable. Direct detection, e.g. over a marker with a fluorophore, does not reach the sensitivity of indirect methods. For the indirect indication i.a. proposed an enzyme which provides a detectable light signal by reaction with a substrate. The enzyme can be bound directly as a label on the probe. More favorable for detection sensitivity, however, is the construction of a serological detection chain starting from the partner of an immunological reaction which labels the probe and ending with a conjugate containing an enzyme for indication by means of a substrate

Für die vorliegende Erfindung sind Publikationen relevant, For the present invention publications are relevant,

die eine Markierung an der 5-Position von Pyrimidinbausteinen der Polynukleotidsonden zum Ziel haben. Derartig modifizierte Nukleotidbausteine lassen sich in vivo und in vitro gut in Sonden einbauen, da die chemisch modifizierten Positionen mit den Erkennungsregionen der für den Einbau verantwortlichen Enzyme und mit der Wasserstoffbrückenbindung zwischen Sonde und Zielsequenz vergleichsweise wenig interferieren". Es gibt zwar auch die Möglichkeit, ein modifiziertes Nukleotid chemisch, z.B. mit einem Syntheseautomaten, in eine Oligonukleotidsondeeinzubauen und dann zu markieren (WO 84/03285, J.L. Ruth), doch der Länge dc3s Oligonukleotides und damit der Stärke der mit ihr angestrebten Hybridisierung sind nach dieser Verfahrensweise Grenzen gesetzt.which have a target at the 5-position of pyrimidine building blocks of Polynukleotidsonden. Such modified nucleotide building blocks can be well incorporated into probes in vivo and in vitro, since the chemically modified positions interfere with the recognition regions of the enzymes responsible for the incorporation and with the hydrogen bond between probe and target sequence comparatively little. "Although there is also the possibility of modified nucleotide chemically, for example, with an automatic synthesizer to install and then mark in an oligonucleotide probe (WO 84/03285, JL Ruth), but the length dc3s oligonucleotide and thus the strength of their intended hybridization are limited by this procedure.

Bekannt sind Methoden, die eine chemische Markierung erst an dem unveränderten Polynukleotid vornehmen, wobei vornehmlich Cytosin und Adenin (EP 138357, G.M. Landes), Cytosin (DOS 3431536, H. Graf) oder Guanin (EP 172153, CW. Adams et al.) chemisch derivatisiert werden. Die dazu verwendeten chemischen Reaktionen lassen erwarten, daß die Intaktheit des Polynukleotides und damit auch desse.i Hybridisierung beeinträchtigt werden.Methods are known which carry out a chemical labeling only on the unmodified polynucleotide, cytosine and adenine being predominant (EP 138357, GM Land), cytosine (DOS 3431536, H. Graf) or guanine (EP 172153, CW Adams et al.). be chemically derivatized. The chemical reactions used can be expected to affect the integrity of the polynucleotide and thus desse.i hybridization.

D.C. Ward et al. (FP 63879) beschreiben eine Methode zur Markierung von Nukleotiden an den Basen Thymin, Cytosin und Uracil mit Biotin. Die so markierten Nukleosidtriphosphate werden enzymatisch in die Polynukleotidsonde inkorporiert. Bei der Herstellung der markierten Nukleotide geht man vorzugsweise von UTP oder dUTP aus, an die in C-5 Position über eine metallorganische Zwischenstufe ein Allylamin synthetisiert wird, woran ein aktivierter Biotinylester koppeln kann. Das Syntheseverfahren ist relativ kostspielig und aufwendig. Die enzymatischen Einbauraten der markierten Nukleosidtriphosphate in die Sondensequenz sind nicht sehr hoch bzw. die gewonnenen PoIynukleotidketten nicht ausreichend ling. P. Kourilsky et al. (USP 4581333) koppelten 'u'tec eine Cytochrom C-Brücke z.B. Biotin an das Polynukl&otid. In ähnlicher Weise verknüpfte M. Renz (EMBO J. 3 (1983) 817-822) biotinyliertes Histon Hl und das PolynuUleotid mit Hilfe von Glutardialdehyd. M. Renz und C. Kurz (Nucleic Acids Res. 12 (1984) 3435-3444) ketteten dasDC Ward et al. (FP 63879) describe a method for labeling nucleotides at the bases thymine, cytosine and uracil with biotin. The thus labeled nucleoside triphosphates are enzymatically incorporated into the polynucleotide probe. The preparation of the labeled nucleotides is preferably started from UTP or dUTP, to which an allylamine is synthesized in C-5 position via an organometallic intermediate, to which an activated biotinyl ester can couple. The synthesis process is relatively expensive and expensive. The enzymatic incorporation rates of the labeled nucleoside triphosphates into the probe sequence are not very high or the polynucleotide chains obtained are not sufficient. P. Kourilsky et al. (USP 4,581,333) coupled 'u'tec a cytochrome C-biotin bridge, for example to the Polynukl & otid. Similarly, M. Renz (EMBO J. 3 (1983) 817-822) linked biotinylated histone HI and the polynucleotide with glutaraldehyde. M. Renz and C. Kurz (Nucleic Acids Res. 12 (1984) 3435-3444) chained the

Markerenzym an Polyethylenimip m it Hilfe von p-Benzochinon und die resultierenden Konjugate wurden mit Glutaraldehyd an DNA gebunden. Nach diesen Vorschlägen ergibt sich jeweils ein ungünstig hohes Protein/Polynukleotid-Massenverhältnis, das die Hybridisierung erschwer* und damit die Nachweisempfindlichkeit beeinträchtigen kann. Außerdem werden nun die Bedingungen für die Hybridisierung durch die Stabilität der gebundenen Enzyme begrenzt.Marker enzyme on polyethyleneimip with the aid of p-benzoquinone and the resulting conjugates were bound to DNA with glutaraldehyde. According to these proposals results in each case an unfavorably high protein / polynucleotide mass ratio, which complicates the hybridization * and thus can affect the detection sensitivity. In addition, the conditions for hybridization are now limited by the stability of the bound enzymes.

D. Engelhardt et al. (EP 97373) beanspruchen die chemische Markierung von Nukleotiden mit einer Signalsubstanz mit dem Ziel, die markierten Nukleotide in ein Polynukleotid einzubauen, sowie den Einbau einer Signalsubstanz über Brückenglieder an nicht modifizierte Polynukleotide. In den Anspruch auf Nukleotide, die mit einer Signalsubstanz markiert sind, werden die Methoden zur Markierung von Nukleotiden ne~h D.G. Ward (EP 63879) mit aufgenommen. Die Technik, bereits das Nukleotid mit einer Signalsubstanz zu versehen, bringt i.a. aufgrund des Volumenbedarfs von Linker oder Spacer und Signalsubstanz Beeinträchtigungen beim enzymatisichen Einbau in ein Polynukleotid mit sich.D. Engelhardt et al. (EP 97373) claim the chemical labeling of nucleotides with a signal substance with the aim to incorporate the labeled nucleotides in a polynucleotide, as well as the incorporation of a signal substance via bridge members to unmodified polynucleotides. In the claim on nucleotides labeled with a signal substance, the methods for labeling nucleotides ne ~ h D.G. Ward (EP 63879). The technique of already providing the nucleotide with a signal substance brings i.a. due to the volume requirement of linker or spacer and signal substance impairments in Enzymatisichen incorporation into a polynucleotide with it.

Modifizierte Nukleosidtriphosphate, die enzymatisch in ein Polynuklentid inkorporiert werden sollen, müssen neben ihrer späceren Funktion in dem Polynukleotid noch gewisse Voraussetzungen aufweisen, die sie für einen enzymatischen Einbau i ι das Polynukleotid geeignet machen. So dürfen sie die Erkennungsreaktion der für den Einbau verantwortlichen Enzyme nicht stören und sie sollten gegenüber diesen Enzymen keine andere Reaktivität als die eines Substrates besitzen. Diesem Anspruch werden nur Veränderungen am Nukleotid gerecht, die keine sterischen Hinderungen mit sich bringen, d.h. mit der Modifizierung des Nukleotides sollten möglichst nur kleine Gruppen eingeführt werden. Nukleosidtriphosphate mit raumausfüHenden Gruppen wie Biotin werden in unmittelbarer Nachfolge nur sehr langsam enzymatisch eingebaut. Außerdem darf die Reaktivität dieser neuen Gruppen oder Atome die enzymatischem Inkorporation in das Polynukleotid nirht stören bzw. sie muß maskiert (mit Schutzgruppen versehen) vorliegen.Modified Nukleosidtriphosphate that are to be incorporated enzymatically into a Polynuklentid, in addition to their later function in the polynucleotide still have certain conditions that make them suitable for enzymatic incorporation i ι the polynucleotide. Thus, they must not interfere with the recognition reaction of the enzymes responsible for the incorporation and they should have no reactivity to these enzymes other than a substrate. This claim is met only by nucleotide changes that do not involve steric hindrance, i. with the modification of the nucleotide, only small groups should be introduced if possible. Nucleoside triphosphates with space-carrying groups such as biotin are only very slowly enzymatically incorporated in immediate succession. In addition, the reactivity of these new groups or atoms should not interfere with the enzymatic incorporation into the polynucleotide or it must be masked (capped).

Die Aufgabe der modifizierten Nukleotide im Poiynukleotid besteht darin, eine Markierung für das Poiynukleotid aufzunehmen. Mit der Markierung erreicht man, daß gesuchte PoIynukleotidsequenzen über eine Hybridisierung mit der markierten Polynukleotidsequenz im Falle einer komplementären Basenfolge bestimmbar werden.The task of the modified nucleotides in the polynucleotide is to include a label for the polynucleotide. With the marking it is achieved that desired polynucleotide sequences can be determined by hybridization with the labeled polynucleotide sequence in the case of a complementary base sequence.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein kostengünstiges und wenig aufwendiges Verfahren zur nichtradioaktiven Markierung von PoIynukleotiden zu entwickeln. Die' Anwendung der Erfindung für Hybridisierungstests soll den Einsatz radioaktiver Substanzen erübrigen und eine hohe Nachweisampfindlichkcit garantieren.The aim of the invention is to develop a cost-effective and inexpensive procedure for the non-radioactive labeling of poly-nucleotides. The application of the invention for hybridization tests should eliminate the use of radioactive substances and guarantee a high detection sensitivity.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Nukleotid so zu modifizieren, daß es sich zum einen leicht enzymatisch in ein Poiynukleotid einbauen läßt und zum anderen im Poiynukleotid mit verschiedenen Markern zur Umsetzung gebracht werden kann, ohne das andere Bausteine oder Bindungen im Poiynukleotid angegriffen werden, um dieses Poiynukleotid für einen Nachweis in einer Testprobe zugänglich zu machen.The present invention has for its object to modify a nucleotide so that it can be easily enzymatically incorporated into a Poiynukleotid and on the other hand in Poiynukleotid with different markers can be implemented without the other building blocks or bonds are attacked in Poiynukleotid to make this polynucleotide available for detection in a test sample.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man an der Seitenkette halogenierte Nukleoside in die Forrnylvertundüngen oder in deren geschützte Derivate überführt. Anschließend werden diese zu den entsprechenden Nukleotiden phosphoryliert und durch weitere Phosphorylierung zu den entsprechenden Nukleosidtriphosphaten umgesetzt. Das Triphosphat wird mit Hilfe von Polymerasen oder anderen metabolisierenden Enzymen in PoIynukleotide eingebaut und im Anschluß wird eine Markergruppe, ggf. nach Abspaltung der Schutzgruppen eingebaut. Die wichtigsten Verfahrensschritte bei der Herstellung eines markierten Polynukleotides werden durch die Zeichnung verdeutlicht.According to the invention, the object is achieved by converting halogenated nucleosides on the side chain in the Forrnylvertundüngen or in their protected derivatives. These are then phosphorylated to the corresponding nucleotides and converted by further phosphorylation to the corresponding nucleoside triphosphates. The triphosphate is incorporated into polynucleotides with the aid of polymerases or other metabolizing enzymes and subsequently a marker group is incorporated, if appropriate after cleavage of the protective groups. The most important process steps in the preparation of a labeled polynucleotide are illustrated by the drawing.

Die durch Halogenierung erhaltenen Dihalogenalkylderivate, Vorzugs; weise 3',5' -Di-O-acyl-S-dibrommethyl-^ '-desoxyuridine, lassen sich mit einer Vielzahl von Verbindungen zu Produkten umsetzen, die erfindungsgemäß noch eine Reaktivität besitzen,The dihaloalkyl derivatives obtained by halogenation, preferred; 3 ', 5' -di-O-acyl-S-dibromomethyl- '' -deoxyuridine, can be reacted with a variety of compounds to products that still have a reactivity according to the invention,

die zum einen nicht so hoch sein darf, daß sie die nachfolgenden Reaktionen einschließlich des enzymatischen Einbaus in ein Polynukleotid stört, zum anderen aber ausreichend ist, zur Bindung eines Markers. So werden die halogenieren Nukleoside nach an sich bekannten Methoden in die entsprechenden Formylverbindungen überführt, ts ist jedoch günstiger, die Formvlgruppe zu schützen, z.B. als Acetal, als Hydrogensuifitaddukt, als Cyanhydrin u.a.. Es lassen sich die cyclischen Vollacetale auch direkt aus den Halogenverbindungen durch Umsetzung mit vorzugsweise Propandiol oder Glycol herstellen .which on the one hand must not be so high that it disturbs the subsequent reactions, including the enzymatic incorporation into a polynucleotide, but on the other hand is sufficient for the binding of a marker. Thus, the halogenated nucleosides are converted into the corresponding formyl compounds by methods known per se, but it is more advantageous to protect the formyl group, e.g. as acetal, as Hydrogensuifitaddukt, as Cyanhydrin u.a .. It can be the cyclic Vollacetale also directly from the halogen compounds by reaction with preferably propanediol or glycol produce.

Die derart modifizierten Nukleoside werden unter Beachtung der Stabilität des ieweiligen Nukleosides zum Triphosphat gebrac. t. So ist es wichtig, bei der Mono- und Triphosphorylierung ein Arbeiten im Sauren zu umgehen.The nucleosides modified in this way are converted into the triphosphate, taking into account the stability of the internal nucleoside. t. So it is important to work in the acidic mono- and triphosphorylation.

Der enzymatische Einbau der modifiziert^n Nukleotide erfolgt nach bekannten Methoden wie der Nick-Translation von DNA unter Verwendung von E. coli DNA-Polymerase, durch Auffüllen zurückgesetzter 3'-Enden, wie sie durch Behandlung mit gewissen Restriktionsenzymen entstehen, durch Verwendung des großen (KIenow)Fragmentes von E.coil· Polymerase oder durch die 3'-terminale Addition der modifizierten Nuklciotide mit Hilfe der terminalen DMA-Tranpferase. Gas so erhaltene modifizierte Polynukleotid ist der Hräkursor für eine breite Vielzahl von markierten Poly !U k lfjo ti den.The enzymatic incorporation of the modified nucleotides is carried out by known methods, such as nick translation of DNA using E. coli DNA polymerase, by replenishment of recessed 3 'ends, as formed by treatment with certain restriction enzymes, by use of the large (KIenow) fragment of E. coil polymerase or by the 3'-terminal addition of modified Nuklciotide using the terminal DMA Tranpferase. Gas modified polynucleotide thus obtained is the precursor for a wide variety of labeled polylactides.

Die Markierung der Polynukleoti.de erfolgt erfindungsgemäß nach Einbau der modifizierten Nukleo+ide in Abstimmung mit dem späteren Verwendungszweck der markierten Folynukleotide mit Substanzen, die neben dem Marker selbst eine zur Reaktion mit den modifizierten Orten des Polynukleotides geeignete Gruppe besitzt. Sie erfolgt z.B. mit Biotin, Fluorescin oder einem anderen Marker mit chromophorer oder fluorophurer Gruppe über eine A/omethin-Bindung, die ggf. mit Natriumborhydrid reduziert wird.According to the invention, the labeling of the polynucleotide.de is carried out after incorporation of the modified nucleotide in coordination with the later intended use of the labeled folinucleotides with substances which, in addition to the marker itself, possess a group suitable for reaction with the modified sites of the polynucleotide. It takes place e.g. with biotin, fluorescein or another marker with a chromophoric or fluorophore group via an omethine bond, which may be reduced with sodium borohydride.

In allem Fällen kommt die Reaktion, welche zur Markierung führt, dadurch zustande, dqß das Polynukleotid durch den Einbau rnodifizierier Nukleotide Stellen aufweist, die der Reaktion mit nukleophilen Reagenzien, wie Aminen oder Hydraziden, zugänglich sind, entweder unmittelbar oaer erst nach Entfernen derIn all cases, the reaction leading to labeling is due to the polynucleotide having sites accessible by reaction of modified nucleotides which are amenable to reaction with nucleophilic reagents such as amines or hydrazides, either immediately or only after removal of the nucleotides

Schutzgruppe. Dafür ist die 5-Formylgruppe an einer Pyrimidinbase ein Beispiel.Protecting group. For example, the 5-formyl group on a pyrimidine base is an example.

Der Marker ist mit entsprechenden Agenzien qualitativ und quantitativ nachweisbar. Der Marker kann aber auch so beschaffen sein, daß er selbst Signale für einen Nachweis liefern kann. Das trifft zu für chromophore oder fluorophore Gruppen, doch auch für Proteine wie das Ferritin, das im Elektronenmikroskop als elektronendichtes Material erkennbar wird. Gebräuchlicher sind indirekte Nachweise, die von einem' Marker ausgehen, welcher mit weiteren Agenzien unter Bildung nachweisbarer Signale reagiert. In diesen Fällen sind die Marker Proteine, die nach Kontakt mit Substraten einen spcktroskopischen Nachweis gestatten, odsr es sind Partner einer immunologischen oder Rezeptor-Akzyptor Reaktion, die in bekannter Weise bestimmt werden können. Mit einer immunologischen Nachweiskette, wie man sie z.B. von der ELISA-Technik her kennt» kann eine entsprechende Empfindlichkeit des Testes erreicht werden. Solche Markierungen erlauben z.B. den Nachweis ethioüogischer Agenzien, die ein Polynukleotid enthalten bzw. deren Aktivität mit dem Auftreten eines Polynukleotides korreliert.The marker can be qualitatively and quantitatively detected with appropriate agents. The marker may also be such that it can provide signals for detection itself. This is true for chromophore or fluorophore groups, but also for proteins such as ferritin, which is recognizable by electron microscopy as an electron-dense material. More common are indirect evidence that assumes a 'marker, which reacts with other agents to form detectable signals. In these cases, the markers are proteins which, after contact with substrates, permit spotting-microscopic detection, or they are partners of an immunological or receptor-acycptor response, which can be determined in a known manner. With an immunological detection chain, as they are e.g. known from the ELISA technique, »a corresponding sensitivity of the test can be achieved. Such markings allow e.g. the detection of ethological agents that contain a polynucleotide or whose activity correlates with the appearance of a polynucleotide.

Es ist in vielen Fällen von Vorteil, bei der Aufnahme eines Markers mit den genannten Funktionen in das Polynukleotid auch einen entsprechend dimensionierten Spacer zu berücksichtigen, damit eine gewisse Beweglichkeit und Reaktionsbereitschaft des Markers für die weiteren Nachweisreaktionen gegeben sind. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird diesem Spacer ein gewisser Grad an Hydrophilie mitgegeben, um bei Hybridisierungen unspezifische Wechselwirkungen, z.B. mit dem Träger, zu vermeiden.It is advantageous in many cases, when taking a marker with said functions into the polynucleotide, to also take into account a suitably dimensioned spacer, so that a certain mobility and reactivity of the marker for the further detection reactions are given. In the context of the present invention, this spacer is given a certain degree of hydrophilicity in order to avoid nonspecific interactions in hybridizations, e.g. with the carrier, to avoid.

Ein bevorzugter Weg dieser Erfindung besteht darin, 3' , 5' Di-D-acetylthymin-2'-desoxyribosid zum 3 ' , 5'-Di-O-acetyl-5-dibromrnethyl-2 '-desoxyuridin zu bromieren. Daraus läßt sich hydrolytisch 5-Formyl-2' -desoxyuridxn gewinnen, das zwar als Triphosphat auch direkt in ein Polynukleotid inkorporiert werden kann - es ist jedoch günstiger, die Formylgruppe zu schützen, z.B. als Acetal, als Hydrogensulfitaddukt, als Cyanhydrin u.a..A preferred route of this invention is to brominate 3 ', 5'-di-D-acetylthymine-2'-deoxyriboside to give 3', 5'-di-O-acetyl-5-dibromo-methyl-2'-deoxyuridine. From this it is possible to obtain hydrolytically 5-formyl-2'-deoxyuridine which, although it can also be incorporated directly into a polynucleotide as a triphosphate, it is more favorable to protect the formyl group, e.g. as acetal, as Hydrogensulfitaddukt, as cyanohydrin u.a ..

Nach Einbau des geschützten 5-Formyl-2'-desoxyuridintripbosphates läßt sic'.i die Schutzgruppe leicht wieder abspalten, so daß für die Markierungsreaktion eine reaktive Aldehydgruppe "ur Verfügung steht. So entsteht aus 3',5'-üi-0-acetyl-5-dibrommethyl-2'-deso >yuridin und 1, 3-Propandiol ein cyclisches Vollacetal, das sich phosphorylieren läßt zum 5-(2-(l,3-Dioxany]))-2^l-desoxyuridin-5'-triphosphat.After incorporation of the protected 5-formyl-2'-deoxyuridine triphosphate, sic'.i readily cleaves off the protective group so that a reactive aldehyde group is available for the labeling reaction to give 3 ', 5'-di-O-acetyl 5-dibromomethyl-2'-desioduridine and 1, 3-propanediol is a cyclic acetal which can be phosphorylated to give 5- (2- (1,3-dioxany))) - 2 ^l -deoxyuridine-5'-triphosphate ,

Die Vorteile des Verfahrens liegen darin, daß die erfindungsgemäß modifizierten Nukleotide die Erkennungsreaktion der für den Einbau verantwortlichen Enzyme nicht stören und auch gegenüber diesen Enzymen keine andere Reaktivität als die eines Substrates besitzen.The advantages of the method are that the nucleotides modified according to the invention do not interfere with the recognition reaction of the enzymes responsible for the incorporation and also have no reactivity towards these enzymes other than that of a substrate.

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Bei den folgenden Spezifikationen handelt es sich um praktische Beisoiele, die die Besonderheiten des vorliegenden Verfahrens illustrieren, aber den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.The following specifications are practical examples which illustrate the specifics of the present process but are not intended to limit the scope of the invention.

1. Herstellung von 5(2-(1,3-Dioxanyl) )-2'-desoxyuridin1. Preparation of 5 (2- (1,3-dioxanyl)) -2'-deoxyuridine

1 mMol 3 ' ,5 '-Di-O-acetyl-2'-desoxythymidin wird in 200 ml Dicliloräthan mit 2,2 mMoi Brom unter Verwendung einer Lichtquelle bromiert. Nach dem Abrotieren des Lösungsmittels wird der Rückstand in 10 ml absolutem Dioxan aufgenommen und in eine Lösung1 mmol of 3 ', 5'-di-O-acetyl-2'-deoxythymidine is brominated in 200 ml of diclilorethane with 2.2 mmol of bromine using a light source. After the solvent has been removed by evaporation, the residue is taken up in 10 ml of absolute dioxane and poured into a solution

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von 1,1 mMol Propandinlc'?,5 mMol Diisopropyläthylamin und 10 ml absolutem Dioxan bei 20 ⁰C zugetropft. Nach 16 Stunden wird die Lösung einrotiert. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und mit wässriger Bicarbonatlösung extrahiert. Die getrocknete Chlgroformlösung wird einrotiert, der Rückstand an Kieselgel 60 chromatographiert (100 ^ Kieselgel 60 (Merck), 0,06 - 0,2 mm, Essigsäureäthylester mit 0,5 \ Triäthylamin als Laufmittel). Das reine 5(2-( .1, 3-Dioxanyl) )-2 ' -desoxy-3 ' 5 ' -0-acetyl-uridin hat einen Schmelzpunkt von 168 - 72 ⁰C und einen ⁿf-Wert von 0,6 auf DC-Kieselge Lnlatte (Merck ^F25/p' ^^e Entacylierung wird mit einer 10 %igen Lösung von Triäthylamin in absolutem Methanol bei 2O⁰C in 24 h oder nach 1 h Rückfluß durchgeführt. Nach dem Einrotieren und Kodestillieren mit Toluol kann der Rückstand für die weitere Phosphorylierung direkt eingesetzt werden.of 1.1 mmol Propandinlc ', 5 mmol diisopropylethylamine and 10 ml of absolute dioxane at 20 ⁰ C added dropwise. After 16 hours, the solution is evaporated. The residue is taken up in chloroform and extracted with aqueous bicarbonate solution. The dried Chlgroformlösung is concentrated by rotary evaporation, the residue chromatographed on silica gel 60 (100 ^ silica gel 60 (Merck), 0.06 - 0.2 mm, ethyl acetate with 0.5 \ triethylamine as the eluent). The pure 5 (2- (.1, 3-dioxanyl)) -2'-deoxy-3'5'-O-acetyl-uridine has a melting point of 168-72 ⁰ C and an ⁿ f value of 0.6 on DC-Kieselge slab (Merck ^F 25 / p ') ^e deacylation is carried out with a 10% solution of triethylamine in absolute methanol at 2O ⁰ C in 24 h or after 1 h reflux After rotation and codistillation with toluene of the Residue for further phosphorylation be used directly.

2. Umsetzung zum 5(2-(1,3-Dioxanyl))-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (GdUTP)2. Reaction to 5 (2- (1,3-dioxanyl)) - 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate (GdUTP)

0,5 mMol 5(.2-(1, 3-Dioxanyl) )-2 ' -desoxyuridin werden zusammen mit 0,6 mMol Cyanäthylphosphat mit 10 ml absolutem Pyridin je 3 mal einrotiert. Zum Rückstand werden 3 mMol Dicyclohexylcarbodiimid und 0,5 mMol Diisopropyläthylamin in 5 ml Pyridin gegeben. Nach ca. 50 h bei 20 ° werden 1,5 ml H„0 zugegeben. 30 Minuten später wird bis zur Trockne im Vakuum einrotiert, dann in 5 ml Wasser aufgenommen, der unlösliche Rest wird mit 2 weiteren kleinen Wasserportionen gewaschen. Die vereinigten Überstände (10 - 15 ml) werden mit ca. 5 ml Triethylamin versetzt, über Nacht geschüttelt, dann einrotiert und schließlich in wenig 0,5 %iger wäßriger Triethylamin-Lösung aufgenommen. Die Lösung wird an DEAE-Sephadex A fraktioniert mit Hilfe eines Gradienten (0-0,3 mol) von Triethylammoniumhydrogencarbonav. Nach wiederholtem Abrotieren (mit Ethanol)0.5 mmol 5 (.2- (1, 3-dioxanyl)) -2 'desoxyuridine are rotary evaporated together with 0.6 mmol Cyanäthylphosphat with 10 ml of absolute pyridine 3 times. To the residue are added 3 mmol of dicyclohexylcarbodiimide and 0.5 mmol of diisopropylethylamine in 5 ml of pyridine. After about 50 h at 20 °, 1.5 ml H "0 are added. 30 minutes later it is evaporated to dryness in vacuo, then taken up in 5 ml of water, the insoluble residue is washed with 2 more small portions of water. The combined supernatants (10 - 15 ml) are mixed with about 5 ml of triethylamine, shaken overnight, then evaporated and finally taken up in a little 0.5% aqueous triethylamine solution. The solution is fractionated on DEAE-Sephadex A using a gradient (0-0.3 mol) of triethylammonium bicarbonate. After repeated evaporation (with ethanol)

der gesammelten mit DC als positiv auf Monophosphat getesteten Fraktionen erhält man das Triethylammoniucsalz des Dioxanyldesoxyuridinmonophosphates. Zur Triphosphory1ierung (im wesentlichen nach Hoard u. ütt(1965)) werden 0,4 mMol des 5(2-(1.3-Dioxany1))-2'-desuxyuridin-5'-monophosphat-Triethylammoniumsalzes mit 4 ml Dimethylformamid (DMF) und 0,5 mMol Tributylamin versetzt und unter wiederholter Zugabe von DMF mehrmals einrotiert. Schließlich wird in DMF aufgenommen, 2 niMol Carbonyldiimidazol in 4 ml DMF zugegeben und 4 h geschüttelt. Danach werden 3,2 mM Methanol zugegeben. Nach 30 Minuten werden unter starkem Rühren 2 mM Tributylammoniumphosphat in 20 ml DMF zugegeben und die Mischung wird 1 Tag im Exsiccator belassen. Das ausgefallene Imidazoliumpyrophosphat wird mit mehreren DMF-Portionen gewaschen, die vereinigten Überstände werden im Volumenverhältnis 1:1 mit Methanol behandelt und einrotiert. 0er Rest wird in 0,5 ^iger wäßriger Triethylaminlösung aufgenominen und an DEAE mit einem Gradienten (0-0,5 molar) von Triethylammoniumhydrogencarbonat fraktioniert. Nach Einrotieren der entsprechenden Fraktionen wird noch mehrmals mit Ethanol abrotiert, um das Triethyl· ammoniumhydrogencarbonat zu entfernen. Das erhaltene Triphospha.t kann bei -20 ⁰C ohn ; Abbauerscheinungen gelagert werden. Dir; UV-Absorption hat bei 265 nm ein Maximum, d^s sich beim Ansäuern durch Entacetalisierung zum 5-Formyl-dUyP in Richtung 280 nm verschiebt.the collected fractions tested positive with DC for monophosphate gives the triethylammonium salt of dioxanyl deoxyuridine monophosphate. For Triphosphory1ierung (essentially according to Hoard and utt (1965)) 0.4 mmol of 5 (2- (1.3-Dioxany1)) - 2'-deuxyuridin-5'-monophosphate triethylammonium salt with 4 ml of dimethylformamide (DMF) and 0.5 mmol of tributylamine and rotated several times with repeated addition of DMF. Finally, it is taken up in DMF, 2 niMol carbonyldiimidazole added in 4 ml of DMF and shaken for 4 h. Thereafter, 3.2 mM methanol are added. After 30 minutes, 2 mM tributylammonium phosphate in 20 ml of DMF are added with vigorous stirring and the mixture is left for 1 day in a desiccator. The precipitated imidazolium pyrophosphate is washed with several portions of DMF, the combined supernatants are treated in a volume ratio of 1: 1 with methanol and concentrated by rotary evaporation. The residue is taken up in 0.5% strength aqueous triethylamine solution and fractionated on DEAE with a gradient (0-0.5 molar) of triethylammonium hydrogencarbonate. After the appropriate fractions have been evaporated, the mixture is rotary evaporated several times with ethanol in order to remove the triethylammonium hydrogencarbonate. The resulting Triphospha.t can at -20 ⁰ C without; Degradation phenomena are stored. To you; UV absorption has a maximum at 265 nm, which shifts to 5-formyl-dUyP in the direction of 280 nm upon acidification by deacetalization.

3. Herstellung von Biotin-o-amino-n-hexylamid3. Preparation of biotin-o-amino-n-hexylamide

2 mMol 1,6-Hexamethylendiamin werden in 30 ml H._?0 gelöst. Dia Lösung wird durch Ansäuern auf einen pH-Wert von B-? nebracht, und es werden 0,2 mMol Biotin-N-hyJroxysuccinimid air; Lösung in 10 ml DMF zugegeben. Man läßt über Nacht bei RT stehen, rotiert dann im Vakuum ein, wäscht mit Ether, nimmt den Rest in wenig Wasser auf und fraktioniert an !Cieselgel 60 (5-40 pm, mit Isopropanol/Ammoniak-Lösung (25 %)/ W₇Q = 50/10/40, obere Phase), so daß das Produkt frei von Hexamethylendiamin isoliert werden kann. Die Fraktionierung wird vorteilhafterweise unter Anwendung von Überdruck durchgeführt (Flash-Chromatographie, HPLC).2 mmol of 1,6-hexamethylenediamine are dissolved in 30 ml of H. _? 0 solved. Dia solution is made by acidifying to a pH of B-? and 0.2 mmol of biotin-N-hyroxysuccinimide air; Solution in 10 ml DMF added. It is allowed to stand at RT overnight, then it is rotated in vacuo, washed with ether, the residue is taken up in a little water and fractionated on silica gel 60 (5-40 μm, with isopropanol / ammonia solution (25 %) / W ₇ Q = 50/10/40, upper phase), so that the product can be isolated free of hexamethylenediamine. The fractionation is advantageously carried out using positive pressure (flash chromatography, HPLC).

4. Einbau von QdLJTP in eine DNA-Hybridisierungssonde mittels UNA-Polymerasen4. Incorporation of QdLJTP in a DNA hybridization probe using UNA polymerases

Zwecks Bietinylierung einer Hybridisierungsprobe wurde ein rekombinantes Plasmid der pUC-Reihe mit einer für spätere Hybridisicrungs-For bidietylation of a hybridization probe, a recombinant pUC-series plasmid was designed with one for subsequent hybridization.

versuche geeigneten Sequenzinsertion verwendet. Der Einbau des DdUTP erfolgte mittels Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I in einem Reaktionsansatz von 20 μΐ, bestehend aus 0,5 μg denaturierter Plasmid-DNA, 10 ng M13-mp8-Sequenzierungsprimer oder alternativ 500 |jg 01 igonukleotidprimer mit randomisierter Sequenz, 3 μg bovinem Serumalbumin, je 40 μΜ dATP, dGTP und dCTP, 60 μΜ DdUTP, 3 μΜ dTTP, 75 mM Hepes-NaOH pH 7,55, 5 mM MgCl₂, 3,75 mM 2-Merkaptoethanol und 2,5 Einheiten Enzym. Nach einer einstündigen Reaktion wurde durch EDTA-Zugabe auf 5 mM abgestoppt, 15 η Mol Bioti-nhydrazid zugegeben und durch Essigsäurezusatz der pH auf 4 bis 4,5 gebracht. Nach einer Reaktionszeit von 14 bis 16 h wurde mii. Ammoniumcarbonat neutralisiert und über eine 5 ml-G 50-Säule fraktioniert. Die mit dem AusschluOvolumen gesammelte hochmolekulare DNA wurde in Hybridisierungsversuchen nach bekannten Verfahren eingesetzt. Die gebundene biotinylierte Sonden-DNA wurde nach mehreren Waschschrittan in 0,01 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 2 mM CaCl₂, 0,1 % Tween 20 bzw.Q,25 % Magermilchpulver und kurzzeitigem Backen bei 00 ⁰C für 30 min mit 20 pg/ml Streptavidin in gleichem Puffer zur Reaktion gebracht. Nach 3-fachem Waschen in Tris-HCl pH 7,5 erfolgte eine 30-minütige Inkubation in einer Lösung von biotinyliertem Protein A einer zuvor als geeignet bestimmten Verdünnung. Nach weiteren Waschungen und nochmaliger Inkubation mit Streptavidin, nefolgt von nochmaligen Waschschritten wurden die Flächenträger in einer geeigneten Verdünnung biotinylierter alkalischer Phosphatase aus Kälberdorm inkubiert¹. Der Nachweis gekoppelter alkalischer Phosphatase erfolgte nach weiteren Waschungen unter Einsatz von Brom-chlor-indoxylphosph? c und Nitroblfiu-Tetrazoliumsalz entsprechend allgemein üblicher Vorschriften.try using appropriate sequence insertion. The incorporation of the DdUTP was carried out by Klenow fragment of DNA polymerase I in a reaction mixture of 20 μΐ, consisting of 0.5 ug denatured plasmid DNA, 10 ng M13 mp8 sequencing primer or alternatively 500 | jg 01 oligonucleotide primer randomized sequence, 3 μg bovine serum albumin, 40 μΜ each dATP, dGTP and dCTP, 60 μΜ DdUTP, 3 μΜ dTTP, 75 mM Hepes NaOH pH 7.55, 5 mM MgCl ₂ , 3.75 mM 2-mercaptoethanol and 2.5 units of enzyme , After a one-hour reaction was stopped by addition of EDTA to 5 mM, 15 η mol of biotinylhydrazide added and brought by addition of acetic acid, the pH to 4 to 4.5. After a reaction time of 14 to 16 h was mii. Ammonium carbonate neutralized and fractionated through a 5 ml G 50 column. The high molecular weight DNA collected with the exclusion volume was used in hybridization experiments by known methods. The bound biotinylated probe DNA was after several Waschschrittan in 0.01 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 2 mM CaCl _2, 0.1% Tween 20 bzw.Q, 25% skim milk powder and brief baking at 00 ⁰ C for 30 min with 20 pg / ml streptavidin reacted in the same buffer. After washing three times in Tris-HCl pH 7.5, a 30-minute incubation was carried out in a solution of biotinylated protein A of a dilution previously determined to be suitable. After further washes and repeated incubation with streptavidin, following repeated washing steps, the surface carriers were incubated in a suitable dilution of biotinylated alkaline phosphatase from calf dorm ¹ . The detection of coupled alkaline phosphatase occurred after further washes using bromochloro-indoxylphosph? c and nitroblue-tetrazolium salt according to generally accepted instructions.

5. Einbau von DdUTP in eine DNA-Hybridisierungssonde mittels terminals r Desoxynucleotidyltransferase5. Incorporation of DdUTP into a DNA hybridization probe using terminals of deoxynucleotidyltransferase

Zwecks Bicitinylierung einer Hybridisierungsprobe wurde das im Ausführungsbfiispiel 4 genannte rekombinante Plasmid mittels geeigneter Restrikticmsendonukleasen, die 3' -überhängende EnJen kreieren, geschnitten (in diesem Beispiel mit 5 Einheiten Pst I je [ig Plasmid-DNA). Nach üblichen Deproteinisierungs-, Ruinigungs- und Konzentrierungsiichritten wurde die linearisierte Plasmid-DNA (1 pg) inFor bicitinylation of a hybridization probe, the recombinant plasmid recited in Embodiment 4 was cut by appropriate restriction endonucleases which create 3 'overhanging EnJen (in this example, 5 units of Pst I each [ plasmid DNA ] . After standard deproteinization, purification and concentration steps, the linearized plasmid DNA (1 μg) was incubated in

26S4 2926S4 29

--f4 ---f4 -

einem Reaktionsvolumen von 20 μΐ unter Einsatz terminaler Desoxy· nucleotidyltransferase mit DdU geschwänzt. Die Reaktion verlief für 30 min bei 37 ⁰C in 40 mM Cacodylatpuffer, pH 6,8 mit 10 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnSO₄, 0,1 mM DdUTP und 4 Einheiten Enzym. Nach Abstoppen der Reaktion wurde das DdU umgesetzt mit Biotin-6-aminohexylaiiid, in der Hybridisierung eingesetzt und zur Detektion geführt wie in Ausführungsbeispiel 4 beschrieben.a reaction volume of 20 μΐ using terminal deoxy nucleotidyltransferase with DdU cut. The reaction proceeded for 30 min at 37 ⁰ C in 40 mM cacodylate buffer, pH 6.8, 10 mM MgCl _2, 0.1 mM ZnSO _4, 0.1 mM ddUTP and 4 units of enzyme. After stopping the reaction, the DdU was reacted with biotin-6-aminohexylaiiid, used in the hybridization and led to detection as described in Example 4.

Claims

claims

1. A method for non-radioactive labeling of polynucleotides, characterized in that halogenated on the side chain nucleosides in the Forrnylverbindungen or their protected derivatives such as the bisulfite adduct, the cyanohydrin, thioacetals or full acetals, these by phosphorylation to the corresponding nucleotides and then by further phosphorylation converts to the nucleoside triphosphates, which incorporates triphosphates with the aid of polymerases, terminslen transferases or other metabolizing enzymes in polynucleotides and subsequent marker groups, optionally after cleavage of the protective groups, coupled.

2. The method according to claim 1, dg, that is as halogenated on the side chain nucleosides 3 ', 5' di-O-acyl-5-dibromomethyl-2 'desoxyuridine or 2', 3 ', 5' -Tri-O acyl-S-dibromomethyluridine.

3. Process according to claims 1 and 2, d.g., That is obtained as protected formyl derivatives cyclic Vollacetale by reaction with propanediol.

4. The method according to claims 1 and 2, d.g., That one obtains cyclic full acetals by reaction with glycol or pyrocatechol.

5. A process according to claims 1 and 2, characterized in that the phosphorylation of the protected formyl compounds to the nucleotide is carried out under conditions which avoid acidic cleavage of the FormyI protecting groups and additional protection of the 3'-0H group.

6. The method according to claims 1 and 2, d.g., that one went through the further phosphorylation to the triphosphate under conditions! which prevent acidic cleavage of the formyl protecting groups.

7. The method according to claim 1, characterized in that the en7ymatische Hinbau the modified Nukleosidtriphosphate by methods such. nick translation, cDNA synthesis, primer extension, gap or end-filling

Use of the corresponding enzymes takes place.

8. The method according to claims 1 and 2, d.g., that the labeling of the polynucleotide with a biotin compound, fluorescein compound or other marker with chromophoric or fluorophore group via an azomethine bond is carried out, optionally with e.g. Sodium borohydride is reduced.

A process as claimed in claims 1 and 2, which comprises labeling the polynucleotides obtained after incorporation of the modified nucleoside triphosphates with a partner in an immunological reaction.

10. The method according to claim 8, d.g., that a hapten such as biotin is used as a partner of an immunological reaction

Jl. Process according to claims 1 and 2, d.g., that the binding of the label to the modified structural elements in the poly-nucleoside takes place via a spacer.

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