JP2015536689A - Pegを介した核酸分子のアセンブリ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は核酸分子のアセンブリに関する。本発明は、特に、多様な合成代謝経路の構築、自動DNAアセンブリ、および大きなDNA断片のロバストエンジニアリング等の多様な領域に応用される。
以下の背景の記述は、本発明の理解の補助のために提供されるものであるが、本発明に対する先行技術であること、またはそれの記述であることを認めるものではない。
本発明では、重複オリゴヌクレオチドのセットから核酸分子を単一工程でアセンブルする方法が開示される。該方法は、重複オリゴヌクレオチドのセットを、DNAポリメラーゼ、dNTP混合物、および密集化剤(crowding agent)と接触させることによりアセンブリ混合物を形成することを含む。一実施形態では、密集化剤はポリエチレングリコール(PEG)である。密集化剤の存在により、本発明の核酸アセンブリ過程が促進される。アセンブリ混合物は次に、複数回のサイクルにかけられ、各サイクルは変性段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、所望の核酸分子がこれによりアセンブルされる。いくつかの実施形態において、該段階のうちの一つまたは複数は時間に変動がある。該方法は単一工程で実行することができる。
本発明の方法を利用することで、所望の核酸分子のアセンブリを単一工程で達成することができる。従って、本発明により、数百種類のオリゴヌクレオチドをアセンブルする所要時間および費用の両方が減少する。従って、本発明は、多様な合成代謝経路の構築、自動DNAアセンブリ、および大きなDNA断片のロバストエンジニアリングに関する目標を容易なものにする。本発明は、アセンブリ混合物中の密集化剤の包含が核酸分子のアセンブリに有利な特性を与えるという発見に部分的に基づいている。一実施形態では、密集化剤はポリエチレングリコールである。いかなる特定の理論にも制限されることを望むものではないが、本発明者らは、アセンブリ混合物中の密集化剤の包含が、相補的オリゴヌクレオチドがそれぞれの他のオリゴヌクレオチドにより高い特異性でアニーリングすることを助長することによって、核酸アセンブリ反応のロバスト性を増加させると考えている。
本発明は、重複オリゴヌクレオチド断片のセットから核酸分子をアセンブルするための方法を提供する。重複オリゴヌクレオチドのセットは少なくとも2種類の重複オリゴヌクレオチドを意味するが、他の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、本明細書で説明されるようないかなる数のオリゴヌクレオチドも含有し得、例えば、少なくとも50種類または少なくとも70種類または少なくとも100種類または少なくとも150種類のオリゴヌクレオチドを含有し得る。重複オリゴヌクレオチドのセットは、各オリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部が該セットの少なくとも1種類の他のオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド)に対して相補的でありかつオリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にする配列を有するオリゴヌクレオチドを含有する。種々の実施形態において、該セットのオリゴヌクレオチドは、約60塩基長〜約70塩基長であり得る。60塩基のオリゴヌクレオチドは、向かい合う隣接する(アンチセンス)オリゴヌクレオチドと約30bp重複し得る。70塩基のオリゴヌクレオチドは、その向かい合う隣接する(アンチセンス)オリゴヌクレオチドと約35bp重複し得る(図1a参照)。アセンブルされる核酸分子の各鎖は、適切なオリゴヌクレオチド断片に分割され得る。いくつかの実施形態において、これは、配列を本明細書に記載されるような適切な長さの適切な数の重複断片に分割する適切なソフトウェアを用いて行われるが、他の実施形態では、単に適切な分割点を特定することによって行われる。重複オリゴヌクレオチドのセットは、DNA合成機またはオリゴヌクレオチド合成機で合成され得る。種々の実施形態において、該セットの重複オリゴヌクレオチドは、向かい合う隣接する(アンチセンス)オリゴヌクレオチドと、少なくとも10ヌクレオチドまたは少なくとも20ヌクレオチドまたは少なくとも30ヌクレオチドまたは少なくとも40ヌクレオチドまたは50超のヌクレオチドまたは60超のヌクレオチドが重複する。アセンブルされるオリゴヌクレオチドのセットは、適切な容器中に適切な緩衝液を用いてプールされ得る。アセンブリ混合物は、本明細書に記載されるようなDNAポリメラーゼ、dNTP、および密集化剤も含有する。次に、アセンブリ混合物は、アニーリング段階、伸長段階、および変性段階のうちの一つまたは複数を含む、一回または複数回の核酸アセンブリ段階のサイクルにかけられる。該段階は記載の順で行われ得るが、いくつかの実施形態ではいかなる順序でも行われ得る。各段階の条件は本明細書に記載される。結果として、重複オリゴヌクレオチドのセットから所望の核酸分子がアセンブルされ、これは一実施形態では単一工程で行われる。
密集化剤は、分子密集を起こす、増強する、または促進する作用剤である。密集化剤は水分子と結合し得る。一実施形態では、密集化剤は水分子と結合し、タンパク質または核酸分子には結合しない。分子密集は、溶液中の他の分子が利用可能な溶媒の体積を高分子が減少させることによって起こり得る。いくつかの実施形態において、密集化剤はポリエチレングリコール(PEG)である。いかなる適切なPEGも本発明の組成物および方法においても使用可能である。種々の実施形態において、PEGは、PEG12000またはPEG10000またはPEG8000またはPEG4000またはPEG2000またはPEG1000である。他の実施形態では、PEGは、4000超、または6000超または8000超または10000超または12000超の分子量を有する。他の実施形態では、PEGは4000未満、または6000未満または8000未満または10000未満または12000未満の分子量を有する。さらに他の実施形態では、PEGは、様々なサイズのPEG分子の混合物(例えば、上記PEG分子のあらゆる組み合わせ)として与えられる。PEGは、本発明の方法において、例えば、0.0188%または0.0375%または0.075%または0.3%または0.45%または0.6%または0.75%または1.0%(全てw/v)等のあらゆる適切な濃度で与えられ得る。本発明の方法の他の実施形態では、PEGは、0.0188%超または0.0375%超または0.075%超または0.3%超または0.45%超または0.6%超または0.75%超または1.0%超(全てw/v)の濃度で与えられる。さらに別の実施形態では、PEGは、本発明の方法において、0.0188%未満または0.0375%未満または0.075%未満または0.3%未満または0.45%未満または0.6%未満または0.75%未満または1.0%未満の濃度で与えられる。PEGは有用な密集化剤であるが、例えば、アルブミン、フィコール(例えば、フィコール70)および他の高質量分岐多糖類(例えば、デキストラン)等のさらなる密集化剤も本方法において使用可能である。当業者は本開示を参照することで本発明において有用なさらなる密集化剤を理解するであろう。
一実施形態では、アセンブリ混合物は、重複オリゴヌクレオチドのセット、DNAポリメラーゼ、dNTP混合物、および密集化剤の組み合わせである。アセンブリ混合物は、実行される方法に望ましい追加成分を含有してもよい。いくつかの実施形態において、密集化剤はポリエチレングリコール(PEG)である。特定の実施形態では、PEGはPEG8000であるが、当業者は本明細書によって、他の密集化剤も本発明に有用であることを理解するだろう。密集化剤がPEGである場合、様々な分子量が用いられ得、または本明細書で開示されるあらゆるサイズのPEGの混合物等の様々なサイズのPEGの混合物が用いられ得る。アセンブリ混合物は通常は溶液として存在するが、いくつかの実施形態では、乾燥混合物であり得る。一実施形態では、DNAポリメラーゼおよびdNTPは、本方法に供される場合、重複オリゴヌクレオチドがアニーリングして二本鎖DNA分子を生成する際に該重複オリゴヌクレオチドを重合するのに充分な量で存在する。密集化剤はいかなる密集化剤でもよく、いかなる有用な濃度でも存在していてもよい。
いくつかの実施形態において、アセンブリ混合物はプライマーをさらに含む。一実施形態では、プライマーは末端オリゴヌクレオチドにそれらの5'末端においてアニーリングする。末端オリゴヌクレオチドは、アセンブルされる核酸分子を形成するオリゴヌクレオチド鎖の5'末端を形成するオリゴヌクレオチド断片である(一例は、図1中のオリゴヌクレオチドAおよびF)。本明細書に記載されるように、アセンブルされる核酸分子は、重複オリゴヌクレオチド断片のセットからアセンブルされる。オリゴヌクレオチド断片がアニーリングし、DNAポリメラーゼがギャップを埋めると、所望の核酸分子がアセンブルされる。プライマーは、本方法において機能するいかなる好都合なサイズのものであってもよい。種々の実施形態において、プライマーは、約10ヌクレオチド、もしくは約15ヌクレオチド、もしくは約18ヌクレオチドもしくは約20ヌクレオチドもしくは約25ヌクレオチドもしくは約30ヌクレオチドもしくは約35ヌクレオチドもしくはそれ以上、または、10〜20ヌクレオチドもしくは5〜15ヌクレオチドもしくは15〜25ヌクレオチドもしくは20〜40ヌクレオチドもしくは30〜50ヌクレオチドもしくは40〜60ヌクレオチドもしくは50〜70ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、プライマーは約60ヌクレオチドである。
本発明で利用されるオリゴヌクレオチドはいかなる適切な長さであってもよい。種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、40〜80個のヌクレオチド、または40〜60個のヌクレオチド、または50〜70個のヌクレオチド、または約60個のヌクレオチドを含む。しかし、他の実施形態では、本発明で利用されるオリゴヌクレオチドは、本方法で機能するいかなる長さのものであってもよい。さらなる例としては、限定はされないが、20〜40個のヌクレオチド、30〜50個のヌクレオチド、40〜60個のヌクレオチド、または50〜70個のヌクレオチド、または60〜80個のヌクレオチド、または約20個のヌクレオチド、または約30個のヌクレオチド、または約40個のヌクレオチド、または約50個のヌクレオチド、または約60個のヌクレオチド、または約70個のヌクレオチド、または約80個のヌクレオチド、または80超個のヌクレオチドが挙げられる。
本方法で用いられるDNAポリメラーゼは、いかなる適切なDNAポリメラーゼであってもよい。特定の実施形態では、処理能力の増加を可能にするために処理能力が増強されたドメインを含有する酵素であるパイロコッカス様酵素も適切である。いかなるDNAポリメラーゼも用いられ得るが、高精度および高処理能力を与えるDNAポリメラーゼが最も効果的である。いくつかの実施形態において、DNAポリメラーゼは5'→3'DNAポリメラーゼ活性または3'→5'エキソヌクレアーゼ活性も有し得る。一実施形態では、DNAポリメラーゼはDNA増幅反応における産物の増幅中に平滑末端を生成する。本発明で用いられ得るDNAポリメラーゼのさらなる非限定例としては、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来のDNAポリメラーゼが挙げられ、これは、天然の酵素よりも優れた活性および/またはより高い精度を与えるために一つまたは複数のドメインで修飾されていてもよい。修飾には、DNAアセンブリ手順におけるより有利な特性を酵素に与えるための、酵素の核酸配列における変化が含まれ得る。DNAポリメラーゼは熱安定性であり得る。DNAポリメラーゼはこれら特性の全てまたは一部のみを有し得、当業者は本明細書により、どの特性が本方法の特定の適用において有利に用いられ得るか、並びにどの反応条件およびどの緩衝液成分が特定のDNAポリメラーゼに適しているかを理解するであろう。本発明の方法に適した1つのDNAポリメラーゼは、市販のPHUSION(登録商標)High Fidelity DNAポリメラーゼ(Finnzymes, Oy、フィンランド)である。他のDNAポリメラーゼも適切であり得る。一実施形態では、マスターミックスは、100%DMSO中に、適切な濃度(例えば、1.5mM)のMgCl2、および適切な濃度(例えば、最終反応濃度において各dNTPが200μM)のdNTP混合物と一緒に、DNAポリメラーゼを含有し得る。
本方法の一サイクルは、一回または複数回のアニーリング段階、一回または複数回の伸長段階、および一回または複数回の変性段階等の、一つまたは複数の段階から成る。一実施形態では、一サイクルはアニーリング段階、伸長段階、および変性段階を有するが、いくつかの実施形態では、一サイクルは各種類の段階の2つ以上を有し得る。本方法は、アセンブリを実行するのに必要ないかなる好都合な数のサイクルも利用することができる。種々の実施形態において、約25サイクルまたは約30サイクルまたは約35サイクルが本方法に含まれる。他の実施形態では、20超のサイクルまたは25超のサイクルまたは30超のサイクルまたは35超のサイクルが方法に含まれる。さらに別の実施形態では、25未満のサイクルまたは30未満のサイクルまたは35未満のサイクルが本方法に含まれる。
別の態様では、本発明は本発明の方法を実行するためのキットを提供する。一実施形態では、本発明のキットは、DNAポリメラーゼ、dNTP混合物、および密集化剤を含有する。キットは、本発明の方法を実行するための説明書および/または本方法の実行についての情報を提供するウェブサイトもしくは他のリソースに使用者を誘導する情報も含有し得る。キットに含有されるDNAポリメラーゼ、dNTP、および密集化剤は、別々の容器に提供されてもよいし、あるいは同じ容器に提供されてもよい。DNAポリメラーゼ、dNTP、および密集化剤は、本明細書に記載のいずれであってもよい。
本実施例は、密集化剤(ここではPEG8000)の存在下および非存在下での1kb未満のPCR産物に対する一工程遺伝子アセンブリ法の比較を示すものである。
工程1:98℃30秒の変性段階
工程2:67℃1分間の組み合わされた第一アニーリング/伸長段階
工程3:アニーリング/伸長段階の時間を15秒/サイクル累積的に延長
工程1〜3を合計30サイクル繰り返す
合計反応時間:約2.5時間
本実施例は、PEG8000の存在下および非存在下での、ギャップが存在しない86種類のオリゴヌクレオチドからの2.3kb遺伝子(mutS)の一工程PCRアセンブリを示すものである。
本実施例は、ギャップが存在しない124種類のオリゴからの、3.7kb遺伝子(MetH)の、PEG8000有りおよび無しの一工程PCRを示すものである。使用した全てのオリゴヌクレオチドは60〜70塩基長であった。60塩基オリゴヌクレオチドは30塩基のオーバーハングを有し、70塩基オリゴヌクレオチドは35塩基のオーバーハングを有していた。
本実施例は、ギャップが存在しない70種類のオリゴヌクレオチドからの、ATリッチ2.1kb遺伝子(dhaB1)の、PEG8000有りおよび無しの一工程PCRアセンブリを示すものである。PEG8000有りおよび無しでの、ギャップが存在しない63種類のオリゴヌクレオチドからのATリッチ1.7kb遺伝子(dhaB)のアセンブリも示される。使用した全てのオリゴヌクレオチドは60〜70塩基長であった。60塩基オリゴヌクレオチドは30塩基のオーバーハングを有し、70塩基オリゴヌクレオチドは35塩基のオーバーハングを有していた。
本実施例は、7kb分子を作製するための7種類のDNA断片の、PEG8000有りまたは無しでの、一工程PCRアセンブリを示すものである。各断片と30bpの相同性(重複)を有する7種類のDNA断片(50ng〜100ng)をプールした。250bpの断片1;2,000bpの断片2;1,000bpの断片3;700bpの断片4;1,500bpの断片5;1,000bpの断片6;および1,800bpの断片7。
本実施例は、PEGおよびISOを比較する、mutS(86種類のオリゴ)の一工程PCRアセンブリを示すものである。使用した全てのオリゴヌクレオチドは60〜70塩基長であった。60塩基オリゴヌクレオチドは30塩基のオーバーハングを有し、70塩基オリゴヌクレオチドは35塩基のオーバーハングを有していた。
マイコプラズマ属由来の最小ゲノムを、ARCHETYPE(商標)(Synthetic Genomics, Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州)ソフトウェアプログラムを用いて、それぞれおよそ1.4kbの370個の提唱された断片に分割した。これらの370個の断片のそれぞれを、次に約44個の(ギャップが存在しない)オリゴヌクレオチドに分割し、それぞれのオリゴはおよそ70ヌクレオチド長であり、向かい合う隣接するオリゴと重複するおよそ35個のヌクレオチドを含有していた(すなわち、それぞれの隣接する二本鎖DNA上の反復配列のおよそ35個のヌクレオチド)。断片の隣接(または「末端」)オリゴヌクレオチド(例えば、オリゴ#1およびオリゴ#44)は、370個の断片全てに共通な配列である30個のヌクレオチド(PCR増幅用)およびインサートをベクターから放出させるための制限酵素認識部位(例えばNotI)を含有する配列である8個の塩基を含有していた。また、370個の断片のそれぞれは、その後のアセンブリ段階のため組み換えられるように、隣接する二本鎖核酸断片に対し60ヌクレオチドの重複配列を含有していた。
50μl 2×Q5ポリメラーゼミックス(NEB)
0.8μl 5%PEG8000
0.5μl プライマー1[pUC19 インサート F]
0.5μl プライマー2[pUC19 インサート R]
1.25μl 200nMの上記オリゴプール
46.95μl 水
サイクル条件:
1. 98℃で1分間
2. 98℃で10秒間
3. 57℃で30秒間
40Cにゆっくりと冷却(0.1C/秒)
4. 40℃で30秒間
3. 57℃で6分間
サイクル毎に15秒延長
4. 工程2にさらに29回移行
5. 72Cで5分間
6. 10℃−−−
本実施例は、オリゴヌクレオチドプールからのHAおよびNA遺伝子のDNA構築物の自動アセンブリを示すものである。インフルエンザウイルスは、中央コアを包む糖タンパク質を含有するウイルス外被でできている。中央コアはウイルスRNAゲノムおよびRNAをパッケージングし保護する他のウイルスタンパク質を含有している。インフルエンザゲノムは典型的には、8個のRNA小片を含有しており、そのそれぞれはウイルスタンパク質をコードする1つまたは2つの遺伝子を含有している。インフルエンザAの場合、ゲノムは、赤血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)を含む11種のタンパク質をコードする11個の遺伝子を8個のRNA小片上に含有している。他のタンパク質としては、核タンパク質(NP)、M1、M2、NS1、NS2、PA、PB1、PB1−F2およびPB2が挙げられる。
HAおよびNA遺伝子のDNA構築物の配列を示す96種類のオリゴヌクレオチドのプールを本発明のアセンブリ装置に与えた。HAおよびNA構築物はおよそ3kb長であり、本方法において96種類のオリゴヌクレオチドからアセンブルした。最初および最後のオリゴヌクレオチドは、PCR増幅用のプライマー結合ドメイン、並びにDNAアセンブリのための、必要であれば大きな断片をアセンブルするための、増幅後にプライマー結合ドメインを放出し重複領域を露出させるNotI制限酵素認識部位を含有していた。
それぞれのアセンブルされた産物に対し、PCR反応を自動化した様式で実行した。
25μlの2×PHUSION(登録商標)Hot−Start Master Mix(Thermo Fisher Scientific Oy, Oy、フィンランド)
2μlの1%PEG8000
0.25μlの末端プライマー1(100μM)
0.25μlの末端プライマー2(100μM)
20μlのMBG水
PCR master mixを含有する反応容器の反応域に、2.5μlの上記オリゴプールを50nMで鋳型として移した(またはその後に混合する)。
2. 以下のパラメーターを用いて熱サイクルを生じさせた。
98℃で1分間
30回(98℃で30秒間、65Cで6分間、および15秒/サイクルずつそれを延長
72℃で5分間
10℃で最後まで(forever)
PCR産物をAMPURE(登録商標)XP technology(Agencourt, Bioscience Corp.、ベバリー、マサチューセッツ州)を用いて精製した。
およそ3kbの核酸アセンブリを作製した。電気泳動ゲルを図8に示す。これらの遺伝子には既に、哺乳類細胞へのトランスフェクション後の発現のためのプロモーター領域(polIおよびpolII)が含まれている。
Claims (25)
- 重複オリゴヌクレオチドのセットから単一工程で核酸分子をアセンブルする方法であって、
(a)重複オリゴヌクレオチドのセットを、DNAポリメラーゼ;dNTPの混合物;およびポリエチレングリコールと接触させて、アセンブリ混合物を形成すること;
(b)前記アセンブリ混合物を、各サイクルがアニーリング段階、伸長段階、変性段階のうちの一つまたは複数を含む複数回のサイクルにかけること;
(c)それによって、単一工程で重複オリゴヌクレオチドのセットから前記核酸分子をアセンブルすること、
を含む、方法。 - 前記オリゴヌクレオチドのセットが末端オリゴヌクレオチドおよび非末端オリゴヌクレオチドを含み、該末端オリゴヌクレオチドが該非末端オリゴヌクレオチドよりも高い濃度でアセンブリ混合物中に与えられる、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1回のアニーリング段階が50℃〜77℃の温度で起こる、請求項1に記載の方法。
- あるサイクルの伸長段階の時間がその前のサイクルの伸長段階と比較して延長されている、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼがパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の改変DNAポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドのセットが1つの遺伝子にアセンブルされる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコールがPEG8000である、請求項1に記載の方法。
- PEGの濃度が0.025%以上である、請求項7に記載の方法。
- PEGの濃度が0.375%以上である、請求項7に記載の方法。
- 前記アニーリング段階が67℃で起こる、請求項1に記載の方法。
- 前記アニーリング段階および前記伸長段階が67℃で起こる、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸分子が1kb長よりも大きい、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸分子が2kb長よりも大きい、請求項12に記載の方法。
- 前記核酸分子が3kb長よりも大きい、請求項12に記載の方法。
- 前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも5種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも60種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも75種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項16に記載の方法。
- アセンブルされた前記核酸分子が2kbよりも大きく、第一伸長段階が5分間〜7分間であり、その後の複数の伸長段階が時間に変動がある段階である、請求項17に記載の方法。
- アセンブルされた前記核酸分子が3kbより大きく、第一伸長段階が5分間〜7分間であり、その後の複数の伸長段階の時間が第一伸長段階に対して漸増する、請求項18に記載の方法。
- 前記重複ヌクレオチドのセットが100種類超のオリゴヌクレオチドを含む、請求項19に記載の方法。
- 一つまたは複数の段階が時間に変動がある段階である、請求項1に記載の方法。
- 前記伸長段階が時間に変動がある段階である、請求項21に記載の方法。
- 前記伸長段階が1サイクル毎に約15秒だけ累積的に延長される、請求項22に記載の方法。
- 前記複数回のサイクルが少なくとも25回のサイクルを含む、請求項1に記載の方法。
- アセンブルされた前記核酸分子が一つまたは複数のATリッチ配列を含む、請求項1に記載の方法。
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