CN104822840A

CN104822840A - Peg-介导的核酸分子的组装

Info

Publication number: CN104822840A
Application number: CN201380061360.6A
Authority: CN
Inventors: J·尤拉诺; D·G·吉布森; N·C·卡瓦扎; Z·齐
Original assignee: Synthetic Genomics Inc
Current assignee: Viridos Inc
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2015-08-05
Also published as: JP2015536689A; DK2931913T3; EP2931913B1; JP2021048883A; SG10201704426UA; JP2019022503A; WO2014093535A8; EP2931913A4; CN109913519B; WO2014093535A1; IL238918A0; EP2931913A1; CA2893817A1; IL238918B; JP7009337B2; US20140308710A1; CA2893817C; CN109913519A; US20190177759A1; AU2013359293A1

Abstract

本发明公开了用于从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子的方法。所述方法涉及使一组重叠寡核苷酸与DNA聚合酶、dNTP的混合物以及拥挤剂接触以形成组装混合物。在一个实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇(PEG)。拥挤剂的存在促进本发明的核酸组装过程。随后使组装混合物经历多个循环，每一个循环包括退火期、延伸期和变性期，并且由此组装期望的核酸分子。在一些实施方案中，一个或多个时期随时间变化。

Description

PEG-介导的核酸分子的组装

本申请要求2012年12月13日提交的美国临时申请序列号61/736,946的权益，所述美国临时申请在此通过引用以其整体(包括所有表、图和权利要求)并入。

发明领域

本发明涉及核酸分子的组装。本发明可应用于不同领域，诸如多种合成代谢途径的构建、自动DNA组装以及大DNA片段的强劲工程等领域。

背景

本发明的背景的以下描述被提供来帮助理解本发明，但不被承认为或描述本发明的现有技术水平。

合成基因构建应用于分子生物学的许多领域。DNA序列可以使用各种方法来组装。这些方法一般涉及合成和扩增的两步骤过程，其中在第一步骤中使用用于寡核苷酸合成的标准技术合成一组重叠寡核苷酸，并基于所述寡核苷酸的自引发(通过重叠区域之间的同源性)组装所述重叠寡核苷酸。在第二步骤中，使用另外一对扩增全长基因产物的引物，将组装的核酸进行PCR以扩增。一些可用的方法依赖于DNA聚合酶在组装过程中建立越来越长的DNA片段。

其它核酸组装技术在原始基因组装混合物中包括扩增引物。这些方法一直以来是无效的，只能够组装较小的基因，或不能组装具有挑战性核苷酸含量的核酸(诸如富含AT或GC的序列)。

通常地核酸构建体的组装需要至少2个步骤：用于寡核苷酸的预组装的第一步骤，和在单独的PCR步骤中扩增和组装预组装的产物的第二步骤。

有利的是具有用于组装核酸或基因，可在单个步骤中实现期望的核酸或基因的组装和扩增的方法，并且所述方法还可合成比先前可用的核酸和基因的尺寸更大的核酸和基因。还有利的是具有可在单个步骤中进行组装的方法。

概述

本发明公开了在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子的方法。所述方法涉及将一组重叠寡核苷酸与DNA聚合酶、dNTP的混合物以及拥挤剂接触以形成组装混合物。在一个实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇(PEG)。拥挤剂的存在促进本发明的核酸组装过程。随后使组装混合物经历多个循环，每一个循环包括变性期、退火期和延伸期，并且由此组装期望的核酸分子。在一些实施方案中，一个或多个所述时期随时间变化。可在单个步骤中进行所述方法。

在一个方面，本发明提供了在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子的方法。所述方法包括(a)使一组重叠寡核苷酸与DNA聚合酶、dNTP的混合物以及聚乙二醇接触以形成组装混合物；(b)使所述组装混合物经历多个循环，每一个循环包括变性期、退火期和延伸期，以及(c)由此在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子。

在一个实施方案中，寡核苷酸的组含有末端寡核苷酸和非末端寡核苷酸，并且在组装混合物中以比非末端寡核苷酸高的浓度提供所述末端寡核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个退火期发生在57℃至77℃的温度之间。每一个循环的延伸期可在时间上相对于先前循环的延伸期得以增加。所述DNA聚合酶可以是热稳定性DNA聚合酶，诸如DNA聚合酶(Finnzymes,Oy,FI)。可将寡核苷酸的组组装成基因。在一些实施方案中，所述聚乙二醇是PEG 8000。PEG的浓度可以是0.025％(w/v)或更大，或0.375％(w/v)或更大。退火期可发生在67℃，并且可将退火期和延伸期合并为单个时期。在各种实施方案中，核酸分子的长度可大于1kb，或长度大于2kb，或长度大于3kb。重叠寡核苷酸的组可具有至少5个寡核苷酸，或至少60个寡核苷酸，或至少75个寡核苷酸。

在一个实施方案中，所述核酸分子的长度大于2kb，起始延伸期为5分钟至7分钟，并且随后延伸期是随时间变化的时期。在另一个实施方案中，核酸分子大于3kb，起始延伸期为5分钟至7分钟，并且子序列延伸期在时间上相对于初始延伸期逐渐增加。寡核苷酸的组可含有超过100个寡核苷酸。一个或多个时期可以是随时间变化的时期。在具体实施方案中，所述延伸期是随时间变化的时期。所述延伸期可按约15秒/循环累计地延长，并且所述多个循环为至少25个循环。所述核酸分子可具有一个或多个富含AT的序列。

上述本发明的概述是非限定性的，并且根据本发明的以下详述和根据权利要求，本发明的其它特性和优势将是显而易见的。

附图详述

图1A提供了重叠寡核苷酸的图解说明，其中寡核苷酸A和B、B和C、C和D、D和E以及E和F是重叠寡核苷酸，并且是反向相邻的寡核苷酸。图1B说明双链(ds)DNA片段之间的同源性或重叠序列。

图2提供了一组基因A的有空位和无空位的寡核苷酸的图解说明。

图3提供了显示根据本发明的方法从寡核苷酸组装2.3kb基因(mutS)的凝胶的说明。

图4提供了显示根据本发明的方法从寡核苷酸组装3.7kb基因的凝胶的说明。

图5提供了显示根据本发明的方法从寡核苷酸组装富含AT的DNA的凝胶的说明。

图6提供了显示根据本发明的方法组装7个DNA片段以产生7kb分子的凝胶的说明。

图7提供了显示根据本发明的方法从86个寡核苷酸组装mutS基因的凝胶的说明。

图8A-B说明显示在本发明的系统中使用本发明的方法从各种流感病毒株组装核酸构建体HA(H)和NA(N)的0.8％预制琼脂糖凝胶，每一个构建体从96个混合的寡核苷酸组装而来。构建体HA和NA为大约3kb。图8A-泳道1：A/Brisbane/10/2010(HIN1)_HA；泳道2：A/Brisbane/10/2010(H1N1)_NA；泳道3：X179A_TD(H1N1)_HA；泳道4：X179A(H1N1)_NA；泳道5：A/Victoria/361/2011_CDC/E3(H3N2)_HA；泳道6：A/Victoria/361/2011(H3N2)_NA；泳道7：A/Brisbane/256/2011_P2/E3(H3N2)_HA；泳道8：A/Brisbane/256/2011_P2/E3(H3N2)_NA；标准泳道。图8B-标准泳道；泳道1：B/Texas/06/2011_BX-45_HA；泳道2：B/Texas/06/2011_BX-49_NA；泳道3：B/New_Hampshire/l/2012_HA；泳道4：B/New_Hampshire/l/2012_NA；泳道5：B/Brisbane/60/08_HA；泳道6：B/Brisbane/60/08_NA；泳道7：B/Nevada/03/201l_v2_HA；泳道8：B/Nevada/03/2011_v2_NA。

发明详述

通过使用本发明的方法，可在单个步骤中实现期望的核酸分子的组装。因此根据本发明，组装数百个寡核苷酸的必需时间和成本都得以下降。本发明从而有利于与多种合成代谢途径的构建、自动DNA组装以及大DNA片段的强劲工程相关的目标。本发明部分地基于以下发现，即在组装混合物中包含拥挤剂在核酸分子的组装中提供有益性质。在一个实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇。不想受任何特定理论束缚，本发明人相信在组装混合物中包含拥挤剂帮助互补寡核苷酸以更高的特异性彼此互补，从而增强核酸组装反应的稳健性。

本发明利用在组装混合物中包含拥挤剂的益处，而且还在核酸组装中最优化退火和延伸的反应温度和反应时间。通过将退火和延伸合并在单个步骤中，使得一组寡核苷酸中的寡核苷酸序列能够以特异性退火，并且用作进行核酸延伸的模板。所述方法允许组装比先前可能的核酸片段长度更长的核酸片段且成本更低。在一些实施方案中，长于1kb并达到7kb和更长的核酸片段可被组装和扩增。本方法还允许组装和/或扩增具有高AT含量或高GC含量的核酸分子。此外，本发明的方法允许消除核酸组装步骤，以及允许除去反应混合物中包含的某些酶。所述方法还允许组装比先前可能的寡核苷酸数量显著更大的数量的寡核苷酸。可按照所述方法从混合物组装超过100个单链DNA寡核苷酸，并且可利用所述方法组装成打的双链DNA片段。通过本方法已大大减少了组装具有富含AT或GC的序列的核酸所需的时间和努力。

在一个实施方案中，本发明是用于组装一组单链重叠寡核苷酸(其包含期望被组装的核酸的长度或其片段)的单步骤或一步法，所述方法通过使所述组与DNA聚合酶、dNTP的混合物和拥挤剂接触来进行。“单步骤”或“一步”意指当一旦将反应组分置于反应容器中时，所期望的核酸分子的组装和扩增得以实现就无需再打开容器。因此，本发明的方法为将核酸构建体的组装并入单步骤中提供了机会，从而将预组装步骤与PCR扩增以及组装步骤合并为单个反应步骤。可同时组装单链重叠寡核苷酸。

方法

本发明提供了用于从一组重叠寡核苷酸片段组装核酸分子的方法。一组重叠寡核苷酸意指至少2个重叠寡核苷酸，但在其它实施方案中，寡核苷酸的组可含有任何数量的如本文中解释的寡核苷酸，诸如，例如至少50或至少70或至少100或至少150个寡核苷酸。重叠寡核苷酸的组含有具有序列的寡核苷酸，其中所述序列的每一个寡核苷酸的至少一部分序列与所述组的至少一个其它寡核苷酸(反义寡核苷酸)互补并且允许所述寡核苷酸与其退火。在各种实施方案中，所述组的寡核苷酸的长度可以是约60个碱基至约70个碱基。60个碱基的寡核苷酸可与反向相邻(反义)的寡核苷酸重叠约30bp。70个碱基的寡核苷酸可与其反向相邻(反义)的寡核苷酸重叠约35bp(参见图1a)。待组装的核酸分子的每一条链可被分成适合的寡核苷酸片段。在一些实施方案中，这使用可将序列分成适合数量的如本文中描述的适合长度的重叠片段的合适软件来进行，但在其它实施方案中，这只需通过鉴定适合的分隔点来进行。可在DNA或寡核苷酸合成仪上合成重叠寡核苷酸的组。在各种实施方案中，所述组的重叠寡核苷酸与反向相邻(反义)的寡核苷酸重叠至少10个核苷酸或至少20个核苷酸或至少30或至少40或超过50或超过60个核苷酸。可使用适合的缓冲液将待组装的寡核苷酸的组在适合的容器中混合。所述组装混合物还含有如本文中描述的DNA聚合酶、dNTP和拥挤剂。随后使组装混合物经历一个或多个循环的核酸组装期，其包括一个或多个退火期、延伸期和变性期。虽然可按引述的顺序进行所述时期，但在一些实施方案中，可以任意顺序进行它们。本文中描述了每一个期的情况。结果是期望的核酸分子从重叠寡核苷酸的组的组装，在一个实施方案中，所述组装在单个步骤中进行。

重叠(单链)寡核苷酸与重叠(双链)核酸片段是有区别的。在一些实施方案中，单链寡核苷酸与互补序列上的它们的反向相邻(或反义)寡核苷酸重叠，从而允许所述寡核苷酸彼此退火，并且所得空位可通过DNA聚合酶填充，其实施方案描绘于图1a中。当将单链寡核苷酸组装成核酸片段时，可组装多个核酸片段以获得更大的DNA构建体。核酸片段(双链)还可在片段或重叠序列之间，例如在它们各自的末端(如图1b中描绘的)具有同源性。所述片段上的重叠序列可用于例如通过“嚼回”和修复法或本文中描述的其它方法，将所述片段组装成更大的构建体。如果期望组装一组dsDNA片段，那么当将这些重叠核酸片段经历所述方法的循环的变性、退火期和延伸期时，它们将变成重叠寡核苷酸。所述方法因此用于从重叠单链寡核苷酸组装核酸片段，其实例描绘于图1a中，并且还用于组装多个具有重叠序列(或片段之间的同源性)的双链核酸片段，其实例描绘于图1b。在另一个实施方案中，所述核酸片段具有单链悬垂，这意味着dsDNA的链的一条或两条链延伸至dsDNA的双链区之外，从而留下单链悬垂。本发明的方法还用于组装单链寡核苷酸和双链DNA片段的混合物，其中所述寡核苷酸可与来自所述dsDNA的悬垂退火，从而提供将单链寡核苷酸与dsDNA片段桥连或连接在一起的方式。

本发明还提供了用于组装法中的退火期和延伸期的最优化的温度和/或时期。在一个实施方案中，本发明将退火和延伸合并在单个时期，从而允许互补DNA序列特异性退火，并用作PCR延伸的模板。不受任何特定理论束缚，本发明人相信拥挤剂的添加促进互补寡核苷酸以甚至更高的特异性退火，从而增强了核酸的PCR反应和组装的稳健性。

在一个实施方案中，本发明的方法利用单个步骤和单一温度(即等温的)进行PCR退火和延伸。在一个实施方案中，将所述退火期和延伸期合并，并在例如约67℃的温度下等温地进行。在其它实施方案中，至少退火期在57℃至77℃或50℃至77℃的温度下发生，或将退火期和延伸期合并，并在57℃至77℃或50℃至77℃的温度下进行。在不同的实施方案中，约50℃±2℃的退火和延伸温度可用于富含AT的DNA序列的组装。约67℃±2℃的退火和延伸温度可用于富含GC的DNA序列的组装。

所述方法允许组装比使用先前的方法所可能组装的长度长得多的DNA分子。意外地发现通过使用本发明的方法，可组装约为先前所可能组装的长度的4倍的DNA分子。所述方法可用于组装大小为约1kb或大于1kb的DNA片段。在其它实施方案中，可组装大于2kb或大于3kb或大于约3.5kb或大于4kb或大于5kb或大于6kb或约7kb或大于7kb的DNA分子。在更多的实施方案中，所述方法允许组装1-4kb、或1-5kb、或1-6kb、或1-7kb、或1-8kb、或1-9kb、或1-10kb、或2-5kb、或2-7kb、或2-8kb、或2-10kb的DNA分子。

本发明的方法还用于将非常大量的单链(ss)寡核苷酸组装成核酸片段。在各种实施方案中，所述方法可用于将一组超过60个寡核苷酸，或超过80个，或超过100个，或超过120个，或超过140个，或超过160个，或超过180个，或超过200个寡核苷酸，或60-200个或60-300个寡核苷酸组装成双链核酸片段。

拥挤剂

拥挤剂是引起、增强或促进分子拥挤的试剂。拥挤剂可结合水分子。在一个实施方案中，拥挤剂结合水分子并且不结合蛋白质或核酸分子。分子拥挤可通过减少可用于溶液中的其它分子的溶剂体积的大分子来发生。在一些实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇(PEG)。任何适合的PEG可用于本发明的组合物和方法。在各种实施方案中，所述PEG是PEG 12000或PEG 10000或PEG 8000或PEG 4000或PEG2000或PEG 1000。在其它实施方案中，所述PEG具有大于4000，或大于6000，或大于8000，或大于10000，或大于12000的分子量。在其它实施方案中，所述PEG具有小于4000，或小于6000，或小于8000，或小于10000或小于12000的分子量。在其它实施方案中，以不同大小的PEG分子的混合物，例如上文中所列的PEG分子的任意组合提供PEG。可在本发明的方法中以任何适合的浓度诸如，例如0.0188％，或0.0375％，或0.075％，或0.3％，或0.45％，或0.6％，或0.75％或1.0％(全部为w/v)提供PEG。在本发明的方法的其它实施方案中，以大于0.0188％，或大于0.0375％，或大于0.075％，或大于0.3％，或大于0.45％，或大于0.6％，或大于0.75％或大于1.0％(全部为w/v)的浓度提供PEG。在更多实施方案中，在本发明的方法中以小于0.0188％，或小于0.0375％，或小于0.075％，或小于0.3％，或小于0.45％，或小于0.6％，或小于0.75％或小于1.0％的浓度提供PEG。虽然PEG是有用的拥挤剂，但还可将另外的拥挤剂用于本方法，诸如，例如白蛋白、Ficoll(例如，Ficoll 70)和其它高质量分枝的多糖(例如，葡聚糖)。通过参考本公开，本领域普通技术人员将认识到可用于本发明的另外的拥挤剂。

组装混合物

在一个实施方案中，所述组装混合物是一组重叠寡核苷酸、DNA聚合酶、dNTP的混合物和拥挤剂的组合。所述组装混合物还可含有期望用于正在进行的方法的另外的组分。在一些实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇(PEG)。在具体实施方案中，所述PEG是PEG 8000，但本领域普通技术人员借助于本说明书将认识到其它拥挤剂也可用于本发明。当拥挤剂是PEG时，可使用不同的分子量，或可使用不同大小的PEG的混合物，诸如本文中公开的任何大小的PEG的混合物。所述组装混合物通常以溶液形式存在，但在一些实施方案中，可以是干燥混合物。在一个实施方案中，所述DNA聚合酶和dNTP以足以聚合重叠寡核苷酸(当将它们退火时)的量存在以当经历所述方法时产生双链DNA分子。所述拥挤剂可以是可以任何有用浓度存在的任何拥挤剂。

所述方法涉及使所述组装混合物经历多个循环，即一个或多个循环。循环可包括一个或多个退火期、延伸期和变性期。循环还可包括超过任何类型的时期的一个期。退火涉及寡核苷酸与另一个寡核苷酸上的互补序列通过氢键配对以形成双链核酸。退火可通过任何有效的方法进行，一个方法是降低组装混合物的温度以允许互补序列退火。因此在退火期过程中，重叠寡核苷酸的组退火，形成待组装的核酸分子的部分或完全长度，从而留下其中因这样的区域存在于所述重叠序列之间而不存在核苷酸的空位。在延伸期过程中，已退火的寡核苷酸的组接受DNA聚合酶的作用，所述DNA聚合酶将填充留在无互补碱基退火和形成碱基对的区域中的空位。延伸期从而将形成部分或完全双链核酸分子。连接酶任选地以适合的浓度存在于组装混合物中，以用于连接退火的寡核苷酸链。但在许多实施方案中，连接酶不是必需的，并且连接将自发进行。在变性期过程中，将双链核酸分子变性成单链寡核苷酸。变性可通过热变性来进行。通过一个或多个这样的时期的多个循环，从重叠寡核苷酸的组组装出期望的核酸分子。在一个实施方案中，在单个步骤中进行所述方法。

引物

在一些实施方案中，所述组装混合物还包含引物。在一个实施方案中，所述引物与它们的5’末端上的末端寡核苷酸退火。所述末端寡核苷酸是形成寡核苷酸链的5’末端的那些寡核苷酸片段(在一个实例中，图1中的寡核苷酸A和F)，所述寡核苷酸链形成待组装的核酸分子。如本文中所描述，从一组重叠寡核苷酸片段组装待组装的核酸分子。当将寡核苷酸片段退火和当DNA聚合酶填充空位时，所期望的核酸分子被组装。所述引物可具有在本方法中起作用的任何适当的大小。在各种实施方案中，所述引物可以为约10个核苷酸，或约15个核苷酸，或约18个核苷酸，或约20个核苷酸，或约25个核苷酸，或约30个核苷酸，或约35个核苷酸或更长，或10至20个核苷酸，或5至15个核苷酸，或15至25个核苷酸，或20至40个核苷酸，或30至50个核苷酸，或40至60个核苷酸，或50至70个核苷酸。在一个实施方案中，所述引物为约60个核苷酸。

在另一个实施方案中，在所述组装混合物中不存在引物，但所述末端寡核苷以比其它(非末端)寡核苷酸更高的浓度存在。所述末端寡核苷酸可具有如本文中描述的任何适当的长度，但在一个实施方案中，所述末端寡核苷酸的长度为约60个核苷酸。所述末端寡核苷酸还可以以不同的浓度存在，这取决于具体的应用，但在一个实施方案中，以约500nM的浓度存在。末端寡核苷酸的一个实例是图1中的寡核苷酸A和F。在另一个实施方案中，可使用引物和末端寡核苷酸的混合物。所述非末端寡核苷酸是不为所述末端寡核苷酸的那些寡核苷酸。

寡核苷酸

本发明中使用的寡核苷酸可具有任何适合的长度。在各种实施方案中，所述寡核苷酸包含40-80en核苷酸，或40-60个核苷酸，或50-70个核苷酸，或约60个核苷酸。但在其它实施方案中，本发明中使用的寡核苷酸可具有在本方法中起作用的任何长度。另外的实例包括，但不限于，20-40个核苷酸、30-50个核苷酸、40-60个核苷酸、或50-70个核苷酸、或60-80个核苷酸、或约20个核苷酸、或约30个核苷酸、或约40个核苷酸、或约50个核苷酸、或约60个核苷酸、或约70个核苷酸、或约80个核苷酸、或超过80个核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸的组中的寡核苷酸无空位，即使用无空位比对。无空位比对意指当将所述组的寡核苷酸对齐时，待组装的基因的所有核苷酸和/或序列以所述组的至少2个寡核苷酸为代表。在其它实施方案中，使用有空位的寡核苷酸组。在图2中说明有空位和无空位的寡核苷酸的实例。

在不同的实施方案中，所述组装混合物含有一组至少5个，或至少10个，或至少25个寡核苷酸，或至少50个寡核苷酸，或至少60个寡核苷酸，或至少70个寡核苷酸，或至少80个寡核苷酸，或至少90个寡核苷酸，或至少100个寡核苷酸，或至少110个寡核苷酸，或至少120个寡核苷酸，或至少150个寡核苷酸。在根据本发明的一步反应中组装所述寡核苷酸的组。在其它实施方案中，所述组装混合物含有50至100个寡核苷酸，或75至125个寡核苷酸，或100至150个寡核苷酸。

在不同的实施方案中，所述组装混合物中的寡核苷酸以约2.5nM或2.0nM至3.0nM的浓度存在。在使用末端引物的实施方案中，所述末端引物可以以约500nM或约400nM至约600nM的浓度存在。通过参考本说明书，本领域普通技术人员将认识到可根据选择的反应条件改变寡核苷酸和/或末端引物的具体浓度。

DNA聚合酶

本方法中使用的DNA聚合酶可以是任何适合的DNA聚合酶。在具体的实施方案中，含有使持续合成能力增强的持续合成能力增强结构域的火球菌属(Pyroccoccus)样酶也是适合的。虽然可使用任何DNA聚合酶，但递送高准确性和高持续合成能力的DNA聚合酶将是最有效的。在一些实施方案中，所述DNA聚合酶还可具有5’→3’DNA聚合酶活性或3’→5’外切核酸酶活性。在一个实施方案中，所述DNA聚合酶在DNA扩增反应中在产物的扩增中生成平端。此外，可用于本发明的DNA聚合酶的非限定性实例包括来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶，可在一个或多个结构域上修饰所述DNA聚合酶以提供比天然酶更大的活性和/或更大的准确性。所述修饰可包括酶的核酸序列的变化，以提供在DNA组装过程中具有更有利的性质的酶。所述DNA聚合酶可以是热稳定的。所述DNA聚合酶可具有这些性质的全部或仅一些性质，并且本领域普通技术人员借助于本说明书将认识到哪种性质可有利地用于方法的特定应用中，以及哪种反应条件和缓冲液组分适合于特定的DNA聚合酶。适合于本方法的一种DNA聚合酶是商购可得的高保真DNA聚合酶(Finnzymes,Oy,FI)。其它DNA聚合酶也可以是适合的。在一个实施方案中，主混合物(master mix)可含有具DNA聚合酶和适当浓度(例如，1.5mM)的MgCl₂以及适合浓度的100％DMSO中的dNTP(例如，终浓度为200uM的每一种dNTP)的混合物。

任何适合的反应缓冲液可用于本发明的组装反应物中，诸如，例如ISO缓冲液。本领域普通技术人员将认识适合用于进行本文中公开的方法的另外的缓冲液和条件。

循环和时期

所述方法的循环由一个或多个时期，诸如一个或多个退火期、一个或多个延伸期以及一个或多个变性期组成。在一个实施方案中，循环具有退火期、延伸期和变性期，但在一些实施方案中，循环可具有超过一个每一类型的时期。所述方法可利用进行组装所必需的任何适合数目的循环。在各种实施方案中，在所述方法中包括约25个循环或约30个循环或约35个循环。在其它实施方案中，在所述方法中包括超过20个循环，或超过25个循环，或超过30个循环，或超过35个循环。在更多实施方案中，在所述方法中包括少于25个循环，或少于30个循环或少于35个循环。

在所述方法的一些实施方案中，一个或多个所述时期可以是随时间变化的时期。所述时期的任一个时期可以是随时间变化的时期，或所有所述时期或时期的任意组合可以是随时间变化的时期；从而可存在随时间变化的退火期和/或随时间变化的延伸期和/或随时间变化的变性期。随时间变化的时期是进行在循环间变化或改变的一段时间的时期。循环的随时间变化的时期(例如，随时间变化的延伸期)可在时间上相对于先前循环的相同时期或相对于所述循环的第一个这样的时期或相对于所述方法的第一个循环的所述时期得以增加或减少。例如，在一个实施方案中，每一个循环的延伸期是随时间变化的时期。因此，在一个实施方案中，循环的第一个延伸期在约67℃进行约6分钟，并且对于一个或多个随后的循环，可使所述延伸期增加约15秒。在另一个实施方案中，随时间变化的时期可在时间上相对于所述方法的第二个循环得以增加或减少。时域(timewise)延伸可以是累计的，因此如果循环1具有6分钟的延伸期，则循环2延伸期可以为约6分钟15秒(1:15)，并且循环3可以为约6:30(即，按每循环约15秒累计地增加)，依此类推。在各种实施方案中，随时间变化的时期中的时域增加可以是约5秒，或约10秒，或约15秒，或约20秒，或约25秒，或约30秒，或约45秒，或约1分钟的增加。从一个循环至下一个循环，任何时期的增加可以是随时间变化的和/或累计的或非累计的。在一些实施方案中，一个或多个退火期和/或变性期随时间变化，例如通过延长(无论是累计地还是非累计地)上述时期的任何时期的所述时期的时间来改变。合并的退火/延伸期还可如本文中所描述随时间变化。在不同的实施方案中，至少2个循环或至少3个循环可利用随时间变化的时期。

循环的第一个延伸期(或任何循环的任何延伸期)可以只是延伸期或可以是其中退火和延伸在相同时期发生的合并的退火/延伸期。在不同的实施方案中，循环的第一个合并的退火/延伸期(或随后的合并的退火/延伸期)可进行至少30秒/千碱基的正组装的核酸，或至少1分钟/kb的正组装的核酸，或至少1.5分钟/kb，或至少2分钟/kb，或至少2.5分钟/kb，或至少3分钟/kb的正组装的核酸的时间段。在不同的实施方案中，循环的第一延伸期或合并的退火/延伸期可持续约15秒，或约30秒，或约45秒，或约1分钟，或约2分钟，或约3分钟，或约4分钟，或约5分钟，或约6分钟，或约7分钟，或约8分钟，或约9分钟或约10分钟。如本文中所述，随后的延伸期或合并的退火/延伸期可随时间变化，以及可得以累计地增加，或可具有相同的时间段，如本文中所描述的。

在变性期过程中，使核酸分子变性。在一个实施方案中，使用热变性。可在约98℃的温度下发生热变性。但可使用用于使核酸分子变性的任何温度，诸如高于或低于70℃，或高于或低于80℃，或高于或低于90℃，或高于98℃。本领域普通技术人员通过参考本公开，将认识到变性的精确温度将取决于核酸分子的精确组成和长度。取决于核酸的精确组成和长度，变性期的时间还可变化。在一些实施方案中，变性期可发生30秒。但在其它实施方案中，变性期的长度可多于或少于30秒。

在退火期过程中，寡核苷酸的组的寡核苷酸将会找到它们的互补(反义)序列，并且通过形成双链核酸(通过氢键)退火。所述核酸序列可具有有空位的区域。在退火期过程中，还可提供寡核苷酸的组、其它组装混合物的组分，其可包括DNA聚合酶、dNTP的混合物和拥挤剂(例如，聚乙二醇)。还可提供另外的组分，诸如适合的缓冲液、缓冲液组分、任选的连接酶(如果需要的话)以及另外的组分。

在延伸期过程中，所述DNA聚合酶聚合dNTP，并且通过寡核苷酸的组的杂交或退火填充留下的空位(例如参见图1)。如本文中所述，在一些实施方案中，可将延伸期和退火期组合成单个时期。在各种实施方案中，各种实施方案中的退火期或合并的的退火/延伸期中使用的温度可以为约65℃，或约66℃，约67℃，或约68℃，或约69℃，或约65至约69℃，或约66℃至约68℃。用于合并的退火/延伸期的时间段可变化，这取决于待组装的核酸序列的长度。在各种实施方案中，合并的退火/延伸期可以为约1分钟，或约2分钟，或约3分钟，或约4分钟，或约5分钟，或约6分钟，或约7分钟，或约8分钟，或约9分钟或约10分钟。在各种实施方案中，对于小于或等于约1kb的核酸序列，合并的退火/延伸期的时间和温度可以为67℃，持续1分钟。在其它实施方案中，对于约2kb至约3kb，或约2kb至约6kb，或约3kb至约4kb，或约3kb至约6kb，或约2kb至约7kb，或约2kb至约8kb的核酸序列，合并的退火/延伸期可在约67℃下进行约6分钟。在随时间变化的形式中，所述合并的退火/延伸期可按每循环适当的时间段累计地增加。例如，在一些实施方案中，合并的退火/延伸期的时间段可按每循环约15秒，或按约10秒/循环或约20秒/循环累计地增加。取决于具体应用，循环的数目可变化，但在不同的实施方案中，可使用约30个循环，或约25个循环，或约35个循环，或约40个循环。可使用任何适合的数目的循环。其它实例包括超过20个循环，或超过25个循环，或超过30个循环或超过35个循环。

具有富含AT序列的DNA的链通常难以组装。本发明的方法能够毫无困难地组装具有富含AT序列的DNA分子。在不同的实施方案中，富含AT的序列可具有大于60％，或大于65％，或大于70％的AT含量。所述方法可还组装具有高GC含量的核酸，所述核酸也因不足的链分离和二级结构形成而通常难以组装。在对于具有富含AT的区域的核酸序列使用合并的退火/延伸期的实施方案中，期望使用更低的温度。因此，在一个实施方案中，为了组装富含AT的核酸序列，退火/延伸期的温度可以为约62℃，或约63℃，或约64℃，或约65℃，或约66℃或或约67℃。在一个实施方案中，合并的时期的时间段为约4分钟。但在其它实施方案中，合并的时期的时间段为约3分钟或约5分钟。在具体实施方案中，在65℃下进行合并的退火/延伸期约4分钟。富含AT的序列的所述时期可随时间变化，如本文中描述的。

试剂盒

在另一个方面，本发明提供了用于进行本发明方法的试剂盒。在一个实施方案中，本发明的试剂盒含有DNA聚合酶、dNTP的混合物和拥挤剂。所述试剂盒还可含有用于进行本发明的方法的说明书和/或指导用户访问提供关于进行所述方法的信息的网站或其它来源的信息。可在单独的容器中或在相同的容器中提供试剂盒中含有的DNA聚合酶、dNTP和拥挤剂。所述DNA聚合酶、dNTP拥挤剂可以是本文中描述的任何试剂。

实施例1–小于1kb的PCR产物的组装

本实施例说明在拥挤剂(此处是PEG 8000)存在相对于不存在的情况下，用于小于1kb的PCR产物的一步基因组装法之间的比较。

选择具有如下长度的3个基因：基因1：32个寡核苷酸；基因2：28个寡核苷酸；基因3：30个寡核苷酸；基因4：31个寡核苷酸。所有寡核苷酸的长度为60-70个碱基。60个碱基的寡核苷酸具有30个碱基的悬垂，并且70个碱基的寡核苷酸具有35个碱基的悬垂。对于每一个基因，通过添加5ul的每一种寡聚物(100uM的原液)将所有寡核苷酸在50ml管中混合。通过添加1xTE缓冲液，pH 8.0将体积调整至20ml，以获得25nM/寡聚物的终寡核苷酸浓度。

用0.75％PEG 8000制备ISO原液缓冲液。将ISO缓冲液用作将PEG递送至PCR反应物的工具。其含有所需量的PEG-8000、600mMTris-HCl，pH 7.5、40mM MgCl₂、40mM DTT、800uM的4种dNTP的每一种和4mM NAD。将原液添加至2x主混合物(Finnzymes Oy,FI)以获得0.375％w/v的终PEG浓度。主混合物缓冲液含有DNA聚合酶、核苷酸和含有MgCl₂的反应缓冲液。本领域普通技术人员将认识到商业上制备的混合物提供了巨大的方便性，但可制备其它适合的制剂。

为了在PEG 8000不存在的情况下组装寡核苷酸，用0.5和1ul的25nM/上述寡核苷酸混合物设立反应，随后向管中添加2x主混合物(Finnzymes Oy,FI)、水以及A和B引物。总PCR体积为20ul。

为了在PEG 8000存在的情况下组装寡核苷酸，用0.5和1ul的25nM/上述寡核苷酸混合物设立反应，随后向管中添加2x主混合物(Finnzymes Oy,FI)和0.0375％PEG 8000、水以及A和B引物。总PCR体积为20ul。

表1

使用下列组装方案：

步骤1 在98℃进行30秒变性期

步骤2 在67℃进行1分钟合并的第一退火/延伸期

步骤3 以15秒/循环累计地增加退火/延伸期的时间

重复步骤1-3，进行总共30个循环

总反应时间：约2.5小时

用5ul的上述反应物进行1.2％DNA凝胶。所述凝胶显示有空位的寡核苷酸的强劲扩增可通过在67℃合并退火和延伸温度来实现。在PEG存在的情况下组装的寡核苷酸提供了与在PEG存在的情况下组装的那些样品显著更加不同的凝胶条带。

实施例2-2.3kb基因的组装

本实施例说明在PEG 8000存在和不存在的情况下从86个无空位的寡核苷酸进行的2.3kb基因(mutS)的一步PCR组装。

通过添加5ul的每一种寡核苷酸(100uM原液)来将寡核苷酸在50ml管中混合。通过添加1xTE缓冲液,pH 8.0将体积调整至20ml来获得25nM/寡核苷酸的终寡核苷酸浓度。在水中制备0.75％PEG8000原液。将所述原液添加至主混合物(Finnzymes Oy,FI)以获得0.0054％、0.0188％、0.0375％、0.075％和0.15％的终PEG浓度。所有使用的寡核苷酸的长度为60-70个碱基。60个碱基的寡核苷酸具有30个碱基的悬垂，并且70个碱基的寡核苷酸具有35个碱基的悬垂。

为了在PEG 8000不存在的情况下组装86个寡核苷酸，将0.5ul、1.0ul、1.5ul和2.5ul(对应于图3中泳道7-10，泳道M为标准标记泳道)的上述25nM寡核苷酸混合物添加至4个PCR管，随后添加主混合物、水和引物以获得20ul的总PCR体积。

为了在PEG 8000存在的情况下组装86个寡核苷酸，将1ul的25nM寡核苷酸混合物添加至5个PCR管中，随后添加具有0.0054％、0.0188％、0.0375％、0.075％和0.15％(对应于图3中的泳道1-5)的终PEG 8000浓度的主混合物、水和引物以获得20ul的总PCR体积。

表2

使用下列组装方案：

步骤1 在98℃进行30秒

步骤2 在67℃进行6分钟

步骤3 以15秒/循环增加时间

重复步骤1-3，进行总共30次

总反应时间：约6小时

用5ul的上述反应物进行1.2％DNA凝胶。在图3中说明凝胶。所述凝胶显示单独的PCR条件不足以组装大DNA片段，以及单独的PEG 8000(无其它ISO组分)允许成功的组装。本实施例还说明通过提供至少2.5分钟/kb的经组装的核酸的合并的第一循环退火/延伸期，成功地组装了2.3kb基因(mutS)。

实施例3-从124个寡核苷酸组装3.7kb基因

本实施例显示在PEG 8000存在和不存在的情况下从124个无空位的寡核苷酸进行的3.7kb基因(MetH)的一步PCR。所有使用的寡核苷酸的长度为60-70个碱基。60个碱基的寡核苷酸具有30个碱基的悬垂，并且70个碱基的寡核苷酸具有35个碱基的悬垂。

通过添加5ul的每一种寡聚物(100uM的原液)将寡核苷酸在15ml管中混合。通过添加1xTE缓冲液，pH 8.0将体积调整至10ml，以获得50nM/寡聚物的终寡核苷酸浓度。用0.75％PEG 8000制备ISO原液缓冲液。将原液添加至主混合物(Finnzymes Oy,FI)以获得0.0188％、0.0375％、0.075％、0.3％和0.45％的终PEG 8000浓度。

为了在PEG 8000不存在的情况下组装寡核苷酸，将0.5ul、1.0ul、1.5ul、2.0ul和3.0ul(分别对应于图4中泳道1-5)的上述50nM/寡核苷酸混合物添加至5个PCR管，随后添加主混合物、水和引物以获得20ul的总PCR体积。

为了在PEG 8000存在的情况下组装寡核苷酸，将1ul的50nM寡核苷酸混合物添加至5个PCR管中，随后添加具有0.0188％、0.0375％、0.075％、0.3％和0.45％的PEG 8000(如图4中泳道6-10显示的)的预混合物、水以及引物以获得20ul的总PCR体积。

表3

使用下列组装方案：

步骤1 在98℃进行30秒

步骤2 在67℃进行6分钟

步骤3 以15秒/循环增加时间

重复步骤1-3，进行总共35次

总反应时间：约7小时

用3ul的上述反应物进行1.2％DNA凝胶，并且于图4中说明所述凝胶。结果显示可按照本发明从寡核苷酸组装3.7kb基因。

实施例4–富含AT的基因的组装

本实施例说明在PEG 8000存在和不存在的情况下，从70个无空位的寡核苷酸进行的富含AT的2.1kb基因(dhaB1)的一步PCR组装。还显示了在PEG 8000存在和不存在的情况下从63个无空位的寡核苷酸组装富含AT的1.7kb基因(dhaB)。所有使用的寡核苷酸的长度为60-70个碱基。60个碱基寡核苷酸具有30个碱基的悬垂，并且70个碱基的寡核苷酸具有35个碱基的悬垂。

通过添加5ul的每一种寡聚物(从100uM的原液)将寡核苷酸在50ml管中混合。通过添加1xTE缓冲液，pH 8.0将体积调整至20ul，以获得25nM/寡聚物的终寡核苷酸浓度。

用0.75％PEG 8000制备ISO原液缓冲液，并且所述原液缓冲液具有如实施例1中描述的组分。将原液添加至主混合物(Finnzymes Oy,FI)以获得0.0375％的终PEG 8000浓度。

为了在PEG 8000不存在的情况下组装寡核苷酸，将0.5ul、1.0ul、1.5ul和2.0ul(在图5的“在PEG 8000不存在的情况下”的凝胶中，对于1.7kb基因，分别显示为泳道1-4，以及对于2.1kb基因，分别显示为泳道5-8)的上述20nM寡核苷酸混合物添加至5个PCR管，随后添加主混合物、水和引物以获得20ul的总PCR体积。

为了在PEG 8000存在的情况下组装寡核苷酸，将0.5ul、1.0ul、1.5ul和2.0ul(在图5的“在PEG存在的情况下”的凝胶中，对于1.7kb基因，分别显示为泳道1-4，以及对于2.1kb基因，分别显示为泳道5-8)的25nM寡核苷酸混合物添加至5个PCR管中，随后添加具有0.0375％的PEG 8000的预混合物、水以及引物以获得20ul的总PCR体积。

表4

使用下列组装方案：

步骤1 在98℃进行30秒

步骤2 在67℃进行4分钟

步骤3 以15秒/循环增加时间

重复步骤1-3，进行总共30次

总反应时间：约5小时

用3ul的上述反应物进行1.2％DNA凝胶，并且于图5中说明所述凝胶。结果显示单独的组装条件不足以组装大的富含AT(70％)的DNA片段，以及拥挤剂(PEG 8000)的添加促进了成功的组装。还显示了在合并的退火/延伸期过程中可降低温度以促进富含AT的DNA的组装。

实施例5-从7个重叠dsDNA片段组装7kb的DNA产物

本实施例说明在PEG 8000存在或不存在的情况下，产生7kb分子的7个DNA片段的一步PCR组装。将7个与每一个片段具有30bp同源性(重叠)的DNA片段(50ng-100ng)混合。250bp的片段1；2,000bp的片段2；1,000bp的片段3；700bp的片段4；1,500bp的片段5；1,000bp的片段6；和1,800bp的片段7。

在水中制备0.15％PEG 8000的原液。将所述原液添加至2x主混合物(Finnzymes Oy,FI)以获得0.0375％和0.075％的终PEG 8000浓度。

为了在PEG 8000不存在的情况下组装7个DNA片段，将3.5ul的片段混合物添加至PCR管，随后添加主混合物、水和引物。

为了在PEG 8000存在的情况下组装7个DNA片段，将3.5ul的片段混合物添加至2个PCR管，随后添加具有0.0375％和0.075％的终PEG浓度的主混合物、水和引物A和B。

表5

使用下列组装方案：

步骤1 在98℃进行30秒

步骤2 在67℃进行6分钟

步骤3 以15秒/循环增加时间

重复步骤1-3，进行总共30次

总反应时间：约7小时

用3ul的上述反应物进行1.2％DNA凝胶，并且于图6中说明所述凝胶，其中泳道1不含PEG，泳道2含有0.0375％PEG，且泳道3含有0.075％PEG，以及泳道M是标记泳道。结果显示重叠DNA片段的强劲扩增通过在67℃合并退火和延伸温度来实现。PEG 8000增加产物。

实施例6-mutS(86个寡核苷酸)的组装

本实施例说明比较PEG和ISO的mutS(86个寡核苷酸)的一步PCR组装。所有使用的寡核苷酸的长度为60-70个碱基。60个碱基寡核苷酸具有30个碱基的悬垂，并且70个碱基的寡核苷酸具有35个碱基的悬垂。

通过添加5ul的每一种寡聚物(100uM的原液)将寡核苷酸在50ml管中混合。通过添加1xTE缓冲液，pH 8.0将体积调整至20ml，以获得25nM/寡聚物的终寡核苷酸浓度。

在水中制备0.75％PEG 8000的原液。将所述原液添加至主混合物(Finnzymes Oy,FI)以获得0.0188％、0.028％、0.0375％和0.075％的终PEG 8000浓度。

在ISO缓冲液中制备0.75％PEG 8000的原液，所述缓冲液原液具有如实施例1中描述的组分。将所述原液添加至主混合物(Finnzymes Oy,FI)以获得0.0188％、0.028％、0.0375％和0.075％的终PEG 8000浓度，分别如图7中的泳道1-4显示的。泳道5-8不含PEG并且M为标记泳道。

表6

使用下列组装方案：

步骤1 在98℃进行30秒

步骤2 在67℃进行6分钟

步骤3 以15分钟/循环增加时间

重复步骤1-3，进行总共30次

总反应时间：约6小时

用3ul的上述反应物进行1.2％DNA凝胶，并且于图7中说明所述凝胶。结果显示PEG是ISO中的改善PCR介导的DNA组装的组分。

实施例7–组装最小基因组子组装体

使用ARCHETYPE^TM(Synthetic Genomics,Inc.,San Diego,CA)软件程序将来自支原体属(Mycoplasma)的最小基因组分成370个各自约1.4kb的建议片段。这370个片段中的每一个依次分成约44个(无空位的)寡核苷酸，每一个寡核苷酸的长度为约70个核苷酸，并且含有与反向相邻的寡核苷酸重叠的约35个核苷酸(即每一个相邻双链DNA上约35个核苷酸的重复序列)。片段的侧翼(或“末端”)寡核苷酸(例如寡核苷酸#1和寡核苷酸#44)含有对于所有370个片段是共同的序列的30个核苷酸(以用于PCR扩增)和含有限制位点(例如NotI)的序列的8个碱基(以用于从载体释放插入物)。370个片段的每一个还含有60个核苷酸的与相邻双链核酸片段重叠的序列，以便它们可被重组以进行随后阶段的组装。

一旦包含该370个子组装体的每一个的寡核苷酸混合后，就将它们稀释至200nM/寡核苷酸的浓度。在单个步骤中组装寡核苷酸并且扩增所得的产物的组装反应示于下文中：

50ul 2X Q5聚合酶混合物(NEB)

0.8ul 5％PEG-8000

0.5ul引物1[pUC19 Insert F]

0.5ul引物2[pUC19 Insert R]

1.25ul 200nM的上述寡核苷酸汇集物

46.95ul水

我们发现，对于这些高A/T含量的DNA样品，有益地在60℃或更低温度下退火/延伸。

使用下列循环条件，并且所述条件在范围广泛的DNA序列间起作用：

循环条件：

1.在98℃进行1分钟

2.在98℃进行10秒

3.在57℃进行30秒

缓慢冷却(0.1C/秒)至40C

4.在40℃进行30秒

3.在57℃进行6分钟

以15秒/循环增加

4.转至步骤2，再进行29次

5.在72C进行5分钟

6.10℃-----

随后使所述组装物经历组装的其它阶段，其中将1.4kb的构建体组装成74个各自6.7kb的构建体。随后将这些6.7kb的构建体组装成8个各自50-75kb的构建体，随后将所述构建体组装成483kb的最小支原体属基因组。

实施例8–功能性HA和NA DNA分子和蛋白质部分的合成

本实施例说明HA和NA基因的DNA构建体从寡核苷酸汇集物的自动组装。流感病毒由含有包围中央核心的糖蛋白的病毒包膜组成。所述中央核心含有病毒RNA基因组与包装和保护所述RNA的其它病毒蛋白。流感病毒基因组通常含有8个片段的各自含有1或2个编码病毒蛋白质的基因的RNA。在甲型流感的情况下，所述基因组含有在8个片段的RNA上编码包括血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的11种蛋白质的11个基因。其它蛋白质包括核蛋白(NP)、M1、M2、NS1、NS2、PA、PB1、PB1-F2和PB2。

血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是存在病毒颗粒外部上的糖蛋白。这些糖蛋白在病毒的生命周期中具有至关重要的功能，包括帮助结合于宿主细胞和病毒颗粒的复制。含有这些蛋白质的组装的病毒从而用于疫苗的生产。

寡核苷酸合成和组装

将代表HA和NA基因的DNA构建体序列的96个寡核苷酸汇集物提供给本发明的组装单位。所述HA和NA构建体的长度为约3kb，并且在所述方法中从96个寡核苷酸组装而来。第一和最后的寡核苷酸含有用于PCR扩增的引物结合结构域和在扩增后释放引物结合结构域的NotI限制位点以及进行DNA组装的暴露重叠区，必要时以组装更大的片段。

所述组装单位使用具有集成热循环能力的NXP,Span-8实验室自动化工作站(Beckman Instruments Inc.,Fullerton,CA)。

对所述组装单位进行编程以进行所述过程中的几个不同步骤，即，1)扩增寡核苷酸的PRC1扩增；2)针对PCR1扩增的寡核苷酸的误差校正步骤；3)扩增校正的寡核苷酸的PCR2步骤；4)提供纯的扩增的寡核苷酸的PCR产物纯化步骤；5)将所述寡核苷酸产物组装成基因的组装步骤。可在反应容器(其为96孔板)的不同反应区中进行每一个过程，并且所述反应区可以是96孔板上的1列或多列。组装反应是在50℃下进行30-60分钟，并且反应的温度发生变动以及此后保持在10℃。

第一PCR和误差校正

对于每一个组装的产物，以自动方式进行PCR反应：

25ul 2X热启动主混合物(Thermo Fisher Scientific Oy,Oy,Fl)

2ul 1％PEG 8000

0.25ul末端引物1(100uM)

0.25ul末端引物2(100uM)

20ul MBG水

将2.5ul的上述寡核苷酸汇集物作为模板以50nM转移至含有PCR主混合物的容器的反应区(或随后合并)。

2.使用下列参数进行热循环：

在98℃进行1分钟

30X(在98℃进行30秒，在65C进行6分钟以及按15秒/循环延长该时间，在72℃进行5分钟)

在10℃永久放置

PCR纯化

使用XP技术(Agencourt,Bioscience Corp.Beverly,MA)纯化PCR产物

将子组装体在质粒载体内合并成HA和NA基因的GIBSON(Synthetic Genomics,San Diego,CA)。

产生约3kb的核酸构建体。电泳凝胶示于图8中。这些基因已包括启动子区域(pol I和pol II)以在转染进哺乳动物细胞后进行表达。

可适合地在本文中未明确公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制不存在的情况下实施本文中说明性描述的本发明。因此，例如，在本文中的每一种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”的任一个可被另外两个术语的任一个替代。已采用的术语和表达被用作描述而非限制的术语，并且在这样的术语和表达的使用中无意排除所示和所述描述的特征或其部分的任何等同物，但应认识到，各种修改可能在所要求保护的本发明的范围内。

此外，当根据马库什(Markush)组描述本发明的特性或方面时，本领域技术人员将认识到，本发明也由此根据马库什组的任何单个成员或成员的亚组来描述。例如，如果X被描述为选自由溴、氯和碘组成的组，那么充分描述关于X是溴的权利要求和关于X是溴和氯的权利要求。

其它实施方案在以下权利要求内。

Claims

1.一种用于在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子的方法，所述方法包括：

(a)使一组重叠寡核苷酸与

DNA聚合酶；

dNTP的混合物；和

聚乙二醇；

接触，以形成组装混合物；

(b)使所述组装混合物经历多个循环，每一个循环包括一个或多个退火期、延伸期、变性期，

(c)由此在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装所述核酸分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸的组包括末端寡核苷酸和非末端寡核苷酸，并且在所述组装混合物中以比所述非末端寡核苷酸高的浓度提供所述末端寡核苷酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个退火期在50℃至77℃的温度下发生。

4.根据权利要求1所述的方法，其中循环的延伸期在时间上相对于先前循环的延伸期得以增加。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶是来自激烈火球菌的经修饰的DNA聚合酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其中将所述寡核苷酸的组组装成基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚乙二醇是PEG 8000。

8.根据权利要求7所述的方法，其中PEG的浓度为0.025％或更大。

9.根据权利要求7所述的方法，其中PEG的浓度为0.375％或更大。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述退火期发生在67℃。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述退火期和所述延伸期发生在67℃。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸分子的长度大于1kb。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸分子的长度大于2kb。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸分子的长度大于3kb。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述重叠寡核苷酸的组包含至少5个寡核苷酸。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述重叠寡核苷酸的组包含至少60个寡核苷酸。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述重叠寡核苷酸的组包含至少75个寡核苷酸。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述组装的核酸分子大于2kb，所述初始延伸期为5分钟至7分钟，并且随后的延伸期为随时间变化的时期。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述组装的核酸分子大于3kb，所述初始延伸期为5分钟至7分钟，并且随后的延伸期在时间上相对于所述初始延伸期逐渐增加。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述重叠核苷酸的组包含超过100个寡核苷酸。

21.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个时期是随时间变化的时期。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述延伸期是随时间变化的时期。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述延伸期按约15秒/循环累计地延长。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个循环包括至少25个循环。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述组装的核酸分子包含一个或多个富含AT的序列。