JP6751352B2 - 核酸分析方法及びそれに用いる蛍光・濁度測定装置 - Google Patents

核酸分析方法及びそれに用いる蛍光・濁度測定装置 Download PDF

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Description

本発明は、核酸分析方法及びそれに用いる蛍光・濁度測定装置に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子検査に利用できる核酸分析方法及びそれに用いる蛍光・濁度測定装置に関する。より詳細には、本発明は、生体から抽出したデオキシリボ核酸(DNA)を増幅させる方法において、DNAの増幅を検出すること、及びDNAの一塩基多型(SNP、あるいはSNPsと呼ぶが、ここではSNPsと呼ぶ)を検出することの両方が可能な装置、及びこの装置を用いた、DNAの増幅を検出する方法及びSNPsを検出する方法を含む核酸分析方法に関する。この核酸分析方法においては、DNAの増幅が所定の量を越えたことを自動で検出することが可能であり、かつSNPsの検出を自動で行うことも可能である。
関連出願の相互参照
本出願は、2014年12月26日出願の日本特願2014−265940号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
遺伝子検査において、生体から抽出したDNAを用いて、紫外線を用いる方法や、電気詠動を用いる方法などで、DNAを検出する方法が利用されている。しかし、生体から抽出したDNAをそのまま用いるとDNAの数が少ないため検出感度が低く誤検出する可能性が高いことから、一般的には、生体から抽出したDNAを増幅させてからDNAを検出する方法が採られている。DNAを増幅させる方法やDNAを検出する方法は、DNAの種類に応じて複数の方法が実用化されており、それぞれの方法に対応した機器が製造・販売されている。
これまでは、DNAなどの遺伝子を専門に扱う大学、研究機関、製薬会社などの専門機関に限り、DNAを用いた研究が盛んに行われていたが、近年、病院や保健所などの一般的な機関でもDNAを用いた検査が実施されるようになってきた。しかしながら、現状、製造・販売されている機器の多くが研究用途の為、機器の使用にはDNAの専門知識を必要とする。そのため、DNAの専門知識が無くても簡単に使用できる検査機器が望まれている。
DNAを増幅させる方法の1つにLoop−Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法がある。LAMP法では、生体から抽出したDNAを、DNA増幅に必要な溶液に混合する。この時に混合したDNAと結合する蛍光物質や、DNAの合成反応で生成されたピロリン酸塩による白濁により、DNA増幅の可否を確認できる。DNAの入った混合溶液を、所定の温度(DNAごとに異なる50℃から70℃弱のいずれかの温度)で所定の時間(DNAごとに異なる数分から数時間のいずれかの時間)加熱することにより、DNAが増幅する。DNAの増幅過程では、DNAの二本鎖が2つに切り離され、それぞれの鎖に物質が結合し、元のDNAと同様の二本鎖の構造を持つDNAが作成される。これを繰り返し行うことにより、DNAが増幅する。この時に、DNAの増幅に合わせて、DNAに結合する蛍光物質からの蛍光の光強度が大きくなったり、DNA合成反応で生成されたピロリン酸塩により溶液が濁ってきたりする。溶液の蛍光の光強度や蛍光の光強度の変化や、濁りによる光強度の減光量や光強度の変化を検出することにより、DNA増幅の可否を判別する。
DNAを増幅させた後、DNAを増幅するために用いた触媒(酵素)を失活させ、溶液中のDNAを安定させる必要がある。所定の温度(DNAごとに異なる80℃から100℃のいずれかの温度)で所定の時間(DNAごとに異なる2分から10分のいずれかの時間)加熱して、触媒を失活させる。
DNAのSNPsを検出する方法の1つにFluorescence Loop Primer(FLP)法がある。FLP法は、DNAに結合する物質に蛍光体を結合させた物質と、DNAに結合する物質に蛍光体を消光する物質を結合させた物質を使用し、規則的に両者をDNAへ結合させることにより、DNAの結合状態と蛍光の光強度の相関を導き、蛍光の光強度から遺伝子の結合状態を検出する方法である。
DNAに結合する物質に蛍光体を結合させた物質と、DNAに結合する物質に蛍光体を消光する物質を結合させた物質を使用し、規則的に両者をDNAへ結合させる方法は次の通りである。DNAに結合する物質に蛍光体を結合させた物質として、DNAの増幅時にDNAの一本鎖と結合する物質に蛍光体を結合した物質(FLPと呼ぶ)を使用する。DNAに結合する物質に蛍光体を消光する物質を結合させた物質として、検出対象となるSNPsの塩基と結合する物質に消光する物質を結合させた物質(Quencher Probe(QP)と呼ぶ)を使用する。DNAの増幅が停止し安定した状態で、高温(100℃程度)から低温(40℃程度)に温度を下降、又は、上昇させることにより、DNAの二本鎖が2つに切り離される状態とDNAの二本鎖が生成される状態が発生し、通常はFLPが結合して蛍光発光するDNAが、SNPsの塩基が結合する温度では、FLPに代わりQPが結合して蛍光が消光する。さらに、SNPsの型によって、結合する温度が異なるため、蛍光の光強度又は蛍光の光強度の変化を検出することにより、SNPsの型を判別する。
DNAの増幅検出とSNPsの検出を行うための装置及び方法を開示する文献として、例えば、以下の文献がある。機器/検出方法(参照文献)の順で記載する。
・i−densy/Quenching Probe法(非特許文献1)
・ABI Prism 7900 HT/TaqMan法(非特許文献2)
・LightCycler/融解曲線分析(非特許文献3)
・LightCycler 480/High−resolution Melting Analysis、Hybridization Probe法、Invader−plus法、TaqMan法(非特許文献3)
・ABI Prism 7700/LAMP法(特許文献1)
特許文献1:日本特開2013-31463号公報
非特許文献1:Sensors 2012, 12, 16614-16627
非特許文献2:Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007;16(6)
非特許文献3:JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2011, p. 1853-1860
特許文献1及び非特許文献1〜3の全記載は、ここに特に開示として援用される。
DNAを増幅させるためのLAMP法を用いた機器は製造・販売されている(特許文献1参照)。しかしながら、多くの機器では、DNAの増幅を確認することはできず、機器の使用後に、試薬の状態を人が目視確認して判別している。また、DNAが所定の量を越えたことを自動で検出できる機器は製造・販売されているが、種類は少なく、高価である。また、DNAが所定の量を越えたことを自動で検出できる機器では、DNAと混合させた蛍光物質の光強度を検出する方法か、DNAと混合させた濁る物質の透過光の光強度を検出する方法のいずれか一方による方法であり、同時に自動で検出できる機器は無い。
DNAのSNPsを検出するためのFLP法を用いた機器は製造・販売されている。しかしながら、これらの機器では、測定した特性を数値データやグラフなどで人が目視確認してSNPsを判別しており、そのためには、専門的な知識を必要とする。さらに、機器は種類が少なく、高価である。また、現状、SNPsを自動で検出できる機器は無い。さらに、DNAを増幅させるためのLAMP法と組み合わせて、DNA増幅をさせた後、試薬を取りだすことなく、DNAのSNPsを検出できる機器はほとんど無く、DNA増幅の検出・確認とDNAのSNPs検出の両方を自動でできる機器は無い。
前記非特許文献1〜3に記載の機器及び方法でも、SNPs検出は蛍光を検出しているが、検出対象であるDNA増幅の検出・確認は、目視で行っている。DNA(核酸)増幅の検出・確認とSNPsの蛍光での検出の両方を実施できる装置は知られていない。
そのため、専門的な知識を必要とせず、簡単な操作で取り扱いが可能な、DNAを増幅させるためのLAMP法とDNAのSNPsを検出するためのFLP法を組み合わせて使用できる核酸分析用装置であって、LAMP法によるDNAの増幅を検出及び確認できる機能とSNPsを検出する機能を併せ持った装置、より具体的には、DNA増幅の検出及び確認のための濁度測定と蛍光測定を1つの装置で可能とする装置が望まれている。さらに、この装置を用いた、DNAのSNPsの自動検出機器の提供も望まれている。
本発明は前記の課題を解決することを目的としてなされたものであり、DNAを増幅させながら、所定のDNAの量を越えたことを検出して、その後、DNAを増幅させるための触媒を失活させ、DNAのSNPsを検出する過程を、簡単な操作で、自動で実施する装置である。以下、各請求項の説明をする。
本発明は、以下の通りである。
[1]
・測定試料を収容するための容器を格納するため容器格納部を少なくとも1つ有するサンプルホルダであって、前記サンプルホルダの容器格納部は、底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔と底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔を有し、
・前記容器格納部内に格納した容器への光照射用光源、
・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料の濁度計測用素子、
・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料から発せられる蛍光計測用素子、
・前記容器格納部内に格納した容器の温度を調節するための温度調節装置、
を含む蛍光及び濁度測定装置であって、
−前記光源及び前記容器格納部は、前記2つの横貫通孔の一方を介して連通しており、
−前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、前記2つの横貫通孔の他方を介して連通しており、
−前記容器格納部及び前記蛍光計測用素子は、前記縦貫通孔を介して連通しており、
−前記容器格納部と前記蛍光計測用素子の間に、光源の光の少なくとも一部をカットし、容器から発せられる蛍光の少なくとも一部を透過する波長フィルタを含む、
前記装置。
[2]
−前記光源、前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、略水平関係に位置しており、
−前記蛍光計測素子は、前記容器格納部の略下方に位置する、
[1]に記載の装置。
[3]
−前記光源は、LEDであり、
−前記蛍光計測用素子は、フォトICであり、
−前記濁度計測用素子は、フォトダイオードである、
[1]または[2]に記載の装置。
[4]
前記LEDは、ピーク波長が465nmであり、半値幅が約20nmであり、
前記フォトICは、波長帯域が500〜580nmであり、
前記フォトダイオードは、波長帯域が450〜500nmであり、かつ
前記波長フィルタは、520nm以下の波長をカットするフィルタである、
[3]に記載の装置。
[5]
前記温度調節装置は、前記サンプルホルダの内部に設けられた加熱手段、前記サンプルホルダに向けて送風するための送風機、及び前記サンプルホルダの内部またはサンプルホルダに隣接して設けられた温度測定手段を含む、
[1]〜[4]のいずれかに記載の装置。
[6]
前記サンプルホルダの容器格納部の開口に対向する位置に、前記サンプルホルダに接近及び乖離可能な、サンプルホルダの容器格納部に格納された容器の蓋を押さえるための容器蓋押さえ部材をさらに有し、前記容器蓋押さえ部材は、温度調節装置を含む、[1]〜[5]のいずれかに記載の装置。
[7]
前記容器中の濁度及び蛍光を同時又は逐次に測定するために用いられる、[1]〜[6]のいずれかに記載の装置。
[8]
前記容器中に含まれる核酸の増幅を濁度測定により検知するために用いる、[7]に記載の装置。
[9]
前記容器中において核酸増幅後に、一本鎖核酸のハイブリダイズ又は二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を用いて検知するために用いられる、[7]又は[8]に記載の装置。
[10]
[1]〜[6]のいずれかに記載の装置を用いる核酸分析方法であって、
(1)前記容器中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置し、
(2)前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知し、
(3)所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する、ことを含み、
−前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を変化させることで、溶液中の一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察するか、又は溶液中の二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、前記方法。
[11]
前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を高温から低温に変化させることで、一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察することで行う、[10]に記載の方法。
[12]
前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を低温から高温に変化させることで、二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、[10]に記載の方法。
[13]
前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅は等温核酸増幅法で行う、[10]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]
前記等温核酸増幅法がLAMP法である、[13]に記載の方法。
[15]
前記等温核酸増幅法による核酸増幅は、40〜70℃の温度で行い、増幅完了後に溶液を90〜100℃に加熱し、増幅した二本鎖核酸を解離させて一本鎖核酸とし、その後、溶液を冷却して一本鎖核酸のハイブリダイズによる蛍光の発光又は消光を観察する、[13]又は[14]に記載の方法。
[16]
前記測定試料に含まれる核酸の一塩基多型(SNPs)を測定するための、[10]〜[15]のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、LAMP法によるDNAの増幅を検出及び確認できる機能とSNPsを検出する機能を併せ持った装置を提供することができる。本発明の装置を用いることで、LAMP法によるDNAの増幅を検出及び確認と、能とSNPsの検出を1つの装置で行う核酸分析方法を提供することができ、さらに、SNPsの検出を、DNAの増幅完了確認も含めて自動で行うこともできる。
図1は、本発明装置の測定部10の斜視図である。 図2は、本発明装置の測定部10とファン50の斜視図である。 図3は、本発明装置の測定部10の斜視断面図である。 図4は、本発明装置の測定部10の略断面説明図である。 図5は、本発明装置のサンプルホルダ11の説明図である。 図6は、本発明装置の容器(チューブ)蓋押え部14の説明図である。 図7は、本発明の実施形態のDNAを入れた溶液を使用し、DNAの増幅過程とDNA増幅の検出過程、DNAを増やすための触媒の失活過程、DNAのSNPsの検出過程を示す図である。 図8は、測定時の温度グラフである。 図9は、濁度測定時の光強度グラフである。 図10は、濁度グラフである。 図11は、蛍光測定時の蛍光光強度グラフである。 図12は、蛍光変化グラフである。 図13は、検出結果一覧表である。
[蛍光及び濁度測定装置]
本発明の蛍光及び濁度測定装置(以下、本発明装置と呼ぶ)を図1〜6を参照して説明する。
本発明装置は、
・測定試料を収容するための容器1を格納するため容器格納部11aを少なくとも1つ有するサンプルホルダ11、
・前記容器格納部11a内に格納した容器1への光照射用光源20、
・前記容器格納部11a内に格納した容器1中の測定試料の濁度計測用素子30、
・前記容器格納部11a内に格納した容器1中の測定試料から発せられる蛍光計測用素子40、
・前記容器格納部11a内に格納した容器1を加熱及び冷却するための温度調節装置、
を含む。
<サンプルホルダ11>
図3のようにサンプルホルダ11は、測定試料を収容するための容器1を格納するため容器格納部11aを少なくとも1つ有するサンプルホルダ11である。測定試料を収容するための容器1は、容器1に収容した測定試料の濁度及び蛍光の測定を妨げないという観点から、少なくとも濁度及び蛍光の測定に関係する波長域では光透過性であることが適当であり、さらに、光源からの光についても、濁度及び蛍光の測定に関係する波長域の光に対しては、光透過性であることが適当である。そのような容器としては、可視光領域において透明な反応用チューブを挙げることができる。
サンプルホルダ11の容器格納部11aは、底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔11cと底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔11b、11dを有する。後述するように、一方の横貫通孔は、光源20と容器格納部11aとの間を連通させるためのものであり、光源20から容器格納部11aへの光照射が過不足なく確保できるような形状及び寸法を有するものであることができる。他方の横貫通孔は、容器格納部11aと濁度計測用素子30との間を連通させるためのものであり、容器格納部11aに格納された容器中の測定試料の濁度を濁度計測用素子30において、測定できるように、容器中の測定試料を透過した光が濁度計測用素子30に過不足なく到達できるような形状及び寸法を有するものであることができる。さらに、縦貫通孔は、容器格納部11aと蛍光計測用素子40との間を連通させるためのものであり、容器格納部11aに格納された容器中の測定試料から発せられる蛍光を蛍光計測用素子40において、測定できるように、容器中の測定試料から発せられた蛍光が蛍光計測用素子40に過不足なく到達できるような形状及び寸法を有するものであることができる。
サンプルホルダ11に設けられる容器格納部の数は特に限定はなく、本発明装置において同時に測定したい測定試料の数に応じて適宜決定できる。サンプルホルダ11に設けられる容器格納部の数は、例えば、1〜20の範囲であり、2〜10の範囲であることができる。但し、これらの範囲に限定される意図ではなく、適宜決定できる事項である。また、各容器格納部は、それぞれ底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔11cと底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔11b、11dを有する。容器格納部の形状や寸法は、容器格納部に格納する容器の形状及び寸法に応じて適宜決定できる。容器は、生体試料の実験用に汎用されているプラクチック製チューブであることができ、容器格納部の形状及び寸法は、プラクチック製チューブの形状及び寸法に応じて適宜決定できる。
<光照射用光源20>
光照射用光源20は、容器格納部11a内に格納した容器1へ、濁度及び蛍光計測用の光を照射するためのものである。光照射用光源20は、波長と光量を有する光源であれば、特に限定されるものではないが、エネルギー変換効率が高く、所望の波長域の光照射が比較的簡単にできるという観点からLEDであることが好ましい。LEDは、例えば、ピーク波長が465nmであり、半値幅が約20nmであることが、濁度の測定及び蛍光の測定の両方の観点から好ましい。但し、このようなLEDに限定される意図ではなく、濁度の測定及び蛍光の測定が可能であれば、他のピーク波長と半値幅を有するLEDを適宜使用することもできる。
光照射用光源20は、密閉された光源部遮光ユニット21内に収納され、光源部遮光ユニット21は、内部に光照射用光源20が格納され、光源部遮光ユニット21の開口は、容器格納部11aの横貫通孔11bの外部開口と対向して接続される。光照射用光源20からの照射光は、容器格納部11aの横貫通孔11bを介して、容器格納部11a内に格納された容器1に照射される。
<濁度計測用素子30>
濁度計測用素子30は、容器格納部11a内に格納した容器1中の測定試料の濁度を計測するための素子である。光照射用光源20から照射される光は、横貫通孔11bを介して、容器格納部11a内に格納された容器1に照射され、容器1内の測定試料を透過して、濁度計測用素子30により光強度として計測される。濁度計測用素子30は、密閉された濁度計測用遮光ユニット31内に収納され、濁度計測用遮光ユニット31の開口は、容器格納部11aの横貫通孔11dの外部開口と対向して接続される。容器格納部11aからの光は、容器格納部11aの横貫通孔11dを介して、濁度計測用遮光ユニット31内に収納された濁度計測用素子30に到達する。
以上のように、光源20、容器格納部11a及び濁度計測用素子30は、略直線上に位置する。それにより、光源30及び容器格納部11aは、一方の横貫通孔11bを介して連通する。さらに、容器格納部11a及び濁度計測用素子30は、他方の横貫通孔11dを介して連通する。この状態は図3及び4に示される。より具体的には、本発明装置内において、光源20、容器格納部11a及び濁度計測用素子30は、略水平の位置関係に配置することができる。
本発明装置においては、濁度計測用素子30は、フォトダイオードであることができる。フォトダイオードでは、入射した光を電荷に変換するため、光強度を電圧として計測することが可能である。フォトダイオードは、感度が高く高精度の光強度測定が可能である。容器1中の測定試料が透明な場合、光強度が大きく、容器1中の測定試料が濁った場合、光強度が小さくなる。光強度の変化の度合いを濁度として計測する。フォトダイオードは、光源LEDのピーク波長が465nmである場合、波長帯域が例えば、450〜500nmであることができる。但し、これに限定される意図ではない。
<蛍光計測用素子40>
蛍光計測用素子40は、容器格納部11a内に格納した容器1中の測定試料から発せられる蛍光を計測するための素子である。光照射用光源20から照射される光は、横貫通孔11bを介して、容器格納部11a内に格納された容器1に照射され、容器1内の測定試料がこの照射光により蛍光を発する場合、蛍光計測用素子40により計測される。蛍光計測用素子40は、密閉された蛍光計測用遮光ユニット41内に収納され、蛍光計測用遮光ユニット41の開口は、容器格納部11aの縦貫通孔11cの外部開口と対向して接続される。容器格納部11aからの蛍光は、容器格納部11aの縦貫通孔11cを介して、蛍光計測用遮光ユニット41内に収納された蛍光計測用素子40に到達する。
本発明装置においては、容器格納部11a及び蛍光計測用素子40は、縦貫通孔11cを介して連通する。光源20、容器格納部11a及び蛍光計測用素子40は、光源20と容器格納部11aを結ぶ直線と容器格納部11aと蛍光を計測するための素子40を結ぶ直線とが、略垂直関係になるように位置する。
より具体的には、本発明装置内において、蛍光計測用素子40は、容器格納部11aの略下方に位置するように配置することができる。
本発明装置においては、蛍光計測用素子40は、フォトICであることができる。フォトICでは、入射した光を電荷に変換するため、光強度を電圧として計測することが可能である。フォトICは、自身で電荷を増幅するため、微弱な蛍光であっても計測することが可能であり、より高精度、高感度の蛍光測定が可能である。容器1中の測定試料に蛍光体が含まれている場合、光源LEDの光を蛍光体に照射することで励起された光が全方向に発光する。光源LEDのピーク波長が465nmである場合、例えば、蛍光体の励起波長が465nm近傍であり、蛍光体の発光波長が530nm近傍である場合、フォトICは、波長帯域が例えば、500〜580nmであることができる。但し、これに限定される意図ではない。
<波長フィルタ44>
本発明装置においては、容器格納部11aと蛍光計測用素子40の間に、光源の光の少なくとも一部をカットし、容器1中の測定試料から発せられる蛍光の少なくとも一部を透過する波長フィルタ44を含む。これにより、容器1中の測定試料から発せられる蛍光のみを測定することが可能になり、測定精度を向上させることができる。
本発明装置においては、波長フィルタ44は、光源LEDのピーク波長が465nmである場合、例えば、520nm以下の波長をカットするフィルタであることができる。波長フィルタ44は、光源LEDのピーク波長や容器1中の測定試料から発せられる蛍光のピーク波長などを考慮して、適宜選択することができる。
<温度調節装置>
本発明装置は、容器格納部11a内に格納した容器1の温度を調節するための温度調節装置を含む。より具体的には、温度調節用の加熱のための装置として、サンプルホルダ11は、例えば、内部にヒーターを内蔵することができ、サンプルホルダ11が複数の容器格納部11aを有する場合には、図1のようにサンプルホルダ11の長手方向に棒状ヒーター12を内蔵することができる。棒状ヒーター12は単一のヒーターであっても、複数のヒーターであってもよい。サンプルホルダ11の内部にヒーターを内蔵させることで、容器格納部11a内に格納した容器1をより所望の温度に的確に加熱することができる。但し、サンプルホルダ11の外側に追加でまたは内部ヒーターに代えてヒーターを設けることもできる。その際、棒状以外の形状のヒーターであってもよい。
さらに温度調節用の冷却のための装置として、図2に示すように、測定部10に向けて送風するための送風用のファン50を設けることができる。送風用のファン50は、測定部10の例えば、下部に設けることができ、このファン50は、サンプルホルダ11等に装置の外部の空気を送り、サンプルホルダ11を効率よく、かつ均一に冷却することができる。即ち、ファン50を稼働すると装置外の空気を装置内に吸気して、測定部10の方向に送風して、サンプルホルダ11を冷却する。
さらに、前記温度調節装置は、サンプルホルダ11の内部またはサンプルホルダ11に隣接して設けられた温度測定手段、例えば、温度センサを含むことができる。
<容器蓋押さえ部14>
本発明装置は、サンプルホルダ11の容器格納部11aの、容器1を容器格納部11aに挿入して格納するため記載開口に対向する位置に、サンプルホルダの容器格納部に格納された容器の蓋を押さえるための容器蓋押さえ部14をさらに有することができる。容器蓋押さえ部14は、サンプルホルダに接近及び乖離可能であり、容器格納部11aに容器1を挿入するときは、サンプルホルダから乖離した位置を取り、容器格納部11aに容器1を挿入して格納した後は、サンプルホルダに接近し、さらに容器格納部11aに格納された容器1の蓋を押さえることができる。容器蓋押さえ部14は、温度調節装置を含むことができる。ここでの温度調節装置はヒーターであり、より具体的には容器蓋押さえ部14の内部に設けたヒーターであることができる。容器蓋押さえ部14は、サンプルホルダ11の平面形状と対応する形状であることが、サンプルホルダ11に設けられた容器格納部11aに格納される全ての容器1(複数の場合)の蓋押さえることができるという観点で好ましい。サンプルホルダ11が複数の容器格納部11aを有し、容器蓋押さえ部14がそれに対応する形状を有する場合、蓋押さえ部14の内部に設けるヒーターは、棒状ヒーター15であることができる。蓋押さえ部14がヒーターを内装することで、容器1の蓋を加熱することができ、それにより容器内の溶液の蒸発を抑え、容器の上部や蓋内に水滴が付着することを抑え、容器内での反応条件を一定に維持することができる。但し、蓋押さえ部14の外側に追加でまたは内部ヒーターに代えてヒーターを設けることもできる。その際、棒状以外の形状のヒーターであってもよい。
本発明装置について図1〜3に加えて、図4〜6を用いて、本発明装置をより具体的に説明する。図4〜6においては、容器1として反応用の透明チューブを示す。
図5は、サンプルホルダ11の上面を示す図であり、チューブ1を8個挿入できる形状の例を示している。13は温度センサであり、チューブ周辺のサンプルホルダの温度を測定する。温度センサ13は、サンプルホルダ11の側面のチューブ1を挿入する穴の間に配置することにより、温度センサ13を4個で、チューブ1の8個の温度を測定している。棒状ヒーター12は電圧を印加すると発熱し、電圧を変えると発熱量が変わる。周期的に温度センサ13を測定し、測定した温度に合わせて棒状ヒーター13への印加電圧を制御することにより、サンプルホルダ11の温度を制御する。
図6は、容器(チューブ)蓋押さえ部14の上面を示す図である。容器(チューブ)蓋押さえ部14は、チューブ1の蓋を上から押さえる部材である。チューブ蓋押さえ部14は、棒状ヒーター15を内装しており、チューブ1の蓋を加熱することができ、チューブ内の溶液の蒸発を抑え、チューブ内に水滴が付着することを抑える。図6は、チューブ蓋押さえ部14の上面を示す図である。16は温度センサであり、チューブ蓋押さえ部14の温度を測定する。棒状ヒーター15は電圧を印加すると発熱し、電圧を変えると発熱量が変わる。周期的に温度センサ16を測定し、測定した温度に合わせて棒状ヒーター15への印加電圧を制御することにより、チューブ蓋押さえ部14の温度を制御する。
図4は測定部の断面図である。サンプルホルダ11の容器格納部11aの先端部付近には、水平方向の対面に2個と下方向に1個、穴(貫通孔)が空いている。光源部遮光ユニット21にLED基板23が取り付けてあり、LED22から照射する光は光源部遮光ユニット21の内部を進み、チューブ1及びDNAが入った溶液2に照射する。この場合、LED22から照射する光は、光源部遮光ユニット21で遮光され、光の進行方向から外れた方向へは照射されない構造である。
濁度測定部遮光ユニット31に濁度測定用光センサ基板33が取り付けてあり、DNAが入った溶液2を透過若しくは拡散した光は、チューブ1を透過し、濁度測定部遮光ユニット31の内部を進み、濁度測定用光センサ32で受光する。この場合、外部の光は濁度測定部遮光ユニット31で遮光される構造である。
蛍光測定部遮光ユニット41に蛍光測定用光センサ基板43と波長フィルタ44が取り付けてあり、DNAが入った溶液2で蛍光発光した光は、チューブ1を透過し、波長フィルタ44を透過し、蛍光測定部遮光ユニット41の内部を進み、蛍光測定用光センサ42で受光する。この場合、外部の光は蛍光測定部遮光ユニット41で遮光される構造である。また、波長フィルタ44の透過波長の光のみ蛍光測定用光センサ42に入射し、他の波長の光は遮光される構造である。
水平対面方向の穴には一方に、21の光源部遮光ユニット、22のLED、23のLED基板、もう一方に、31の濁度測定部遮光ユニット、32の濁度測定用光センサ、33の濁度測定用光センサ基板が取り付けてあり、垂直下方向の穴には、41の蛍光測定部遮光ユニット、44の波長フィルタ、42の蛍光測定用光センサ、43の蛍光測定用光センサ基板が取り付けてある。
LED22から発光した光は、光源部遮光ユニット21の内部を進み、サンプルホルダ11の先端部分の水平方向の1つの穴を通り、チューブ1を透過し、DNAが入った溶液2に含まれる物質に当たり、光が透過若しくは拡散して、透過光及び拡散光の一部が水平方向の対面側へ進み、さらにチューブ1を透過して、サンプルホルダ11の容器格納部11aの先端部分の水平方向の対面にあるもう1つの穴を通り、濁度測定部遮光ユニット31の内部を進み、濁度測定用光センサ32で受光する。
LED22から発光した光は、光源部遮光ユニット21の内部を進み、サンプルホルダ11の先端部分の水平方向の1つの穴を通り、チューブ1を透過して、DNAが入った溶液2に含まれる蛍光物質に当たり蛍光発光して、さらに、蛍光発光した光の一部がサンプルホルダ11の下方向に進み、チューブ1を透過して、サンプルホルダ11の先端部分の下方向の穴を通り、蛍光測定部遮光ユニット41の内部を進み、蛍光測定用光センサ42で受光する。
濁度測定用光センサ32で受光した光強度と、蛍光測定用光センサ42で受光した光強度は、同時に取得することもできる。これにより、濁度測定と蛍光測定が同時に実施可能である。
本発明装置は、容器1中の濁度及び蛍光を同時又は逐次に測定するために用いられる。さらに本発明装置は、容器1中のDNAが入った溶液2に含まれる核酸の増幅を濁度測定により検知するために用いることができる。より具体的には、容器1中のDNAが入った溶液2において核酸増幅後に、一本鎖核酸のハイブリダイズ又は二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を用いて検知するために用いることができる。この点については、後述する。
[核酸分析方法]
本発明の核酸分析方法は、前記本発明装置を用いる核酸分析方法であって、以下の(1)〜(3)の工程を含む。
(1)前記容器中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置する。
(2)前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知する。
(3)所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する。
さらに本発明の核酸分析方法では、前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を変化させることで、溶液中の一本鎖核酸をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察するか、又は溶液中の二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う。
工程(1)
容器1中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置する。
容器1は、前述の本発明装置において説明した通りである。
測定試料は、例えば、生体(例えば、動物や植物)から抽出したDNAであることができる。但し、LAMP法で増幅できる者であれば、DNA以外の核酸であってもよい。核酸増幅のための材料は、増幅対象である核酸の種類や増幅方法に応じて適宜選択できる。
核酸分析のための反応系に用いる、測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液は、既知のものをそのまま利用できる。核酸増幅のための材料としては、例えば、WO2014/167377に記載のLAMP−FLP法として説明した反応系(例えば、段落0019〜0036参照)を利用することができる。また、測定試料としては、WO2014/167377の例えば、段落0060〜0064の記載を参照できる。WO2014/167377の全記載は、ここに特に開示として援用される。
前記溶液を含有する容器1は本発明装置のサンプルホルダにセットする。
本発明装置は、複数のサンプルホルダを有することができ、各サンプルホルダに異なる溶液(特に異なる測定試料を含む溶液)を含む容器をセットすることで、これらの測定試料についての核酸分析を同時に実施することができる。
工程(2)
前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知する。濁度測定は連続的にまたは断続的に行うことができる。測定された濁度は、電気信号として記録することができ、さらに必要に応じて、ディスプレイや紙媒体などに表示することができる。さらに、測定された濁度に、既知のデータに基づいて閾値を設定し、この閾値を超えたら、核酸の増幅が所定(所望)の度合まで進行した、と認定することもできる。さらに、前記閾値を超えたことをディスプレイや紙媒体に表示して、測定者に知らせることもできる。
工程(3)
所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する。蛍光測定は連続的にまたは断続的に行うことができる。測定された蛍光は、信号として記録することができ、さらに必要に応じて、ディスプレイや紙媒体などに表示することができる。
蛍光測定は、例えば、溶液の温度を高温から低温に変化させることで、一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察することで行うことができる。あるいは、蛍光測定は、溶液の温度を低温から高温に変化させることで、二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行うことができる。尚、溶液の温度の「高温」及び「低温」は、ハイブリダイズさせる一本鎖核酸の配列、解離させる二本鎖核酸の配列に応じて、適宜設定できる。
測定試料を鋳型とする核酸の増幅は等温核酸増幅法で行うことができる。等温核酸増幅法は、例えば、LAMP法であることができる。LAMP法による核酸増幅方法は、例えば、前述のWO2014/167377を参照できる。但し、等温核酸増幅法及びLAMP法に限定される意図ではなく、他の方法も適宜使用することはできる。
等温核酸増幅法による核酸増幅は、例えば、40〜70℃の温度で行い、増幅完了後に溶液を90〜100℃に加熱し、増幅した二本鎖核酸を解離させて一本鎖核酸とし、その後、溶液を冷却して一本鎖核酸のハイブリダイズによる蛍光の発光又は消光を観察することができる。但し、この条件に限定される意図ではない。
本発明の核酸分析方法は、前記測定試料に含まれる核酸の一塩基多型(SNPs)を測定するために用いることができる。この点を以下により具体的に説明する。
図7は、本発明の実施形態のDNAを入れた溶液を使用し、DNAの増幅過程とDNA増幅の検出過程、DNAを増やすための触媒の失活過程、DNAのSNPsの検出過程を示す図である。1は溶液を入れるためのチューブである。2は生体から抽出したDNA、DNA増幅に必要な触媒、DNAと結合する蛍光物質、DNAと結合した際に濁る物質を混合した溶液である。DNAの入った混合溶液2を透明チューブ1に入れ、以下の処理を実施する。
DNAの増幅過程とDNA増幅の検出過程では、所定の温度(DNAごとに異なる50℃から70℃弱のいずれかの温度)で所定の時間(DNAごとに異なる数分から数時間のいずれかの時間)加熱することにより、DNAが増幅する。DNAが増幅すると、蛍光物質が混合している場合、蛍光の光強度が大きくなるため、蛍光の明るさや光強度の変化が大きくなることを目視や検知することにより確認でき、濁る物質が混合している場合、溶液が濁ってくるため、物質の色の変化や、溶液を透過してくる光の光強度が小さくなることを目視や機器で検出することにより確認できる。
DNAを増やすための触媒の失活過程では、所定の温度(DNAごとに異なる80℃から100℃のいずれかの温度)で所定の時間(DNAごとに異なる2分から10分のいずれかの時間)加熱して、DNAを増幅するために用いた触媒を失活させ、溶液中のDNAを安定させる。
DNAのSNPsの検出過程では、所定の温度範囲(100℃から40℃)で温度を変化させることにより、ある温度でDNAの二本鎖が切り離され2つの一本鎖に分離し、別の温度で二本鎖に結合する現象を利用する。DNAの二本鎖が切り離され2つの一本鎖に分離した際に、その一本鎖の一部と結合する物質を用い、その物質に蛍光体を結合させておき、DNAの二本鎖が切り離されたり、結合したりした時の蛍光光の光強度を検出することにより、SNPsを検出する。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
測定例を挙げ、DNAの増幅の検出方法と、DNAのSNPsの検出方法について説明する。サンプルとして人工DNAを使い、DNA増幅に必要な触媒、DNAと結合する蛍光物質、DNAと結合した際に濁る物質などを混合したものを使用した。今回、No.1からNo.8の8個のサンプルを測定した。
図8は測定時の温度グラフである。縦軸が温度(℃)、横軸が時間(秒)である。室温(約25℃)から63℃へ上昇し、63℃で30分(1800秒)温度を維持し、98℃へ上昇し、98℃で5分(300秒)温度を維持し、35℃へ下降し、35℃で測定を終了した。
63℃で30分温度を維持している期間は、濁度測定時であり、サンプルの濁度光強度を測定する。
98℃から35℃へ温度下降している期間は、蛍光測定時である、サンプルの蛍光光強度を測定する。尚、ここでは、温度下降時に蛍光測定する事例を説明しているが、温度上昇時に蛍光測定することも可能である。
図9は濁度測定時の光強度グラフである。縦軸が32濁度測定用光センサの電圧値(mV)、横軸が時間(秒)である。LAMP法では、濁度Tとして光強度の自然対数(LN)を使う。濁度測定開始からn番目の濁度Tは、濁度測定開始直後の濁度測定用光センサの電圧値Vを分母、濁度測定開始からn番目の濁度測定用光センサの電圧値Vを分子とした値をLN計算した値(式1)である。
=LN(V/V) ・・・式1
:濁度測定開始からn番目の濁度
:濁度測定開始直後の濁度測定用光センサの電圧値(mV)
:濁度測定開始からn番目の濁度測定用光センサの電圧値(mV)
図9に示す濁度グラフ(縦軸が濁度T、横軸が時間(秒))において、濁度が閾値を越えた場合、DNAが増幅したと判定する。濁度の閾値は使用する条件、例えば、LAMP法ではプライマー配列により異なるため、DNAを用いた測定結果を基に、任意の値を設定する。本例では、閾値を1000とした。さらに、濁度測定開始から閾値を越えた時までの経過時間Tt、濁度のピーク値Dfを計算する。
尚、閾値の設定は、増幅が陽性の場合には必ず一度は濁度がこの値を越え、陰性の場合には必ずこの値を下回り、一度もこの値を上回ることが無いように行う。さらに、閾値以上の濁度を示した場合、増幅陽性として増幅反応終了時に、装置本体に表示され、閾値未満の濁度を示した場合である増幅陰性の場合も同様に、装置本体に表示される。具体的には、増幅反応終了時に、当該ウェルのDET1(検出1)のLEDランプが判定結果の表示に用い、増幅陽性の場合は例えば、緑色、増幅陰性の場合は例えば、赤色がそれぞれ点灯するようにすることができる。これにより、増幅の有無 (閾値を越えたか越えていないか) を即時確認できる。
図10は蛍光測定時の光強度グラフである。縦軸が42蛍光測定用光センサの電圧値(mV)、横軸が温度(℃)である。図11は蛍光測定時の蛍光変化グラフである。縦軸が42蛍光測定用光センサの電圧差(mV)、横軸が温度(℃)である。蛍光変化量は、42蛍光測定用光センサの、測定した電圧値と1回前に測定した電圧値の差である。電圧差をそのまま利用するとノイズの影響が大きいため、平均化処理を行い、蛍光変化グラフを滑らかにする(図12)。蛍光変化グラフの複数のピークを検出し、その温度を検出する。ピークの温度が所定の温度範囲内にあれば、該当するSNPと判定する。ピークの温度範囲は使用するプローブにより異なるため、まず、ピークの自動検出設定のために、当該SNPをメジャータイプとした人工DNAと当該SNPをマイナータイプとした人工DNAを用いて、各タイプのピーク温度を確認する。そして、実際に検出されたピークがメジャータイプと同程度であればメジャータイプ、マイナータイプと同様であればマイナータイプと判断するように設定する。同程度とは、例えば±3℃である。
メジャータイプ及びマイナータイプの判定のためには、ピークの形成される温度すなわちプローブの蛍光が消光する温度の範囲を予め設定する。メジャーアリルとマイナーアリルでピーク形成温度に差が生じるように設計されたプローブを用いることにより、SNPsタイピングにおいては最大二つのピークを形成することができる。このピーク位置は前述の通り人工DNAを用いた検証により決定され、温度範囲の誤差は±3℃の範囲である。装置本体に、この二つのピークを検出するための温度範囲設定の項目を予め備えておく。例えば、高温側のピークを55から64℃、低温側のピークを45-54℃と設定しておくことにより、それぞれの範囲にピークがあるかどうかを判定させることができる。但し、ノイズをピークとして検出しないようにするため、ここでも閾値を設定しておくことも可能である。
本例では、2種類の温度範囲(1つ目として40.5℃から46.5℃の範囲(メジャータイプ)、2つ目として50.0℃から56.0℃の範囲(マイナータイプ))を設定し、メジャータイプのSNP、マイナータイプのSNP、メジャータイプとマイナータイプが共存するタイプのSNPの、3種類のSNPsタイプを検出可能とした。
より具体的には、前述した二つの範囲のいずれかあるいは両方にピークが検出され、その組合せは3通りである。3通りの結果の表示は例えば、以下のように行うことができる。高温側のみピークを検出した場合は、当該ウェルのDET1のLEDが緑色に点灯する。一方で、低温側のみピークを検出した場合は、当該ウェルのDET2のLEDが青色に点灯する。さらに、両温度でピークを検出した場合、すなわちヘテロのアリルの場合には、当該ウェルのLEDはDET1の緑色、DET2の青色ともに点灯する。なお、ピークが検出されなかった場合は当該ウェルのNGのLEDが赤色に点灯するように設定できる。このように、SNPs判定結果を反応終了後に装置本体に表示することで、容易に視認することができる。
図13は検出結果一覧表である。No.1とNo.2はDNA増幅していないサンプルである。No.3とNo.6はメジャータイプのSNP(温度範囲40.5℃から46.5℃でのみ蛍光測定時のピーク検出)、No.4とNo.7はマイナータイプのSNP(温度範囲50.0℃から56.0℃でのみ蛍光測定時のピーク検出)、No.5とNo.8はメジャータイプとマイナータイプが共存するSNP(温度範囲40.5℃から46.5℃と、温度範囲50.0℃から56.0℃の両方で蛍光測定時のピーク検出)のサンプルである。目的のSNPsが検出可能であることが確認できた。
本発明は、核酸分析用装置及び分析方法の分野において有用である。
1 容器(チューブ)
2 DNA含有溶液
10 測定部
11 サンプルホルダ
11a 容器格納部
11b、11d 横貫通孔
11c 縦貫通孔
12 棒状ヒーター(サンプルホルダ用)
13 温度センサ(サンプルホルダ用)
14 容器(チューブ)蓋押さえ部
15 棒状ヒーター(チューブ蓋押さえ部用)
16 温度センサ(チューブ蓋押さえ部用)
20 光源部
21 光源部遮光ユニット
22 LED
23 LED基板
30 濁度測定部
31 濁度測定部遮光ユニット
32 濁度測定用光センサ
33 濁度測定用光センサ基板
40 蛍光測定部
41 蛍光測定部遮光ユニット
42 蛍光測定用光センサ
43 蛍光測定用光センサ基板
44 波長フィルタ
50 ファン

Claims (11)

  1. ・測定試料を収容するための容器であるプラスチック製チューブを格納するため容器格納部を少なくとも1つ有するサンプルホルダであって、前記サンプルホルダの容器格納部は、底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔と底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔を有し、
    ・前記容器格納部内に格納した容器への濁度及び蛍光計測用の光照射用光源、
    ・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料の濁度計測用素子、
    ・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料から発せられる蛍光計測用素子、
    ・前記容器格納部内に格納した容器の温度を調節するための温度調節装置、
    を含む蛍光及び濁度測定装置であって、
    −前記光源及び前記容器格納部は、前記2つの横貫通孔の一方を介して連通しており、
    −前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、前記2つの横貫通孔の他方を介して連通しており、
    −前記容器格納部及び前記蛍光計測用素子は、前記縦貫通孔を介して連通しており、
    −前記容器格納部と前記蛍光計測用素子の間に、光源の光の少なくとも一部をカットし、容器から発せられる蛍光の少なくとも一部を透過する波長フィルタを含み、
    −前記光源、前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、略水平関係に位置し、
    −前記蛍光計測素子は、前記容器格納部の略下方に位置し、
    −前記サンプルホルダの容器格納部の開口に対向する位置に、前記サンプルホルダに接近及び乖離可能な、サンプルホルダの容器格納部に格納された容器の蓋を押さえるための容器蓋押さえ部材をさらに有し、前記容器蓋押さえ部材は、内部にヒーターを含む、
    前記装置。
  2. −前記光源は、LEDであり、
    −前記蛍光計測用素子は、フォトICであり、
    −前記濁度計測用素子は、フォトダイオードである、
    請求項1に記載の装置。
  3. 前記LEDは、ピーク波長が465nmであり、半値幅が約20nmであり、
    前記フォトICは、波長帯域が500〜580nmであり、
    前記フォトダイオードは、波長帯域が450〜500nmであり、かつ
    前記波長フィルタは、520nm以下の波長をカットするフィルタである、
    請求項に記載の装置。
  4. 前記温度調節装置は、前記サンプルホルダの内部に設けられた加熱手段、前記サンプルホルダに向けて送風するための送風機、及び前記サンプルホルダの内部またはサンプルホルダに隣接して設けられた温度測定手段を含む、
    請求項1〜のいずれかに記載の装置。
  5. 請求項1〜のいずれかに記載の装置を用いる核酸分析方法であって、
    (1)前記容器中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置し、
    (2)前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知し、
    (3)所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する、ことを含み、
    −前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を変化させることで、溶液中の一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察するか、又は溶液中の二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、前記方法。
  6. 前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を高温から低温に変化させることで、一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察することで行う、請求項に記載の方法。
  7. 前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を低温から高温に変化させることで、二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、請求項に記載の方法。
  8. 前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅は等温核酸増幅法で行う、請求項5〜7のいずれかに記載の方法。
  9. 前記等温核酸増幅法がLAMP法である、請求項に記載の方法。
  10. 前記等温核酸増幅法による核酸増幅は、40〜70℃の温度で行い、増幅完了後に溶液を90〜100℃に加熱し、増幅した二本鎖核酸を解離させて一本鎖核酸とし、その後、溶液を冷却して一本鎖核酸のハイブリダイズによる蛍光の発光又は消光を観察する、請求項8又は9に記載の方法。
  11. 前記測定試料に含まれる核酸の一塩基多型(SNPs)を測定するための、請求項5〜10のいずれかに記載の方法。
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