JP6751352B2 - 核酸分析方法及びそれに用いる蛍光・濁度測定装置 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸分析方法及びそれに用いる蛍光・濁度測定装置に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子検査に利用できる核酸分析方法及びそれに用いる蛍光・濁度測定装置に関する。より詳細には、本発明は、生体から抽出したデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を増幅させる方法において、ＤＮＡの増幅を検出すること、及びＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ、あるいはＳＮＰｓと呼ぶが、ここではＳＮＰｓと呼ぶ）を検出することの両方が可能な装置、及びこの装置を用いた、ＤＮＡの増幅を検出する方法及びＳＮＰｓを検出する方法を含む核酸分析方法に関する。この核酸分析方法においては、ＤＮＡの増幅が所定の量を越えたことを自動で検出することが可能であり、かつＳＮＰｓの検出を自動で行うことも可能である。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月２６日出願の日本特願２０１４−２６５９４０号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月２６日出願の日本特願２０１４−２６５９４０号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
遺伝子検査において、生体から抽出したＤＮＡを用いて、紫外線を用いる方法や、電気詠動を用いる方法などで、ＤＮＡを検出する方法が利用されている。しかし、生体から抽出したＤＮＡをそのまま用いるとＤＮＡの数が少ないため検出感度が低く誤検出する可能性が高いことから、一般的には、生体から抽出したＤＮＡを増幅させてからＤＮＡを検出する方法が採られている。ＤＮＡを増幅させる方法やＤＮＡを検出する方法は、ＤＮＡの種類に応じて複数の方法が実用化されており、それぞれの方法に対応した機器が製造・販売されている。
これまでは、ＤＮＡなどの遺伝子を専門に扱う大学、研究機関、製薬会社などの専門機関に限り、ＤＮＡを用いた研究が盛んに行われていたが、近年、病院や保健所などの一般的な機関でもＤＮＡを用いた検査が実施されるようになってきた。しかしながら、現状、製造・販売されている機器の多くが研究用途の為、機器の使用にはＤＮＡの専門知識を必要とする。そのため、ＤＮＡの専門知識が無くても簡単に使用できる検査機器が望まれている。
ＤＮＡを増幅させる方法の１つにＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法がある。ＬＡＭＰ法では、生体から抽出したＤＮＡを、ＤＮＡ増幅に必要な溶液に混合する。この時に混合したＤＮＡと結合する蛍光物質や、ＤＮＡの合成反応で生成されたピロリン酸塩による白濁により、ＤＮＡ増幅の可否を確認できる。ＤＮＡの入った混合溶液を、所定の温度（ＤＮＡごとに異なる５０℃から７０℃弱のいずれかの温度）で所定の時間（ＤＮＡごとに異なる数分から数時間のいずれかの時間）加熱することにより、ＤＮＡが増幅する。ＤＮＡの増幅過程では、ＤＮＡの二本鎖が２つに切り離され、それぞれの鎖に物質が結合し、元のＤＮＡと同様の二本鎖の構造を持つＤＮＡが作成される。これを繰り返し行うことにより、ＤＮＡが増幅する。この時に、ＤＮＡの増幅に合わせて、ＤＮＡに結合する蛍光物質からの蛍光の光強度が大きくなったり、ＤＮＡ合成反応で生成されたピロリン酸塩により溶液が濁ってきたりする。溶液の蛍光の光強度や蛍光の光強度の変化や、濁りによる光強度の減光量や光強度の変化を検出することにより、ＤＮＡ増幅の可否を判別する。
ＤＮＡを増幅させた後、ＤＮＡを増幅するために用いた触媒（酵素）を失活させ、溶液中のＤＮＡを安定させる必要がある。所定の温度（ＤＮＡごとに異なる８０℃から１００℃のいずれかの温度）で所定の時間（ＤＮＡごとに異なる２分から１０分のいずれかの時間）加熱して、触媒を失活させる。
ＤＮＡのＳＮＰｓを検出する方法の１つにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ（ＦＬＰ）法がある。ＦＬＰ法は、ＤＮＡに結合する物質に蛍光体を結合させた物質と、ＤＮＡに結合する物質に蛍光体を消光する物質を結合させた物質を使用し、規則的に両者をＤＮＡへ結合させることにより、ＤＮＡの結合状態と蛍光の光強度の相関を導き、蛍光の光強度から遺伝子の結合状態を検出する方法である。
ＤＮＡに結合する物質に蛍光体を結合させた物質と、ＤＮＡに結合する物質に蛍光体を消光する物質を結合させた物質を使用し、規則的に両者をＤＮＡへ結合させる方法は次の通りである。ＤＮＡに結合する物質に蛍光体を結合させた物質として、ＤＮＡの増幅時にＤＮＡの一本鎖と結合する物質に蛍光体を結合した物質（ＦＬＰと呼ぶ）を使用する。ＤＮＡに結合する物質に蛍光体を消光する物質を結合させた物質として、検出対象となるＳＮＰｓの塩基と結合する物質に消光する物質を結合させた物質（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｐｒｏｂｅ（ＱＰ）と呼ぶ）を使用する。ＤＮＡの増幅が停止し安定した状態で、高温（１００℃程度）から低温（４０℃程度）に温度を下降、又は、上昇させることにより、ＤＮＡの二本鎖が２つに切り離される状態とＤＮＡの二本鎖が生成される状態が発生し、通常はＦＬＰが結合して蛍光発光するＤＮＡが、ＳＮＰｓの塩基が結合する温度では、ＦＬＰに代わりＱＰが結合して蛍光が消光する。さらに、ＳＮＰｓの型によって、結合する温度が異なるため、蛍光の光強度又は蛍光の光強度の変化を検出することにより、ＳＮＰｓの型を判別する。
ＤＮＡの増幅検出とＳＮＰｓの検出を行うための装置及び方法を開示する文献として、例えば、以下の文献がある。機器/検出方法（参照文献）の順で記載する。
・ｉ−ｄｅｎｓｙ／Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ法（非特許文献１）
・ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ ＨＴ／ＴａｑＭａｎ法（非特許文献２）
・ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ／融解曲線分析（非特許文献３）
・ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０／Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｉｎｖａｄｅｒ−ｐｌｕｓ法、ＴａｑＭａｎ法（非特許文献３）
・ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００／ＬＡＭＰ法（特許文献１）
・ｉ−ｄｅｎｓｙ／Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ法（非特許文献１）
・ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ ＨＴ／ＴａｑＭａｎ法（非特許文献２）
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・ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００／ＬＡＭＰ法（特許文献１）
特許文献１：日本特開2013-31463号公報
非特許文献１：Sensors 2012, 12, 16614-16627
非特許文献２：Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007;16(6)
非特許文献３：JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2011, p. 1853-1860
特許文献１及び非特許文献１〜３の全記載は、ここに特に開示として援用される。
非特許文献２：Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007;16(6)
非特許文献３：JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2011, p. 1853-1860
特許文献１及び非特許文献１〜３の全記載は、ここに特に開示として援用される。
ＤＮＡを増幅させるためのＬＡＭＰ法を用いた機器は製造・販売されている（特許文献１参照）。しかしながら、多くの機器では、ＤＮＡの増幅を確認することはできず、機器の使用後に、試薬の状態を人が目視確認して判別している。また、ＤＮＡが所定の量を越えたことを自動で検出できる機器は製造・販売されているが、種類は少なく、高価である。また、ＤＮＡが所定の量を越えたことを自動で検出できる機器では、ＤＮＡと混合させた蛍光物質の光強度を検出する方法か、ＤＮＡと混合させた濁る物質の透過光の光強度を検出する方法のいずれか一方による方法であり、同時に自動で検出できる機器は無い。
ＤＮＡのＳＮＰｓを検出するためのＦＬＰ法を用いた機器は製造・販売されている。しかしながら、これらの機器では、測定した特性を数値データやグラフなどで人が目視確認してＳＮＰｓを判別しており、そのためには、専門的な知識を必要とする。さらに、機器は種類が少なく、高価である。また、現状、ＳＮＰｓを自動で検出できる機器は無い。さらに、ＤＮＡを増幅させるためのＬＡＭＰ法と組み合わせて、ＤＮＡ増幅をさせた後、試薬を取りだすことなく、ＤＮＡのＳＮＰｓを検出できる機器はほとんど無く、ＤＮＡ増幅の検出・確認とＤＮＡのＳＮＰｓ検出の両方を自動でできる機器は無い。
前記非特許文献１〜３に記載の機器及び方法でも、ＳＮＰｓ検出は蛍光を検出しているが、検出対象であるＤＮＡ増幅の検出・確認は、目視で行っている。ＤＮＡ（核酸）増幅の検出・確認とSNPsの蛍光での検出の両方を実施できる装置は知られていない。
そのため、専門的な知識を必要とせず、簡単な操作で取り扱いが可能な、ＤＮＡを増幅させるためのＬＡＭＰ法とＤＮＡのＳＮＰｓを検出するためのＦＬＰ法を組み合わせて使用できる核酸分析用装置であって、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅を検出及び確認できる機能とＳＮＰｓを検出する機能を併せ持った装置、より具体的には、ＤＮＡ増幅の検出及び確認のための濁度測定と蛍光測定を１つの装置で可能とする装置が望まれている。さらに、この装置を用いた、ＤＮＡのＳＮＰｓの自動検出機器の提供も望まれている。
本発明は前記の課題を解決することを目的としてなされたものであり、ＤＮＡを増幅させながら、所定のＤＮＡの量を越えたことを検出して、その後、ＤＮＡを増幅させるための触媒を失活させ、ＤＮＡのＳＮＰｓを検出する過程を、簡単な操作で、自動で実施する装置である。以下、各請求項の説明をする。
本発明は、以下の通りである。
[１]
・測定試料を収容するための容器を格納するため容器格納部を少なくとも1つ有するサンプルホルダであって、前記サンプルホルダの容器格納部は、底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔と底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔を有し、
・前記容器格納部内に格納した容器への光照射用光源、
・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料の濁度計測用素子、
・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料から発せられる蛍光計測用素子、
・前記容器格納部内に格納した容器の温度を調節するための温度調節装置、
を含む蛍光及び濁度測定装置であって、
−前記光源及び前記容器格納部は、前記2つの横貫通孔の一方を介して連通しており、
−前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、前記2つの横貫通孔の他方を介して連通しており、
−前記容器格納部及び前記蛍光計測用素子は、前記縦貫通孔を介して連通しており、
−前記容器格納部と前記蛍光計測用素子の間に、光源の光の少なくとも一部をカットし、容器から発せられる蛍光の少なくとも一部を透過する波長フィルタを含む、
前記装置。
[２]
−前記光源、前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、略水平関係に位置しており、
−前記蛍光計測素子は、前記容器格納部の略下方に位置する、
［１］に記載の装置。
[３]
−前記光源は、ＬＥＤであり、
−前記蛍光計測用素子は、フォトＩＣであり、
−前記濁度計測用素子は、フォトダイオードである、
［１］または［２］に記載の装置。
[４]
前記ＬＥＤは、ピーク波長が４６５ｎｍであり、半値幅が約２０ｎｍであり、
前記フォトＩＣは、波長帯域が５００〜５８０ｎｍであり、
前記フォトダイオードは、波長帯域が４５０〜５００ｎｍであり、かつ
前記波長フィルタは、５２０ｎｍ以下の波長をカットするフィルタである、
［３］に記載の装置。
[５]
前記温度調節装置は、前記サンプルホルダの内部に設けられた加熱手段、前記サンプルホルダに向けて送風するための送風機、及び前記サンプルホルダの内部またはサンプルホルダに隣接して設けられた温度測定手段を含む、
［１］〜［４］のいずれかに記載の装置。
[６]
前記サンプルホルダの容器格納部の開口に対向する位置に、前記サンプルホルダに接近及び乖離可能な、サンプルホルダの容器格納部に格納された容器の蓋を押さえるための容器蓋押さえ部材をさらに有し、前記容器蓋押さえ部材は、温度調節装置を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の装置。
[７]
前記容器中の濁度及び蛍光を同時又は逐次に測定するために用いられる、［１］〜［６］のいずれかに記載の装置。
[８]
前記容器中に含まれる核酸の増幅を濁度測定により検知するために用いる、［７］に記載の装置。
[９]
前記容器中において核酸増幅後に、一本鎖核酸のハイブリダイズ又は二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を用いて検知するために用いられる、［７］又は［８］に記載の装置。
[１０]
［１］〜［６］のいずれかに記載の装置を用いる核酸分析方法であって、
（１）前記容器中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置し、
（２）前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知し、
（３）所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する、ことを含み、
−前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を変化させることで、溶液中の一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察するか、又は溶液中の二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、前記方法。
[１１]
前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を高温から低温に変化させることで、一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察することで行う、［１０］に記載の方法。
[１２]
前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を低温から高温に変化させることで、二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、［１０］に記載の方法。
[１３]
前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅は等温核酸増幅法で行う、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
[１４]
前記等温核酸増幅法がＬＡＭＰ法である、［１３］に記載の方法。
[１５]
前記等温核酸増幅法による核酸増幅は、４０〜７０℃の温度で行い、増幅完了後に溶液を９０〜１００℃に加熱し、増幅した二本鎖核酸を解離させて一本鎖核酸とし、その後、溶液を冷却して一本鎖核酸のハイブリダイズによる蛍光の発光又は消光を観察する、［１３］又は［１４］に記載の方法。
[１６]
前記測定試料に含まれる核酸の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を測定するための、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
[１]
・測定試料を収容するための容器を格納するため容器格納部を少なくとも1つ有するサンプルホルダであって、前記サンプルホルダの容器格納部は、底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔と底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔を有し、
・前記容器格納部内に格納した容器への光照射用光源、
・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料の濁度計測用素子、
・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料から発せられる蛍光計測用素子、
・前記容器格納部内に格納した容器の温度を調節するための温度調節装置、
を含む蛍光及び濁度測定装置であって、
−前記光源及び前記容器格納部は、前記2つの横貫通孔の一方を介して連通しており、
−前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、前記2つの横貫通孔の他方を介して連通しており、
−前記容器格納部及び前記蛍光計測用素子は、前記縦貫通孔を介して連通しており、
−前記容器格納部と前記蛍光計測用素子の間に、光源の光の少なくとも一部をカットし、容器から発せられる蛍光の少なくとも一部を透過する波長フィルタを含む、
前記装置。
[２]
−前記光源、前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、略水平関係に位置しており、
−前記蛍光計測素子は、前記容器格納部の略下方に位置する、
［１］に記載の装置。
[３]
−前記光源は、ＬＥＤであり、
−前記蛍光計測用素子は、フォトＩＣであり、
−前記濁度計測用素子は、フォトダイオードである、
［１］または［２］に記載の装置。
[４]
前記ＬＥＤは、ピーク波長が４６５ｎｍであり、半値幅が約２０ｎｍであり、
前記フォトＩＣは、波長帯域が５００〜５８０ｎｍであり、
前記フォトダイオードは、波長帯域が４５０〜５００ｎｍであり、かつ
前記波長フィルタは、５２０ｎｍ以下の波長をカットするフィルタである、
［３］に記載の装置。
[５]
前記温度調節装置は、前記サンプルホルダの内部に設けられた加熱手段、前記サンプルホルダに向けて送風するための送風機、及び前記サンプルホルダの内部またはサンプルホルダに隣接して設けられた温度測定手段を含む、
［１］〜［４］のいずれかに記載の装置。
[６]
前記サンプルホルダの容器格納部の開口に対向する位置に、前記サンプルホルダに接近及び乖離可能な、サンプルホルダの容器格納部に格納された容器の蓋を押さえるための容器蓋押さえ部材をさらに有し、前記容器蓋押さえ部材は、温度調節装置を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の装置。
[７]
前記容器中の濁度及び蛍光を同時又は逐次に測定するために用いられる、［１］〜［６］のいずれかに記載の装置。
[８]
前記容器中に含まれる核酸の増幅を濁度測定により検知するために用いる、［７］に記載の装置。
[９]
前記容器中において核酸増幅後に、一本鎖核酸のハイブリダイズ又は二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を用いて検知するために用いられる、［７］又は［８］に記載の装置。
[１０]
［１］〜［６］のいずれかに記載の装置を用いる核酸分析方法であって、
（１）前記容器中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置し、
（２）前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知し、
（３）所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する、ことを含み、
−前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を変化させることで、溶液中の一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察するか、又は溶液中の二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、前記方法。
[１１]
前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を高温から低温に変化させることで、一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察することで行う、［１０］に記載の方法。
[１２]
前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を低温から高温に変化させることで、二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、［１０］に記載の方法。
[１３]
前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅は等温核酸増幅法で行う、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
[１４]
前記等温核酸増幅法がＬＡＭＰ法である、［１３］に記載の方法。
[１５]
前記等温核酸増幅法による核酸増幅は、４０〜７０℃の温度で行い、増幅完了後に溶液を９０〜１００℃に加熱し、増幅した二本鎖核酸を解離させて一本鎖核酸とし、その後、溶液を冷却して一本鎖核酸のハイブリダイズによる蛍光の発光又は消光を観察する、［１３］又は［１４］に記載の方法。
[１６]
前記測定試料に含まれる核酸の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を測定するための、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅を検出及び確認できる機能とＳＮＰｓを検出する機能を併せ持った装置を提供することができる。本発明の装置を用いることで、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅を検出及び確認と、能とＳＮＰｓの検出を1つの装置で行う核酸分析方法を提供することができ、さらに、ＳＮＰｓの検出を、ＤＮＡの増幅完了確認も含めて自動で行うこともできる。
［蛍光及び濁度測定装置］
本発明の蛍光及び濁度測定装置（以下、本発明装置と呼ぶ）を図１〜６を参照して説明する。
本発明の蛍光及び濁度測定装置（以下、本発明装置と呼ぶ）を図１〜６を参照して説明する。
本発明装置は、
・測定試料を収容するための容器１を格納するため容器格納部１１ａを少なくとも1つ有するサンプルホルダ１１、
・前記容器格納部１１ａ内に格納した容器１への光照射用光源２０、
・前記容器格納部１１ａ内に格納した容器１中の測定試料の濁度計測用素子３０、
・前記容器格納部１１ａ内に格納した容器１中の測定試料から発せられる蛍光計測用素子４０、
・前記容器格納部１１ａ内に格納した容器１を加熱及び冷却するための温度調節装置、
を含む。
・測定試料を収容するための容器１を格納するため容器格納部１１ａを少なくとも1つ有するサンプルホルダ１１、
・前記容器格納部１１ａ内に格納した容器１への光照射用光源２０、
・前記容器格納部１１ａ内に格納した容器１中の測定試料の濁度計測用素子３０、
・前記容器格納部１１ａ内に格納した容器１中の測定試料から発せられる蛍光計測用素子４０、
・前記容器格納部１１ａ内に格納した容器１を加熱及び冷却するための温度調節装置、
を含む。
＜サンプルホルダ１１＞
図３のようにサンプルホルダ１１は、測定試料を収容するための容器１を格納するため容器格納部１１ａを少なくとも1つ有するサンプルホルダ１１である。測定試料を収容するための容器１は、容器１に収容した測定試料の濁度及び蛍光の測定を妨げないという観点から、少なくとも濁度及び蛍光の測定に関係する波長域では光透過性であることが適当であり、さらに、光源からの光についても、濁度及び蛍光の測定に関係する波長域の光に対しては、光透過性であることが適当である。そのような容器としては、可視光領域において透明な反応用チューブを挙げることができる。
図３のようにサンプルホルダ１１は、測定試料を収容するための容器１を格納するため容器格納部１１ａを少なくとも1つ有するサンプルホルダ１１である。測定試料を収容するための容器１は、容器１に収容した測定試料の濁度及び蛍光の測定を妨げないという観点から、少なくとも濁度及び蛍光の測定に関係する波長域では光透過性であることが適当であり、さらに、光源からの光についても、濁度及び蛍光の測定に関係する波長域の光に対しては、光透過性であることが適当である。そのような容器としては、可視光領域において透明な反応用チューブを挙げることができる。
サンプルホルダ１１の容器格納部１１ａは、底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔１１ｃと底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔１１ｂ、１１ｄを有する。後述するように、一方の横貫通孔は、光源２０と容器格納部１１ａとの間を連通させるためのものであり、光源２０から容器格納部１１ａへの光照射が過不足なく確保できるような形状及び寸法を有するものであることができる。他方の横貫通孔は、容器格納部１１ａと濁度計測用素子３０との間を連通させるためのものであり、容器格納部１１ａに格納された容器中の測定試料の濁度を濁度計測用素子３０において、測定できるように、容器中の測定試料を透過した光が濁度計測用素子３０に過不足なく到達できるような形状及び寸法を有するものであることができる。さらに、縦貫通孔は、容器格納部１１ａと蛍光計測用素子４０との間を連通させるためのものであり、容器格納部１１ａに格納された容器中の測定試料から発せられる蛍光を蛍光計測用素子４０において、測定できるように、容器中の測定試料から発せられた蛍光が蛍光計測用素子４０に過不足なく到達できるような形状及び寸法を有するものであることができる。
サンプルホルダ１１に設けられる容器格納部の数は特に限定はなく、本発明装置において同時に測定したい測定試料の数に応じて適宜決定できる。サンプルホルダ１１に設けられる容器格納部の数は、例えば、１〜２０の範囲であり、２〜１０の範囲であることができる。但し、これらの範囲に限定される意図ではなく、適宜決定できる事項である。また、各容器格納部は、それぞれ底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔１１ｃと底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔１１ｂ、１１ｄを有する。容器格納部の形状や寸法は、容器格納部に格納する容器の形状及び寸法に応じて適宜決定できる。容器は、生体試料の実験用に汎用されているプラクチック製チューブであることができ、容器格納部の形状及び寸法は、プラクチック製チューブの形状及び寸法に応じて適宜決定できる。
＜光照射用光源２０＞
光照射用光源２０は、容器格納部１１ａ内に格納した容器１へ、濁度及び蛍光計測用の光を照射するためのものである。光照射用光源２０は、波長と光量を有する光源であれば、特に限定されるものではないが、エネルギー変換効率が高く、所望の波長域の光照射が比較的簡単にできるという観点からＬＥＤであることが好ましい。ＬＥＤは、例えば、ピーク波長が４６５ｎｍであり、半値幅が約２０ｎｍであることが、濁度の測定及び蛍光の測定の両方の観点から好ましい。但し、このようなＬＥＤに限定される意図ではなく、濁度の測定及び蛍光の測定が可能であれば、他のピーク波長と半値幅を有するＬＥＤを適宜使用することもできる。
光照射用光源２０は、容器格納部１１ａ内に格納した容器１へ、濁度及び蛍光計測用の光を照射するためのものである。光照射用光源２０は、波長と光量を有する光源であれば、特に限定されるものではないが、エネルギー変換効率が高く、所望の波長域の光照射が比較的簡単にできるという観点からＬＥＤであることが好ましい。ＬＥＤは、例えば、ピーク波長が４６５ｎｍであり、半値幅が約２０ｎｍであることが、濁度の測定及び蛍光の測定の両方の観点から好ましい。但し、このようなＬＥＤに限定される意図ではなく、濁度の測定及び蛍光の測定が可能であれば、他のピーク波長と半値幅を有するＬＥＤを適宜使用することもできる。
光照射用光源２０は、密閉された光源部遮光ユニット２１内に収納され、光源部遮光ユニット２１は、内部に光照射用光源２０が格納され、光源部遮光ユニット２１の開口は、容器格納部１１ａの横貫通孔１１ｂの外部開口と対向して接続される。光照射用光源２０からの照射光は、容器格納部１１ａの横貫通孔１１ｂを介して、容器格納部１１ａ内に格納された容器１に照射される。
＜濁度計測用素子３０＞
濁度計測用素子３０は、容器格納部１１ａ内に格納した容器１中の測定試料の濁度を計測するための素子である。光照射用光源２０から照射される光は、横貫通孔１１ｂを介して、容器格納部１１ａ内に格納された容器１に照射され、容器１内の測定試料を透過して、濁度計測用素子３０により光強度として計測される。濁度計測用素子３０は、密閉された濁度計測用遮光ユニット３１内に収納され、濁度計測用遮光ユニット３１の開口は、容器格納部１１ａの横貫通孔１１ｄの外部開口と対向して接続される。容器格納部１１ａからの光は、容器格納部１１ａの横貫通孔１１ｄを介して、濁度計測用遮光ユニット３１内に収納された濁度計測用素子３０に到達する。
濁度計測用素子３０は、容器格納部１１ａ内に格納した容器１中の測定試料の濁度を計測するための素子である。光照射用光源２０から照射される光は、横貫通孔１１ｂを介して、容器格納部１１ａ内に格納された容器１に照射され、容器１内の測定試料を透過して、濁度計測用素子３０により光強度として計測される。濁度計測用素子３０は、密閉された濁度計測用遮光ユニット３１内に収納され、濁度計測用遮光ユニット３１の開口は、容器格納部１１ａの横貫通孔１１ｄの外部開口と対向して接続される。容器格納部１１ａからの光は、容器格納部１１ａの横貫通孔１１ｄを介して、濁度計測用遮光ユニット３１内に収納された濁度計測用素子３０に到達する。
以上のように、光源２０、容器格納部１１ａ及び濁度計測用素子３０は、略直線上に位置する。それにより、光源３０及び容器格納部１１ａは、一方の横貫通孔１１ｂを介して連通する。さらに、容器格納部１１ａ及び濁度計測用素子３０は、他方の横貫通孔１１ｄを介して連通する。この状態は図３及び４に示される。より具体的には、本発明装置内において、光源２０、容器格納部１１ａ及び濁度計測用素子３０は、略水平の位置関係に配置することができる。
本発明装置においては、濁度計測用素子３０は、フォトダイオードであることができる。フォトダイオードでは、入射した光を電荷に変換するため、光強度を電圧として計測することが可能である。フォトダイオードは、感度が高く高精度の光強度測定が可能である。容器１中の測定試料が透明な場合、光強度が大きく、容器１中の測定試料が濁った場合、光強度が小さくなる。光強度の変化の度合いを濁度として計測する。フォトダイオードは、光源ＬＥＤのピーク波長が４６５ｎｍである場合、波長帯域が例えば、４５０〜５００ｎｍであることができる。但し、これに限定される意図ではない。
＜蛍光計測用素子４０＞
蛍光計測用素子４０は、容器格納部１１ａ内に格納した容器１中の測定試料から発せられる蛍光を計測するための素子である。光照射用光源２０から照射される光は、横貫通孔１１ｂを介して、容器格納部１１ａ内に格納された容器１に照射され、容器１内の測定試料がこの照射光により蛍光を発する場合、蛍光計測用素子４０により計測される。蛍光計測用素子４０は、密閉された蛍光計測用遮光ユニット４１内に収納され、蛍光計測用遮光ユニット４１の開口は、容器格納部１１ａの縦貫通孔１１ｃの外部開口と対向して接続される。容器格納部１１ａからの蛍光は、容器格納部１１ａの縦貫通孔１１ｃを介して、蛍光計測用遮光ユニット４１内に収納された蛍光計測用素子４０に到達する。
蛍光計測用素子４０は、容器格納部１１ａ内に格納した容器１中の測定試料から発せられる蛍光を計測するための素子である。光照射用光源２０から照射される光は、横貫通孔１１ｂを介して、容器格納部１１ａ内に格納された容器１に照射され、容器１内の測定試料がこの照射光により蛍光を発する場合、蛍光計測用素子４０により計測される。蛍光計測用素子４０は、密閉された蛍光計測用遮光ユニット４１内に収納され、蛍光計測用遮光ユニット４１の開口は、容器格納部１１ａの縦貫通孔１１ｃの外部開口と対向して接続される。容器格納部１１ａからの蛍光は、容器格納部１１ａの縦貫通孔１１ｃを介して、蛍光計測用遮光ユニット４１内に収納された蛍光計測用素子４０に到達する。
本発明装置においては、容器格納部１１ａ及び蛍光計測用素子４０は、縦貫通孔１１ｃを介して連通する。光源２０、容器格納部１１ａ及び蛍光計測用素子４０は、光源２０と容器格納部１１ａを結ぶ直線と容器格納部１１ａと蛍光を計測するための素子４０を結ぶ直線とが、略垂直関係になるように位置する。
より具体的には、本発明装置内において、蛍光計測用素子４０は、容器格納部１１ａの略下方に位置するように配置することができる。
より具体的には、本発明装置内において、蛍光計測用素子４０は、容器格納部１１ａの略下方に位置するように配置することができる。
本発明装置においては、蛍光計測用素子４０は、フォトＩＣであることができる。フォトＩＣでは、入射した光を電荷に変換するため、光強度を電圧として計測することが可能である。フォトＩＣは、自身で電荷を増幅するため、微弱な蛍光であっても計測することが可能であり、より高精度、高感度の蛍光測定が可能である。容器１中の測定試料に蛍光体が含まれている場合、光源ＬＥＤの光を蛍光体に照射することで励起された光が全方向に発光する。光源ＬＥＤのピーク波長が４６５ｎｍである場合、例えば、蛍光体の励起波長が４６５ｎｍ近傍であり、蛍光体の発光波長が５３０ｎｍ近傍である場合、フォトＩＣは、波長帯域が例えば、５００〜５８０ｎｍであることができる。但し、これに限定される意図ではない。
＜波長フィルタ４４＞
本発明装置においては、容器格納部１１ａと蛍光計測用素子４０の間に、光源の光の少なくとも一部をカットし、容器１中の測定試料から発せられる蛍光の少なくとも一部を透過する波長フィルタ４４を含む。これにより、容器１中の測定試料から発せられる蛍光のみを測定することが可能になり、測定精度を向上させることができる。
本発明装置においては、容器格納部１１ａと蛍光計測用素子４０の間に、光源の光の少なくとも一部をカットし、容器１中の測定試料から発せられる蛍光の少なくとも一部を透過する波長フィルタ４４を含む。これにより、容器１中の測定試料から発せられる蛍光のみを測定することが可能になり、測定精度を向上させることができる。
本発明装置においては、波長フィルタ４４は、光源ＬＥＤのピーク波長が４６５ｎｍである場合、例えば、５２０ｎｍ以下の波長をカットするフィルタであることができる。波長フィルタ４４は、光源ＬＥＤのピーク波長や容器１中の測定試料から発せられる蛍光のピーク波長などを考慮して、適宜選択することができる。
＜温度調節装置＞
本発明装置は、容器格納部１１ａ内に格納した容器１の温度を調節するための温度調節装置を含む。より具体的には、温度調節用の加熱のための装置として、サンプルホルダ１１は、例えば、内部にヒーターを内蔵することができ、サンプルホルダ１１が複数の容器格納部１１ａを有する場合には、図１のようにサンプルホルダ１１の長手方向に棒状ヒーター１２を内蔵することができる。棒状ヒーター１２は単一のヒーターであっても、複数のヒーターであってもよい。サンプルホルダ１１の内部にヒーターを内蔵させることで、容器格納部１１ａ内に格納した容器１をより所望の温度に的確に加熱することができる。但し、サンプルホルダ１１の外側に追加でまたは内部ヒーターに代えてヒーターを設けることもできる。その際、棒状以外の形状のヒーターであってもよい。
本発明装置は、容器格納部１１ａ内に格納した容器１の温度を調節するための温度調節装置を含む。より具体的には、温度調節用の加熱のための装置として、サンプルホルダ１１は、例えば、内部にヒーターを内蔵することができ、サンプルホルダ１１が複数の容器格納部１１ａを有する場合には、図１のようにサンプルホルダ１１の長手方向に棒状ヒーター１２を内蔵することができる。棒状ヒーター１２は単一のヒーターであっても、複数のヒーターであってもよい。サンプルホルダ１１の内部にヒーターを内蔵させることで、容器格納部１１ａ内に格納した容器１をより所望の温度に的確に加熱することができる。但し、サンプルホルダ１１の外側に追加でまたは内部ヒーターに代えてヒーターを設けることもできる。その際、棒状以外の形状のヒーターであってもよい。
さらに温度調節用の冷却のための装置として、図２に示すように、測定部１０に向けて送風するための送風用のファン５０を設けることができる。送風用のファン５０は、測定部１０の例えば、下部に設けることができ、このファン５０は、サンプルホルダ１１等に装置の外部の空気を送り、サンプルホルダ１１を効率よく、かつ均一に冷却することができる。即ち、ファン５０を稼働すると装置外の空気を装置内に吸気して、測定部１０の方向に送風して、サンプルホルダ１１を冷却する。
さらに、前記温度調節装置は、サンプルホルダ１１の内部またはサンプルホルダ１１に隣接して設けられた温度測定手段、例えば、温度センサを含むことができる。
＜容器蓋押さえ部１４＞
本発明装置は、サンプルホルダ１１の容器格納部１１ａの、容器１を容器格納部１１ａに挿入して格納するため記載開口に対向する位置に、サンプルホルダの容器格納部に格納された容器の蓋を押さえるための容器蓋押さえ部１４をさらに有することができる。容器蓋押さえ部１４は、サンプルホルダに接近及び乖離可能であり、容器格納部１１ａに容器１を挿入するときは、サンプルホルダから乖離した位置を取り、容器格納部１１ａに容器１を挿入して格納した後は、サンプルホルダに接近し、さらに容器格納部１１ａに格納された容器１の蓋を押さえることができる。容器蓋押さえ部１４は、温度調節装置を含むことができる。ここでの温度調節装置はヒーターであり、より具体的には容器蓋押さえ部１４の内部に設けたヒーターであることができる。容器蓋押さえ部１４は、サンプルホルダ１１の平面形状と対応する形状であることが、サンプルホルダ１１に設けられた容器格納部１１ａに格納される全ての容器１（複数の場合）の蓋押さえることができるという観点で好ましい。サンプルホルダ１１が複数の容器格納部１１ａを有し、容器蓋押さえ部１４がそれに対応する形状を有する場合、蓋押さえ部１４の内部に設けるヒーターは、棒状ヒーター１５であることができる。蓋押さえ部１４がヒーターを内装することで、容器１の蓋を加熱することができ、それにより容器内の溶液の蒸発を抑え、容器の上部や蓋内に水滴が付着することを抑え、容器内での反応条件を一定に維持することができる。但し、蓋押さえ部１４の外側に追加でまたは内部ヒーターに代えてヒーターを設けることもできる。その際、棒状以外の形状のヒーターであってもよい。
本発明装置は、サンプルホルダ１１の容器格納部１１ａの、容器１を容器格納部１１ａに挿入して格納するため記載開口に対向する位置に、サンプルホルダの容器格納部に格納された容器の蓋を押さえるための容器蓋押さえ部１４をさらに有することができる。容器蓋押さえ部１４は、サンプルホルダに接近及び乖離可能であり、容器格納部１１ａに容器１を挿入するときは、サンプルホルダから乖離した位置を取り、容器格納部１１ａに容器１を挿入して格納した後は、サンプルホルダに接近し、さらに容器格納部１１ａに格納された容器１の蓋を押さえることができる。容器蓋押さえ部１４は、温度調節装置を含むことができる。ここでの温度調節装置はヒーターであり、より具体的には容器蓋押さえ部１４の内部に設けたヒーターであることができる。容器蓋押さえ部１４は、サンプルホルダ１１の平面形状と対応する形状であることが、サンプルホルダ１１に設けられた容器格納部１１ａに格納される全ての容器１（複数の場合）の蓋押さえることができるという観点で好ましい。サンプルホルダ１１が複数の容器格納部１１ａを有し、容器蓋押さえ部１４がそれに対応する形状を有する場合、蓋押さえ部１４の内部に設けるヒーターは、棒状ヒーター１５であることができる。蓋押さえ部１４がヒーターを内装することで、容器１の蓋を加熱することができ、それにより容器内の溶液の蒸発を抑え、容器の上部や蓋内に水滴が付着することを抑え、容器内での反応条件を一定に維持することができる。但し、蓋押さえ部１４の外側に追加でまたは内部ヒーターに代えてヒーターを設けることもできる。その際、棒状以外の形状のヒーターであってもよい。
本発明装置について図１〜３に加えて、図４〜６を用いて、本発明装置をより具体的に説明する。図４〜６においては、容器１として反応用の透明チューブを示す。
図５は、サンプルホルダ１１の上面を示す図であり、チューブ１を８個挿入できる形状の例を示している。１３は温度センサであり、チューブ周辺のサンプルホルダの温度を測定する。温度センサ１３は、サンプルホルダ１１の側面のチューブ１を挿入する穴の間に配置することにより、温度センサ１３を４個で、チューブ１の８個の温度を測定している。棒状ヒーター１２は電圧を印加すると発熱し、電圧を変えると発熱量が変わる。周期的に温度センサ１３を測定し、測定した温度に合わせて棒状ヒーター１３への印加電圧を制御することにより、サンプルホルダ１１の温度を制御する。
図６は、容器（チューブ）蓋押さえ部１４の上面を示す図である。容器（チューブ）蓋押さえ部１４は、チューブ１の蓋を上から押さえる部材である。チューブ蓋押さえ部１４は、棒状ヒーター１５を内装しており、チューブ１の蓋を加熱することができ、チューブ内の溶液の蒸発を抑え、チューブ内に水滴が付着することを抑える。図６は、チューブ蓋押さえ部１４の上面を示す図である。１６は温度センサであり、チューブ蓋押さえ部１４の温度を測定する。棒状ヒーター１５は電圧を印加すると発熱し、電圧を変えると発熱量が変わる。周期的に温度センサ１６を測定し、測定した温度に合わせて棒状ヒーター１５への印加電圧を制御することにより、チューブ蓋押さえ部１４の温度を制御する。
図４は測定部の断面図である。サンプルホルダ１１の容器格納部１１ａの先端部付近には、水平方向の対面に２個と下方向に１個、穴（貫通孔）が空いている。光源部遮光ユニット２１にＬＥＤ基板２３が取り付けてあり、ＬＥＤ２２から照射する光は光源部遮光ユニット２１の内部を進み、チューブ１及びＤＮＡが入った溶液２に照射する。この場合、ＬＥＤ２２から照射する光は、光源部遮光ユニット２１で遮光され、光の進行方向から外れた方向へは照射されない構造である。
濁度測定部遮光ユニット３１に濁度測定用光センサ基板３３が取り付けてあり、ＤＮＡが入った溶液２を透過若しくは拡散した光は、チューブ１を透過し、濁度測定部遮光ユニット３１の内部を進み、濁度測定用光センサ３２で受光する。この場合、外部の光は濁度測定部遮光ユニット３１で遮光される構造である。
蛍光測定部遮光ユニット４１に蛍光測定用光センサ基板４３と波長フィルタ４４が取り付けてあり、ＤＮＡが入った溶液２で蛍光発光した光は、チューブ１を透過し、波長フィルタ４４を透過し、蛍光測定部遮光ユニット４１の内部を進み、蛍光測定用光センサ４２で受光する。この場合、外部の光は蛍光測定部遮光ユニット４１で遮光される構造である。また、波長フィルタ４４の透過波長の光のみ蛍光測定用光センサ４２に入射し、他の波長の光は遮光される構造である。
蛍光測定部遮光ユニット４１に蛍光測定用光センサ基板４３と波長フィルタ４４が取り付けてあり、ＤＮＡが入った溶液２で蛍光発光した光は、チューブ１を透過し、波長フィルタ４４を透過し、蛍光測定部遮光ユニット４１の内部を進み、蛍光測定用光センサ４２で受光する。この場合、外部の光は蛍光測定部遮光ユニット４１で遮光される構造である。また、波長フィルタ４４の透過波長の光のみ蛍光測定用光センサ４２に入射し、他の波長の光は遮光される構造である。
水平対面方向の穴には一方に、２１の光源部遮光ユニット、２２のＬＥＤ、２３のＬＥＤ基板、もう一方に、３１の濁度測定部遮光ユニット、３２の濁度測定用光センサ、３３の濁度測定用光センサ基板が取り付けてあり、垂直下方向の穴には、４１の蛍光測定部遮光ユニット、４４の波長フィルタ、４２の蛍光測定用光センサ、４３の蛍光測定用光センサ基板が取り付けてある。
ＬＥＤ２２から発光した光は、光源部遮光ユニット２１の内部を進み、サンプルホルダ１１の先端部分の水平方向の１つの穴を通り、チューブ１を透過し、ＤＮＡが入った溶液２に含まれる物質に当たり、光が透過若しくは拡散して、透過光及び拡散光の一部が水平方向の対面側へ進み、さらにチューブ１を透過して、サンプルホルダ１１の容器格納部１１ａの先端部分の水平方向の対面にあるもう１つの穴を通り、濁度測定部遮光ユニット３１の内部を進み、濁度測定用光センサ３２で受光する。
ＬＥＤ２２から発光した光は、光源部遮光ユニット２１の内部を進み、サンプルホルダ１１の先端部分の水平方向の１つの穴を通り、チューブ１を透過して、ＤＮＡが入った溶液２に含まれる蛍光物質に当たり蛍光発光して、さらに、蛍光発光した光の一部がサンプルホルダ１１の下方向に進み、チューブ１を透過して、サンプルホルダ１１の先端部分の下方向の穴を通り、蛍光測定部遮光ユニット４１の内部を進み、蛍光測定用光センサ４２で受光する。
濁度測定用光センサ３２で受光した光強度と、蛍光測定用光センサ４２で受光した光強度は、同時に取得することもできる。これにより、濁度測定と蛍光測定が同時に実施可能である。
本発明装置は、容器１中の濁度及び蛍光を同時又は逐次に測定するために用いられる。さらに本発明装置は、容器１中のＤＮＡが入った溶液２に含まれる核酸の増幅を濁度測定により検知するために用いることができる。より具体的には、容器１中のＤＮＡが入った溶液２において核酸増幅後に、一本鎖核酸のハイブリダイズ又は二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を用いて検知するために用いることができる。この点については、後述する。
［核酸分析方法］
本発明の核酸分析方法は、前記本発明装置を用いる核酸分析方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）前記容器中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置する。
（２）前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知する。
（３）所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する。
本発明の核酸分析方法は、前記本発明装置を用いる核酸分析方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）前記容器中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置する。
（２）前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知する。
（３）所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する。
さらに本発明の核酸分析方法では、前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を変化させることで、溶液中の一本鎖核酸をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察するか、又は溶液中の二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う。
工程（１）
容器１中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置する。
容器１は、前述の本発明装置において説明した通りである。
測定試料は、例えば、生体(例えば、動物や植物)から抽出したＤＮＡであることができる。但し、ＬＡＭＰ法で増幅できる者であれば、ＤＮＡ以外の核酸であってもよい。核酸増幅のための材料は、増幅対象である核酸の種類や増幅方法に応じて適宜選択できる。
核酸分析のための反応系に用いる、測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液は、既知のものをそのまま利用できる。核酸増幅のための材料としては、例えば、ＷＯ２０１４/１６７３７７に記載のＬＡＭＰ−ＦＬＰ法として説明した反応系(例えば、段落００１９〜００３６参照)を利用することができる。また、測定試料としては、ＷＯ２０１４/１６７３７７の例えば、段落００６０〜００６４の記載を参照できる。ＷＯ２０１４/１６７３７７の全記載は、ここに特に開示として援用される。
容器１中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置する。
容器１は、前述の本発明装置において説明した通りである。
測定試料は、例えば、生体(例えば、動物や植物)から抽出したＤＮＡであることができる。但し、ＬＡＭＰ法で増幅できる者であれば、ＤＮＡ以外の核酸であってもよい。核酸増幅のための材料は、増幅対象である核酸の種類や増幅方法に応じて適宜選択できる。
核酸分析のための反応系に用いる、測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液は、既知のものをそのまま利用できる。核酸増幅のための材料としては、例えば、ＷＯ２０１４/１６７３７７に記載のＬＡＭＰ−ＦＬＰ法として説明した反応系(例えば、段落００１９〜００３６参照)を利用することができる。また、測定試料としては、ＷＯ２０１４/１６７３７７の例えば、段落００６０〜００６４の記載を参照できる。ＷＯ２０１４/１６７３７７の全記載は、ここに特に開示として援用される。
前記溶液を含有する容器１は本発明装置のサンプルホルダにセットする。
本発明装置は、複数のサンプルホルダを有することができ、各サンプルホルダに異なる溶液（特に異なる測定試料を含む溶液）を含む容器をセットすることで、これらの測定試料についての核酸分析を同時に実施することができる。
本発明装置は、複数のサンプルホルダを有することができ、各サンプルホルダに異なる溶液（特に異なる測定試料を含む溶液）を含む容器をセットすることで、これらの測定試料についての核酸分析を同時に実施することができる。
工程（２）
前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知する。濁度測定は連続的にまたは断続的に行うことができる。測定された濁度は、電気信号として記録することができ、さらに必要に応じて、ディスプレイや紙媒体などに表示することができる。さらに、測定された濁度に、既知のデータに基づいて閾値を設定し、この閾値を超えたら、核酸の増幅が所定（所望）の度合まで進行した、と認定することもできる。さらに、前記閾値を超えたことをディスプレイや紙媒体に表示して、測定者に知らせることもできる。
前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知する。濁度測定は連続的にまたは断続的に行うことができる。測定された濁度は、電気信号として記録することができ、さらに必要に応じて、ディスプレイや紙媒体などに表示することができる。さらに、測定された濁度に、既知のデータに基づいて閾値を設定し、この閾値を超えたら、核酸の増幅が所定（所望）の度合まで進行した、と認定することもできる。さらに、前記閾値を超えたことをディスプレイや紙媒体に表示して、測定者に知らせることもできる。
工程（３）
所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する。蛍光測定は連続的にまたは断続的に行うことができる。測定された蛍光は、信号として記録することができ、さらに必要に応じて、ディスプレイや紙媒体などに表示することができる。
所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する。蛍光測定は連続的にまたは断続的に行うことができる。測定された蛍光は、信号として記録することができ、さらに必要に応じて、ディスプレイや紙媒体などに表示することができる。
蛍光測定は、例えば、溶液の温度を高温から低温に変化させることで、一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察することで行うことができる。あるいは、蛍光測定は、溶液の温度を低温から高温に変化させることで、二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行うことができる。尚、溶液の温度の「高温」及び「低温」は、ハイブリダイズさせる一本鎖核酸の配列、解離させる二本鎖核酸の配列に応じて、適宜設定できる。
測定試料を鋳型とする核酸の増幅は等温核酸増幅法で行うことができる。等温核酸増幅法は、例えば、ＬＡＭＰ法であることができる。ＬＡＭＰ法による核酸増幅方法は、例えば、前述のＷＯ２０１４/１６７３７７を参照できる。但し、等温核酸増幅法及びＬＡＭＰ法に限定される意図ではなく、他の方法も適宜使用することはできる。
等温核酸増幅法による核酸増幅は、例えば、４０〜７０℃の温度で行い、増幅完了後に溶液を９０〜１００℃に加熱し、増幅した二本鎖核酸を解離させて一本鎖核酸とし、その後、溶液を冷却して一本鎖核酸のハイブリダイズによる蛍光の発光又は消光を観察することができる。但し、この条件に限定される意図ではない。
本発明の核酸分析方法は、前記測定試料に含まれる核酸の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を測定するために用いることができる。この点を以下により具体的に説明する。
図７は、本発明の実施形態のＤＮＡを入れた溶液を使用し、ＤＮＡの増幅過程とＤＮＡ増幅の検出過程、ＤＮＡを増やすための触媒の失活過程、ＤＮＡのＳＮＰｓの検出過程を示す図である。１は溶液を入れるためのチューブである。２は生体から抽出したＤＮＡ、ＤＮＡ増幅に必要な触媒、ＤＮＡと結合する蛍光物質、ＤＮＡと結合した際に濁る物質を混合した溶液である。ＤＮＡの入った混合溶液２を透明チューブ１に入れ、以下の処理を実施する。
ＤＮＡの増幅過程とＤＮＡ増幅の検出過程では、所定の温度（ＤＮＡごとに異なる５０℃から７０℃弱のいずれかの温度）で所定の時間（ＤＮＡごとに異なる数分から数時間のいずれかの時間）加熱することにより、ＤＮＡが増幅する。ＤＮＡが増幅すると、蛍光物質が混合している場合、蛍光の光強度が大きくなるため、蛍光の明るさや光強度の変化が大きくなることを目視や検知することにより確認でき、濁る物質が混合している場合、溶液が濁ってくるため、物質の色の変化や、溶液を透過してくる光の光強度が小さくなることを目視や機器で検出することにより確認できる。
ＤＮＡを増やすための触媒の失活過程では、所定の温度（ＤＮＡごとに異なる８０℃から１００℃のいずれかの温度）で所定の時間（ＤＮＡごとに異なる２分から１０分のいずれかの時間）加熱して、ＤＮＡを増幅するために用いた触媒を失活させ、溶液中のＤＮＡを安定させる。
ＤＮＡのＳＮＰｓの検出過程では、所定の温度範囲（１００℃から４０℃）で温度を変化させることにより、ある温度でＤＮＡの二本鎖が切り離され２つの一本鎖に分離し、別の温度で二本鎖に結合する現象を利用する。ＤＮＡの二本鎖が切り離され２つの一本鎖に分離した際に、その一本鎖の一部と結合する物質を用い、その物質に蛍光体を結合させておき、ＤＮＡの二本鎖が切り離されたり、結合したりした時の蛍光光の光強度を検出することにより、ＳＮＰｓを検出する。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
測定例を挙げ、ＤＮＡの増幅の検出方法と、ＤＮＡのＳＮＰｓの検出方法について説明する。サンプルとして人工ＤＮＡを使い、ＤＮＡ増幅に必要な触媒、ＤＮＡと結合する蛍光物質、ＤＮＡと結合した際に濁る物質などを混合したものを使用した。今回、Ｎｏ．１からＮｏ．８の８個のサンプルを測定した。
図８は測定時の温度グラフである。縦軸が温度（℃）、横軸が時間（秒）である。室温（約２５℃）から６３℃へ上昇し、６３℃で３０分（１８００秒）温度を維持し、９８℃へ上昇し、９８℃で５分（３００秒）温度を維持し、３５℃へ下降し、３５℃で測定を終了した。
６３℃で３０分温度を維持している期間は、濁度測定時であり、サンプルの濁度光強度を測定する。
９８℃から３５℃へ温度下降している期間は、蛍光測定時である、サンプルの蛍光光強度を測定する。尚、ここでは、温度下降時に蛍光測定する事例を説明しているが、温度上昇時に蛍光測定することも可能である。
６３℃で３０分温度を維持している期間は、濁度測定時であり、サンプルの濁度光強度を測定する。
９８℃から３５℃へ温度下降している期間は、蛍光測定時である、サンプルの蛍光光強度を測定する。尚、ここでは、温度下降時に蛍光測定する事例を説明しているが、温度上昇時に蛍光測定することも可能である。
図９は濁度測定時の光強度グラフである。縦軸が３２濁度測定用光センサの電圧値（ｍＶ）、横軸が時間（秒）である。ＬＡＭＰ法では、濁度Ｔとして光強度の自然対数（ＬＮ）を使う。濁度測定開始からｎ番目の濁度Ｔｎは、濁度測定開始直後の濁度測定用光センサの電圧値Ｖ０を分母、濁度測定開始からｎ番目の濁度測定用光センサの電圧値Ｖｎを分子とした値をＬＮ計算した値（式１）である。
Ｔｎ＝ＬＮ（Ｖ０／Ｖｎ） ・・・式１
Ｔｎ：濁度測定開始からｎ番目の濁度
Ｖ０：濁度測定開始直後の濁度測定用光センサの電圧値（ｍＶ）
Ｖｎ：濁度測定開始からｎ番目の濁度測定用光センサの電圧値（ｍＶ）
Ｔｎ：濁度測定開始からｎ番目の濁度
Ｖ０：濁度測定開始直後の濁度測定用光センサの電圧値（ｍＶ）
Ｖｎ：濁度測定開始からｎ番目の濁度測定用光センサの電圧値（ｍＶ）
図９に示す濁度グラフ（縦軸が濁度Ｔ、横軸が時間（秒））において、濁度が閾値を越えた場合、ＤＮＡが増幅したと判定する。濁度の閾値は使用する条件、例えば、LAMP法ではプライマー配列により異なるため、ＤＮＡを用いた測定結果を基に、任意の値を設定する。本例では、閾値を１０００とした。さらに、濁度測定開始から閾値を越えた時までの経過時間Ｔｔ、濁度のピーク値Ｄｆを計算する。
尚、閾値の設定は、増幅が陽性の場合には必ず一度は濁度がこの値を越え、陰性の場合には必ずこの値を下回り、一度もこの値を上回ることが無いように行う。さらに、閾値以上の濁度を示した場合、増幅陽性として増幅反応終了時に、装置本体に表示され、閾値未満の濁度を示した場合である増幅陰性の場合も同様に、装置本体に表示される。具体的には、増幅反応終了時に、当該ウェルのDET1(検出1)のLEDランプが判定結果の表示に用い、増幅陽性の場合は例えば、緑色、増幅陰性の場合は例えば、赤色がそれぞれ点灯するようにすることができる。これにより、増幅の有無 (閾値を越えたか越えていないか) を即時確認できる。
図１０は蛍光測定時の光強度グラフである。縦軸が４２蛍光測定用光センサの電圧値（ｍＶ）、横軸が温度（℃）である。図１１は蛍光測定時の蛍光変化グラフである。縦軸が４２蛍光測定用光センサの電圧差（ｍＶ）、横軸が温度（℃）である。蛍光変化量は、４２蛍光測定用光センサの、測定した電圧値と１回前に測定した電圧値の差である。電圧差をそのまま利用するとノイズの影響が大きいため、平均化処理を行い、蛍光変化グラフを滑らかにする（図１２）。蛍光変化グラフの複数のピークを検出し、その温度を検出する。ピークの温度が所定の温度範囲内にあれば、該当するＳＮＰと判定する。ピークの温度範囲は使用するプローブにより異なるため、まず、ピークの自動検出設定のために、当該ＳＮＰをメジャータイプとした人工ＤＮＡと当該ＳＮＰをマイナータイプとした人工ＤＮＡを用いて、各タイプのピーク温度を確認する。そして、実際に検出されたピークがメジャータイプと同程度であればメジャータイプ、マイナータイプと同様であればマイナータイプと判断するように設定する。同程度とは、例えば±３℃である。
メジャータイプ及びマイナータイプの判定のためには、ピークの形成される温度すなわちプローブの蛍光が消光する温度の範囲を予め設定する。メジャーアリルとマイナーアリルでピーク形成温度に差が生じるように設計されたプローブを用いることにより、SNPsタイピングにおいては最大二つのピークを形成することができる。このピーク位置は前述の通り人工DNAを用いた検証により決定され、温度範囲の誤差は±3℃の範囲である。装置本体に、この二つのピークを検出するための温度範囲設定の項目を予め備えておく。例えば、高温側のピークを55から64℃、低温側のピークを45-54℃と設定しておくことにより、それぞれの範囲にピークがあるかどうかを判定させることができる。但し、ノイズをピークとして検出しないようにするため、ここでも閾値を設定しておくことも可能である。
本例では、２種類の温度範囲（１つ目として４０．５℃から４６．５℃の範囲（メジャータイプ）、２つ目として５０．０℃から５６．０℃の範囲（マイナータイプ））を設定し、メジャータイプのＳＮＰ、マイナータイプのＳＮＰ、メジャータイプとマイナータイプが共存するタイプのＳＮＰの、３種類のＳＮＰｓタイプを検出可能とした。
より具体的には、前述した二つの範囲のいずれかあるいは両方にピークが検出され、その組合せは3通りである。3通りの結果の表示は例えば、以下のように行うことができる。高温側のみピークを検出した場合は、当該ウェルのDET1のLEDが緑色に点灯する。一方で、低温側のみピークを検出した場合は、当該ウェルのDET2のLEDが青色に点灯する。さらに、両温度でピークを検出した場合、すなわちヘテロのアリルの場合には、当該ウェルのLEDはDET1の緑色、DET2の青色ともに点灯する。なお、ピークが検出されなかった場合は当該ウェルのNGのLEDが赤色に点灯するように設定できる。このように、SNPs判定結果を反応終了後に装置本体に表示することで、容易に視認することができる。
図１３は検出結果一覧表である。Ｎｏ．１とＮｏ．２はＤＮＡ増幅していないサンプルである。Ｎｏ．３とＮｏ．６はメジャータイプのＳＮＰ（温度範囲４０．５℃から４６．５℃でのみ蛍光測定時のピーク検出）、Ｎｏ．４とＮｏ．７はマイナータイプのＳＮＰ（温度範囲５０．０℃から５６．０℃でのみ蛍光測定時のピーク検出）、Ｎｏ．５とＮｏ．８はメジャータイプとマイナータイプが共存するＳＮＰ（温度範囲４０．５℃から４６．５℃と、温度範囲５０．０℃から５６．０℃の両方で蛍光測定時のピーク検出）のサンプルである。目的のＳＮＰｓが検出可能であることが確認できた。
本発明は、核酸分析用装置及び分析方法の分野において有用である。
１ 容器（チューブ）
２ ＤＮＡ含有溶液
１０ 測定部
１１ サンプルホルダ
１１ａ 容器格納部
１１ｂ、１１ｄ 横貫通孔
１１ｃ 縦貫通孔
１２ 棒状ヒーター（サンプルホルダ用）
１３ 温度センサ（サンプルホルダ用）
１４ 容器（チューブ）蓋押さえ部
１５ 棒状ヒーター（チューブ蓋押さえ部用）
１６ 温度センサ（チューブ蓋押さえ部用）
２０ 光源部
２１ 光源部遮光ユニット
２２ ＬＥＤ
２３ ＬＥＤ基板
３０ 濁度測定部
３１ 濁度測定部遮光ユニット
３２ 濁度測定用光センサ
３３ 濁度測定用光センサ基板
４０ 蛍光測定部
４１ 蛍光測定部遮光ユニット
４２ 蛍光測定用光センサ
４３ 蛍光測定用光センサ基板
４４ 波長フィルタ
５０ ファン
２ ＤＮＡ含有溶液
１０ 測定部
１１ サンプルホルダ
１１ａ 容器格納部
１１ｂ、１１ｄ 横貫通孔
１１ｃ 縦貫通孔
１２ 棒状ヒーター（サンプルホルダ用）
１３ 温度センサ（サンプルホルダ用）
１４ 容器（チューブ）蓋押さえ部
１５ 棒状ヒーター（チューブ蓋押さえ部用）
１６ 温度センサ（チューブ蓋押さえ部用）
２０ 光源部
２１ 光源部遮光ユニット
２２ ＬＥＤ
２３ ＬＥＤ基板
３０ 濁度測定部
３１ 濁度測定部遮光ユニット
３２ 濁度測定用光センサ
３３ 濁度測定用光センサ基板
４０ 蛍光測定部
４１ 蛍光測定部遮光ユニット
４２ 蛍光測定用光センサ
４３ 蛍光測定用光センサ基板
４４ 波長フィルタ
５０ ファン
Claims (11)
- ・測定試料を収容するための容器であるプラスチック製チューブを格納するため容器格納部を少なくとも1つ有するサンプルホルダであって、前記サンプルホルダの容器格納部は、底部に容器格納部の深さ方向に1つの縦貫通孔と底部付近の側壁に容器格納部の深さ方向と直行する方向に容器格納部内で開口部が対向する2つの横貫通孔を有し、
・前記容器格納部内に格納した容器への濁度及び蛍光計測用の光照射用光源、
・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料の濁度計測用素子、
・前記容器格納部内に格納した容器中の測定試料から発せられる蛍光計測用素子、
・前記容器格納部内に格納した容器の温度を調節するための温度調節装置、
を含む蛍光及び濁度測定装置であって、
−前記光源及び前記容器格納部は、前記2つの横貫通孔の一方を介して連通しており、
−前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、前記2つの横貫通孔の他方を介して連通しており、
−前記容器格納部及び前記蛍光計測用素子は、前記縦貫通孔を介して連通しており、
−前記容器格納部と前記蛍光計測用素子の間に、光源の光の少なくとも一部をカットし、容器から発せられる蛍光の少なくとも一部を透過する波長フィルタを含み、
−前記光源、前記容器格納部及び前記濁度計測用素子は、略水平関係に位置し、
−前記蛍光計測素子は、前記容器格納部の略下方に位置し、
−前記サンプルホルダの容器格納部の開口に対向する位置に、前記サンプルホルダに接近及び乖離可能な、サンプルホルダの容器格納部に格納された容器の蓋を押さえるための容器蓋押さえ部材をさらに有し、前記容器蓋押さえ部材は、内部にヒーターを含む、
前記装置。 - −前記光源は、ＬＥＤであり、
−前記蛍光計測用素子は、フォトＩＣであり、
−前記濁度計測用素子は、フォトダイオードである、
請求項１に記載の装置。 - 前記ＬＥＤは、ピーク波長が４６５ｎｍであり、半値幅が約２０ｎｍであり、
前記フォトＩＣは、波長帯域が５００〜５８０ｎｍであり、
前記フォトダイオードは、波長帯域が４５０〜５００ｎｍであり、かつ
前記波長フィルタは、５２０ｎｍ以下の波長をカットするフィルタである、
請求項２に記載の装置。 - 前記温度調節装置は、前記サンプルホルダの内部に設けられた加熱手段、前記サンプルホルダに向けて送風するための送風機、及び前記サンプルホルダの内部またはサンプルホルダに隣接して設けられた温度測定手段を含む、
請求項１〜３のいずれかに記載の装置。 - 請求項１〜４のいずれかに記載の装置を用いる核酸分析方法であって、
（１）前記容器中に測定試料及び核酸増幅のための材料を含有する溶液を配置し、
（２）前記容器中の溶液の濁度を測定して、前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅の度合を検知し、
（３）所定の増幅が確認された後に、前記容器中の溶液の蛍光を測定して、増幅した核酸の配列を確認する、ことを含み、
−前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を変化させることで、溶液中の一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察するか、又は溶液中の二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、前記方法。 - 前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を高温から低温に変化させることで、一本鎖核酸同士をハイブリダイズさせて蛍光の発光又は消光を観察することで行う、請求項５に記載の方法。
- 前記容器中の溶液の蛍光測定は、溶液の温度を低温から高温に変化させることで、二本鎖核酸の解離を蛍光の発光又は消光を観察することで行う、請求項５に記載の方法。
- 前記測定試料を鋳型とする核酸の増幅は等温核酸増幅法で行う、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
- 前記等温核酸増幅法がＬＡＭＰ法である、請求項８に記載の方法。
- 前記等温核酸増幅法による核酸増幅は、４０〜７０℃の温度で行い、増幅完了後に溶液を９０〜１００℃に加熱し、増幅した二本鎖核酸を解離させて一本鎖核酸とし、その後、溶液を冷却して一本鎖核酸のハイブリダイズによる蛍光の発光又は消光を観察する、請求項８又は９に記載の方法。
- 前記測定試料に含まれる核酸の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を測定するための、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
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