KR20070046009A - Ｒｅｇ Ⅳ ｍＲＮＡ 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
적어도 둘 중 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 갖는 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머와 역전사 효소를 사용하여 프로모터 서열을 포함하는 이중 사슬 DNA를 제조하는 단계; 상기 이중 사슬 DNA를 주형으로 사용하여 RNA 중합효소로 RNA 전사물을 제조하는 단계; 및 상기 RNA 전사물을 이번에는 DNA 합성을 위한 주형으로 사용하고 역전사 효소를 이용하여 상기 이중 사슬 DNA를 제조하는 단계를 포함하는 RNA 증폭 공정에서, 증폭된 RNA 산물의 양은 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침으로 측정된다.
Reg IV, Reg IV mRNA, 위암, 대장암, 검출 시약
Description
도 1은 실시예 2에서 준비된, 삽입성 형광염료(intercalating fluorescent dye)가 표지된 핵산 탐침의 구조를 나타낸다. B1, B2, B3 및 B4는 염기를 나타낸다. (A) Ishiguro 등의 방법(Ishiguro T. 등, (1996) Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997)에 따라, 링커에 의해 포스페이트 디에스테르에 결합된 삽입성 형광염료(옥사졸 옐로(oxazole yellow))를 갖는 탐침. 3' 말단의 -OH기 연장 반응을 방지하기 위하여, 3' 말단의 -OH기는 글리콜산에 의해 수식되었다. (B) 상업적으로 입수 가능한 Label-ON 시약(Clontech)을 사용하여 도입된 아미노기 및 Ishiguro 등의 방법(Ishiguro T. 등, (1996) Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997)에 따라 결합된 옥사졸 옐로를 갖는 탐침. 여기에서, 아미노기는 도입 위치에서 뉴클레오시드가 결핍된 부분에 도입되었다(도면에서 B3). 3' 말단의 -OH기 연장 반응을 방지하기 위하여, 3' 말단의 -OH기는 비오틴으로 수식되었다.
도 2는 실시예 3의 측정 결과로써 수득된 형광 프로파일을 나타낸다. 본 발명에 따른 RNA 증폭과, 형광 강도의 주기적인 측정을 동시에 수행한 결과들(여기 파장: 470nm, 형광 파장: 520nm). 수평축은 반응 시간을 나타내고, 수직축은 형광 강도비(반응 혼합물의 형광 강도/백그라운드 형광)를 나타낸다. 그래프에서 복제 들의 수는 사용된 Reg IV RNA(염기번호 1-1275를 포함)의 초기 복제 수를 나타낸다(260nm에서 흡광도 측정). 도 2A는 반응 혼합물 조성 (A)를 사용한 결과를 나타내고, 도 2B는 반응 혼합물 조성 (B)를 사용한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 4의 측정 결과로써 수득된 형광 프로파일을 나타낸다. 본 발명에 따른 RNA 증폭과, 형광 강도의 주기적인 측정을 동시에 수행한 결과들(여기 파장: 470nm, 형광 파장: 520nm). 수평축은 반응 시간을 나타내고, 수직축은 형광 강도비(반응 혼합물의 형광 강도/백그라운드 형광)를 나타낸다. 그래프에서 각 경우들의 수는 사용된 Reg IV RNA(염기번호 1-1275를 포함)의 초기 복제 수를 나타낸다(260nm에서 흡광도 측정). 도 3A는 반응 혼합물 조성 (A)를 사용한 결과를 나타내고, 도 3B는 반응 혼합물 조성 (B)를 사용한 결과를 나타낸다.
도 4는 도 3의 결과로부터 수득한 한 쌍의 검정 곡선(calibration curve)이다. 도 3의 결과에서 형광 강도비가 1.2에 도달된 시간으로 검출 시간을 정의하고, 상기 검출 시간을 표준 RNA의 초기 복제 수의 로그값에 대하여 도시하였다. 그래프 내의 식은 1차 회귀 방정식 및 상관 계수를 나타낸다. 미지 시료의 초기 복제 수는 상기 검정 곡선 및 본 방법에 의해 수득된 미지 시료의 검출 시간으로부터 계산된다. 도 4A는 반응 혼합물 조성 (A)를 사용한 결과를 나타내고, 도 4B는 반응 혼합물 조성 (B)를 사용한 결과를 나타낸다.
본 발명은 재생성 섬 파생군 4형(Regenerating islet-derived family, member 4)(재생성 유전자형 4) mRNA(Reg IV mRNA)를 간편하고, 등온에서, 단일 단계로 신속하게 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 의학 및 특히 임상 진단 또는 암 연구의 분야에 관한 것이며, 암 세포의 검출에 유용하다.
재생성 섬 파생군 4형(재생성 유전자형 4)(이후로는 "Reg IV"로 명명)은 Reg 유전자 군의 한 일원이며, 분비된 단백질은 C형 렉틴 슈퍼 패밀리에 속한다. Reg 유전자군 단백질은 렉틴, 췌장 β 세포에서의 세포사멸 저항 인자 및 성장 인자, 뉴런, 위장 상피 세포 등으로 기능한다. Reg IV의 발현은 위장 조직 내에서 발견되었으며, 그의 발현량은 위암, 대장암 및 다른 암에서 증가한다고 보고되었다(참조: Zang YW 등, (2003) World J. Gastroenterol., 9, 2635-2641).
최근에, RT-PCR을 이용한 Reg IV mRNA 양의 측정은 위암 및 대장암과 같은 장관암에서 Reg IV mRNA 양이 증가함을 밝혔다(참조: Oue N. 등, (2004) Cancer Res., 64, 2397-2405 및 Violette S. 등, (2002) Int. J. Cancer, 103, 185-193). 다시 말해, 이들의 발견은 Reg IV mRNA의 검출이 위암 및 대장암의 마커(marker)로서 유용함을 암시한다.
Reg IV mRNA의 매우 감도 높은 검출을 위한 하나의 방법은 RT-PCR에 의한 Reg IV mRNA을 증폭하고 증폭 산물의 양을 측정하는 방법이지만, 일반적으로 이것은 역전사(reverse transcription, RT) 단계 및 PCR 단계를 포함하는 2단계의 처리 를 요구하므로, 절차를 복잡게 하고 재현율을 떨어뜨릴 뿐만 아니라 2차 감염의 위험을 증가시킨다. 대부분 경우에 RT 및 PCR 단계는 묶어서 2시간 이상 걸리며, 따라서 상기 방법은 다수의 피검물을 처리하거나 검사 비용을 줄이기에는 부적절하다.
표적 RNA의 검출은 주로 실시간 RT-PCR에 의해 이루어지는데, 여기에서 PCR 단계는 삽입성 형광염료의 존재 하에서 수행되어 형광의 증가가 측정되지만, 이는 프라이머 이합체와 같은 비특이적 증폭 산물의 검출과 관련하여 문제가 된다. 또한, DNA도 RT-PCR에서 증폭되기 때문에, 핵산 추출 단계 동안 DNase 처리 등으로 염색체 DNA가 완전히 제거되어야 하는데, 이는 핵산 추출 절차를 보다 복잡하게 만든다. 아울러, PCR은 반응 온도의 급작스런 증가/감소를 요구하는데, 이는 자동화된 반응기에 있어서 전력 절약 및 원가 절감에 대해 장해가 되고 있다.
NASBA 방법(참조: 일본특허 제 2650159호 및 일본 특허 제 3152927호) 및 TMA 방법(참조: 일본특허 제 3241717호)이 등온 조건에서 RNA만을 증폭하는 방법으로 보고되었다. 이들 RNA 증폭 방법은 연쇄 반응을 이용하는데, 표적 RNA에 대한 프로모터 서열을 포함하는 프라이머, 역전사 효소 및 필요하다면 리보핵산가수분해효소 H(RNaseH)가, 프로모터 서열을 포함하는 이중 사슬 DNA의 합성에 사용되며, RNA 중합효소가 표적 RNA의 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA의 합성에 사용되고, RNA는 다시 프로모터 서열을 포함하는 이중 사슬 DNA의 합성을 위해 주형으로 사용된다. RNA 증폭 후에 증폭된 RNA는, 검출가능한 표지가 부착된 핵산 탐침을 사용하여 전기 영동 또는 혼성화 방법에 의하여 검출된다.
이들 RNA 증폭 방법은, 등온에서 단일 단계로 RNA만 증폭하기 때문에 간편한 mRNA 검출로서 적절하지만, 혼성화 방법 등에 의한 검출은 복잡한 절차를 요구하며 고도의 재현가능한 정량분석은 제공하지 않는다.
mRNA의 증폭 및 검출을 위한 간편한 방법은 Ishiguro 등에 의해 개발된 방법이다(참조: 일본 미심사 특허 공보 제 2000-14400호; 및 Ishiguro 등, (2003) Anal. Biochem., 314, 77-86). 이 방법에서, RNA 증폭은 삽입성 형광염료로 표지된 핵산 탐침의 존재 하에서 수행되며, 표적 핵산과 상보적인 이중 사슬을 형성할 때, 상기 삽입된 형광 염료 부분이 상보적인 이중 사슬로 삽입됨으로써 형광 특성에 변화를 겪게 되어, 형광 특성의 변화가 측정되도록 고안된 것인데, 밀폐된 용기 내에서 간편하고, 등온에서 단일 단계로 RNA 증폭 및 검출을 동시에 수행할 수 있다.
비록, 상술한 Reg IV mRNA 검출이 위암 및 대장암과 같은 장관암의 진단에 유용할지라도, RT-PCR의 사용은 2단계 처리, 복잡한 절차 및 반응온도의 급작스런 증가/감소를 요구하며, 이들 조건들은 2차 감염의 위험을 수반하고, 저조한 재현성을 가질 뿐만 아니라, 보다 간편한 측정 및 자동화의 개발에 장애가 된다. 본 발명의 목적은 간편하고 신속하며 등온에서 단일 단계로 Reg IV mRNA를 검출하는 방법을 제공함으로써 상술한 문제점들을 극복하는 것이다.
상술한 문제점들을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 본 발명자들은 상기 RNA 증폭 방법에 적용하는, 간편하고, 신속하며, 등온에서 단일 단계로 Reg IV mRNA을 검출하는 방법을 개발하였다. 구체적으로, 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머(적어도 둘 중 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 가진다)가 프로모터 서열을 갖는 이중 사슬 DNA를 제조하기 위해 사용되고, 상기 이중 사슬 DNA는 RNA 전사물을 제조하기 위한 주형으로 사용되며, 상기 RNA 전사물은 다시 이중 사슬 DNA를 제조하는 DNA 합성을 위한 주형으로 사용되는, RNA 증폭 과정에 의해 수득된 증폭 RNA 산물의 양을 측정하는 단계에 의하여 Reg IV mRNA를 간편하고, 등온에서 단일 단계로 검출하는 것이 가능하게 되었다.
본 발명에 따라, 등온에서 단일 단계로 간편하고 신속하게 Reg IV mRNA의 검출을 매우 고감도로 달성할 수 있게 되었다. 따라서, 본 발명은 위암, 대장암 및 다른 암의 진단에 적용 가능하며, 암의 마커로써 유용하다. 본 발명은 단일 단계로, 밀폐된 용기 내에서 수행될 수 있기 때문에 2차 오염물질로서 증폭 산물에 의한 환경 오염의 위험을 최소화할 수 있다. 또한, 상기 방법은 단일 단계로 간편하고 신속하게 수행되기 때문에 다수 피검물도 처리될 수 있으며, 재현성을 잠재적으로 감소시키는 절차들의 수를 줄일 수 있다. 아울러, 본 발명의 RNA 증폭 방법은 RNA만을 증폭하기 때문에, RT-PCR에서 요구되는 바와 같은 이중 사슬 DNA를 완전히 제거하는 단계 없이 mRNA의 엄격한(stringent) 증폭 및 검출을 달성할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 고감도 및 신속한 발현 분석에 최적이다. 게다가, 등온에서 단일 단계로 수행될 수 있기 때문에, PCR에서와 같은 열 사이클링 메커니즘의 공급이 필요치 않으며, 따라서 자동화가 용이하게 된다.
본 발명을 수행하기 위한
최량의
형태
본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본 발명은 시료 내에 존재하는 Reg IV mRNA를 검출하기 위한 방법이며, 상기 방법은, RNA의 특정 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 하류 부분과 적어도 일치하는 제 1 프라이머 및, 상기 특정 뉴클레오티드 서열의 3' 말단으로부터 상류 부분과 적어도 상보적인 제 2 프라이머(제 1 프라이머 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 갖는다)를 사용하여, 프로모터 서열 및 상기 프로모터 서열로부터 하류에 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 사슬 DNA를 제조하는 단계; 상기 이중 사슬 DNA를 주형으로 사용하여 RNA 전사물(RNA transcript)을 제조하는 단계; 상기 RNA 전사물을 다시 DNA 합성을 위한 주형으로 사용하여, 상기 이중 사슬 DNA를 제조하는 단계; 상기 단계들 각각을 동시에 촉진하는 조건 하에서 상술한 단계들을 반복하는 핵산 증폭 단계; 및 RNA 전사물의 양을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 시료는 암 세포를 가진다고 의심되는 혈액, 혈청, 혈장, 조직 또는 세척액(lavage)과 같은 피검물로부터 공지의 방법으로 추출된 핵산으로 구성된다.
본 발명에 따른 특정 뉴클레오티드 서열은 적어도 Reg IV mRNA의 부분적인 서열 또는 그에 상보적인 서열로 구성되며, 제 1 프라이머와 제 2 프라이머 사이로 정의된 영역의 서열이다. 본 발명에 따라, 특정 뉴클레오티드 서열로부터 RNA 전사물이 증폭된다. 프로모터 서열이 제 1 프라이머에 부가되는 경우, Reg IV mRNA는 cDNA 합성을 위한 주형 역할을 하기 전에 특정 핵산 서열의 5' 말단에서 절단되는 것이 바람직하다. 상기 절단 방법은 특별히 제한되지는 않지만, Reg IV mRNA의 특정 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 겹치면서 인접하는 영역과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(절단 올리고뉴클레오티드(cleavage oligonucleotide))를 첨가함으로써 형성된 RNA-DNA 혼성체 중 RNA 부분을 절단하는 리보핵산가수분해효소 H(RNaseH)를 갖는 효소를 사용하는 방법이 바람직하며, 사용되는 절단 올리고뉴클레오티드는 연장 반응을 방지하기 위하여, 3'-말단의 -OH가 적절히 수식된 것 예를 들어, 아민화된 것을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 표적 핵산은 제 1 및 제 2 프라이머와 일치하지 않거나 상보적인 특정 염기 서열 내의 영역을 가지는데, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침과의 상보적인 결합을 가능하게 하는 서열을 가진다. 따라서, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침은 본 발명에 따른 특정 뉴클레오티드 서열의 일부와 상보적인 서열이다. 그러므로, 본 발명의 일 형태에 따라, 상기 특정 뉴클레오티드 서열이 Reg IV mRNA와 일치하는 서열인 경우, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침은 서열번호 7에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 서열을 가지며, 상기 특정 뉴클레오티드 서열이 Reg IV mRNA와 상보적인 서열인 경우, 상기 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침은 서열번호 7에 기재된 서열과 상보적인 서열 중 적 어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 서열을 가진다.
본 발명에 따른 제 1 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 가지며, 제 1 프라이머의 경우에 Reg IV mRNA의 상보적인 서열과 충분한 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 제 2 프라이머의 경우에 Reg IV mRNA와 충분한 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. "충분한 상보성(sufficient complementarity)"이란 말은, 본 발명의 핵산 증폭 단계에 있어서, 반응 조건(반응 온도 및 염의 조성 등) 하에서 특정 뉴클레오티드 서열 또는 상기 서열과 상보적인 서열과 상보적인 결합이 일어날 수 있다는 의미이다. 반응 조건은 예를 들어, 후술하는 실시예들에 기재한 바와 같이, 60mM Tris, 18mM 염화마그네슘, 100mM 염화칼륨, 1mM DTT의 존재 하 43℃에서의 혼성화 조건일 수 있다.
Reg IV mRNA와 상보적인 서열과의 충분한 상보성을 제 1 프라이머에게 제공하고, Reg IV mRNA 서열과의 충분한 상보성을 제 2 프라이머에게 제공하며, 표적 핵산 서열과의 충분한 상보성을 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침에 제공하기 위하여, 제 1 프라이머는 서열번호 1, 3 또는 5에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 것이 바람직하고, 제 2 프라이머는 서열번호 2, 4 또는 6에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 것이 바람직하며, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침은 서열번호 7, 8 또는 9에 기재된 서열 또는 상기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게, 제 1 프라이머는 서열번호 1에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하고, 제 2 프라이머는 서열번호 2에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하며, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침은 서열번호 7에 기재된 서열 또는 상기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 서열의 조합; 제 1 프라이머는 서열번호 3에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하고, 제 2 프라이머는 서열번호 4에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하며, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침은 서열번호 8에 기재된 서열 또는 상기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 서열의 조합; 또는 제 1 프라이머는 서열번호 5에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하고, 제 2 프라이머는 서열번호 6에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하며, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침은 서열번호 9에 기재된 서열 또는 상기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 서열의 조합을 이용한다. 이들 조합들은 Reg IV mRNA에 상보적인 방법으로 결합하는 서열들의 위치 관계로 인해 선호되는 형태이지만, 다른 조합들도 또한 Reg IV mRNA의 증폭 및 검출을 가능하게 한다.
제 1 프라이머는 특정 서열과 상보적인 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 뉴클레오티드의 하나 이상이 결실, 치환 또는 부가된, 서열번호 1, 3 또는 5에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는, 매우 엄격한(stringent) 조건 하에서 특정 서열과 상보적인 서열에 특이적으로 결합할 수 있는, 서열번호 1, 3 또는 5에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 제 2 프라이머는 특정 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 뉴클레오티드의 하나 이상이 결실, 치환 또는 부가된, 서열번호 2, 4 또는 6에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는, 매우 엄격한 조건 하에서 특정 서열에 특이적으로 결합할 수 있는, 서열번호 2, 4 또는 6에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
검출의 목표가 Reg IV의 RNA와 상보적인 RNA인 경우, 제 1 프라이머와 제 2 프라이머는 그들의 5' 및 3' 말단이 역으로 된 상보적인 프라이머가 될 수 있다.
매우 엄격한 조건은 예를 들어, 후술하는 실시예들에서 나타낸 바와 같이, 60mM Tris, 18mM 염화마그네슘, 100mM 염화칼륨, 1mM DTT의 존재하 43℃에서의 혼성화 조건일 수 있다.
본 발명에 따른 프로모터 서열은 RNA 중합효소가 전사를 개시하기 위해 결합하는 서열이며, 다른 RNA 중합효소들에 대한 특이적 서열이 알려져 있다. RNA 중합효소에 특별한 제한은 없으나, T7 파지 RNA 중합효소, T3 파지 RNA 중합효소 및 SP6 파지 RNA 중합효소와 같은 통상적인 것이 바람직하며, 그들에 해당하는 프로모터 서열이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 Reg IV mRNA를 검출하는 방법은 특정 효소(단일 사슬 RNA 주형에 대한 RNA-의존 DNA 중합효소 활성을 갖는 효소(역전사 효소), RNaseH 활성을 갖는 효소, 단일 사슬 DNA 주형에 대한 DNA-의존 DNA 중합효소 활성을 갖는 효소 및 RNA 중합효소 활성을 갖는 효소)를 요구한다. 이들 효소들 중 어느 것도 다른 활성을 갖는 효소일 수 있으며, 즉, 각 활성을 갖는 다수의 효소들이 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA 중합효소 활성을 갖는 효소가 단일 사슬 RNA 주형에 대한 RNA-의존 DNA 중합효소 활성을 갖는 역전사 효소, RNaseH 활성을 갖는 효소 및 단일 사슬 DNA 주형에 대한 DNA-의존 DNA 중합효소 활성을 갖는 효소에 부가될 수 있으며, 또는 RNaseH 활성을 갖는 부가적인 효소가 추가물로 또한 첨가될 수 있다. 융통성 있는 이용의 관점에서, 역전사 효소로 바람직한 것은 AMV 역전사 효소, M-MLV 역전사 효소 및 이들의 유도체이다.
역전사 반응이 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머의 존재 하에서 수행되는 경우, 제 2 프라이머는 Reg IV mRNA의 특정 염기 서열에 결합하여 RNA-의존 DNA 중합효소를 갖는 효소로 cDNA 합성을 수행한다. 상기 수득된 RNA-DNA 혼성체 중 RNA 부분은 RNaseH 활성을 갖는 효소에 의하여 분해되고 분리되어, 제 1 프라이머가 cDNA에 결합할 수 있다.
다음에, 특정 염기 서열로부터 유도되고 5' 말단에 프로모터 서열을 포함하는 이중 사슬 DNA는 DNA-의존 DNA 중합효소 활성을 갖는 효소에 의하여 제조된다. 상기 이중 사슬 DNA는 프로모터 서열로부터 하류의 특정 염기 서열을 포함하며, 상기 특정 염기 서열로부터 유도된 RNA 전사물은 RNA 중합효소 활성을 갖는 효소에 의하여 제조된다. 상기 RNA 전사물은 제 1 및 제 2 프라이머에 의해 이중 사슬 DNA 합성을 위한 주형으로 작용하여, 연쇄 반응 내에서 일련의 반응들이 일어나서 RNA 전사물을 증폭시킨다.
상기 연쇄 반응을 촉진하기 위하여, 각각의 효소를 위해 필수적인 요소로 알 려진, 적어도 완충 용액, 마그네슘염, 칼륨염, 뉴클레오시드삼인산 및 리보뉴클레오시드삼인산을 첨가하는 것이 필요함은 당연하다. 또한, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디티오트레이톨(DTT), 보빈혈청알부민(BSA), 당(sugar) 등을 반응 효율을 조절하기 위하여 첨가할 수 있다.
예를 들어, AMV 역전사 효소 및 T7 RNA 중합효소를 사용하는 경우, 반응 온도는 35℃ 내지 65℃의 범위로 설정하는 것이 바람직하고, 40℃ 내지 44℃의 범위로 설정하는 것이 가장 바람직하다. RNA 증폭 단계는 등온에서 진행되며, 반응 온도는 역전사 효소 및 RNA 중합효소가 그들의 활성을 나타내는 어떠한 바람직한 온도로 설정될 수 있다.
증폭된 RNA 전사물의 양은 공지의 핵산 검출 방법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 검출 방법으로써 전기영동, 액체 크로마토그래피, 또는 검출 가능한 표지로 치환된 핵산 탐침을 사용하는 혼성화 방법이 사용될 수 있다. 그러나, 이들 절차들은 다수 단계들을 포함하며, 증폭 산물이 분석용 시스템으로부터 제거되기 때문에 증폭 산물이 2차 오염의 요인이 되는 환경 내로 놓여질 위험성이 크다. 이들 문제들을 극복하기 위하여, 표적 핵산과 상보적인 결합을 할 때 형광 특성이 변하도록 고안된 핵산 탐침을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 방법으로써, 핵산 증폭 단계가 삽입성 형광염료로 표지된 핵산 탐침의 존재 하에서 수행되는 방법을 언급할 수 있는데, 표적 핵산과 상보적인 이중 사슬을 형성하는 경우, 삽입성 형광염료가 상보적인 이중 사슬 내로 삽입되어 형광 특성의 변화를 겪게 되며 이 형광 특성의 변화가 측정되도록 고안된 방법이다(참조: 일본 미심사 특허 공보 제 2000-14400호; 및 Ishiguro T. 등, (2003) Anal. Biochem., 314, 77-86).
삽입성 형광염료는 특별한 제한이 없으며, 옥사졸 옐로(oxazole yellow), 티아졸 오렌지(thiazole orange), 이티듐브로마이드(ethidium bromide) 및 이들의 유도체와 같은 통상적인 염료가 사용될 수 있다. 형광 특성의 변화는 형광 강도의 변화일 수 있다. 예를 들어, 옥사졸 옐로의 경우에 있어서 이중 사슬 DNA 내로의 삽입은 510nm에서(490nm의 여기 파장), 형광의 현저한 증가를 야기한다. 상기 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침은 상기 RNA 전사물과 충분한 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 이는 말단, 포스페이트 디에스테르 부분 또는 염기 부분과 적절한 링커를 통하여 결합된 삽입성 형광염료를 갖고, 3'- 말단의 -OH기로부터 연장 반응을 방지하기 위하여 3'-말단의 -OH기가 적절히 수식된 구조를 갖는다(참조: 일본 미심사 특허 공보평 제 8-211050호; 및 Ishiguro T. 등, (1996) Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997).
삽입성 형광염료로 올리고뉴클레오티드를 표지하는 것은 공지의 방법으로 기능기를 올리고뉴클레오티드 내로 도입하고, 거기에 삽입성 형광염료를 결합함으로써 달성될 수 있다(참조: 일본 미심사 특허 공보 제 2001-13147; 및 Ishiguro T. 등, (1996) Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997). 기능기를 도입하는 방법은 통상적으로 사용되는 Label-ON 시약(Clontech Laboratories, Inc.)을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 형태로써, 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 포함하는 제 1 프라이머(서열번호 1에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 제 2 프라이머(서열번호 2에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 삽입성 형 광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호 7에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호 49-58 사이로부터 선택된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함하며, 특정 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 겹치면서 인접하는 영역과 상보적인 서열을 갖는다), AMV 역전사 효소, T7 RNA 중합효소, 완충 용액, 마그네슘염, 칼륨염, 뉴클레오시드삼인산, 리보뉴클레오시드삼인산 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 적어도 포함하는 증폭 시약을 샘플에 첨가하는 방법이 제공되며, 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 포함하는 제 1 프라이머(서열번호 10에 기재된 서열), 제 2 프라이머(서열번호 11에 기재된 서열), 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호 42에 기재된 서열), 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호 50에 기재된 서열), AMV 역전사 효소, T7 RNA 중합효소, 완충 용액, 마그네슘염, 칼륨염, 뉴클레오시드삼인산, 리보뉴클레오시드삼인산 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 적어도 포함하는 증폭 시료 또는 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 포함하는 제 1 프라이머(서열번호 18에 기재된 서열), 제 2 프라이머(서열번호 33에 기재된 서열), 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호 42에 기재된 서열), 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호 54에 기재된 서열), AMV 역전사 효소, T7 RNA 중합효소, 완충 용액, 마그네슘염, 칼륨염, 뉴클레오시드삼인산, 리보뉴클레오시드삼인산 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 적어도 포함하는 증폭 시료를 샘플에 첨가하는 것이 바람직하고, 반응 혼합물의 형광 강도를 주기적으로 측정하면서 35 내지 65℃(바람직하게는 40 내지 44℃)의 일정한 반응 온도에서 반응을 수행하는 것이 바람직하다.
다른 형태로써, 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 포함하는 제 1 프라이머(서열 번호 3에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 제 2 프라이머(서열번호 4에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호 8에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호 59에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함하며, 특정 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 겹치면서 인접하는 영역과 상보적인 서열을 갖는다), AMV 역전사 효소, T7 RNA 중합효소, 완충 용액, 마그네슘염, 칼륨염, 뉴클레오시드삼인산, 리보뉴클레오시드삼인산 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 적어도 포함하는 증폭 시약을 샘플에 첨가하고, 반응 혼합물의 형광 강도를 주기적으로 측정하면서 35 내지 65℃(바람직하게는 40 내지 44℃)의 일정한 반응 온도에서 반응을 수행하는 방법이 제공된다.
또 다른 형태로써, 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 포함하는 제 1 프라이머(서열번호 5에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 제 2 프라이머(서열번호 6에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호 9에 기재된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함한다), 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호 60-64로부터 선택된 서열 중 연속하는 15개의 염기를 포함하며, 특정 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 겹치면서 인접하는 영역과 상보적인 서열을 갖는다), AMV 역전사 효소, T7 RNA 중합효소, 완충 용액, 마그네슘염, 칼륨염, 뉴클레오시드삼인산, 리보뉴클레오시드삼인산 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 적어도 포함하는 증폭 시약을 샘플에 첨가하고, 반응 혼합물의 형광 강도를 주기적으로 측정하면서 35 내지 65℃(바람직하게는 40 내지 44℃)의 일 정한 반응 온도에서 반응을 수행하는 방법이 제공된다.
상술한 모든 형태에서, 형광 강도는 초기 RNA 양으로부터 증가하는 곡선의 결과를 나타내며, 따라서 기지 농도의 표준 RNA를 사용하여 검정 곡선을 작도함으로써, 미지 시료 내의 초기 RNA 농도를 정량할 수 있다. 또한, 형광 강도는 주기적으로 측정되기 때문에, 형광의 현저한 증가가 검출되는 어떤 원하는 점에서 측정이 종료될 수 있으며, 핵산 증폭으로부터 측정이 얻어지며, 검출은 대개 1시간 이내 또는 최적 시스템에서는 30분 이내에 얻어질 수 있다.
검출 시약 내의 모든 테스트 물질들은 동일 용기 내에 포함될 수 있음이 특히 주목할 만하다. 즉, 단일 용기 내로 테스트 물질들의 규정된 양을 공급하는 단순한 절차는 Reg IV mRNA의 자동적인 증폭 및 검출이 그 후에 수행되도록 할 것이다. 상기 용기는 형광 염료에 의해 방출되는 신호의 외부 측정이 가능하도록 예를 들어, 부분적으로 투명한 재료로 구성될 수 있으며, 테스트 물질들을 배분한 후에는 밀폐될 수 있는 용기가 오염을 방지하기 위하여 특히 바람직하다.
상술한 형태에 따른 RNA 증폭 및 검출 방법은 단일 단계로 등온에서 수행될 수 있으며, 따라서, RT-PCR보다 간편하며, 자동화하기에 적절하다. 그러나, RT-PCR과 같은 변성(denaturation) 및 어닐링(annealing) 없이, 35 내지 65℃의 상대적으로 낮은 일정한 온도에서 반응이 수행되는 점 및, 목표 RNA의 고차 구조의 효과로 인하여, 프라이머 이합체와 같은 비특이적 증폭 산물이 생기기 쉬우며, 따라서, 상술한 RNA 증폭 및 검출 방법을 사용하여 신속하고 간편하며 등온에서 단일 단계로 Reg IV mRNA를 검출하는 것이 이전에 불가능했었기 때문에, RT-PCR과 비교 되는 검출 시스템을 만들기 위하여 보다 주의를 기울인 고안이 필요하다. 본 발명에 따르면, 신속하고, 간편하며, 등온에서 단일 단계로 Reg IV mRNA를 고특이성 및 고감도로 검출하는 것이 최초로 가능하다.
실시예
본 발명은 실시예들에 의해 하기에 추가로 설명될 것이며, 본 발명이 이들 실시예들에 의해 제한되지 않음을 이해하여야 한다.
실시예 1:
Reg IV RNA는, 체외 전사를 위한 주형으로서 SP6 파지 RNA 중합효소/프로모터로부터 하류의 Reg IV cDNA(국제 생물기술 정보센터 목록 번호 NM032044에 지정된 염기번호에 따른, 염기번호 1-1275)를 포함하는 이중 사슬 DNA를 사용하여 제조되었고, 그 후, 상기 이중사슬 DNA는 DNaseI 처리에 의해 완전히 절단되었으며, RNA가 정제되었다. 상기 RNA는 260nm에서의 흡광도를 측정함으로써 정량되었다.
하기 실시예들은 측정의 대상으로서 상기 RNA를 취급하지만, 본 발명에 따른 측정의 대상인 Reg IV mRNA의 검출에도 전적으로 적용 가능하다.
실시예 2:
삽입성 형광염료로 치환된 올리고뉴클레오티드 탐침이 제조되었다. 아미노기는 서열번호 43의 5' 말단으로부터 12번째 G, 서열번호 44의 5' 말단으로부터 10 번째 A, 서열번호 45의 5' 말단으로부터 12번째 A, 서열번호 46의 5' 말단으로부터 11번째 C, 서열번호 47의 5' 말단으로부터 10번째 A 및 서열번호 48의 5' 말단으로부터 14번째 C의 위치에 Label-ON 시약(Clontech Laboratories, Inc.)을 사용하여 도입되었고, 3' 말단은 비오틴으로 수식되었다. 옥사졸 옐로는 Ishiguro T. 등, (1996) Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997(도 1B)에 기술된 방법에 의하여 상기 아미노기에 결합되었다. 또한, 서열번호 42에 기재된 서열의 5' 말단으로부터 9번째 C와 10번째 A 사이의 포스페이트 디에스테르 부분에 링커를 통하여 결합된 옥사졸 옐로를 갖는 옥사졸 옐로 표지된 핵산 탐침이 Ishiguro T. 등, (1996) Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997(도 1A)에 기술된 방법에 의하여 제조되었다.
실시예 3:
본 발명의 방법은 Reg IV RNA의 각기 다른 최초의 복제 수(copy number)를 검출하는데 사용되었다.
(1) 상술한 Reg IV RNA(염기번호 1-1275를 포함하는)를 RNA 희석제(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.25U/㎕ 리보핵산가수분해효소 억제제, 5.0mM DTT)를 사용하여 50, 102, 103, 104, 105 및 106 복제수/5㎕로 RNA 샘플용으로 사용하기 위하여 묽혔다. 상기 RNA 희석제는 음의 대조군(0 복제수)으로 사용되었다.
(2) 하기 조성을 가지는 반응 혼합물의 20㎕를 0.5㎖ 부피의 PCR 튜 브(GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin-Elmer) 내에 넣은 후, RNA 샘플 5㎕를 가하였다.
반응 혼합물 조성 (A): 농도는 효소 용액을 가한 후의 최종 농도(30㎕ 기준)이다.
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
18mM 염화마그네슘
100mM 염화칼륨
1mM DTT
0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각
3mM ATP, CTP, UTP, GTP 각각
3.6mM ITP
0.2μM 제 1 프라이머(서열번호: 10): 지정된 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 부가된 T7 중합효소-프로모터 서열(서열번호: 65)이 포함된 제 1 프라이머
0.2μM 제 2 프라이머(서열번호: 11)
50nM 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호: 42)
0.16μM 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호: 50): 이 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 -OH는 아미노기로 수식됨
6U/30㎕ 리보핵산가수분해효소 억제제(Takara Bio Inc.)
11.7% DMSO
반응 혼합물 조성 (B): 농도는 효소 용액을 가한 후의 최종 농도(30㎕ 기준)이다.
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
18mM 염화마그네슘
100mM 염화칼륨
1mM DTT
0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각
3mM ATP, CTP, UTP, GTP 각각
3.6mM ITP
0.2μM 제 1 프라이머(서열번호: 18): 지정된 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 부가된 T7 중합효소-프로모터 서열(서열번호: 65)이 포함된 제 1 프라이머
0.2μM 제 2 프라이머(서열번호: 33)
50nM 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호: 42)
0.16μM 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호: 54): 이 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 -OH는 아미노기로 수식됨
6U/30㎕ 리보핵산가수분해효소 억제제(Takara Bio Inc.)
13% DMSO
(3) 이들 반응 혼합물(A, B)을 5분간 43℃에 유지하고, 그 후, 2분간 43℃에서 유지된 하기 조성을 가지는 효소 용액 5㎕를 첨가하였다.
효소 용액 조성: 반응시의 최종 농도(30㎕ 기준)
2% 솔비톨
6.4U/30㎕ AMV 역전사 효소(Life Science Co., Ltd.)
142U/30㎕ T7 RNA 중합효소(Invitrogen Corp.)
3.6㎍/30㎕ 보빈혈청알부민
(4) 다음에, 열 조절 기능이 장착되고, PCR 튜브의 직접적인 측정이 가능한 형광 광도계가 반응 혼합물의 형광 강도를 주기적으로 측정하면서 43℃에서의 반응 동안 사용되었다(여기 파장: 470nm, 형광 파장: 520nm).
상기 반응 혼합물의 형광 강도비의 시간에 따른 변화(규정된 시간에서의 형광강도 값÷백그라운드 형광강도 값)를 도 2에 나타내었으며, 효소 첨가 시점이 0분으로 정의되었다. 도 2A 및 2B의 결과에 기초하여, Reg IV RNA의 초기 농도에 따른 형광 프로파일을 수득하였으며, 50 복제수/테스트의 Reg IV RNA는 약 10분 후에 검출할 수 있었다. 이는 Reg IV RNA가 본 발명의 방법에 의하여 고감도 및 고속으로 검출될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4:
Reg IV RNA를 본 발명의 방법에 의하여, 제 1 프라이머, 제 2 프라이머, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침 및 절단 올리고뉴클레오티드의 다른 조합을 사용하여 검출되었다.
(1) 상술한 Reg IV RNA(염기번호 1-1275를 포함하는)를 RNA 희석제(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.25U/㎕ 리보핵산가수분해효소 억제제, 5.0mM DTT)를 사용하여 104, 102 또는 50 복제수/5㎕로 RNA 샘플용으로 사용하기 위하여 묽혔다.
(2) 하기 조성을 가지는 반응 혼합물의 20㎕를 0.5㎖ 부피의 PCR 튜브(GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin-Elmer) 내에 넣은 후, RNA 샘플 5㎕를 가하였다.
반응 혼합물 조성: 농도는 효소 용액을 가한 후의 최종 농도(30㎕ 기준)이다.
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
18mM 염화마그네슘
100mM 염화칼륨
1mM DTT
0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각
3mM ATP, CTP, UTP, GTP 각각
3.6mM ITP
1μM 제 1 프라이머(서열번호: 표 1 내지 표 3에 기재된 서열): 지정된 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 부가된 T7 중합효소-프로모터 서열(서열번호: 65)이 포 함된 제 1 프라이머
1μM 제 2 프라이머(서열번호: 표 1 내지 표 3에 기재된 서열)
20nM 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호: 표 1 내지 표 3에 기재된 서열): 실시예 2에서 제조된 핵산 탐침
0.16μM 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호: 표 1 내지 표 3에 기재된 서열): 이 올리고뉴클레오티드의 3-말단의 -OH는 아미노기로 수식됨
6U/30㎕ 리보핵산가수분해효소 억제제(Takara Bio Inc.)
13% DMSO
(3) 이들 반응 혼합물을 5분간 43℃에 유지하고, 그 후, 2분간 43℃에 유지된 하기 조성을 가지는 효소 용액 5㎕를 첨가하였다.
효소 용액 조성: 반응시의 최종 농도(30㎕ 기준)
2% 솔비톨
6.4U/30㎕ AMV 역전사 효소(Life Science Co., Ltd.)
142U/30㎕ T7 RNA 중합효소(Invitrogen Corp.)
3.6㎍/30㎕ 보빈혈청알부민
(4) 다음에, 열 조절 기능이 장착되고, PCR 튜브의 직접적인 측정이 가능한 형광 광도계가 반응 혼합물의 형광 강도를 주기적으로 측정하면서 43℃에서의 반응 동안 사용되었다(여기 파장: 470nm, 형광 파장: 520nm). 표 1 내지 표 3은 결과를 나타내는데, 여기서 (+)는 반응 혼합물의 형광강도 비가 1.2를 넘었음을 의미하며, 그 점에서의 시간이 검출 시간으로 기재되는데, 효소 첨가 시점을 0분으로 정의한 것이다.
표 1 내에 기재된 제 1 프라이머, 제 2 프라이머, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침 및 절단 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용하는 경우, Reg IV RNA의 104, 102 및 50 복제수/테스트가 30분 내에 검출되었다. 구체적으로, Reg IV RNA는, 제 1 프라이머로서 서열번호 10 및 12 내지 23으로부터 선택된 서열, 제 2 프라이머로서 서열번호 11 및 30 내지 33으로부터 선택된 서열, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침으로서 서열번호 42, 43으로부터 선택된 서열 및 절단 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 49 내지 58로부터 선택된 서열을 포함하는 조합을 사용하는 경우 신속하게 검출될 수 있었으며, 제 1 프라이머로서 서열번호 3으로부터 선택된 서열, 제 2 프라이머로서 서열번호 34, 35로부터 선택된 서열, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침으로서 서열번호 44, 45로부터 선택된 서열 및 절단 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 59로부터 선택된 서열을 포함하는 조합을 사용하는 경우 신속하게 검출될 수 있었고, 또는 제 1 프라이머로서 서열번호 24 내지 29로부터 선택된 서열, 제 2 프라이머로서 서열번호 36 내지 41로부터 선택된 서열, 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침으로서 서열번호 46 내지 48로부터 선택된 서열 및 절단 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 60 내지 64로부터 선택된 서열을 포함하는 조합을 사용하는 경우 신속하게 검출될 수 있었다. 여기에서, 서열번호 10 및 12 내지 23은 각각 서열번호 1의 부분 서열이며, 서열번호 11 및 30 내지 33은 각각 서열번호 2의 부분 서열이고, 서열번호 42, 43은 각각 서열번호 7의 부분 서열이며, 서열번호 34, 35는 각각 서열번호 4의 부분 서열이고, 서열번호 44, 45는 각각 서열번호 8의 부분 서열이며, 서열번호 24 내지 29는 각각 서열번호 5의 부분 서열이고, 서열번호 36 내지 41은 각각 서열번호 5의 부분 서열이며, 및 서열번호 46 내지 48은 각각 서열번호 9의 부분 서열이다. 이는 본 발명의 제 1 프라이머, 제 2 프라이머 및 형광염료 삽입물이 치환된 핵산 탐침을 사용하는 RNA 증폭 및 검출 방법이 Reg IV RNA의 신속한 검출을 가능하게 함을 암시하였다.
표 1 내지 표 3: 각기 다른 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용한 검출의 결과
표 1:
표 2:
표 3:
상기 표에 기재된 올리고뉴클레오티드 조합은 Reg IV RNA의 104, 102 및 50 복제수/테스트를 샘플로 하여 RNA 증폭/형광 측정을 위해 사용되었다. 형광 강도비가 1.2보다 큰 샘플은 (+)로 표시하였으며, 이들 시점에서의 시간을 검출 시간으로 기록하였다.
실시예 5:
본 발명의 방법은 Reg IV RNA의 검출을 위해 사용되었다.
(1) 상술한 Reg IV RNA(염기번호 7 내지 1242를 포함하는)를 RNA 희석제(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.25U/㎕ 리보핵산가수분해효소 억제제, 5.0mM DTT)를 사용하여 102, 103, 104, 105 및 106 복제수/5㎕로 검정 곡선 표준 RNA용으로 사용하기 위하여 묽혔다. 상기 RNA 희석제는 음의 표준(NEG)으로 사용되었다. 샘플 A(102 복제수/5㎕), B(103 복제수/5㎕), C(104 복제수/5㎕), D(105 복제수 /5㎕) 및 E(106 복제수/5㎕)가 동일한 방법으로 준비되었다.
(2) 하기 조성을 가지는 반응 혼합물의 20㎕를 0.5㎖ 부피의 PCR 튜브(GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin-Elmer) 내에 넣은 후, 표준 RNA 샘플 5㎕를 가하였다.
반응 혼합물 조성 (A): 농도는 효소 용액을 가한 후의 최종 농도(30㎕ 기준)이다.
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
18mM 염화마그네슘
100mM 염화칼륨
1mM DTT
0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각
3mM ATP, CTP, UTP, GTP 각각
3.6mM ITP
0.2μM 제 1 프라이머(서열번호: 10): 지정된 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 부가된 T7 중합효소-프로모터 서열(서열번호: 65)이 포함된 제 1 프라이머
0.2μM 제 2 프라이머(서열번호: 11)
50nM 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호: 42): 링커를 통하여 포스페이트 디에스테르와 결합된 옥사졸 옐로를 가진 실시예 2의 핵산 탐침
0.16μM 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호: 50): 이 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 -OH는 아미노기로 수식됨
6U/30㎕ 리보핵산가수분해효소 억제제(Takara Bio Inc.)
11.7% DMSO
반응 혼합물 조성 (B): 농도는 효소 용액을 가한 후의 최종 농도(30㎕ 기준)이다.
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
18mM 염화마그네슘
100mM 염화칼륨
1mM DTT
0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각
3mM ATP, CTP, UTP, GTP 각각
3.6mM ITP
0.2μM 제 1 프라이머(서열번호: 18): 지정된 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 부가된 T7 중합효소-프로모터 서열(서열번호: 65)이 포함된 제 1 프라이머
0.2μM 제 2 프라이머(서열번호: 33)
50nM 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침(서열번호: 42)
0.16μM 절단 올리고뉴클레오티드(서열번호: 54): 이 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 -OH는 아미노기로 수식됨
6U/30㎕ 리보핵산가수분해효소 억제제(Takara Bio Inc.)
13% DMSO
(3) 이들 반응 혼합물(A, B)을 5분간 43℃에 유지하고, 그 후, 2분간 43℃에 유지된 하기 조성을 가지는 효소 용액 5㎕를 첨가하였다.
효소 용액 조성: 반응시의 최종 농도(30㎕ 기준)
2% 솔비톨
6.4U/30㎕ AMV 역전사 효소(Life Science Co., Ltd.)
142U/30㎕ T7 RNA 중합효소(Invitrogen Corp.)
3.6㎍/30㎕ 보빈혈청알부민
(4) 다음에, 열 조절 기능이 장착되고, PCR 튜브의 직접적인 측정이 가능한 형광 광도계가 반응 혼합물의 형광 강도를 주기적으로 측정하면서 43℃에서의 반응 동안 사용되었다(여기 파장: 470nm, 형광 파장: 520nm). 상기 반응 혼합물의 형광 강도비의 시간에 따른 변화(규정된 시간에서의 형광 강도값÷백그라운드 형광 강도값)를 도 3A 및 3B에 나타내었으며, 효소 첨가 시점이 0분으로 정의되었다.
도 3A 및 3B의 결과에 기초하여, 형광 강도비가 1.2에 도달한 시간으로 정의된 검출 시간에 의하여, 도 4A 및 4B에 도시한 바와 같이, 검출 시간 및 초기 복제수의 로그값으로부터 검정 곡선이 도출되었다. 샘플 A, B, C, D 및 E에 대한 복제수가 상기 검정 곡선으로부터 결정되어, 도 4에 도시된 결과를 나타내었다.
도 4A 및 4B에 도시된 결과에서, 102 복제수/테스트는 약 9분에 검출되었으며, 검출 시간 및 초기 복제수 사이에서 만족할 만한 상호관계가 얻어졌다. 표 4A 및 4B에 도시된 결과에서 샘플 A, B, C, D 및 E에 대한 검출 결과는 첨가된 Reg IV RNA의 양에 따른 값들이다. 따라서, 본 발명의 방법은 Reg IV RNA를 신속하고, 고감도 및 고특이성으로 검출할 수 있음이 증명되었다.
표 4:
상기 표 4는, 샘플 A(102 복제수/5㎕), B(103 복제수/5㎕), C(104 복제수/5 ㎕), D(105 복제수/5㎕) 및 E(106 복제수/5㎕)의 측정 결과에 기초한 형광 프로파일로부터 계산된 검출 시간 및 도 4의 검정 곡선으로부터 계산된 복제 수의 결과를 나타낸다. 표 4A는 반응 혼합 조성물 (A)를 사용한 경우의 결과를 나타내며, 표 4B는 반응 혼합 조성물 (B)를 사용한 경우의 결과를 나타낸다.
본 발명은 위암, 대장암 및 다른 암들에 대한 마커로서 적용될 수 있다.
<110> TOSOH Corporation
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<150> JP2005-314343
<151> 2005-10-28
<160> 65
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 1
ttatcgcttt gtgactaaag taaagattat taattcctga ggcaagaaga tataaaagct 60
ccagaaacgt tgactgggac cact 84
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 2
gggttctcct tgatctgcaa atctgtttgg caaccaagac tctaagggc 49
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 3
cttggttgcc aaacagattt 20
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 4
atgcttctgg aagccatctt cctcctaccc tgaggatgta 40
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 5
acagaagagg cagcagtggc agtggattga tggggccatg tatctgta 48
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 6
cttgattctt gctctatggt cggtacttgc acaggaagtg ttggcgcttg ttgcattcgt 60
tgctgctcca agtta 75
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 7
taagggcccc tgccttcttc agtgtctcca g 31
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 8
ggatctcaga gaccttacta gcgcttcttt gaaactcctg ggt 43
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 9
tgttattgga gctcatctca gcacagtgct tgttcccacc catggacttg ccagaccagg 60
60
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 10
tatcgctttg tgactaaagt aaagatta 28
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 11
ggcaaccaag actctaaggg c 21
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 12
ttatcgcttt gtgactaaag taaagatt 28
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 13
cgctttgtga ctaaagtaaa gatta 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 14
taaagattat taattcctga ggcaa 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 15
attcctgagg caagaagata taaaa 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 16
ctgaggcaag aagatataaa agctc 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 17
caagaagata taaaagctcc agaa 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 18
aagaagatat aaaagctcca gaaa 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 19
agaagatata aaagctccag aaac 24
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 20
gatataaaag ctccagaaac gttgac 26
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 21
agctccagaa acgttgactg gga 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 22
tccagaaacg ttgactggga 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 23
agaaacgttg actgggacca ct 22
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 24
acagaagagg cagcagtgg 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 25
ggcagcagtg gcagtggatt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 26
cagtggcagt ggattgatgg 20
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 27
agtggcagtg gattgatgg 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 28
tggattgatg gggccatgt 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Primer
<400> 29
gatggggcca tgtatctgta 20
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 30
ctgtttggca accaagactc taa 23
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 31
ctgtttggca accaagactc 20
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 32
gttctccttg atctgcaaat ctgtt 25
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 33
gggttctcct tgatctgcaa atctgtt 27
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 34
cctcctaccc tgaggatgta 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 35
atgcttctgg aagccatctt 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 36
ttcgttgctg ctccaagtta 20
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 37
aagtgttggc gcttgttgc 19
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 38
gctctatggt cggtacttgc aca 23
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 39
cttgctctat ggtcggtact t 21
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 40
tgattcttgc tctatggtcg gtactt 26
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Primer
<400> 41
cttgattctt gctctatggt cgg 23
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 42
gccttcttca gtgtctccag 20
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 43
taagggcccc tgccttct 18
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 44
gcttctttga aactcctggg t 21
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 45
ggatctcaga gaccttacta gcg 23
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 46
atggacttgc cagaccagg 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 47
tctcagcaca gtgcttgttc 20
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intercalator Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe
<400> 48
tgttattgga gctcatctca gc 22
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 49
gcgataatat tatttgagaa aaacaa 26
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 50
aaagcgataa tattatttga gaaaaa 26
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 51
tctttacttt agtcacaaag cgataa 26
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 52
aggaattaat aatctttact ttagtc 26
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 53
cctcaggaat taataatctt tactt 25
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 54
cttcttgcct caggaattaa taatct 26
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 55
tatatcttct tgcctcagga attaat 26
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 56
ggagctttta tatcttcttg cctcag 26
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 57
tctggagctt ttatatcttc ttgcc 25
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 58
gtttctggag cttttatatc ttcttg 26
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 59
gtttggcaac caagactcta agggc 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 60
ttctgtgggt cgtgcaggcc aatcc 25
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 61
gctgcctctt ctgtgggtcg tgcagg 26
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 62
gccactgctg cctcttctgt gggtc 25
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 63
aatccactgc cactgctgcc tcttct 26
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage Oligonucleotide
<400> 64
cccatcaatc cactgccact gctgc 25
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 Polymerase Promoter Sequence
<400> 65
aattctaata cgactcacta tagggaga 28
Claims (7)
- 샘플 내에 존재하는 재생성 섬 파생군 4형(Regenerating islet-derived family, member 4: 재생성 유전자형 4) mRNA(Reg IV mRNA)를 검출하는 방법에 있어서,(1) 상기 RNA의 특정 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 하류 부분과 적어도 일치하는 제 1 프라이머와, 상기 특정 뉴클레오티드 서열의 3' 말단으로부터 상류 부분과 적어도 상보적인 제 2 프라이머를 사용하여 프로모터 서열 및 상기 프로모터 서열로부터 하류의 상기 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 사슬 DNA를 제조하는 단계에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 상기 프로모터 서열을 갖는, 이중 사슬 DNA 제조 단계;(2) 상기 이중 사슬 DNA를 주형으로 사용하여 RNA 전사물을 제조하는 단계;(3) 상기 RNA 전사물을 다시 DNA 합성을 위한 주형으로 사용하여, 연쇄 반응으로 상기 RNA 전사물을 증폭하는 단계; 및(4) 상기 RNA 전사물의 양을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Reg IV mRNA 검출 방법.
- 제 1항에 있어서,서열번호 1에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머와, 서열번호 2에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 상기 제 2 프라이머의 조합; 서열번호 3에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머와, 서열번호 4에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 상기 제 2 프라이머의 조합; 또는 서열번호 5에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머와, 서열번호 6에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 상기 제 2 프라이머의 조합을 사용하는 것을 특징으로 하는 Reg IV mRNA 검출 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 RNA 전사물 양의 검출은, 삽입성 염료로 표지된 핵산 탐침의 형광 특성변화를 측정함으로써 이루어지며, 목표 핵산과 상보적인 이중 사슬을 형성하는 경우, 삽입성 형광염료 부분이 상기 상보적인 이중 사슬 내로 삽입되어 형광 특성 변화를 겪도록 고안된 것을 특징으로 하는 Reg IV mRNA 검출 방법.
- 제 3항에 있어서,서열번호 1에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머, 서열번호 2에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 상기 제 2 프라이머 및 서열번호 7에 기재된 서열 또는 전기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침의 조합; 서열번호 3에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머, 서열번호 4에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 상기 제 2 프라이머 및 서열번호 8에 기재된 서열 또는 전기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침의 조합; 또는 서열번호 5에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머, 서열번호 6에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 상기 제 2 프라이머 및 서열번호 9에 기재된 서열 또는 전기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침의 조합을 사용하는 것을 특징으로 하는 Reg IV mRNA 검출 방법.
- Reg IV mRNA의 검출 시약에 있어서,서열번호 1에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 제 1 프라이머와, 서열번호 2에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 제 2 프라이머의 서열의 조합으로서, 상기 제 1 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 가진 조합; 서열번호 3에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 제 1 프라이머와, 서열번호 4에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 제 2 프라이머의 서열의 조합으로서, 상기 제 1 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 가진 조 합; 또는 서열번호 5에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 제 1 프라이머와, 서열번호 6에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 제 2 프라이머의 서열의 조합으로서, 상기 제 1 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 가진 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 상기 검출 시약의 필수 구성 요소인 것을 특징으로 하는 Reg IV mRNA 검출 시약.
- Reg IV mRNA 검출 방법에 있어서,서열번호 1에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머, 서열번호 2에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 제 2 프라이머 및, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 전기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침의 서열의 조합으로서, 상기 제 1 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 가진 조합; 서열번호 3에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머, 서열번호 4에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 제 2 프라이머 및, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 전기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침의 서열의 조합으로서, 상기 제 1 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 가진 조합; 또는 서열번호 5에 기재된 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는 상기 제 1 프라이머, 서열번호 6에 기재된 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 제 2 프라이머 및, 서열번호 9에 기재된 서열 또는 전기 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 염기를 포함하는 삽입성 형광염료가 표지된 핵산 탐침의 서열의 조합으로서, 상기 제 1 및 제 2 프라이머 중 적어도 하나는 5' 말단에 프로모터 서열을 가진 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 필수 구성 요소인 것을 특징으로 하는 Reg IV mRNA 검출 방법.
- 서열번호 1 내지 9 또는 이들 서열과 상보적인 서열 중 적어도 15개의 연속하는 염기를 포함하는, Reg IV mRNA의 증폭 또는 검출을 위한 올리고뉴클레오티드.
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