WO2012176596A1 - 核酸増幅装置及び核酸分析装置 - Google Patents

核酸増幅装置及び核酸分析装置 Download PDF

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WO2012176596A1
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temperature
nucleic acid
temperature control
control block
melting
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PCT/JP2012/064037
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耕史 前田
千枝 杉山
義之 庄司
雅人 石沢
稔 佐野
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • B01L2300/1822—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks using Peltier elements

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification device equipped with a plurality of temperature control blocks that can be individually temperature controlled, and a nucleic acid analyzer that uses the nucleic acid amplification device as a part of the device.
  • the temperature control block needs to accurately control the absolute temperature value to the target temperature.
  • a calibrated temperature measurement probe is used to measure the temperature absolute value of the temperature control block, and if the measured temperature is different from the target temperature, a method of correcting the measured temperature to match the target temperature has been adopted. Has been.
  • the limit accuracy of temperature correction using a calibrated temperature measurement probe is ⁇ 0.25 ° C.
  • a plurality of temperature control blocks that can be individually controlled in temperature may be mounted on one apparatus. Also in this case, if the temperature of each temperature control block is individually corrected using a calibrated temperature measurement probe, the temperature control accuracy of each temperature control block after the correction is ⁇ 0.25 ° C. Therefore, the temperature difference between the temperature control blocks is theoretically 0.5 ° C. at the maximum.
  • thermochromic liquid crystal a method using a test piece using a thermochromic liquid crystal has been proposed for temperature correction of the temperature control block (see, for example, Patent Document 1).
  • the method is based on the principle that the temperature of the test piece is calibrated by detecting the color change of the liquid crystal when the test piece is controlled to the test temperature by mixing the thermochromic liquid crystal into the test piece in contact with the fluid sample. To do.
  • the PCR method includes (1) a heat denaturation temperature of 95 ° C., (2) an annealing temperature of about 55 ° C. to 65 ° C., and (3) an extension reaction temperature alternately n times (hereinafter referred to as “temperature cycle”). ) To amplify the target nucleic acid sequence 2n times.
  • the annealing temperature and extension reaction temperature vary depending on the target sequence, and the required accuracy of the temperature is generally within ⁇ 0.5 ° C. However, the higher the accuracy and reproducibility of temperature, the better the amplification efficiency and amplification reproducibility of DNA.
  • the real-time PCR method refers to a method of measuring amplification by PCR in real time by using a fluorescent dye and quantifying the amount of nucleic acid in the reaction solution from the amplification rate (number of cycles).
  • a real-time PCR apparatus in which a plurality of reaction vessels (wells) are arranged in a space where temperature is controlled by one temperature control block is used.
  • the temperature difference between the plurality of reaction vessels (wells) can be suppressed to ⁇ 0.2 ° C. or less.
  • This real-time PCR device can individually control the temperature of a plurality of temperature control blocks, and can simultaneously execute a plurality of temperature cycles.
  • this type of apparatus also requires a temperature control accuracy equivalent to that in the case where only one temperature control block is used between a plurality of reaction vessels (wells).
  • HRM analysis refers to the temperature of the amplified product amplified by the real-time PCR method in the range of about 60 ° C to 95 ° C with a resolution of 0.1 ° C or less, and the melting temperature of the amplified product (the two amplified products) This is an analysis method for determining the melting temperature of the double-stranded bond of the strand nucleic acid.
  • the melting temperature is different for each amplified sequence, and theoretically, it is known that even a difference of 1 base differs.
  • nucleic acids can be separated and detected for each sequence from an amplification reaction solution in which a plurality of different sequences are mixed.
  • the conventional temperature correction method using a calibrated temperature measurement probe has a temperature difference of 0.5 ° C. at the maximum, and it is difficult to satisfy the above-described requirements.
  • nucleic acid fragment amplified by the PCR method was collected and mixed well in the same container, and then the mixed solution was dispensed into 96 reaction containers (wells) as shown in FIG. 1A.
  • the nucleic acid fragment was subjected to HRM analysis using a real-time PCR apparatus having a temperature uniformity between reaction vessels (wells) of 0.05 ° C. or less to determine the melting temperature.
  • FIG. 1B the inventors discovered that the variation in melting temperature of nucleic acid fragments amplified by PCR was very small, and the variation was within ⁇ 0.05 ° C.
  • the inventors utilize this discovery, a plurality of temperature control blocks that can be individually temperature controlled, a real-time fluorescence measurement unit that performs fluorescence measurement in real time on a sample in a reaction vessel temperature-controlled by each temperature control block, A storage unit for storing a reference melting temperature of a temperature calibration sample dispensed in one or a plurality of reaction vessels whose temperature is controlled in each temperature control block, and a temperature stored in each reaction vessel corresponding to each temperature control block.
  • the melting temperature measurement unit that measures the melting temperature of the calibration sample as the measured melting temperature, the measured melting temperature corresponding to each temperature control block and the reference melting temperature are compared, and the temperature of each temperature control block is based on each difference value.
  • a temperature correction unit that corrects the absolute value is mounted on the nucleic acid amplification device.
  • the nucleic acid amplification device having the above configuration is mounted on the nucleic acid analyzer.
  • temperature uniformity among a plurality of temperature control blocks that can be individually temperature controlled can be realized with the same accuracy as the temperature control resolution.
  • FIG. 2 shows a functional block configuration of the nucleic acid amplification device according to the embodiment.
  • the nucleic acid amplification apparatus shown in FIG. 2 includes a plurality of temperature control blocks 1 that can be individually temperature controlled, a real-time fluorescence measurement unit 3, and a control unit 5 that controls them.
  • a mechanism part including a plurality of temperature control blocks 1 and a real-time fluorescence measurement unit 3 that can individually control the temperature is referred to as a real-time fluorescence measurement mechanism 15.
  • the base body of the temperature control block 1 is formed of a material having excellent thermal conductivity, and the reaction vessel is accommodated in a holding mechanism formed on the base body.
  • a temperature sensor and a heat source are also arranged on the base.
  • the substrate for example, copper, aluminum, and various alloys are used.
  • the temperature sensor uses a thermistor, a thermocouple, a resistance temperature detector, or the like. The temperature sensor is disposed in the vicinity of the holding mechanism of the reaction container in order to measure the temperature of the sample in the reaction container.
  • a Peltier element is used as the heat source.
  • the Peltier element is a thermoelectric element and is used for heating or cooling the substrate.
  • a radiation fin is disposed on the base.
  • temperature control it is not necessary to mount a heat source in the temperature control block 1.
  • the plurality of temperature control blocks 1 are arranged on a pedestal made of a material having excellent heat insulation properties such as plastic. Accordingly, the propagation of temperature from one temperature control block 1 to another temperature control block 1 can be ignored. That is, the mutual interference of temperatures between the plurality of temperature control blocks can be ignored.
  • the real-time fluorescence measurement unit 3 measures the sample in the reaction container whose temperature is controlled by each temperature control block 1 in real time.
  • the sample is fluorescently labeled.
  • the real-time fluorescence measurement unit 3 includes an excitation light source that generates excitation light that irradiates the reaction container, and a fluorescence detector that measures fluorescence generated from the sample irradiated with the excitation light.
  • a light emitting diode (LED), a semiconductor laser, a xenon lamp, a halogen lamp, or the like is used as the excitation light source.
  • a photodiode, a photomultiplier, a CCD, or the like is used as the fluorescence detector.
  • the control unit 5 executes temperature control of each temperature control block 1, processing of measurement data of the real-time fluorescence measurement unit 3, and the like.
  • the control unit 5 stores the melting temperature of the temperature calibration sample used when correcting the temperature of each temperature control block 1 in the storage unit 11.
  • the melting temperature here (hereinafter also referred to as “reference melting temperature”) is taken into the control unit 5 through various routes, as will be described later.
  • the control unit 5 has a melting temperature measurement unit 7 and a temperature correction unit 9 as functions used when correcting the temperature of each temperature control block 1.
  • the melting temperature measurement unit 7 measures the melting temperature of the temperature calibration sample accommodated in each reaction container corresponding to each temperature control block 1.
  • the measurement of the melting temperature is determined as the measurement temperature of the temperature sensor (hereinafter also referred to as “measured melting temperature”) when the real-time fluorescence measurement unit 3 detects the melting of the temperature calibration sample.
  • the measured melting temperature is given from the melting temperature measuring unit 7 to the temperature correcting unit 9.
  • the temperature correction unit 9 compares the measured melting temperature with the reference melting temperature stored in the storage unit 11, and corrects the temperature absolute value of each temperature control block 1 so that the difference is eliminated. The difference between the measured melting temperature and the reference melting temperature detected for each temperature control block 1 gives the temperature control accuracy of the temperature control block 1.
  • FIG. 3 shows a specific example of a nucleic acid amplifier that corrects the absolute temperature values of a plurality of temperature control blocks 1 using one type of temperature calibration sample.
  • the device configuration shown in FIG. 3 represents the device configuration shown in FIG. 2 in more detail.
  • the turntable 22 here corresponds to the base of the first embodiment.
  • the turntable 22 is made of a material having excellent heat insulation. Accordingly, the mutual interference of temperatures between the plurality of temperature control blocks can be ignored.
  • the turntable 22 is fixed with respect to a rotating shaft (not shown), and can freely rotate both in the clockwise direction and in the counterclockwise direction as indicated by an arrow.
  • the rotating shaft is rotationally driven by a stepping motor (not shown).
  • reaction vessel 21 is made of a member that is transparent to light in the fluorescence wavelength band, and is attached so that its bottom is exposed from the back side of the turntable 22.
  • the real-time fluorescence measurement unit 3 is disposed on the back side of the turntable 22 and irradiates the bottom of the reaction vessel 21 with excitation light generated from an excitation light source.
  • the real-time fluorescence measurement unit 3 detects fluorescence generated in the sample in the reaction vessel 21 irradiated with the excitation light with a fluorescence detector, and outputs the fluorescence intensity to the data processing unit 23 as fluorescence measurement data.
  • the data processing unit 23 processes the fluorescence measurement data sequentially input from the fluorescence detector and the temperature data measured by the temperature sensor, and outputs the data to the storage / calculation unit 24.
  • the storage / calculation unit 24 is composed of, for example, a general-purpose computer, and executes analysis processing for analyzing the melting temperature of each temperature block 1 and calculation processing for calculating a correction value.
  • the storage / calculation unit 24 sets the measurement temperature at the time when the melting of the temperature calibration sample is detected from the fluorescence measurement data as the measurement melting temperature.
  • the storage / calculation unit 24 calculates a correction value for the absolute temperature value based on the difference value between the measured melting temperature and the reference melting temperature.
  • the measured temperature of the temperature control block 1 is also given to the device control unit 25.
  • the reference melting temperature is stored in advance in the storage / calculation unit 24.
  • the device control unit 25 controls each temperature control block 1 to a target temperature so that a temperature change necessary for real-time fluorescence detection can be obtained. Specifically, the heat generation amount of the heat source mounted on the temperature control block 1 is controlled. At this time, the apparatus control unit 25 acquires the measured temperature from the temperature sensor mounted on the temperature control block 1 and performs feedback control so that the measured temperature matches the target temperature. The measured temperature here is also given to the storage / calculation unit 24 as described above.
  • the apparatus control part 25 changes the temperature of the reaction container 21 in the range of at least 50 degreeC to 95 degreeC in the case of real-time fluorescence detection.
  • the data processing unit 23, the storage / calculation unit 24, and the device control unit 25 in FIG. 3 correspond to the control unit 5 in FIG. In FIG. 3, the data processing unit 23, the storage / calculation unit 24, and the device control unit 25 are shown as independent devices, but may be configured as one device.
  • the temperature control block 1 is mounted on the outer edge of the turntable 22, and fluorescence is detected when the turntable 22 rotates and the temperature control block 1 passes in front of the real-time fluorescence measurement unit 3.
  • fluorescence is detected when the turntable 22 rotates and the temperature control block 1 passes in front of the real-time fluorescence measurement unit 3.
  • the pedestal side on which the temperature control block 1 is mounted may be fixed and the real-time fluorescence measurement unit 3 side may be rotated or moved. In this case, fluorescence detection is performed when the real-time fluorescence measurement unit 3 passes a position facing the temperature control block 1.
  • FIG. 4 shows another device configuration example of the nucleic acid amplification device that corrects the temperature of the temperature control block 1 using one type of temperature calibration sample.
  • the apparatus configuration shown in FIG. 4 also represents the apparatus configuration shown in FIG. 2 in more detail.
  • the number of the real-time fluorescence measurement units 3 is smaller than the number of the temperature control blocks 1. For this reason, the structure which fixed either one of the base which mounts the temperature control block 1, and the real-time fluorescence measurement part 3, and rotationally controlled the other was employ
  • the temperature control block 1 and the real-time fluorescence measurement unit 3 correspond one-to-one and a plurality of these are provided, the apparatus configuration shown in FIG. 4 is possible.
  • the temperature control block 1 represents an example in which a reaction plate 26 in which a plurality of reaction vessels 21 are arranged in a matrix is placed.
  • reaction vessel 21 and the reaction plate 26 may be of any material and shape as long as they can transmit the fluorescence wavelength and can conduct the heat of the temperature control block 1. More preferably, it is desirable to use a PCR tube (Gleiner, Germany) or a 96-well PCR plate that does not contain DNase or RNase.
  • the temperature calibration sample in the present embodiment only needs to contain a nucleic acid fragment capable of HRM analysis and a detection dye.
  • a nucleic acid fragment capable of HRM analysis and a detection dye.
  • DNA, RNA, or PNA can be used as the nucleic acid fragment. More preferably, a sample obtained by amplifying any one kind of nucleic acid fragment by the PCR method is used. More preferably, a nucleic acid fragment in which the coincidence between the absolute temperature of the aqueous solution and the melting temperature is confirmed is used.
  • nucleic acid fragments capable of HRM analysis and a detection dye it is only necessary to include two types of nucleic acid fragments capable of HRM analysis and a detection dye. More preferably, amplification products obtained by individually amplifying two types of nucleic acid fragments by PCR are used.
  • the temperature calibration sample is preferably contained in a container having a barcode attached to the outer wall.
  • the barcode information includes at least melting temperature information of the temperature calibration sample.
  • a barcode may be attached to the reaction plate 26 itself.
  • the bar code information includes at least the melting temperature information of the temperature calibration sample.
  • the nucleic acid amplification device corrects variations in temperature absolute values existing between a plurality of temperature control blocks through the following three processing steps.
  • a sample containing a nucleic acid fragment having a predetermined melting temperature amplified by a nucleic acid amplification method such as a PCR method is dispensed into a plurality of reaction containers as a temperature calibration sample. Then, this reaction container is installed or installed in the holding mechanism of the several temperature control block 1 in the nucleic acid amplifier which carries out temperature calibration. Alternatively, the temperature calibration sample is dispensed into a reaction vessel previously installed or installed on the holding mechanism of the plurality of temperature control blocks 1.
  • the melting temperature of the temperature calibration sample is actually measured for each temperature control block 1.
  • a known method is applied to the measurement of the melting temperature here.
  • the fluorescence intensity is measured in real time while changing the temperature of the temperature control block 1 from a low temperature (eg, 60 ° C.) to a high temperature (eg, 95 ° C.).
  • the fluorescence intensity is measured by changing the temperature with a temperature resolution equal to or higher than the temperature accuracy required for the nucleic acid amplification device. For example, if the temperature accuracy required for the nucleic acid amplifier is ⁇ 0.1 ° C or less, the target temperature is varied in increments of 0.1 ° C or less, and the melting temperature is measured by fluorescence.
  • the control unit 5 corrects the absolute temperature value managed for each temperature control block 1 so that the measured value of the melting temperature matches the melting temperature stored in the storage unit 11. . Note that measurement error may occur in the measurement of the melting temperature. Therefore, in a more preferred embodiment, it is desirable to repeat step 2 and step 3 twice or more to improve temperature uniformity between the temperature control blocks.
  • FIG. 5 shows a melting temperature information confirmation processing procedure executed prior to temperature correction.
  • the description will be made assuming that the storage / calculation unit 24 executes the processing. But you may perform using the other control part which comprises a nucleic acid amplifier, and the external control part connected to a nucleic acid amplifier.
  • the storage / calculation unit 24 tries to obtain melting temperature information of the temperature calibration sample via the network (step S1). If available, the melting temperature information is read out via the network and stored in a predetermined storage area (step S2).
  • the network here includes the Internet as well as the LAN.
  • the storage / calculation unit 24 requests the user to input melting temperature information (step S3).
  • the user inputs the melting temperature using bar code input or the like in addition to keyboard input.
  • the storage / calculation unit 24 stores the input melting temperature information in a predetermined storage area (step S4).
  • FIG. 6 shows the entire temperature correction operation including the melting temperature information confirmation process (FIG. 5).
  • the storage / calculation unit 24 is described as executing a series of processes. However, a series of other control units constituting the nucleic acid amplification device or an external control unit connected to the nucleic acid amplification device is a series. Processing may be executed.
  • the storage / calculation unit 24 confirms melting temperature information of the temperature calibration sample (step S11).
  • the processing operation shown in FIG. 5 is executed.
  • the storage / calculation unit 24 measures the melting temperature of the installed temperature calibration sample (step S12). Specifically, the temperature of the temperature control block 1 is changed from a low temperature (for example, 60 ° C.) to a high temperature (for example, 95 ° C.) in predetermined increments, and the fluorescence intensity emitted from the temperature calibration sample at that time is measured in real time. To do. When detecting the melting of the sample from the fluorescence intensity, the storage / calculation unit 24 stores the measured temperature at that time in the predetermined storage area as the measured melting temperature.
  • a low temperature for example, 60 ° C.
  • a high temperature for example, 95 ° C.
  • the storage / calculation unit 24 compares the reference melting temperature confirmed in advance with the measured melting temperature of each temperature control block 1 (step S13). At this time, the storage / calculation unit 24 calculates a difference value between the reference melting temperature confirmed in advance and the measured melting temperature of each temperature control block 1.
  • the storage / calculation unit 24 uses the difference value calculated for each temperature control block 1 so that the measured melting temperature of each temperature control block 1 becomes the reference melting temperature of the temperature calibration sample. The value is corrected (step S14).
  • the following is obtained by measuring the melting temperature with a resolution of 0.1 ° C or lower when using the temperature control block 1 that can set the temperature with a resolution of 0.1 ° C or lower and the temperature calibration sample with a melting temperature of 87.3 ° C.
  • the melting temperature curve will be explained.
  • the melting temperature of the sample accommodated in each reaction container is determined as the temperature at the fluorescence intensity value (0.2) having the largest decay rate (the amount of decrease in fluorescence intensity per unit time).
  • the method for determining the melting temperature is not limited to this method, and for example, the analysis method shown in Non-Patent Document 1 can also be used.
  • FIG. 7A shows a measurement example of melting temperature curves measured for a plurality of temperature control blocks 1 when no temperature correction is performed.
  • the maximum temperature difference between the plurality of temperature control blocks was 1.7 ° C.
  • the measured values are plotted with the horizontal axis as temperature and the vertical axis as fluorescence intensity. The same applies to FIGS. 7B and 7C.
  • FIG. 7B shows a measurement example of melting temperature curves measured for a plurality of temperature control blocks 1 when the temperature absolute value of each temperature control block 1 is corrected based on the melting temperature of 87.3 ° C.
  • the maximum temperature difference between the plurality of temperature control blocks converges to 0.1 ° C. or less.
  • FIG. 7C shows a measurement example of melting temperature curves measured for a plurality of temperature control blocks 1 when a conventional temperature setting method using a calibrated temperature probe is used.
  • the maximum temperature difference between the plurality of temperature control blocks is 0.53 ° C.
  • the nucleic acid amplification apparatus is equipped with a function for correcting the temperature absolute value of the temperature control block 1 using the temperature calibration sample.
  • the maximum temperature difference between the plurality of temperature control blocks can be made uniform with the same accuracy as the temperature control resolution of each temperature control block 1.
  • the maximum temperature difference between the plurality of temperature control blocks can be uniformized to ⁇ 0.05 ° C. or less. That is, the temperature difference between the temperature control blocks can be corrected to the same extent as the temperature control resolution in each temperature control block. For this reason, even when nucleic acid amplification is performed using a plurality of temperature control blocks, the influence of the difference in temperature control blocks on the analysis accuracy can be ignored.
  • a part having a large change rate at which the fluorescence intensity changes abruptly (a part having the largest fluorescence intensity decay rate (in the case of FIG. 7B, the fluorescence intensity value is 0.2)) is determined as the melting temperature. .
  • the melting temperature may be determined using other methods.
  • the melting temperature may be determined using a measurement curve in which temperature is plotted on the horizontal axis and the change rate of fluorescence intensity is plotted on the vertical axis. Specifically, the temperature at which the change in fluorescence intensity is the largest may be determined as the melting temperature. In this case, the melting temperature can be specified more clearly.
  • 8A corresponds to FIG. 7A
  • FIG. 8B corresponds to FIG. 7B.
  • the detection of the melting temperature is executed by the storage / calculation unit 24.
  • Example 3 the temperature at which the measured decay rate of the fluorescence intensity is the highest or the temperature at which the change rate of the fluorescence intensity is the largest is used as the “melting temperature”.
  • any determination method may be used. . That is, the method is not limited to the method for determining the melting temperature from the measurement curve of the temperature calibration sample.
  • Example 4 In the above-described embodiment, the temperature calibration method using the temperature calibration sample having one melting temperature has been described. If the temperature characteristics of each temperature control block 1 are the same so that the temperature characteristics of each temperature control block 1 can be ignored even with a single temperature calibration sample, the maximum temperature difference of the temperature control block 1 is uniform to ⁇ 0.05 ° C or less for temperatures other than the melting temperature. Can be
  • each temperature control block 1 generally has a unique temperature characteristic. Therefore, in the present embodiment, by adopting the following method, the temperature absolute values between the plurality of temperature control blocks are made uniform even when controlling the plurality of temperature control blocks 1 that can be individually controlled to an arbitrary temperature. .
  • each temperature control block 1 when the temperature characteristics of each temperature control block 1 are measured in advance and stored in the storage / calculation unit 24 and the temperature is controlled to a temperature other than the melting temperature, the temperature characteristics and the melting temperature are used.
  • the temperature of each temperature control block 1 is controlled based on the control error.
  • the temperature characteristics may be measured in the temperature range used for nucleic acid amplification.
  • the target temperature may be set from about 50 ° C. to about 100 ° C.
  • FIG. 9 shows an example of actually measured temperature characteristics.
  • FIG. 9 shows the relationship between the measured temperatures of the temperature control block 1 measured by the temperature sensor when the target temperature of each temperature control block 1 is varied in increments of 1 ° C.
  • the vertical axis in FIG. 9 is the measured temperature, and the horizontal axis is the target temperature.
  • the temperature characteristic unique to each temperature control block 1 can be defined by the slope and intercept of a straight line.
  • the temperature characteristics specific to each temperature control block 1 are measured and stored in the storage area, and the error between the target temperature and the measured temperature with respect to the melting temperature is corrected. It can be accurately controlled at any temperature. That is, for any temperature other than the melting temperature, the temperature absolute value can be made uniform among the plurality of temperature control blocks.
  • each temperature control block 1 can be controlled to an arbitrary absolute value by using the measured temperature characteristic as it is.
  • Example 5 a temperature correction function having a function of evaluating the accuracy of the corrected temperature will be described.
  • the measured melting temperature of the temperature control block 1 should match the reference melting temperature (strictly, the difference should be below the same level as the temperature control resolution).
  • the temperature correction function described below is proposed.
  • FIG. 10 shows an example of a processing procedure corresponding to the temperature correction function.
  • the storage / calculation unit 24 performs the above-described reference melting temperature confirmation process (step S21). This processing operation is the same as steps S1 to S4 shown in FIG.
  • step S22 the storage / calculation unit 24 performs temperature correction of each temperature control block 1 (step S22).
  • This processing operation is the same as steps S12 to S14 shown in FIG. Specifically, the target temperature of the temperature control block 1 is varied from around 50 ° C. to around 100 ° C., and the melting temperature is measured and the absolute temperature value is corrected.
  • the storage / calculation unit 24 remeasures the melting temperature of the temperature calibration sample for each temperature control block 1. This operation is performed automatically.
  • the storage / calculation unit 24 determines whether or not the temperature difference between the measured melting temperature and the reference melting temperature is within the target accuracy (whether or not it is equal to or less than a determination threshold) (step S23).
  • the threshold value for giving the target accuracy may be set in advance by the user or may be assigned as an initial value.
  • the storage / calculation unit 24 displays the accuracy that each temperature control block 1 satisfies, and ends the correction operation (step S24).
  • the accuracy the temperature absolute value measured for each temperature control block 1 after correction and the accuracy between wells are also displayed.
  • step S23 if it is determined in step S23 that the temperature difference exceeds the target accuracy, the storage / calculation unit 24 compares the temperature correction count (repetition count) that has already been executed with a threshold (step S25).
  • the threshold value here gives the upper limit value of the number of corrections of the melting temperature measurement and the temperature absolute value of each temperature control block 1.
  • the threshold value may be set in advance by the user or may be assigned as an initial value.
  • step S25 When there is a temperature control block 1 for which a negative result is obtained in the determination process of step S25 (that is, when the number of temperature corrections for the corresponding temperature control block has not reached a predetermined threshold), the storage / calculation unit 24 The process returns to step S22.
  • the storage / calculation unit 24 executes a temperature absolute value correction process based on the temperature difference between the measured melting temperature value and the original melting temperature for each temperature control block 1. When there is a temperature control block that does not fall within the target accuracy, a series of operations are repeatedly executed until the specified number of repetitions is reached.
  • the storage / calculation unit 24 determines that the corresponding temperature control block 1 is identified and an alarm indicating temperature control abnormality is displayed (step S26). Also in this case, the storage / calculation unit 24 displays the temperature absolute value measured for each corrected temperature control block 1 and the accuracy between wells.
  • normal operation means all operations that can be performed by the nucleic acid amplification apparatus, in addition to the apparatus operation for temperature calibration.
  • nucleic acid amplification apparatus equipped with a function for correcting temperature absolute values of a plurality of temperature control blocks 1 that can individually control the temperature.
  • the basic configuration of the nucleic acid amplification device according to this embodiment is the same as that of the nucleic acid amplification device described in Embodiment 1.
  • the two types of temperature calibration samples in this embodiment need only be separated from each other by at least 5 ° C. More preferably, a nucleic acid fragment having a melting temperature of about 60 ° C. (eg, 50 ° C. to 70 ° C.) is used as the first type of temperature calibration sample, and a melting temperature of about 90 ° C. (eg, 80 ° C.) is used as the second type of temperature calibration sample. ( ⁇ 100 ° C) nucleic acid fragment.
  • Each temperature calibration sample may measure the melting temperature separately, or two melting temperatures may be measured simultaneously by measuring the melting temperature once using a mixture of each temperature calibration sample.
  • FIG. 11 shows a processing procedure example corresponding to a temperature correction function using N (N ⁇ 2) temperature calibration samples.
  • N N ⁇ 2
  • FIG. 11 shows a processing procedure example corresponding to a temperature correction function using N (N ⁇ 2) temperature calibration samples.
  • the storage / calculation unit 24 performs confirmation processing of all N melting temperature information (step S31). This processing operation is the same as steps S1 to S4 shown in FIG. 5 except that the number of melting temperatures to be confirmed is N.
  • the temperature of the control block 1 is actually measured (step S32).
  • the storage / calculation unit 24 compares the actually measured melting temperature with the original melting temperature of the i-th temperature calibration sample (step S33). Further, the storage / calculation unit 24 displays information on the original melting temperature acquired in advance for the i-th temperature calibration sample (step S35).
  • the storage / calculation unit 24 corrects the absolute temperature value of each temperature control block 1 so that the actually measured melting temperature for each temperature control block 1 matches the original melting temperature (step S34).
  • the storage / calculation unit 24 measures the melting temperature of the i-th temperature calibration sample for each temperature control block 1 and determines whether or not the difference value between the measured melting temperature and the reference melting temperature is within the target accuracy. (Step S36).
  • the storage / calculation unit 24 displays the accuracy that each temperature control block satisfies, and proceeds to processing for the next temperature calibration sample (step S37). Specifically, the temperature absolute value measured for each temperature control block 1 after correction and the accuracy between wells are displayed.
  • step S36 when it is determined in step S36 that the temperature difference exceeds the target accuracy, the storage / calculation unit 24 compares the temperature correction count (repetition count) that has already been executed with a threshold value (step S38).
  • step S38 When there is a temperature control block 1 for which a negative result is obtained in the determination process of step S38 (that is, when the number of temperature corrections for the corresponding temperature control block has not reached a predetermined threshold), the storage / calculation unit 24 The process returns to step S32.
  • the storage / calculation unit 24 executes again the temperature absolute value correction processing based on the temperature difference between the measured melting temperature value and the original melting temperature for each temperature control block 1. If the temperature difference between the temperature control blocks does not fall within the target accuracy, a series of operations are repeatedly executed until the specified number of repetitions is reached.
  • step S38 If the accuracy between the temperature control blocks does not fall within the target accuracy even if the series of operations is repeated a specified number of times (if a positive result is obtained in step S38), the storage / calculation unit 24 selects the corresponding temperature control block 1 And an alarm indicating a temperature control abnormality is displayed (step S39).
  • step S40 the storage / calculation unit 24 determines whether or not the correction operation has been completed for all the temperature calibration samples. If a negative result is obtained, the storage / calculation unit 24 returns to step S32 and executes a correction operation for the next i + 1th temperature calibration sample. When a positive result is obtained in step S40, the series of processes is terminated.
  • Example 7 (Function block configuration of nucleic acid analyzer)
  • a nucleic acid analyzer mounting the nucleic acid amplification device according to each of the above-described embodiments will be described.
  • the nucleic acid analyzer include a genetic testing device.
  • FIG. 12 shows a specific example of the nucleic acid analyzer according to this embodiment.
  • the nucleic acid analyzer includes a preprocessing unit, a real-time fluorescence measurement mechanism 15, and a control unit (not shown).
  • the pretreatment unit includes at least a dispensing mechanism 31, a reaction container transport mechanism 32, a sample erection position 33, a nucleic acid extraction reagent erection position 34, a nucleic acid amplification reagent erection position 35, a consumables erection position 36, and a consumables disposal hole 37.
  • the reaction vessel disposal hole 38 is provided.
  • the dispensing mechanism 31 is provided with a dispensing tip for dispensing reagents and samples.
  • the apparatus configuration shown in FIG. 12 corresponds to the case where the real-time fluorescence measurement mechanism 15 having the configuration shown in FIG. 3 is incorporated. That is, it corresponds to the case of using the real-time fluorescence measurement mechanism 15 having a rotation drive system.
  • FIG. 13 shows another specific example of the nucleic acid analyzer according to this embodiment.
  • the nucleic acid analyzer shown in FIG. 13 corresponds to the case where the real-time fluorescence measuring mechanism 15 having the configuration shown in FIG. 4 is incorporated. That is, this corresponds to the case of using the real-time fluorescence measurement mechanism 15 that does not use a rotational drive system.
  • FIG. 14 shows a processing operation procedure executed by the nucleic acid analyzer shown in FIGS.
  • the same reference numerals are given to the portions corresponding to FIG. 10.
  • the user installs a temperature calibration reagent and consumables necessary for the operation of the nucleic acid analyzer at predetermined positions. Thereafter, the user inputs an instruction for temperature correction of the plurality of temperature control blocks 1 that can be individually controlled or temperature confirmation of the temperature control block 1.
  • the nucleic acid analyzer that detected the previous instruction input confirms the melting temperature of the temperature calibration reagent and stores it in the storage area (step S51).
  • the melting temperature here is taken into the nucleic acid analyzer via the network, input from a barcode attached to the container of the temperature calibration reagent, or both, or manual input by the user.
  • the dispensing mechanism 31 dispenses a predetermined amount of the temperature calibration sample installed at the reagent installation position 33 into the reaction container (step S52).
  • the predetermined amount here may be any capacity as long as it is a capacity that can be measured by the real-time fluorescence measurement mechanism 15. However, if the real-time fluorescence measurement mechanism 15 does not have a function of preventing evaporation of the reaction solution, it is preferable to add mineral oil to the upper layer of the temperature calibration sample at this stage.
  • reaction vessel is closed and conveyed to the real time fluorescence measurement mechanism 15 through the reaction vessel conveyance mechanism 32. Thereafter, the temperature correction operation according to each embodiment described above is executed (steps S22 to S26).
  • FIG. 15A shows a measurement example of melting temperature curves measured for a plurality of temperature control blocks 1 when no temperature correction is performed.
  • FIG. 15A shows a melting temperature curve when the melting temperature is measured for a mixture of two types of temperature calibration samples (for example, a sample having a low-temperature side melting temperature (60 ° C.) and a high-temperature side melting temperature (95 ° C.)). A measurement example is shown.
  • the horizontal axis represents temperature and the vertical axis represents temperature change rate.
  • a maximum temperature difference of 1.5 ° C. is observed for the low temperature side melting temperature
  • a maximum temperature difference of 1.7 ° C. is recognized for the high temperature side melting temperature.
  • FIGS. 15B and 15C when the temperature is corrected based on the melting temperature, as shown in FIGS. 15B and 15C, the temperature difference between the plurality of temperature control blocks can be controlled to 0.1 ° C. or less.
  • FIG. 15B is a melting temperature curve measured when the temperature of the plurality of temperature control blocks 1 is corrected for the low-temperature side melting temperature
  • FIG. 15C is the correction of the temperature of the plurality of temperature control blocks 1 for the high-temperature side melting temperature. It is a melting temperature curve measured in the case of.
  • each temperature control block 1 can be made equal to the melting temperature, and extremely high uniformity can be realized as compared with the conventional method.
  • a target accuracy evaluation function it is possible to automatically determine the temperature control block 1 in which the temperature control of the liquid temperature has become abnormal. If the information of the temperature control block 1 in which the temperature control abnormality is determined is stored in the system side, it is excluded from the inspection area so that the temperature control block 1 in which abnormality is recognized in the temperature control is not used in the normal inspection. It is possible to realize control that does or does not use the inspection result.
  • FIG. 16 shows a system configuration according to this embodiment.
  • a temperature calibration sample is used for temperature correction.
  • the system shown in FIG. 16 includes a network information database 100, an information management apparatus 101, a nucleic acid amplification apparatus 102, and a service information management apparatus 103.
  • temperature calibration sample information (specifically, the melting temperature of the temperature calibration sample) and temperature calibration result information of each nucleic acid amplification device 102 are stored.
  • the temperature calibration sample information is stored in the network information database 100 from the information management apparatus 101 via the network, and read out to the N nucleic acid amplification apparatuses 102 via the network.
  • the temperature calibration result information is stored in the network information database 100 from the N nucleic acid amplification devices 102 via the network, and is further read out by the information management device 101.
  • the temperature correction operation using the temperature calibration sample having the same melting temperature is executed in each nucleic acid amplification device 102, whereby the temperature absolute value among the N devices can be made uniform. Further, the information management apparatus 101 can collectively manage the temperature calibration result information of each nucleic acid amplification apparatus 102. For this reason, when an abnormality in temperature control is recognized in a certain nucleic acid amplification device 102, information regarding the nucleic acid amplification device 102 in which the abnormality is found is provided to the service information management device 103 that manages service information. Customer support is possible. Of course, the arrangement positions of the service information management apparatus 103 and the nucleic acid amplification apparatus 102 that is the service providing destination may be the same or different.
  • each of the above-described configurations, functions, processing units, processing means, and the like may be partly or entirely realized as, for example, an integrated circuit or other hardware.
  • Each of the above-described configurations, functions, and the like may be realized by the processor interpreting and executing a program that realizes each function. That is, it may be realized as software.
  • Information such as programs, tables, and files for realizing each function can be stored in a memory, a hard disk, a storage device such as an SSD (Solid State Drive), or a storage medium such as an IC card, an SD card, or a DVD.
  • control lines and information lines indicate what is considered necessary for explanation, and do not represent all control lines and information lines necessary for the product. In practice, it can be considered that almost all components are connected to each other.

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Abstract

　従来手法では、個別に温度制御可能な温度制御ブロックの温度絶対値の補正に、校正済みの温度測定プローブを用いる場合、温度制御ブロック間に最大で0.5℃の温度差が残る。これに対し、本発明は、各温度制御ブロックに対応する各反応容器に収容された温度校正試料の融解温度を、測定融解温度として測定する。そして、各温度制御ブロックに対応する測定融解温度と温度校正試料の基準融解温度とを比較し、各差分値に基づいて各温度制御ブロックの温度絶対値を補正する。

Description

核酸増幅装置及び核酸分析装置
　本発明は、個別に温度制御可能な温度制御ブロックを複数搭載する核酸増幅装置、及び当該核酸増幅装置を装置の一部に使用する核酸分析装置に関する。
　温度制御ブロックは、その温度絶対値を目標温度に正確に制御する必要がある。従来、温度制御ブロックの温度絶対値の測定には、校正済みの温度測定プローブが使用され、測定温度が目標温度と異なる場合には、測定温度が目標温度に一致するように補正する手法が採用されている。一般的に、校正済みの温度測定プローブを用いた温度補正の限界精度は、±0.25℃とされる。
　ところで、個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロックが１つの装置に搭載される場合がある。この場合も、校正済みの温度測定プローブを用いて各温度制御ブロックの温度を個別に補正すると、補正終了後の各温度制御ブロックの温度制御精度は±0.25℃となる。従って、温度制御ブロック間の温度差は、理論的には最大で0.5℃になる。
　この他、温度制御ブロックの温度補正には、熱変色性液晶を用いた試験片を使用する方法が提案されている（例えば特許文献１を参照。）。当該方法は、流体試料と接触する試験片に熱変色性液晶を混入させ、試験片を試験温度に制御した時の液晶の変色を検出することにより、試験片の温度を校正することを原理とする。
特開平１０－２０６４１１号公報 特開２０１０－５１２６５号公報 特開平０５－３１７０３０号公報 特開２０１０－１６６８２３号公報 特表２００３－５２５６２１号公報 特表２００５－５１９６４２号公報 特開２００８－２７８８９６号公報 特開平０３－１３１７６１号公報
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Feb. 2009, p. 435-440
　ところで、温度制御ブロックにより温度管理を行う反応には、特に精密な温度制御が必要となるものがある。例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR：Polymerase Chain Reaction）や高解像度融解（HRM：High Resolution Melting）解析に伴う反応である。
　ＰＣＲ法とは、(1) 95℃の熱変性温度、(2) およそ55℃～65℃程度のアニーリング温度、(3) 伸長反応温度を交互にｎ回繰り返す（以下、「温度サイクル」という。）ことにより、標的とする核酸配列を２ｎ倍に増幅する核酸増幅方法である。
　アニーリング温度及び伸長反応温度は標的配列により異なり、当該温度の要求精度は、一般には±0.5℃以内とされている。ただし、温度の正確性と再現性が高いほど、ＤＮＡの増幅効率と増幅再現性が向上する。
　この増幅効率と増幅再現性は、リアルタイムＰＣＲ法の定量精度に影響する重要な因子である。因みに、リアルタイムＰＣＲ法とは、蛍光色素の使用により、ＰＣＲによる増幅をリアルタイムに測定し、その増幅率（サイクル回数）から反応液中の核酸量を定量する方法をいう。
　従来、リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡの定量には、１つの温度制御ブロックで温度管理する空間内に複数の反応容器（ウェル）を配置する方式のリアルタイムＰＣＲ装置が用いられている。このように、複数の反応容器（ウェル）が１つの温度制御ブロックで温度管理される場合、複数の反応容器（ウェル）間の温度差は±0.2℃以下に抑えることができる。
　近年、複数の温度制御ブロックを有するリアルタイムＰＣＲ装置が提案されている。このリアルタイムＰＣＲ装置は、複数の温度制御ブロックを個別に温度制御することができ、複数の温度サイクルを同時に実行することができる。勿論、この種の装置においても、複数の反応容器（ウェル）の間に、１つの温度制御ブロックのみを用いる場合と同等レベルの温度制御精度が求められる。
　一方、ＨＲＭ解析とは、リアルタイムＰＣＲ法により増幅した増幅産物の温度を、約60℃から95℃の範囲内で、0.1℃以下の分解能で蛍光測定し、増幅産物の融解温度（増幅した２本鎖核酸の２本鎖結合が融解する温度）を決定する解析法である。
　当該融解温度は増幅配列毎に異なるものであり、理論的には１塩基の違いでも異なることが知られている。この解析法により、複数の異なる配列が混ざった増幅反応液から配列毎に核酸を分離して検出することができる。
　ところで、複数の反応容器（ウェル）に設置したサンプル群の融解温度の差を比較する目的においては、反応容器（ウェル）間の温度再現性は高いほど良く、当該解析法に要求される反応ウェル間の温度再現性は±0.1℃以下である。
　現在、リアルタイムＰＣＲ装置の臨床検査への応用が始まっている。例えば複数の温度制御ブロックを用いてリアルタイムＰＣＲを実行する全自動臨床検査装置がある。当該装置においては、複数の温度制御ブロック間における温度絶対値の差が分析性能に影響する。このため、複数の温度制御ブロックの間にも、反応容器（ウェル）間の温度制御精度と同等レベルの温度制御精度が要求される。
　しかし、校正済みの温度測定プローブを用いる従来の温度補正方法は、最大で0.5℃の温度差が残り、前述した要求を満たすことが困難である。
　発明者らは、当該技術課題の解決を鋭意検討するにあたり、以下の測定を行った。まず、ＰＣＲ法により増幅した１種類の核酸断片を同じ容器に纏めて良く混合し、その後、その混合液を、図１Ａに示すように、９６個の反応容器（ウェル）に分注した。次に、反応容器（ウェル）間の温度均一性が0.05℃以下のリアルタイムＰＣＲ装置を用いて核酸断片をＨＲＭ解析して融解温度を測定した。すると、図１Ｂに示すように、ＰＣＲで増幅した核酸断片の融解温度のバラツキは非常に少なく、バラツキを±0.05℃以下に収まっていることを発明者らは発見した。
　発明者らは、この発見を利用し、個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロックと、各温度制御ブロックによって温度管理される反応容器内の試料をリアルタイムで蛍光測定するリアルタイム蛍光測定部と、各温度制御ブロックで温度管理される１つ又は複数の反応容器に分注された温度校正試料の基準融解温度を記憶する記憶部と、各温度制御ブロックに対応する各反応容器に収容された温度校正試料の融解温度を測定融解温度として測定する融解温度測定部と、各温度制御ブロックに対応する測定融解温度と前記基準融解温度とを比較し、各差分値に基づいて各温度制御ブロックの温度絶対値を補正する温度補正部とを核酸増幅装置に搭載する。また、当該構成の核酸増幅装置を核酸分析装置に実装する。
　本発明によれば、個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロック間における温度均一性を、温度制御分解能と同等精度で実現することができる。
　上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
反応容器（ウェル）への温度校正試料の分注例を示す図。 反応容器（ウェル）間における融解温度の測定誤差の分布を説明する図。 リアルタイム蛍光測定機構を組み込んだ核酸増幅装置の機能ブロック構成を示す図。 リアルタイム蛍光測定機構を組み込んだ核酸増幅装置の一形態例を示す図。 リアルタイム蛍光測定機構を組み込んだ核酸増幅装置の一形態例を示す図。 温度校正試料の融解温度情報を確認する手順を説明する図。 温度補正動作を説明する図。 温度補正を実行しない場合の測定結果を示す図（補正前）。 融解温度を基準に各温度制御ブロックの温度絶対値を補正した場合の測定結果を示す図。 校正済みの温度測定プローブを用いて各温度制御ブロックの温度絶対値を補正した場合の測定結果を示す図（従来例）。 温度補正を実行しない場合の測定結果を示す図（補正前）。 融解温度を基準に各温度制御ブロックの温度絶対値を補正した場合の測定結果を示す図。 各温度制御ブロックに固有の温度特性を説明する図。 補正後の温度の精度を評価する機能を有する温度補正動作を説明する図。 複数の温度校正試料を使用する温度補正動作を説明する図。 リアルタイム蛍光測定機構を組み込んだ自動分析装置の構成例を示す図。 リアルタイム蛍光測定機構を組み込んだ自動分析装置の構成例を示す図。 核酸分析装置の処理動作を説明する図。 温度補正を実行しない場合の測定結果を示す図（補正前）。 低温側の融解温度を基準に各温度制御ブロックの温度絶対値を補正した場合の測定結果を示す図。 高温側の融解温度を基準に各温度制御ブロックの温度絶対値を補正した場合の測定結果を示す図。 ネットワークシステム構成を説明する図。
　以下、図面に基づいて、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明の実施態様は、後述する形態例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。
　＜形態例１＞
　（核酸増幅装置の機能ブロック構成）
　図２に、形態例に係る核酸増幅装置の機能ブロック構成を示す。図２に示す核酸増幅装置は、個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロック１と、リアルタイム蛍光測定部３と、それらを制御する制御部５で構成される。本明細書では、個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロック１とリアルタイム蛍光測定部３を含む機構部分をリアルタイム蛍光測定機構１５と呼ぶ。
　ここで、温度制御ブロック１の基体は熱伝導性に優れた材料により形成され、当該基体に形成された保持機構に反応容器を収容する。基体には、温度センサや熱源も配置される。基体には、例えば銅、アルミニウム、各種の合金を使用する。また、温度センサには、サーミスタ、熱電対、測温抵抗体等を使用する。温度センサは、反応容器内の試料の温度を測定するため、反応容器の保持機構の近傍に配置される。
　熱源には、例えばペルチェ素子を使用する。ペルチェ素子は熱電素子であり、基体の加熱又は冷却に使用される。なお、望ましい構成においては、基体上に放熱フィンを配置する。もっとも、温度制御が可能であれば、温度制御ブロック１に熱源が搭載されている必要は無い。例えば空気の温度を変えて温度制御ブロック１の温度を制御するエアーインキュベーター方式を採用しても良い。
　複数の温度制御ブロック１は、プラスチック等の断熱性に優れた材料で構成された台座上に配置される。従って、１つの温度制御ブロック１から他の温度制御ブロック１への温度の伝播を無視することができる。すなわち、複数の温度制御ブロック間における温度の相互干渉を無視することができる。
　リアルタイム蛍光測定部３は、各温度制御ブロック１によって温度管理される反応容器内の試料をリアルタイムで蛍光測定する。もちろん、試料は蛍光標識されている。リアルタイム蛍光測定部３は、反応容器に照射する励起光を発生する励起光源と、励起光が照射された試料から発生される蛍光を測定する蛍光検出器で構成される。ここで、励起光源には、例えば発光ダイオード（ＬＥＤ）、半導体レーザー、キセノンランプ、ハロゲンランプ等が用いられる。また、蛍光検出器には、例えばフォトダイオード、フォトマルチプライヤー、ＣＣＤ等が用いられる。
　各温度制御ブロック１の温度制御、リアルタイム蛍光測定部３の測定データの処理等は制御部５が実行する。この形態例の場合、制御部５は、各温度制御ブロック１の温度補正時に使用する温度校正試料の融解温度を記憶部１１に記憶する。ここでの融解温度（以下「基準融解温度」ともいう。）は、後述するように、様々な経路で制御部５に取り込まれる。
　制御部５は、各温度制御ブロック１の温度補正時に使用する機能として、融解温度測定部７と温度補正部９を有している。
　融解温度測定部７は、各温度制御ブロック１に対応する各反応容器に収容された温度校正試料の融解温度をそれぞれ測定する。融解温度の測定は、リアルタイム蛍光測定部３が温度校正試料の融解を検出した際の温度センサの測定温度（以下「測定融解温度」ともいう。）として決定される。測定融解温度は、融解温度測定部７から温度補正部９に与えられる。
　温度補正部９は、測定融解温度と記憶部１１に記憶されている基準融解温度と比較し、その差分がなくなるように、各温度制御ブロック１の温度絶対値を補正する。各温度制御ブロック１について検出される測定融解温度と基準融解温度の差分が、当該温度制御ブロック１の温度制御精度を与える。
　（装置構成の具体例１）
　図３に、１種類の温度校正試料を使用して複数の温度制御ブロック１の温度絶対値を補正する核酸増幅装置の具体例を示す。図３に示す装置構成は、図２に示した装置構成をより詳細に表したものである。
　本形態例の場合、個別に温度制御可能な４つの温度制御ブロック１が、円板形状に形成された回転盤２２の外縁部に沿って配置されている。ここでの回転盤２２が、形態例１の台座に対応する。回転盤２２は、断熱性に優れた材料で構成されている。従って、複数の温度制御ブロック間での温度の相互干渉は無視することができる。
　回転盤２２は、不図示の回転軸に対して固定されており、矢印で示すように、時計方向にも反時計方向にも自由に回転することができる。回転軸は、不図示のステッピングモータにより回転駆動される。
　温度制御ブロック１には、１つ又は複数の反応容器２１が着脱可能に収容又は架設される。反応容器２１は、蛍光波長帯域の光に対して透明な部材で構成されており、その底部が回転盤２２の裏面側から露出するように取り付けられている。
　リアルタイム蛍光測定部３は回転盤２２の裏面側に配置され、励起光源から発生された励起光を反応容器２１の底部に照射する。また、リアルタイム蛍光測定部３は、励起光が照射された反応容器２１内の試料で発生する蛍光を蛍光検出器で検出し、その蛍光強度を蛍光測定データとしてデータ処理部２３に出力する。なお、図３の場合、リアルタイム蛍光測定部３は２つである。従って、同時に２つの反応容器２１をリアルタイム蛍光測定できる。
　データ処理部２３は、蛍光検出器から逐次入力される蛍光測定データと温度センサで測定された温度データをデータ処理し、記憶・演算部２４に出力する。
　記憶・演算部２４は、例えば汎用型のコンピュータで構成され、各温度ブロック１の融解温度を解析する解析処理と、補正値を算出する演算処理とを実行する。ここで、記憶・演算部２４は、蛍光測定データから温度校正試料の融解が検出された時点の測定温度を測定融解温度とする。また、記憶・演算部２４は、測定融解温度と基準融解温度の差分値に基づいて温度絶対値の補正値を算出する。なお、温度制御ブロック１の測定温度は、装置制御部２５にも与えられる。基準融解温度は、記憶・演算部２４に予め記憶されている。
　装置制御部２５は、リアルタイム蛍光検出に必要な温度変化が得られるように各温度制御ブロック１を目標温度に制御する。具体的には、温度制御ブロック１に搭載された熱源の発熱量を制御する。この際、装置制御部２５は、温度制御ブロック１に搭載された温度センサから測定温度を取得し、測定温度が目標温度に一致するようにフィードバック制御する。ここでの測定温度は、前述したように記憶・演算部２４にも与えられる。
　なお、装置制御部２５は、リアルタイム蛍光検出の際に、反応容器２１の温度を少なくとも50℃から95℃の範囲で変化させる。図３におけるデータ処理部２３、記憶・演算部２４及び装置制御部２５が、図２の制御部５に対応する。図３では、データ処理部２３、記憶・演算部２４及び装置制御部２５をそれぞれ独立した装置として表しているが、１つの装置として構成しても良い。
　前述の説明では、温度制御ブロック１は回転盤２２の外縁部に搭載されており、回転盤２２が回転して温度制御ブロック１がリアルタイム蛍光測定部３の前を通過する際に蛍光が検出される場合について説明した。
　しかし、温度制御ブロック１が搭載される台座側を固定し、リアルタイム蛍光測定部３の側を回転又は移動させる構成としても良い。この場合は、リアルタイム蛍光測定部３が温度制御ブロック１と対向する位置を通過するときに蛍光の検出が実行される。
　（装置構成の具体例２）
　図４に、１種類の温度校正試料を使用して温度制御ブロック１の温度を補正する核酸増幅装置の他の装置構成例を示す。図４に示す装置構成も、図２に示した装置構成をより詳細に表したものである。
　図３に示す装置構成の場合には、温度制御ブロック１の数に対してリアルタイム蛍光測定部３の数が少なかった。このため、温度制御ブロック１を載置する台座及びリアルタイム蛍光測定部３のいずれか一方を固定し、他方を回転制御する構成を採用した。
　しかし、温度制御ブロック１とリアルタイム蛍光測定部３が一対一に対応し、これらを複数備える場合には、図４に示す装置構成が可能となる。なお、図４の場合、温度制御ブロック１には、複数の反応容器２１がマトリクス状に配列された反応プレート２６が載置された例を表している。
　（反応容器）
　本形態例の場合、反応容器２１や反応プレート２６は蛍光波長を透過でき、かつ、温度制御ブロック１の熱を伝導可能な材質であれば、いかなる材質や形状でも良い。より好ましくは、DNase、RNaseが混入していないＰＣＲチューブ（グライナー社、ドイツ）又は９６穴のＰＣＲプレートを用いることが望ましい。
　（温度校正試料）
　本形態例における温度校正試料は、ＨＲＭ解析が可能な核酸断片と検出色素が含まれていれば良い。核酸断片には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡを利用することができる。より好ましくは、任意の１種類の核酸断片をＰＣＲ法で増幅した試料を用いる。さらに好ましくは、水溶液の絶対温度と融解温度の一致を確認した核酸断片を用いる。
　後述する形態例のように２種類の核酸断片を用いる場合にも、ＨＲＭ解析が可能な２種類の核酸断片と検出色素が含まれていれば良い。より好ましくは、２種類の核酸断片をそれぞれ個別にＰＣＲで増幅した増幅産物を用いる。
　なお、温度校正試料は、好ましくは外壁にバーコードが貼付された容器に収容されていることが望ましい。ここで、バーコードの情報には、少なくとも温度校正試料の融解温度情報が含まれることが望ましい。温度校正試料が分注済みのプレート型の反応容器（すなわち、反応プレート２６）を用いる場合には、反応プレート２６自体にバーコードを貼付すれば良い。勿論、バーコードの情報には、少なくとも温度校正試料の融解温度情報が含まれることが望ましい。
　（温度絶対値の補正動作の概要）
　本形態例に係る核酸増幅装置は、以下に示す３つの処理工程を通じ、複数の温度制御ブロック間に存在する温度絶対値のバラツキを補正する。
　（工程１）
　ＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅した所定の融解温度を有する核酸断片を含む試料を、温度校正試料として複数の反応容器に分注する。その後、この反応容器を、温度校正する核酸増幅装置内の複数の温度制御ブロック１の保持機構に設置又は架設する。または、複数の温度制御ブロック１の保持機構に予め設置又は架設された反応容器内に、温度校正試料を分注する。
　（工程２）
　次に、温度校正試料の融解温度を、温度制御ブロック１毎に実際に測定する。ここでの融解温度の測定には、公知の方法を適用する。例えば低温（例えば60℃）から高温（例えば95℃）まで、温度制御ブロック１の温度を変化させながら、リアルタイムで蛍光強度を測定する。このとき、核酸増幅装置に要求される温度精度と同等以上の温度分解能で温度を変化させ、蛍光強度を測定する。例えば核酸増幅装置に要求される温度精度が ±0.1℃以下の場合、 0.1℃刻み以下で目標温度を可変し、融解温度を蛍光測定する。
　（工程３）
　融解温度の測定が終了すると、融解温度の測定値が、記憶部１１に記憶されている融解温度に一致するように、制御部５は、各温度制御ブロック１について管理する温度絶対値を補正する。なお、融解温度の測定には、測定誤差が生じる可能性がある。従って、より好ましい実施の形態では、工程２と工程３を２回以上繰り返し、温度制御ブロック間の温度均一性を高めることが望ましい。
　（補正動作の詳細）
　図５に、温度補正に先立って実行される融解温度情報の確認処理手順を示す。ここでは、記憶・演算部２４が当該処理を実行するものとして説明する。もっとも、核酸増幅装置を構成する他の制御部や核酸増幅装置に接続される外部の制御部を用いて実行しても良い。
　まず、記憶・演算部２４は、ネットワーク経由により、温度校正試料の融解温度情報の入手を試みる（ステップＳ１）。入手が可能であれば、融解温度情報をネットワーク経由で読み出し、所定の記憶領域に記憶する（ステップＳ２）。ここでのネットワークには、ＬＡＮの他、インターネットも含まれる。
　これに対し、ネットワーク上に該当する情報がない場合又は記憶・演算部２４がネットワークに接続していない場合、記憶・演算部２４は融解温度情報の入力をユーザに要求する（ステップＳ３）。この場合、ユーザは、キーボード入力の他、バーコード入力等を用いて融解温度を入力する。記憶・演算部２４は入力された融解温度情報を所定の記憶領域に記憶する（ステップＳ４）。
　図６に、融解温度情報の確認処理（図５）を含む温度補正動作の全体を示す。なお、以下の説明では、記憶・演算部２４が一連の処理を実行するものとして説明するが、核酸増幅装置を構成する他の制御部又は核酸増幅装置と接続される外部の制御部が一連の処理を実行しても良い。
　核酸増幅装置の温度校正が開始されると、記憶・演算部２４は、温度校正試料の融解温度情報を確認する（ステップＳ１１）。ここでは、図５に示す処理動作が実行される。
　次に、記憶・演算部２４は、架設された温度校正試料の融解温度を測定する（ステップＳ１２）。具体的には、温度制御ブロック１の温度を低温（例えば60℃）から高温（例えば95℃）まで、所定の温度刻みで変化させ、その際の温度校正試料から発せられる蛍光強度をリアルタイムで測定する。記憶・演算部２４は、蛍光強度から試料の融解を検出すると、その時の測定温度を測定融解温度として所定の記憶領域に記憶する。
　次に、記憶・演算部２４は、予め確認された基準融解温度と、各温度制御ブロック１の測定融解温度とを比較する（ステップＳ１３）。この際、記憶・演算部２４は、予め確認された基準融解温度と各温度制御ブロック１の測定融解温度との差分値を算出する。
　記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１について算出された差分値を用い、各温度制御ブロック１の測定融解温度が温度校正試料の基準融解温度になるように、各温度制御ブロックの温度絶対値を補正する（ステップＳ１４）。
　以下では、 0.1℃以下の分解能で温度設定が可能な温度制御ブロック１と、融解温度が87.3℃の温度校正試料とを用いる場合について、 0.1℃以下の分解能で融解温度を測定することで得られる融解温度曲線を説明する。
　本形態例の場合、各反応容器に収容された試料の融解温度は、減衰率（単位時間当たりの蛍光強度の減少量）が最も大きい蛍光強度値（0.2）における温度として決定する。ただし、融解温度の決定方法は、この方法に限定されるものでなく、例えば非特許文献１に示される解析方法を用いることもできる。
　図７Ａに、温度補正を全く実行しない場合に、複数の温度制御ブロック１について測定される融解温度曲線の測定例を示す。この例の場合、複数の温度制御ブロック間の最大温度差は 1.7℃であった。なお、図７Ａでは、横軸を温度とし、縦軸を蛍光強度として測定値をプロットして示している。図７Ｂ、図７Ｃも同様である。
　図７Ｂに、融解温度87.3℃を基準として各温度制御ブロック１の温度絶対値を補正した場合に、複数の温度制御ブロック１について測定される融解温度曲線の測定例を示す。この例の場合、複数の温度制御ブロック間の最大温度差は0.1℃以下に収束していることが分かる。
　参考までに、校正済みの温度プローブを用いる従来の温度設定方法を用いた場合に複数の温度制御ブロック１について測定される融解温度曲線の測定例を図７Ｃに示す。この例の場合、複数の温度制御ブロック間の最大温度差は0.53℃である。
　（まとめ）
　以上のように、本形態例に係る核酸増幅装置には、温度校正試料を用いて温度制御ブロック１の温度絶対値を補正する機能を搭載する。このため、本形態例に係る核酸増幅装置によれば、複数の温度制御ブロック間の最大温度差を個々の温度制御ブロック１の温度制御分解能と同等精度に均一化することができる。例えば、図１Ｂに示したように、複数の温度制御ブロック間の最大温度差を±0.05℃以下に均一化することができる。すなわち、温度制御ブロック間の温度差を各温度制御ブロックにおける温度制御分解能と同等程度に補正できる。このため、複数の温度制御ブロックを用いて核酸増幅を行う場合にも、温度制御ブロックの違いが分析精度に与える影響を無視することができる。
　＜形態例２＞
　前述した形態例の場合には、蛍光強度が急激に変化する変化率の大きい部分（蛍光強度の減衰率が最も大きい部分（図７Ｂの場合、蛍光強度値が0.2））を融解温度に決定した。
　しかし、その他の手法を用いて融解温度を決定しても良い。例えば図８Ａ及び図８Ｂに示すように、横軸に温度、縦軸に蛍光強度の変化率をプロットして示す測定曲線を用いて融解温度を決定しても良い。具体的には、蛍光強度の変化が最も大きい温度を融解温度として決定しても良い。この場合、融解温度をより明確に特定することができる。因みに、図８Ａは図７Ａに対応する図であり、図８Ｂは図７Ｂに対応する。勿論、融解温度の検出は、記憶・演算部２４が実行する。
　＜形態例３＞
　前述の形態例においては、測定された蛍光強度の減衰率が最も大きい温度又は蛍光強度の変化率の最も大きい温度を「融解温度」として使用した。
　しかし、融解温度の決定方法は、融解温度を決定することができ、かつ、温度校正試料の融解温度を決定する際に用いた方法と同じであれば、どのような決定方法を用いても良い。すなわち、温度校正試料の測定曲線からの融解温度を決定する方法に限定するものではない。
　＜形態例４＞
　前述の形態例においては、融解温度が１つの温度校正試料を用いる温度校正方法について説明した。融解温度が１つの温度校正試料でも、各温度制御ブロック１の温度特性が無視できる程度に同じであれば、融解温度以外の温度についても温度制御ブロック１の最大温度差を±0.05℃以下に均一化することができる。
　しかしながら、個々の温度制御ブロック１は一般に固有の温度特性を有している。従って、本形態例では以下に示す手法の採用により、個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロック１を任意の温度に制御する場合にも複数の温度制御ブロック間の温度絶対値を均一化する。
　具体的には、各温度制御ブロック１が有する温度特性を事前に測定して記憶・演算部２４に記憶し、融解温度以外の温度に温度を制御する場合には、当該温度特性と融解温度での制御誤差とに基づいて各温度制御ブロック１の温度を制御する。ここで、温度特性の測定は、核酸増幅に使用する温度範囲について行えば良い。例えば目標温度を50℃前後から 100℃前後まで行えば良い。
　図９に、実測される温度特性の一例を示す。図９は、各温度制御ブロック１の目標温度を１℃刻みで可変した場合に温度センサで測定された温度制御ブロック１の測定温度の関係を示している。図９の縦軸が測定温度であり、横軸が目標温度である。図９の場合、各温度制御ブロック１に固有の温度特性は、直線の傾きと切片で規定することができる。
　このように、各温度制御ブロック１に固有の温度特性を測定して記憶領域に記憶しておき、融解温度についての目標温度と測定温度の誤差を補正することにより、個々の温度制御ブロック１を任意の温度に正確に制御することができる。すなわち、融解温度以外の任意の温度について、複数の温度制御ブロックの間で温度絶対値を均一化することができる。
　なお、温度特性の測定は、融解温度についての温度補正の後に実行しても良い。この場合、任意の目標温度と測定温度の関係が測定される。従って、測定された温度特性をそのまま用いることにより、各温度制御ブロック１を任意の温度絶対値に制御することができる。
　＜形態例５＞
　ここでは、補正後の温度の精度を評価する機能を有する温度補正機能について説明する。理想的には、前述した温度補正が終了すると、温度制御ブロック１の測定融解温度は基準融解温度に一致するはずである（厳密には、差分が温度制御分解能と同レベル以下となるはずである）。ただし、デバイスの故障等のため、温度補正後も誤差が残る可能性がある。そこで、以下に説明する温度補正機能を提案する。
　図１０に、当該温度補正機能に対応する処理手順例を示す。まず、記憶・演算部２４は、前述した基準融解温度の確認処理を実行する（ステップＳ２１）。この処理動作は、図５に示すステップＳ１～Ｓ４と同じである。
　次に、記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１の温度補正を実行する（ステップＳ２２）。この処理動作は、図６に示すステップＳ１２～Ｓ１４と同じである。具体的には、温度制御ブロック１の目標温度を50℃前後から100℃前後まで可変し、融解温度の測定と温度絶対値の補正を行う。
　ステップＳ２２に示す温度補正が終了すると、記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１について温度校正試料の融解温度を再測定する。この動作は自動的に実行される。ここで、記憶・演算部２４は、測定融解温度と基準融解温度との温度差が目標精度内に入っているか否か（判定閾値以下か否か）判定する（ステップＳ２３）。目標精度を与える閾値は、ユーザが事前に設定しても良いし、初期値として割り当てられていても良い。
　目標精度に入っていると判定された場合、記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１が満たす精度を表示して補正動作を終了する（ステップＳ２４）。精度の表示時には、補正後の各温度制御ブロック１について測定された温度絶対値、ウェル間精度も表示される。
　これに対し、ステップＳ２３で温度差が目標精度を超えると判定された場合、記憶・演算部２４は、既に実行された温度補正回数（繰り返し回数）と閾値とを比較する（ステップＳ２５）。ここでの閾値は、融解温度の測定と各温度制御ブロック１の温度絶対値の補正回数の上限値を与える。閾値は、ユーザが事前に設定しても良いし、初期値として割当てられていても良い。
　ステップＳ２５の判定処理において否定結果が得られた温度制御ブロック１が存在する場合（すなわち、該当する温度制御ブロックに対する温度補正回数が所定の閾値に達していない場合）、記憶・演算部２４は、ステップＳ２２に戻る。
　記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１について、融解温度の測定値と本来の融解温度との温度差に基づいた温度絶対値の補正処理を実行する。目標精度内に入らない温度制御ブロックがある場合、規定の繰り返し回数に達するまで、一連の動作が繰り返し実行される。
　一連の動作を規定回数だけ繰り返しても、温度制御ブロックの温度制御精度が目標精度内に入らない場合（ステップＳ２５で肯定結果が得られる場合）、記憶・演算部２４は、該当する温度制御ブロック１を特定し、温度制御異常を意味するアラームを表示する（ステップＳ２６）。この場合も、記憶・演算部２４は、補正後の各温度制御ブロック１について測定された温度絶対値と、ウェル間精度も表示する。
　より好ましい形態例では、補正動作後に実行される通常動作時においても、目標精度に入らない温度制御ブロックに対しては、温度制御異常を意味するアラームを常に表示し続けるものとする。ここで、「通常動作」とは、温度校正のための装置動作の他に、核酸増幅装置が実行可能な全ての動作を意味する。また、より好ましい形態例においては、温度制御異常が検出された温度制御ブロックについては、通常動作の使用対象から自動的に除去するよう制御することが望ましい。
　＜形態例６＞
　前述の形態例の場合には、１種類の温度校正試料の使用を前提とする温度補正機能を搭載する核酸増幅装置について説明した。
　ここでは、２種類の温度校正試料の使用を前提として、それぞれ個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロック１の温度絶対値の補正機能を搭載する核酸増幅装置について説明する。本形態例に係る核酸増幅装置の基本構成は、形態例１で説明した核酸増幅装置と同じである。
　なお、本形態例における２種類の温度校正試料とは、各融解温度が少なくとも5℃以上離れていれば良いものとする。より好ましくは、１種類目の温度校正試料として融解温度が60℃前後（例えば50℃～70℃）の核酸断片を用い、２種類目の温度校正試料として融解温度が90℃前後（例えば80℃～100℃）の核酸断片を用いる。各温度校正試料は別々に融解温度を測定しても良いし、各温度校正試料の混合液を用いて、１回の融解温度の測定により２つの融解温度を同時に測定しても良い。
　図１１に、Ｎ個（Ｎ≧２）の温度校正試料を使用した温度補正機能に対応する処理手順例を示す。なお、個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロック１が異なる温度特性を有することを考慮し、図１１の場合には、温度校正試料毎に最適な補正値の決定と校正を繰り返す場合について説明する。
　まず、記憶・演算部２４は、Ｎ個全ての融解温度情報の確認処理を実行する（ステップＳ３１）。この処理動作は、確認する融解温度の個数がＮ個である以外は、図５に示すステップＳ１～Ｓ４と同じである。
　次に、記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１の目標温度を可変制御し、第ｉ温度校正試料（ただし、ｉ＝１、２、…Ｎ）の融解温度が検出された時点の温度制御ブロック１の温度を実測する（ステップＳ３２）。
　次に、記憶・演算部２４は、実測された融解温度と第ｉ温度校正試料の本来の融解温度とを比較する（ステップＳ３３）。また、記憶・演算部２４は、第ｉ温度校正試料について事前に取得された本来の融解温度の情報を表示する（ステップＳ３５）。
　この後、記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１について実測された融解温度が本来の融解温度に一致するように、各温度制御ブロック１の温度絶対値を補正する（ステップＳ３４）。
　次に、記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１について第ｉ温度校正試料の融解温度を測定し、当該測定融解温度と基準融解温度との差分値が目標精度以内か否かを判定する（ステップＳ３６）。
　目標精度に入っていると判定された場合、記憶・演算部２４は、各温度制御ブロックが満たす精度を表示し、次の温度校正試料に対する処理に移行する（ステップＳ３７）。具体的には、補正後の各温度制御ブロック１について測定された温度絶対値とウェル間精度が表示される。
　これに対し、ステップＳ３６で温度差が目標精度を超えると判定された場合、記憶・演算部２４は、既に実行された温度補正回数（繰り返し回数）と閾値とを比較する（ステップＳ３８）。
　ステップＳ３８の判定処理において否定結果が得られた温度制御ブロック１が存在する場合（すなわち、該当する温度制御ブロックに対する温度補正回数が所定の閾値に達していない場合）、記憶・演算部２４は、ステップＳ３２に戻る。
　この後、記憶・演算部２４は、各温度制御ブロック１について、融解温度の測定値と本来の融解温度との温度差に基づいた温度絶対値の補正処理を再度実行する。温度制御ブロック間の温度差が目標精度内に入らない場合、規定の繰り返し回数に達するまで、一連の動作を繰り返し実行する。
　一連の動作を規定回数だけ繰り返しても、温度制御ブロック間の精度が目標精度内に入らない場合（ステップＳ３８で肯定結果が得られる場合）、記憶・演算部２４は、該当する温度制御ブロック１を特定し、温度制御異常を意味するアラームを表示する（ステップＳ３９）。
　ステップＳ３７又はステップＳ３９の後、記憶・演算部２４は、全ての温度校正試料についての補正動作が終了したか否かを判定する（ステップＳ４０）。否定結果が得られた場合、記憶・演算部２４はステップＳ３２に戻り、次の第ｉ＋１温度校正試料についての補正動作を実行する。そして、ステップＳ４０で肯定結果が得られた場合に、一連の処理を終了する。
　＜形態例７＞
　（核酸分析装置の機能ブロック構成）
　ここでは、前述した各形態例に係る核酸増幅装置を実装する核酸分析装置について説明する。核酸分析装置には、例えば遺伝子検査装置がある。
　（装置構成の具体例１）
　図１２に、本形態例に係る核酸分析装置の具体例を示す。核酸分析装置は、前処理部と、リアルタイム蛍光測定機構１５と、不図示の制御部とを有している。ここでの前処理部は、少なくとも分注機構３１、反応容器搬送機構３２、試料架設ポジション３３、核酸抽出試薬架設ポジション３４、核酸増幅試薬架設ポジション３５、消耗品架設ポジション３６、消耗品廃棄穴３７、反応容器廃棄穴３８を有している。なお、分注機構３１には、試薬や試料を分注する分注チップが取り付けられている。図１２に示す装置構成は、図３に示す構成のリアルタイム蛍光測定機構１５を組み込む場合に対応する。すなわち、回転駆動系を有するリアルタイム蛍光測定機構１５を使用する場合に対応する。
　（装置構成の具体例２）
　図１３に、本形態例に係る核酸分析装置の他の具体例を示す。図１３に示す核酸分析装置は、図４に示す構成のリアルタイム蛍光測定機構１５を組み込む場合に対応する。すなわち、回転駆動系を用いないリアルタイム蛍光測定機構１５を使用する場合に対応する。
　（処理動作）
　図１４に、図１２及び図１３に示す核酸分析装置で実行される処理動作手順を示す。なお、図１４には、図１０との対応部分に同一符号を付して示している。
　まず、ユーザが、核酸分析装置の動作に必要な温度校正試薬と消耗品を所定位置に架設する。この後、ユーザは、個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロック１の温度補正又は温度制御ブロック１の温度確認を指示入力する。
　先の指示入力を検出した核酸分析装置は温度校正試薬の融解温度を確認し、記憶領域に記憶する（ステップＳ５１）。ここでの融解温度は、ネットワーク経由、温度校正試薬の容器に添付されたバーコードからの入力、その両方、又はユーザによる手入力を通じて核酸分析装置内に取り込まれる。
　次に、分注機構３１が試薬架設ポジション３３に架設された温度校正試料を反応容器に所定量だけ分注する（ステップＳ５２）。ここでの所定量は、リアルタイム蛍光測定機構１５で測定可能な容量であれば、いかなる容量でも良い。ただし、リアルタイム蛍光測定機構１５に反応液の蒸発防止機能がない場合には、この段階で、温度校正試料の上層にミネラルオイルを添加することが好ましい。
　この後、反応容器は閉栓され、反応容器搬送機構３２を通じてアルタイム蛍光測定機構１５に搬送される。この後、前述した各形態例に係る温度補正動作が実行される（ステップＳ２２～Ｓ２６）。
　図１５Ａに、温度補正を全く実行しない場合に、複数の温度制御ブロック１について測定される融解温度曲線の測定例を示す。なお、図１５Ａは、２種類の温度校正試料（例えば低温側融解温度（60℃）と高温側融解温度（95℃）を有する試料）の混合液について融解温度を測定する場合の融解温度曲線の測定例を示す。なお、図１５Ａは、横軸を温度とし、縦軸を温度変化率として表している。図に示すように、温度補正を行わない場合、低温側融解温度について最大 1.5℃の温度差が認められ、高温側融解温度について最大1.7℃の温度差が認められる。
　一方、融解温度を基準に温度補正すると、図１５Ｂ及び図１５Ｃに示すように、複数の温度制御ブロック間の温度差はいずれも0.1℃以下に制御することができる。因みに、図１５Ｂは低温側融解温度について複数の温度制御ブロック１の温度を補正した場合に測定される融解温度曲線であり、図１５Ｃは高温側融解温度について複数の温度制御ブロック１の温度を補正した場合に測定される融解温度曲線である。
　いずれの場合にも、各温度制御ブロック１の温度絶対値を融解温度に揃えることができ、従来手法に比べても非常に高い均一性を実現することができる。また、目標精度の評価機能を搭載することにより、液温の温度制御が異常になった温度制御ブロック１を自動的に判別することができる。この温度制御異常が判別された温度制御ブロック１の情報をシステム側に記憶しておけば、通常検査の際に、温度制御に異常が認められる温度制御ブロック１が使用されないように検査領域から除外する又は検査結果を不使用とする制御を実現できる。
　＜形態例８＞
　前述した形態例の説明では、単一の核酸増幅装置又は核酸分析装置内で複数の温度制御ブロック間の温度絶対値を均一化する場合について説明した。
　ここでは、複数の核酸増幅装置又は核酸分析装置間での温度絶対値の均一化を図る場合に好適なシステム構成について説明する。
　図１６に、本形態例に係るシステム構成を示す。勿論、この形態例の場合にも温度補正には、温度校正試料を使用する。図１６に示すシステムは、ネットワーク情報データベース１００、情報管理装置１０１、核酸増幅装置１０２、サービス情報管理装置１０３で構成される。
　ネットワーク情報データベース１００には、温度校正試料情報（具体的には温度校正試料の融解温度）と各核酸増幅装置１０２の温度校正結果情報が格納される。温度校正試料情報は、情報管理装置１０１からネットワーク情報データベース１００にネットワーク経由で格納され、Ｎ個の核酸増幅装置１０２にネットワーク経由で読み出される。一方、温度校正結果情報は、Ｎ個の核酸増幅装置１０２からネットワーク経由でネットワーク情報データベース１００に格納され、更に情報管理装置１０１によって読み出される。
　同一の融解温度を有する温度校正試料を用いた温度補正動作が各核酸増幅装置１０２で実行されることにより、Ｎ個の装置間の温度絶対値を均一化することができる。また、情報管理装置１０１は、各核酸増幅装置１０２の温度校正結果情報を集約的に管理することができる。このため、ある核酸増幅装置１０２に温度制御の異常が認められる場合には、サービス情報を管理するサービス情報管理装置１０３に異常の発見された核酸増幅装置１０２に関する情報を提供することにより、迅速な顧客サポートが可能となる。勿論、サービス情報管理装置１０３とサービスの提供先である核酸増幅装置１０２の配置位置は同一でも異なっていても良い。
　＜他の形態例＞
　なお、本発明は上述した形態例に限定されるものでなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上述した形態例は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある形態例の一部を他の形態例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある形態例の構成に他の形態例の構成を加えることも可能である。また、各形態例の構成の一部について、他の構成を追加、削除又は置換することも可能である。
　また、上述した各構成、機能、処理部、処理手段等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路その他のハードウェアとして実現しても良い。また、上記の各構成、機能等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することにより実現しても良い。すなわち、ソフトウェアとして実現しても良い。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリやハードディスク、SSD（Solid State Drive）等の記憶装置、ICカード、SDカード、DVD等の記憶媒体に格納することができる。
　また、制御線や情報線は、説明上必要と考えられるものを示すものであり、製品上必要な全ての制御線や情報線を表すものでない。実際にはほとんど全ての構成が相互に接続されていると考えて良い。
　１…温度制御ブロック
　３…リアルタイム蛍光測定部
　５…制御部
　７…融解温度測定部
　９…温度補正部
　１１…記憶部
　１５…リアルタイム蛍光測定機構
　２１…反応容器
　２２…回転盤
　２３…データ処理部
　２４…記憶・演算部
　２５…装置制御部
　２６…反応プレート
　３１…分注機構
　３２…反応容器搬送機構
　３３…試料架設ポジション
　３４…核酸抽出試薬架設ポジション
　３５…核酸増幅試薬架設ポジション
　３６…消耗品架設ポジション
　３７…消耗品廃棄穴
　３８…反応容器廃棄穴
　１００…ネットワーク情報データベース
　１０１…情報管理装置
　１０２…核酸増幅装置
　１０３…サービス情報管理装置

Claims (15)

  1. 　個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロックと、
    　各温度制御ブロックによって温度管理される反応容器内の試料をリアルタイムで蛍光測定するリアルタイム蛍光測定部と、
    　各温度制御ブロックで温度管理される１又は複数の反応容器に分注された温度校正試料の基準融解温度を記憶する記憶部と、
    　各温度制御ブロックに対応する各反応容器に収容された温度校正試料の融解温度を測定融解温度として測定する融解温度測定部と、
    　各温度制御ブロックに対応する測定融解温度と前記基準融解温度とを比較し、各差分値に基づいて各温度制御ブロックの温度絶対値を補正する温度補正部と
    　を有することを特徴とする核酸増幅装置。
  2. 　請求項１に記載の核酸増幅装置において、
    　前記温度補正部による各温度制御ブロックの温度絶対値の補正終了後、温度校正試料の融解温度を自動的に測定し、補正後の温度制御ブロックの温度制御精度を画面表示する制御部を有することを特徴とする核酸増幅装置。
  3. 　請求項１に記載の核酸増幅装置において、
    　前記温度補正部による各温度制御ブロックの温度絶対値の補正終了後、各温度制御ブロックについて温度校正試料の融解温度を自動的に測定する処理と、
    　測定結果に基づいて各温度制御ブロックの温度絶対値を補正する処理と
    　を繰り返し実行する制御部を有する
    　ことを特徴とする核酸増幅装置。
  4. 　請求項３に記載の核酸増幅装置において、
    　前記制御部は、全ての温度制御ブロックの温度制御精度が、予め設定された温度精度範囲内に入るまで前記補正する処理と前記測定する処理を繰り返す
    　ことを特徴とする核酸増幅装置。
  5. 　請求項４に記載の核酸増幅装置において、
    　前記制御部は、予め設定された回数を繰り返しても、予め設定された温度精度範囲内に温度制御精度が入らない温度制御ブロックについて、温度制御異常を意味するアラームを画面表示する
    　ことを特徴とする核酸増幅装置。
  6. 　請求項５に記載の核酸増幅装置において、
    　前記制御部は、温度制御異常を意味するアラームが画面表示された温度制御ブロックに対し、通常動作中もアラームの表示を継続する
    　ことを特徴とする核酸増幅装置。
  7. 　請求項５に記載の核酸増幅装置において、
    　前記制御部は、温度制御異常を意味するアラームが画面表示された温度制御ブロックに対し、通常動作の使用対象から除外する
    　ことを特徴とする核酸増幅装置。
  8. 　個別に温度制御可能な複数の温度制御ブロックと、各温度制御ブロックによって温度管理される反応容器内の試料をリアルタイムで蛍光測定するリアルタイム蛍光測定部と、各温度制御ブロックで温度管理される１つ又は複数の反応容器に分注された温度校正試料の基準融解温度を記憶する記憶部と、各温度制御ブロックに対応する各反応容器に収容された温度校正試料の融解温度を測定融解温度として測定する融解温度測定部と、各温度制御ブロックに対応する測定融解温度と前記基準融解温度とを比較し、各差分値に基づいて各温度制御ブロックの温度絶対値を補正する温度補正部とを有する核酸増幅装置と、
    　前記反応容器に検体又は試料を分注する分注機構と、
    　前記核酸増幅装置に前記反応容器を搬送し、前記複数の温度制御ブロックのうちいずれかに搬送する搬送機構と
    　を有することを特徴とする核酸分析装置。
  9. 　請求項８に記載の核酸分析装置において、
    　前記温度補正部による各温度制御ブロックの温度絶対値の補正終了後、温度校正試料の融解温度を自動的に測定し、補正後の温度制御ブロックの温度制御精度を画面表示する制御部を有することを特徴とする核酸分析装置。
  10. 　請求項８に記載の核酸分析装置において、
    　前記温度補正部による各温度制御ブロックの温度絶対値の補正終了後、各温度制御ブロックについて温度校正試料の融解温度を自動的に測定する処理と、
    　測定結果に基づいて各温度制御ブロックの温度絶対値を補正する処理と
    　を繰り返し実行する制御部を有する
    　ことを特徴とする核酸分析装置。
  11. 　請求項９に記載の核酸分析装置において、
    　前記制御部は、全ての温度制御ブロックの温度制御精度が、予め設定された温度精度範囲内に入るまで前記補正する処理と前記測定する処理を繰り返す
    　ことを特徴とする核酸分析装置。
  12. 　請求項１０に記載の核酸分析装置において、
    　前記制御部は、予め設定された回数を繰り返しても、予め設定された温度精度範囲内に温度精度が入らない温度制御ブロックについて、温度制御異常を意味するアラームを画面表示する
    　ことを特徴とする核酸分析装置。
  13. 　請求項１２に記載の核酸分析装置において、
    　前記制御部は、温度制御異常を意味するアラームが画面表示された温度制御ブロックに対し、通常動作中もアラームの表示を継続する
    　ことを特徴とする核酸分析装置。
  14. 　請求項１２に記載の核酸分析装置において、
    　前記制御部は、温度制御異常を意味するアラームが画面表示された温度制御ブロックに対し、通常動作の使用対象から除外する
    　ことを特徴とする核酸分析装置。
  15. 　請求項８に記載の核酸分析装置において、
    　前記核酸分析装置はネットワーク経由で前記温度校正試料の基準融解温度を取得し、他の核酸分析装置との間で前記基準融解温度を共有する
    　ことを特徴とする核酸分析装置。
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