JP2003502656A - 小型化されたインビトロ増幅アッセイを行うための装置および方法 - Google Patents

小型化されたインビトロ増幅アッセイを行うための装置および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、微量分析的かつ微量合成的な分析および手法を行うための方法および装置に関する。本発明は、微小流路を通る流体運動を駆動させるためにプラットホームの回転から生じる向心力を利用するプラットホームを操作するための微量システムプラットホームおよび微量操作装置を提供する。本発明は、詳細には、ポリメラーゼ連鎖反応などの小型化されたインビトロ増幅システムを行うための装置および方法を提供する。ＰＣＲを行うための本発明の装置に特に適した方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本出願は、米国特許仮出願第６０／１４０，４７７号（１９９９年６月２２日
出願）に対する優先権を主張する。その開示は明示的に参考として本明細書中に
組み込まれる。
【０００２】 １．発明の分野 本発明は、微量分析的および微量合成的な分析および手法を行うための方法お
よび装置に関する。特に、本発明は、遺伝学的、生化学的および生物分析的なプ
ロセスを超小型化することに関する。詳細には、本発明は、一体化かつ小型化さ
れたサンプル調製、核酸増幅および核酸検出アッセイを行うための装置および方
法を提供する。これらのアッセイは、法医学、生命科学研究ならびに臨床的およ
び分子的な診断法（これらに限定されない）を含む様々な目的のために行うこと
ができる。本発明は、細菌培養物および細胞培養物ならびに全血および処理され
た組織を含む目的とする様々な液状サンプルについて使用することができる。本
発明の微量システム装置を使用する広範囲の任意のそのような微量分析的または
微量合成的なプロセスを行うための方法もまた提供される。
【０００３】 ２．関連技術の背景 宿主細胞からのＤＮＡの抽出および単離は現代の分子生物学の土台である。あ
るタイプのＤＮＡ、すなわち、細菌のプラスミドＤＮＡは、細菌、酵母および哺
乳動物細胞に遺伝物質を挿入するための便利なベクターとして特に有用である。
生物から単離されたＤＮＡは、プラスミドＤＮＡに連続した状態で共有結合させ
ることによって挿入され、その後、細菌細胞などの細胞に導入され、そして増殖
させることができる。それによって、非常に多くのコピー数のプラスミドがそれ
ぞれの細胞において作製される。これらのプラスミドは、様々な実験目的または
治療目的のために十分な量のＤＮＡを（ミリグラムまでの量が工業規模では製造
され得るが、典型的には数マイクログラムの程度で）得るために都合良く採取す
ることができる。プラスミドＤＮＡを採取することは、細胞からのその取り出し
および細胞のゲノムＤＮＡ内容物からの単離として規定され、生命科学研究、診
断法、治療法および他の適用における有用性は増大している。
【０００４】 現在、ＤＮＡの抽出および単離は、手作業、またはロボットによるサンプル調
製装置の使用のいずれかによって行われている。いずれの場合においても、様々
な技術および材料が使用されている（例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット
およびＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキットハンドブック、１９９９、Ｑｉａｇ
ｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｘ−Ｖｏｌｍｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ ４、４０７２４、Ｈ
ｉｌｄｒｅｎ、ドイツ；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙ、１９７９、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３〜１５２２を参照のこと）。典型的には、細胞
が、場合により、プロテアーゼまたはプロテイナーゼＫなどのタンパク質消化酵
素を含有する表面活性剤（界面活性剤）溶液中で最初にインキュベーションされ
る。これらは細胞を溶解し、それによりＤＮＡを溶液中に放出させる。これは、
ヌクレアーゼを不安定化させ、そして混入しているＲＮＡを加水分解するために
アルカリ性条件下で頻繁に行われている。その後、ＤＮＡは、他の細胞構成成分
から分離しなければならない。これは、例えば、タンパク質および他の細胞破片
の選択的な沈殿化、（フェノールおよびクロロホルムを使用する）有機化学品に
よる抽出、およびＤＮＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む数多く
の異なる分離プロトコルを使用して行われる。プラスミドＤＮＡはまた、混在す
る細胞（細菌のゲノムＤＮＡ）から単離しなければならない。ろ過法はプラスミ
ドＤＮＡ溶液をもたらし得るが、ＤＮＡを溶媒和するために必要とされる溶液は
、通常、ＤＮＡの所望する最終的な適用には適していない。結果として、プラス
ミドＤＮＡはエタノール沈殿によってこれらの溶液から取り出されるか、あるい
は固相分離が使用される。これは、（ガラスまたはシリカを使用するアフィニテ
ィー結合法の場合には特に、）溶媒のｐＨおよび塩濃度をさらに変化させること
を必要とする。これらの工程に必要とされる技術には、高価な一組の装置および
その熟練した操作者を必要とするピペット操作、送液、ろ過、洗浄および遠心分
離が含まれる。自動化されたシステムのさらなる条件には、サンプル容器の取扱
いに関するサンプル移動およびロボット工学が含まれる。
【０００５】 この議論は、ＤＮＡサンプルの調製（特に、プラスミドＤＮＡの調製）を行う
ためのより効率的で、迅速かつ安価な自動化された方法および装置がこの分野で
求められていることを例示している。
【０００６】 一体化された遺伝子分析の領域では、サンプル調製、ＰＣＲ、およびリアルタ
イム蛍光法またはハイブリダイゼーション法による検出を一体化することがある
程度の発達を遂げている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、１９９８、「一体化された遺伝
子分析における進歩」、Ｐｒｏｃ．Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
’９８、Ｈａｒｒｉｓｏｎ＆ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ編、Ｋｌｕｗｅｒ：Ａ
ｍｓｔｅｒｄａｍ、１１頁〜１６頁）。これらのシステムは、流体が処理される
マイクロフルーイディックデバイスと連携しなければならないポンプおよび弁な
どの肉眼的な流体取扱いシステムに頼っている。
【０００７】 しかし、ＤＮＡ（特に、プラスミドＤＮＡ）を採取するために細胞培養物を処
理することができる装置および方法が求められている。
【０００８】 生物学および生化学の分野においては、分析手法は、周囲温度よりも高い温度
での生物学的サンプルおよび反応混合物をインキュベーションすることを頻繁に
必要とする。さらに、多くの生物分析的および生合成的な技術は、連続的に、あ
るいは反応スキームまたはプロトコルの経過にわたって２つ以上の温度でインキ
ュベーションすることを必要とする。
【０００９】 そのような生物分析反応の一例がポリメラーゼ連鎖反応である。ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸配列の増幅および検出を可能にする技術である。米
国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ他）および同第４，６８３，２０
２号（Ｍｕｌｌｉｓ）を参照のこと。この技術は、例えば、ＤＮＡ配列分析、プ
ローブ作製、核酸配列のクローニング、部位特異的変異誘発、遺伝子変異の検出
、ウイルス感染の診断、分子的「指紋識別」、ならびに生物学的流体および他の
提供源における汚染微生物のモニターリングを含む広範囲の生物学的適用を有す
る。ポリメラーゼ連鎖反応は、標的の変性、プライマーのアニーリング、および
ポリメラーゼによって媒介される伸長の反復した過程またはサイクルを含む；こ
の反応プロセスにより、特定の標的配列の指数関数的な増幅が得られる。
【００１０】 ＰＣＲを小型化して自動化する方法は、広範囲の分析的な環境において、特に
、非常に多数のサンプルを同時に分析しなければならない状況において、あるい
は分析されるサンプルが少量である場合には望ましい。
【００１１】 ＰＣＲに加えて、米国特許第４，９８８，６１７号（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎおよ
びＨｏｏｄ）に開示されているリガーゼ連鎖反応を含む他のインビトロ増幅手法
が知られており、先行技術において都合良く使用されている。より一般的には、
核酸ハイブリダイゼーションおよび配列決定などの生物工学の分野で知られてい
るいくつかの重要な方法は、サンプル分子を含有する溶液の温度を制御された様
式で変化させることに依存している。これらの方法の実施を自動化して小型化す
ることは、この分野における望まれる目標である。
【００１２】 自動化されたＰＣＲを行うために製造された機械的な自動化流体取扱いシステ
ムおよび装置が先行技術において開示されている。
【００１３】 米国特許第５，３０４，４８７号（１９９４年４月１９日発行、Ｗｉｌｄｉｎ
ｇ他）には、微量スケールの分析装置における流体取扱いが教示されている。
【００１４】 国際特許出願公開ＷＯ９３／２２０５３（１９９３年１１月１１日公開、ペン
シルベニア大学）には、微細加工された検出構造体が開示されている。
【００１５】 国際特許出願公開ＷＯ９３／２２０５８（１９９３年１１月１１日公開、ペン
シルベニア大学）には、ポリヌクレオチド増幅を行うための微細加工された構造
体が開示されている。
【００１６】 Ｗｉｌｄｉｎｇ他（１９９４、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：４３〜４７）は、
シリコンに微細加工された直線流路における流体の操作を開示している。
【００１７】 Ｋｏｐｐ他（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：１０４６）は、異なる温度
の領域を交互に使用してインビトロ増幅反応を行うためのマイクロチップを開示
している。
【００１８】 ＰＣＲおよび他の温度依存的な生物分析反応を行うための先行技術において開
示された合成マイクロチップの１つの欠点は、流路を通ってマイクロチップ上の
流体を移動させるシステム、および１０μｍ〜１００μｍの範囲の直径を有する
リザーバーを設計することが困難であった。これは、部分的には、これらのマイ
クロチップの構成要素の小さなサイズを通って流体を移動させるための高圧ポン
プ手段を必要とするためである。先行技術のマイクロチップのこれらの無力性は
、ＰＣＲおよび他の生物分析プロセスを小型化して自動化することに関してこれ
らの装置の有用性を制限している。
【００１９】 従って、特にＤＮＡサンプルの一体化されたサンプル調製および分析を提供す
るデバイスおよび方法がこの分野では求められている。この要求は、高コストお
よび複雑な自動化（典型的にはロボットによる）システムによって現在悩まされ
ている高処理能分析の場合には特に深刻である。ＤＮＡサンプル調製および分析
の一体化は、非常に熟練した操作者を要求する多数の複雑な技術が必要な、この
分野における現在の必要性がそれによって減少する場合には特に有用である。重
要なことは、ＤＮＡ分析の場合、サンプル調製法およびインビトロ増幅法を一体
化することは、汚染およびサンプル持ち越しの可能性を最小限にする。これは、
この分野で使用されている様々なインビトロ増幅反応などの高感度技術では特に
重要である。
【００２０】 本発明者の何人かにより、微量システムプラットホームと、回転によって、従
って、マイクロプラットホームに埋め込まれた微小流路を通過する流体の動きを
駆動させるためにプラットホームの回転から生じる向心力を利用することによっ
て前記プラットホームを操作する微量操作デバイスとが開発された。これらは、
共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）なら
びに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６
３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年
１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願
）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／
３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号
（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００
年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）に開示されている。
これらのそれぞれの開示は参考として明示的に組み込まれる。
【００２１】 （発明の要約） 本発明は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６
日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／
７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号
（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８
月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）
；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７
９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ，
号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）に開示
されているような微量システムプラットホームを提供する（これらはそれぞれの
開示は参考として明示的に組み込まれる）。
【００２２】 本発明は、微量スケールのプロセスをマイクロプラットホーム上で行うための
装置および方法を提供する。それにより、流体は、プラットホームの回転から生
じる向心力によって駆動されるので、規定された流路においてプラットホーム上
を移動する。この微量システムプラットホームは、一体化および小型化されたサ
ンプル調製、核酸増幅および核酸検出アッセイを行うために提供される。本発明
の装置の第１の要素は、回転可能な構造体であるマイクロプラットホームであり
、最も好ましくは、流体（サンプル）入口ポート、流体光学的な微小流路、試薬
リザーバー、回収チャンバー、検出チャンバーおよびサンプル出口ポート（これ
らは「マイクロフルーイディック構造体」と総称的に呼ばれる）を含むディスク
である。ディスクは、プラットホームのマイクロフルーイディックス構造体を通
過する流体の動きを可能にする向心加速度を生じさせるために約１ｒｐｍ〜約３
０，０００ｒｐｍの速度で回転させられる。本発明のディスクはまた、好ましく
は、空気出口ポートおよび空気移動流路を含む。空気出口ポートおよび特に空気
移動流路は、流体が空気を追い出すための手段を提供し、従って、ディスク上に
おける流体の阻害されない動きが確保される。ディスク、および最も好ましくは
プラットホームの面は、それに含有される流体の温度を周囲温度よりも高い温度
に上げるための加熱エレメントをも含むことができる。ディスク上の特定部位に
は、好ましくは、流体が分析されることを可能にするエレメントもまた含まれる
。
【００２３】 本発明のプラットホームの好ましい実施形態は、マイクロフルーイディックス
ディスクとともに回転するプラテンである。このプラテンは、最も好ましくは、
抵抗加熱エレメント、熱電気的な（ペルチェ）素子、温度センサー、アッセイオ
プティクスおよびマイクロプロセッサーならびに他のエレクトロニクス構成要素
を含む印刷された回路ボード盤である。回転中のプラテンと、固定された電源、
モーター制御器、温度制御器およびコンピューターとの電気的な連絡は、最も好
ましくは、スリップリングアセンブリーを介して達成される。マイクロフルーイ
ディックディスクをプラテンの表面に取り付けて、ディスクおよびプラテンを一
緒に回転させることによって、マイクロフルーイディック構造体全体における流
体の分布および流速、ならびにマイクロフルーイディックディスクの局在化領域
における流体の温度を制御することができる。
【００２４】 好ましい実施形態において、マイクロフルーイディックスディスクの一方の面
はプラテンの一方の面に取り付けられ、そしてマイクロフルーイディックスディ
スク内の特定位置における流体の温度はプラテンとディスクとの温度交換によっ
て制御される。代わりの実施形態において、マイクロフルーイディックディスク
は、ディスクと、プラテンを含む熱調節エレメントとの間で温度交換を行わせる
エレメントをそれぞれが含む２つのプラテンの間に配置される。好ましい実施形
態において、プラテンは、それに埋め込まれているか、またはそれに取り付けら
れている抵抗加熱エレメント、ペルチェ素子および温度センサーを有する印刷さ
れた回路ボード盤である。代わりの実施形態において、マイクロフルーイディッ
クディスク内の熱調節は、抵抗ヒーターを含む層を永続的にディスクに直節結合
させることによって達成される；この場合、ディスク内の流体は、抵抗加熱エレ
メントによって周囲温度よりも高い温度に加熱され、そしてディスクを回転させ
ることによって、また熱を環境に放出することによって周囲温度と等しい温度ま
たはそれよりも高い温度に冷却される。プラテンの場合のように、この複合的な
ディスクと、電源、温度制御器およびコンピューターとの電気的な連絡は、最も
好ましくは、スリップリングアセンブリーを介して達成される。
【００２５】 第１の局面において、本発明は、細胞からのＤＮＡの抽出、単離および精製を
行うために、一体化および小型化されたサンプル調製を行うためのデバイスおよ
び方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明のデバイスおよび方法は
、細菌細胞からプラスミドＤＮＡを単離するために特に提供される。
【００２６】 本発明のプラスミドＤＮＡサンプル調製プラットホームは、下記の機能を行う
ために提供される：細菌細胞からの遊離ＤＮＡに対するサンプル処理；得られた
溶液をろ過して、細菌細胞フラグメントを除くこと；マトリックスに対するＤＮ
Ａ結合を促進させる溶媒条件を使用しての結合マトリックスへの溶液の添加；結
合したＤＮＡの洗浄、およびさらなる分析方法に適合し得る溶液による元の溶液
の置換；ならびに好適な溶媒における結合マトリックスからのＤＮＡの溶出。こ
のようにして溶出されたＤＮＡは、この分野で知られている方法を使用して、単
離することができ、あるいはインビトロで増幅することができ、あるいは配列決
定することができる。下記にさらに詳しく記載されているように、プラスミドＤ
ＮＡサンプル調製を行うマイクロフルーイディック構造体を含む本発明のプラッ
トホームが提供される。これらのマイクロ構造体は、明瞭化するために、１つの
マクロ構造体に関して例示されている。しかし、多数のそのようなプラスミドＤ
ＮＡ調製マイクロフルーイディック構造体を含むプラットホームが本発明によっ
て提供される。この場合、マイクロフルーイディック構造体は、プラットホーム
のサイズと、本明細書中に開示されているようなマイクロフルーイディックス構
造体を含むチャンバーおよびリザーバーの容量能とによって決定される密度でプ
ラットホームの表面に配列させられる。
【００２７】 第２の局面において、本明細書中に記載されているようなマイクロフルーイデ
ィックス構造体を有する本発明が、インビトロ増幅反応を行うために一体化され
た一組の生化学的プロセスを行うために提供される。これらのプロセスには、細
菌細胞または哺乳動物細胞からＤＮＡを単離するためのサンプル処理；ＰＣＲに
適切な溶液条件に溶液条件を調節するためのサンプル調整；調整されたサンプル
をＰＣＲ試薬（デオキシリボースヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素、プライマー
および適切な塩、緩衝液および添加剤を含む）と混合すること；ＰＣＲを行うた
めの熱サイクル処理が含まれる。
【００２８】 いくつかの好ましい実施形態において、本発明のディスクには、プラットホー
ムが数個のサンプルを同時に処理して増幅することができる多数のマイクロフル
ーイディックス構造体が提供される。これらの実施形態において、一組の生化学
的反応を行うためのマイクロフルーイディックス構造体の配置の多数の複製体が
ディスク上に配置され、そしてサンプル入口ポートまたはリザーバーがそれぞれ
の複製体に提供され、それによって多数のサンプルを処理することができる。さ
らに、サンプルＤＮＡが増幅される部分は、ディスク上に配置されたマイクロフ
ルーイディックス構造体の個々の複製体のそれぞれにおいて提供される増幅プラ
イマーを選ぶことによって独立的になり得る。これによって、特定サンプルの「
多重的」な増幅が可能になる。あるいは、同じプライマーを、各サンプルのＤＮ
Ａにおいて同じ標的フラグメントを増幅するために多数のサンプルを平行して処
理するために提供することができる。増幅サイクルの各工程のために使用される
温度、温度勾配速度および保持時間を含む独立した熱サイクル処理プロフィルを
、マイクロフルーイディックス構造体のそれぞれについて、あるいは処理サンプ
ルのそれぞれについて装置に対して個々にプログラム化することができる。
【００２９】 本発明は、多数の異なるサンプルの同時かつ独立的な熱サイクル処理、特定サ
ンプルからの異なるフラグメントの独立した増幅、またはその両方を都合良く可
能にする。この特徴はまた、ディスクに配置された多数のマイクロフルーイディ
ックス構造体に対する反応パラメーターを変化させ、それにより同時に多数の実
験を同時に行うことによって、迅速かつ１回の実験で１つのサンプルまたはアン
プリコンに対する熱サイクル処理パラメーターを使用者が最適化することを可能
にする。マイクロフルーイディックス構造体の特定の複製体は、プラットホーム
上の他の複製体からマイクロフルーイディック的に隔てられて配置され得るので
、すべてよりも少ない数のマイクロフルーイディックス構造体を含む部分を別個
に使用することができ、そして残りの部分を将来の使用のためにそのままにして
おくことができる。
【００３０】 本発明のプラットホームの代わりの実施形態において、共同所有の米国特許第
６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として本明細書
中に組み込まれる）に開示されているような計量用構造体が、多数の混合用構造
体のそれぞれに試薬の一部を分配するために使用される。この場合、それぞれの
混合用構造体が多数のサンプルリザーバーの１つに流体的に接続されており、そ
れによって、サンプルと共通試薬との平行した処理および混合が可能である。こ
のことは、自動化された試薬分配機構に対する必要性を低下させ、（多数の反応
チャンバーに試薬を分配することと同時に行われ得る）試薬の分注に必要とされ
る時間の量を減らし、そして外部から加えられた電動的手段を使用することなく
少量（ｎＬ〜μＬ）の容量の送達を可能にする。
【００３１】 本発明のプラットホーム上における多数の回収チャンバーのアセンブリーはま
た、単純化された検出器を使用することができ、それによって、個々の回収／検
出チャンバーのそれぞれを、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ技術ととも使用されるこの分
野において十分に開発された機構を使用して走査することができる。最後に、本
発明のプラットホームには、この分野で知られている液体送達手段（マイクロピ
ペットなど）に適合し得る、サンプルおよび試薬をぞれぞれ充填するためのサン
プル進入ポートおよび試薬進入ポートが提供される。
【００３２】 本発明のディスクは、遠心力による分析装置の分野において存在する利点を上
回る利点をいくつか有する。第一に、流れが、流体流路の大きさが小さいために
層流であるということである；これにより、混合および洗浄などのプロセスのよ
り良好な制御が可能になる。第二に、微細加工によってもたらされる小さな寸法
により、より大きな肉眼的システムの場合よりもはるかに広い範囲の回転速度に
わたって、そしてその場合よりも大きな信頼性とともに、毛管力に依存した「受
動的」な弁操作の使用が可能になる。小型化の既に記載された利点がこれに付加
される。
【００３３】 本発明は、流体を移動させるために向心加速度が使用されるマイクロフルーイ
ディックスディスクを使用することによって、現在の技術における様々な問題を
解決する。流体を含有する構成要素が、少ない容量を含有するように、従って、
アッセイを行うために必要とされる試薬コスト、反応時間および生物学的材料の
量が少なくなるように構築されることは、本発明のマイクロフルーイディックプ
ラットホームの利点である。流体を含有する構成要素がシールされること、従っ
て、種々の流体の示差的な蒸発および試薬濃度において生じる変化による実験誤
差がなくなることもまた利点である。本発明のマイクロフルーイディックスデバ
イスは完全に包まれているので、蒸発および光学的変動はともに無視できるレベ
ルにまで低下する。本発明のプラットホームはまた、都合のよいことに「受動的
」な混合および弁操作が可能である。すなわち、混合および弁操作が、プラット
ホーム上の構成要素の構造的な配置（形状、長さ、回転軸に対するプラットホー
ム表面における位置、および下記において議論されているような濡れ性などの構
成要素の内部表面の表面性状など）、およびプラットホーム回転の力学（速度、
加速度、方向および方向の変化）の結果として行われ、そしてアッセイの時間設
定および試薬送達の制御が可能になる。
【００３４】 本発明のデバイスはまた、ＰＣＲなどのインビトロ増幅反応を行うために、よ
り単純で、変動により強く、かつより経済的なサンプル調製を行う。サンプル処
理の機構的な局面はすべて、所定の速度でディスクを回転させる１つのモーター
を使用して行われ、それによって流体は微小流路および他のマイクロフルーイデ
ィックス構造体を通ってディスク上を移動させられる。これは、ロボットによる
ピペット操作装置または他の流体移動機構（処理プレートを異なる「装置」に送
達するための自動化）またはその両方を含む現在のサンプル調製法よりも好都合
である。
【００３５】 本発明は、都合のよいことに、サンプル調製をＰＣＲに対する熱サイクル処理
と一体化し、それによってさらなる流体移動工程を省いている。これは、汚染ま
たは流体損失の可能性を最小限にする。
【００３６】 本発明のプラットホームは、少なくとも３つの方法で自動化に対する要求を低
下させる。第一に、送達される流体の正確な計量に対する要求が、共同所有の米
国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有
で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９
６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日
出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８
／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１
４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年
５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日
出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は参考
として本明細書中に明示的に組み込まれる）においてより詳しく記載されている
ようなディスク上の計量用構造体を使用することによって緩和される。アッセイ
に必要とされる容量のわずかに過剰なおおよその容量が充填され、そしてディス
クを回転させて、適切なマイクロフルーイディック構造体の使用による流体の計
量を可能にすることによって、高密度のマイクロタイタープレートアッセイにつ
いて従来必要とされるよりもはるかに簡便な（そして安価な）流体送達技術を用
いることができる。
【００３７】 第二に、マイクロフルーイディックプラットホームにおける流体「送達」事象
の総数が、マイクロタイタープレートに対して少なくなる。プラットホーム上で
行われるすべてのアッセイで使用される共通試薬（試薬溶液、緩衝液および酵素
基質など）を小分けして分注するマイクロフルーイディック構造体を使用するこ
とによって、手作業によるか、または自動化されたピペット操作工程の数が（ア
ッセイの複雑性に依存して）少なくとも半減する。デバイスに対する流体移動を
少なくすることにより、総アッセイ時間を少なくすることができる。これらの構
造体の例が共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日
発行）に開示されている（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３８】 本発明はまた、試薬をサンプルと混合し、そして得られた反応混合物を洗浄す
るためのプラットホーム上の手段を提供する。これにより、アッセイ回収チャン
バー（１つまたは２つ以上）を別の「洗浄」装置に移す必要性がなくなる。これ
はまた、アッセイデバイスの操作を少なくし、そして制御され、かつ一体化され
た流体処理を提供することも少なくする。
【００３９】 本明細書中に開示されている発明は、サンプルおよび供給源に関して柔軟であ
り、細菌、動物の全血、組織および細胞供給源から核酸を単離することができる
。本発明は迅速であり、既存の「自動化された」核酸調節法よりも約５０％以上
迅速である。このシステムの核酸生成物は、この分野で知られている方法と等し
い品質であるか、またはそれ以上の品質である。このシステムは簡便であり、容
易に使用することができ、そして操作者の変動性に依存しないので変動に対して
強い。さらに、開示されたプラットホームおよびシステムは自給式で一体型であ
り、それにより操作者の取扱いおよび誤りの両方が最小限になる。
【００４０】 本発明の装置のいくつかの好ましい実施形態を、本出願の下記の節に、そして
図面においてさらに詳しく記載する。
【００４１】 （好適な実施形態の詳細な説明） 本発明は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６
日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／
７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号
（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８
月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）
；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７
９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ，
号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これ
らのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に開示さ
れているようなマイクロプラットホームおよび微量操作デバイスを提供する。こ
れらは、生物学的サンプルの微量分析的および微量合成的なアッセイを行うのに
適合している。
【００４２】 本発明のために、用語「サンプル」は、より複雑な混合物の構成成分として単
離または検出されるか、あるいは前駆体種から合成される任意の流体、溶液また
は混合物を包含することが理解される。特に、用語「サンプル」は、目的とする
任意の生物学的な種を包含することが理解される。用語「生物学的サンプル」ま
たは用語「生物学的流体サンプル」は、血液、血漿、血清、リンパ、唾液、涙、
脳脊髄液、尿、汗、植物抽出物および野菜抽出物、精液ならびに腹水（これらに
限定されない）を含む任意の生物学的に由来するサンプルを意味することが理解
される。
【００４３】 本発明のために、用語「向心力によって駆動される流体の微量操作装置」は、
分析的な遠心分離器およびローター、微量スケールの遠心力による分離装置、そ
して最も詳しくは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５
月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第
０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９
９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９
７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日
出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９
／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ，
号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）
（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に
記載されているような微量システムプラットホームおよびディスクの取扱い装置
を含むものとする。
【００４４】 本発明のために、用語「微量システムプラットホーム」は、共同所有の米国特
許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同
時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年
１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願
）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９
９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号
（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月
１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願
；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に
参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、向心力によっ
て駆動されるマイクロフルーイディックスアレイを含むものとする。
【００４５】 本発明のために、「毛管」、「微小毛管」および「微小流路」の用語は、相互
に交換可能であること、そして適する場合には濡れ性または非濡れ性のいずれか
の材料から組み立てられることが理解される。
【００４６】 本発明のために、「試薬リザーバー」、「アッセイチャンバー」、「流体保持
チャンバー」、「回収チャンバー」および「検出チャンバー」の用語は、流体を
含む本発明の微量システムプラットホームにおける規定された容量を意味するこ
とが理解される。本明細書中に提供されているこれらの構造体の容量能は約２ｎ
Ｌから約１０００μＬまでである。
【００４７】 本発明のために、用語「流入ポート」および用語「流体入口ポート」は、流体
をプラットホームに加えるための手段を含む本発明の微量システムプラットホー
ムにおける開口部を意味することが理解される。
【００４８】 本発明のために、用語「流出ポート」および用語「流体出口ポート」は、流体
をプラットホームから取り出すための手段を含む本発明の微量システムプラット
ホームにおける規定された容量を意味することが理解される。
【００４９】 本発明のために、用語「毛管接合」は、流体の流れを遅らせるか、または促進
させるために表面力または毛管力が利用される毛管または他の流体経路における
領域を意味することが理解される。毛管接合は、流体的に接続されている（微小
流路などの）フルーイディックス構成要素である、（プラットホーム層内におい
て垂直的に）より大きな深さおよび／または（プラットホーム層内において水平
的に）より大きな幅を有する親水性基体におけるポケット、凹部またはチャンバ
ーとして提供される。接触角が９０ｏよりも小さい流体（大部分のプラスチック
、ガラスおよびシリカを用いて作製されたプラットホーム表面における水溶液な
ど）の場合、流れは、流路の断面が毛管接合の境界において増大するに従って妨
げられる。流れを妨げる力は、流路断面の大きさに逆比例し、そして液体の表面
張力に正比例し、流路を含む材料と接触している流体の接触角のコサインが乗算
される毛管圧力によってもたらされる。本発明による微小流路における毛管現象
に関連する力は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月
１２日発行）および共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／９１０，７２
６号（１９９７年８月１２日出願）（これらはその全体が参考として本明細書中
に組み込まれる）において議論されている。
【００５０】 毛管接合は、少なくとも３通りの方法で組み立てることができる。１つの実施
形態において、毛管接合は、１つの構成要素の横方向の大きさの１つまたは２つ
がもう一方の構成要素の横方向の大きさよりも大きい２つの構成要素の接合部に
おいて形成される。一例として、「濡れる」材料または「濡れ性」材料から作製
されたマイクロフルーイディックス構成要素では、そのような接合は、共同所有
で同時係属中の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日
出願）、第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）および同第
０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）に記載されているように
毛管の拡大部において生じる。毛管を通る流体の流れは、そのような接合におい
て阻害される。一方、「濡れない」材料または「非濡れ性」材料から作製された
構成要素の接合において、チャンバーまたはリザーバーから毛管への出口などの
流体経路内の狭窄部は、流れを阻害する毛管接合をもたらす。一般に、構成要素
の大きさが（チャンバーなどの）より大きな大きさから（毛管などの）小さい大
きさに変化するときに毛管接合が形成される非濡れ性のシステムとは対照的に、
濡れ性のシステムでは、構成要素の大きさが（毛管などの）小さい大きさから（
チャンバーなどの）より大きな大きさに変化するときに毛管接合が形成されるこ
とが理解される。
【００５１】 毛管接合の第２の実施形態が、毛管または流路の示差的な表面処理を有する構
成要素を使用して形成される。例えば、親水性（すなわち、濡れ性）の流路は、
疎水性（すなわち、非濡れ性）の別の領域を有するように処理することができる
。そのような流路を流れる流体は親水性領域を通ってそのように流れるが、流体
−蒸気のメニスカスが疎水性域に突き当たったときに流れは妨げられる。
【００５２】 本発明による毛管接合の第３の実施形態が、横方向の大きさおよび表面性状の
両方において変化を有する構成要素に提供される。そのような接合の一例が、よ
り大きな横方向の大きさを有する疎水性の構成要素（微小流路またはリザーバー
）への微小流路の開口部である。当業者は、本発明による毛管接合が、それらの
横方向の大きさにおける種々のサイズ、種々の親水性的な性質、またはその両方
を有する構成要素の接合部においてどのように作製され得るかを理解している。
【００５３】 本発明のために、用語「毛管作用」は、本発明のローターまたはプラットホー
ムにおいて流体に加えられる回転運動または向心力が存在しない状態における流
体の流れを意味することが理解され、部分的または完全な濡れ性の表面に起因す
る。
【００５４】 本発明のために、用語「毛管微小弁」は、毛管接合を含む毛管微小流路を意味
することが理解される。それによって、流体の流れが妨げられ、そして流体に圧
力を加えることにより、典型的には本発明のローターまたはプラットホームを回
転させることにより生じる向心力に駆動され得る。毛管微小弁は、接合部におけ
る流体に対する流体力学的圧力を増大させることによって、最も好ましくはプラ
ットホームの回転速度を増大させることによって乗り越えることができる毛管接
合を含むことが理解される。
【００５５】 本発明のために、用語「犠牲弁」は、流体の流路から除かれ得る柔軟な材料か
ら作製されることが好ましい弁を意味することが理解される。好ましい実施形態
において、前記犠牲弁はワックス弁であり、そして赤外線照射を含む様々な加熱
手段のいずれかを使用して加熱することによって、最も好ましくは、共同所有の
米国特許第６，０６３，５８９号（参考として組み込まれる）に記載されている
ように、プラットホームの表面に位置しているか、またはプラットホームの表面
に埋め込まれている加熱エレメントを作動させることによって流体の流路から除
かれる。
【００５６】 本発明のために、用語「流体的に連絡している」または用語「流体的に接続さ
れている」により、流体が構成要素間を流れることができるように機能的に相互
に接続されている構成要素が規定されることを目的とする。好ましい実施形態に
おいて、プラットホームは回転可能なプラットホームを含み、より好ましくはデ
ィスクを含む。それによって、ディスク上における流体の動きが、ディスクが回
転したときの向心力によって駆動される。
【００５７】 本発明のために、用語「空気移動流路」は、プラットホーム上の構成要素（微
小流路、チャンバーおよびリザーバーなど）と連続しているプラットホーム表面
のポートであって、流体の動きによってプラットホームおよびローターの構成要
素から空気を追い出すことができる通気孔および微小流路を含むプラットホーム
表面のポートを含むことが理解される。
【００５８】 本発明のマイクロプラットホーム（好ましくは「ディスク」であり、これ以降
は「ディスク」とまとめて示される；本発明のために、「マイクロプラットホー
ム」、「微量システムプラットホーム」および「ディスク」の用語は交換可能で
あると見なされる）は、１つまたは多数の微量合成的または微量分析的なシステ
ム（これは本明細書中では「マイクロフルーイディックス構造体」と呼ばれる）
を含むために提供される。そのようなマイクロフルーイディックス構造体は、デ
ィスクが回転したときに流体が構成要素間を流れることを可能にするように機能
的に相互に相互に接続されている、本明細書中にさらに詳しく記載されているよ
うな関連した構成要素の組合せを含む。これらの構成要素は、下記に記載されて
いるように、ディスクに対して一体的に微細加工され得るか、あるいはディスク
に取り付けられているか、またはディスクに置かれているか、またはディスクと
接触しているか、またはディスクに埋め込まれているモジュールとして微細加工
され得る。本発明のために、用語「微細加工された」は、サブミリメートルのス
ケールでこれらの構造体が製造され得るプロセスをいう。このようなプロセスに
は、当業者が熟知している成形、フォトリソグラフィー、エッチング、プレス加
工および他の手段が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】 本発明はまた、本発明のディスクを操作するための微量操作デバイスを含む。
この場合、ディスクは、流体の流れをディスク上において生じさせる向心力を提
供するデバイス内で回転させられる。従って、デバイスは、制御された回転速度
でディスクを回転させるための手段、ディスクの回転を開始および停止させるた
めの手段、そして好都合には、ディスクの回転方向を変化させるための手段を提
供する。電気機械式手段および制御手段の両方が、本明細書中においてさらに記
載されているように、本発明のデバイスの構成要素として提供される。使用者イ
ンターフェース手段（キーパッドおよびディスプレイなど）もまた、共同所有の
米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所
有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９
９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８
日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０
８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１
１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００
年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６
日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明
示的に参考として本明細書中に組み込まれる）においてさらに記載されているよ
うに提供される。
【００６０】 温度制御エレメントが、プラットホームの温度を、その上にある流体をインキ
ュベーションしているときに制御するために提供される。従って、本発明は、加
熱ランプ、直接的なレーザーヒーター、ペルチェ熱ポンプ、抵抗ヒーター、超音
波ヒーターおよびマイクロ波励起ヒーターを含む加熱エレメント、ならびにペル
チェ素子およびヒートシンク、放射的な熱喪失を容易にする放射ヒートフィンお
よび他の構成要素を含む冷却エレメントを提供する。熱素子は、好ましくは、特
定の領域または多数の領域にわたってプラットホームの温度を制御するために配
置される。好ましくは、加熱エレメントおよび冷却エレメントは、マイクロフル
ーイディックス構成要素（最も好ましくは、本明細書中に記載されているような
微小流路）と熱的に接触している熱調節層をプラットホーム表面に含む本発明の
プラットホームを含む。プラットホームにおける任意の特定領域（好ましくは、
特定の温度調節されている領域のいずれかにおける微小流路）の温度は、抵抗温
度素子（ＲＴＤ）、サーミスター、液晶複屈折センサーによって、あるいはＩＲ
特異的検出器を使用する赤外線測定によってモニターされ、そしてフィードバッ
ク制御システムによって調節することができる。本発明の微量システムプラット
ホームにおける温度制御は、最も好ましくは、共同所有の米国特許第６，０６３
，５８９号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されている方
法およびデバイスを使用して達成される。
【００６１】 好ましい実施形態において、微量システムプラットホーム表面の様々な部分は
、米国特許第６，０６３，５８９号（これは参考として本明細書中に組み込まれ
る）に開示されているような一体的な加熱エレメントを使用して制御される温度
の領域（「熱領域」または「熱アレイ」と呼ばれる）を提供するために変更され
る。より好ましい実施形態において、微量システムプラットホーム表面のそのよ
うな部分は、熱制御エレメントのアレイで構成され、最も好ましくは、異なる温
度を有するプラットホーム表面の作製された隣接領域である。好ましい実施形態
において、プラットホームはまた、共同所有で同時係属している特許出願の米国
特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／
７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６
号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１
２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）
；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９
／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０
８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込
まれる）に開示されているような他の構成要素、最も好ましくは、流路およびお
よび微小流路を含み、それによって、流体は、異なる温度を有する異なる領域の
それぞれを少なくとも１回横切るか、またはより好ましくは数回横切る。これら
の実施形態において、時間流体の量は、任意の特定の熱領域に含まれ、従って、
任意の特定の温度において、領域内の流路の経路長、流路の水力直径の二乗、お
よびプラットホームの回転速度の二乗に依存する。好ましい実施形態において、
アレイは、互いに隣接する異なる温度の少なくとも２つまたは３つの領域を含む
。いくつかの実施形態において、熱領域は矩形の形状であり、一方、他の実施形
態では、熱領域は、回転軸から遠位の位置における環直径が回転軸から近位の位
置よりも大きい楔形状である。
【００６２】 本発明のプラットホームの好ましい実施形態において、本発明のプラットホー
ムの表面に組み立てられた高い温度の熱アレイおよび領域は、熱的な加熱エレメ
ントを含む。好ましい実施形態において、この熱的な加熱エレメントは抵抗ヒー
ターエレメントまたはサーモフォイルヒーターであり、これは電気的に絶縁され
ているプラスチックに包まれたエッチングフォイル加熱エレメントである（Ｍｉ
ｎｃｏから得られるＫａｐｔｏｎ）。本発明のプラットホームを含む抵抗ヒータ
ーエレメントは、共同所有の米国特許第６．０６３，５８７号に記載されている
通りである。簡単に記載すると、前記抵抗ヒーターエレメントは、導電性インク
および抵抗性インクでスクリーン印刷され得る電気的に不活性な基板を組み合わ
せて含む。この場合、導電性インクは一定のパターンでスクリーン印刷され、そ
して抵抗性インクは導電性インクパターンの上に所定のパターンでスクリーン印
刷され、抵抗性インクは導電性インクと電気的に接触しており、そして導電性イ
ンクに加えられた電気的電位により、電流が抵抗性インクを横切って流れ、抵抗
性インクにより熱が発生する。そのような構造体は、「電気的に抵抗性のパッチ
」として本明細書中では定義される。好ましくは、導電性インクは、銀の導電性
インクであり、Ｄｕｐｏｎｔ５０２８、Ｄｕｐｏｎｔ５０２５、Ａｃｈｅｓｏｎ
４２３ＳＳ、Ａｃｈｅｓｏｎ４２６ＳＳおよびＡｃｈｅｓｏｎ ＳＳ２４８９０
などであり、抵抗性インクは、例えば、Ｄｕｐｏｎｔ７０８２、Ｄｕｐｏｎｔ７
１０２、Ｄｕｐｏｎｔ７２７１、Ｄｕｐｏｎｔ７２７８またはＤｕｐｏｎｔ７２
８５あるいはＰＴＣ（正の温度係数）インクである。代わりの実施形態において
、抵抗ヒーターエレメントは、抵抗インクパターンおよび導電性インクパターン
の上にスクリーン印刷された誘電インクをさらに含むことができる。
【００６３】 本発明は、回転させることができる分析的／合成的な微容量アッセイプラット
ホームである特に改変されたマイクロプラットホームと、回転の結果としてプラ
ットホーム上の向心力から生じる流体の動きがプラットホーム上に達成されるよ
うにプラットホームを操作する微量操作デバイスとの組合せを含む。本発明のプ
ラットホームは円形のディスクであることが好ましく、かつ好都合である。しか
し、プラットホーム上の流体を求心性にするように回転し得るプラットホームは
どれも、本発明の範囲に含まれるものとする。本発明の微量操作デバイスは、共
同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２
月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；
同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５
，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１
９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２
日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代
理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考
として本明細書中に組み込まれる）においてさらに詳しく記載されている。
【００６４】 流体（試薬、サンプルおよび他の液体成分を含む）の動きは、プラットホーム
の回転による向心加速度によって制御される。微量システムプラットホーム上に
おける特定のマイクロフルーイディックス構造体に適切な速度および圧力のもと
で流体が流れるために必要とされる向心加速度の大きさは、プラットホームの有
効半径、微小流路の内径、回転方向に対するプラットホーム上の微小流路の位置
角度、およびプラットホームの回転速度（これらに限定されない）を含む様々な
要因によって決定される。本発明の方法のいくつかの実施形態において、共同所
有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共
同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（
１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月
１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同
第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５
，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０
００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月
１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示
は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、計
量されない量の流体（サンプルまたは試薬溶液のいずれか）がプラットホームに
加えられ、そして計量された量が流体リザーバーから微小流路に移される。好ま
しい実施形態において、本発明のプラットホームに供給される流体サンプルの計
量された量は約１ｎＬ〜約５００μＬである。これらの実施形態において、１つ
または多数の計量用毛管を含む計量用マニホールドが、マイクロフルーイディッ
クス構造体の複数の構成要素に流体を分配するために提供される。
【００６５】 本発明のプラットホームの構成要素は互いに流体的に接続されている。好まし
い実施形態において、流体的な接続は、本発明のプラットホームの表面を含む微
小流路によって提供される。微小流路のサイズは、特定の適用によって、そして
本発明のプラットホームおよび方法の個々の実施形態のそれぞれに必要とされる
流体の量および送達速度によって最適に決定される。微小流路のサイズは、０．
１μｍから、ディスクの厚さ（例えば、約１ｍｍ）に近い値にまで変化させるこ
とができる。好ましい実施形態において、微小流路の内径は０．５μｍ〜約５０
０μｍである。微小流路およびリザーバーの形状は、必要に応じて、台形状、円
形状または他の幾何形状であり得る。微小流路は、好ましくは、約０．１ｍｍ〜
２５ｍｍの厚さを有する微量システムプラットホームに埋め込まれる。この場合
、プラットホームの厚さ寸法にわたる微小流路の断面寸法は１ｍｍ未満であり、
そしてプラットホームの前記断面寸法の１パーセント〜９０パーセントとするこ
とができる。サンプルリザーバー、試薬リザーバー、反応チャンバー、回収チャ
ンバー、検出チャンバーならびにサンプル入口ポートおよびサンプル出口ポート
は、好ましくは、約０．１ｍｍ〜２５ｍｍの厚さを有する微量システムプラット
ホームに埋め込まれる。この場合、プラットホームの厚さ寸法にわたる微小流路
の断面寸法はプラットホームの前記断面寸法の１パーセント〜７５パーセントと
することができる。好ましい実施形態において、そのような流路を通る流体の送
達が、所望する構成要素の間における流体の動きを駆動させるために十分な時間
および回転速度でプラットホームを同時に回転させることによって達成される。
【００６６】 入口および出口（流入および流出）のポートは、流体成分の導入または取り出
しのために使用される本発明のマイクロプラットホームの構成要素である。流入
ポートは、サンプルおよび試薬をディスク上に置くか、またはディスクに注入す
ることができるように提供される。これらのタイプのポートは、一般にはディス
クの中心の方に配置される。出口ポートもまた、生成物をディスクから取り出す
ことができるように提供される。ポートの形状および設計は、特定の適用に従っ
て変化する。例えば、サンプル入口ポートは、特に、毛管作用によってサンプル
がディスク内に効率的に吸い込まれることが可能であるように設計される。さら
に、ポートは、自動化されたサンプル／試薬の充填または生成物の取り出しが可
能であるように構成され得る。進入ポートおよび流出ポートは、最も好都合には
アレイ状に提供され、それによって多数のサンプルがディスクに加えられるか、
またはマイクロプラットホームからの生成物の取り出しを行うことができる。
【００６７】 本発明のプラットホームのいくつかの実施形態において、入口ポートおよび出
口ポートは、プラットホームのリザーバーに流体を送達する手動ピペッターまた
は他の手段を使用することに適合する。代替的で、好都合な実施形態において、
プラットホームは、自動化された流体充填デバイスを使用することに適合する。
そのような自動化されたデバイスの一例が、プラットホームの表面に沿って半径
方向の方向で動くロボットアームに位置する１個のピペットヘッドである。この
実施形態において、プラットホームは、適切なリザーバーに向かうために半径方
向に移動するピペットヘッドの下部に方位角方向で回転モーターの中心軸に割り
出しすることができる。
【００６８】 ディスク上の空気取扱いシステムには空気移動流路も含まれる。それによって
、流体の動きにより、空気が、流体を含有する微小流路に接続し、流体の運動方
向に対して逆行する流路を通って追い出され、それにより、流体の動きをさらに
駆動する陽圧がもたらされる。
【００６９】 ディスクなどの本発明のプラットホームおよびそのようなプラットホームを含
むマイクロフルーイディックス構成要素は、好都合には、個々の適用に適した様
々な組成および表面コーティング物を有して提供される。プラットホームの組成
は、構造的条件、製造プロセスおよび試薬の適合性／化学的抵抗性の関数である
。詳細には、無機の結晶性材料または非晶質材料（例えば、シリコン、シリカ、
石英）、不活性な金属から、あるいはプラスチック（例えば、ポリ（メチルメタ
クリレート）（ＰＭＭＡ）、アセトニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）
、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリプロ
ピレンおよびメタロセン）などの有機材料から製造されるプラットホームが提供
される。このようなプラットホームは、下記に記載されているように非修飾の表
面または修飾された表面とともに使用され得る。プラットホームはまた、ポリウ
レタンおよびポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）などの熱硬化性材料から
作製することができる。これらの材料のコンポジットまたは組合せから作製され
たプラットホームまたは本発明によって提供される：例えば、プラットホームの
検出チャンバーを含む光学的に透明なガラス表面がその中に埋め込まれているプ
ラスチック材料から製造されたプラットホーム。あるいは、異なる材料から作製
された層から構成されるプラットホームを作製することができる。これらの材料
の表面の性質は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月
１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０
８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９
０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７
年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出
願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／
５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ，
号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（
これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に開
示されているように特定の適用に対して改変することができる。
【００７０】 好ましくは、ディスクには、微細加工された機械的、光学的および流体工学的
な制御要素が、例えば、プラスチック、シリカ、石英、金属またはセラミックス
から作製されたプラットホーム上に組み込まれる。これらの構造体は、下記にお
いてさらに詳しく記載されているように、成形、フォトリソグラフィー、エッチ
ング、プレス加工または他の適切な手段によって、サブミリメートルのスケール
で組み立てられる。マイクロフルーイディックスおよびリザーバーの個々の組合
せ、または共有されるそのようなリザーバーがそれらに流体的に接続されて提供
される多数のマイクロフルーイディックス構造体を含むプラットホームもまた本
発明によって包含されることもまた認識される。そのようなプラットホームの一
例が図１に示されている。
【００７１】 プラットホームの製造および組み立て 本発明の微量システムプラットホームを含む基板に埋め込まれたマイクロフル
ーイディックス構造体が提供される。プラットホームは、好ましくは、ともに結
合される別個の構成要素を含有する層として製造され、そして組み立てられる。
図１に例示されているように、本発明のプラットホームの例示された実施形態は
、リザーバー層およびマイクロフルーイディックス層の２つの層を含む。さらな
る層を有するプラットホームもまた本発明の範囲に含まれる。
【００７２】 プラットホームのリザーバー層は、アクリル、ポリスチレン、ポリカーボネー
トまたはポリエチレンなどの熱可塑性材料から製造される。そのような材料の場
合、製造方法には、機械加工および従来の射出成形が含まれる。射出成形の場合
、プラットホームの特徴を規定するために使用される金型インサートは、この分
野で知られている機械加工、放電加工および他の手段の標準的な方法を使用して
作製することができる。
【００７３】 プラットホームのリザーバー層はまた、熱、放射線または他のエネルギー源に
さらされるまでは液体形態で存在する熱硬化性材料または他の材料から製造する
ことができる。熱硬化性材料の例には、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ
）、ポリウレタンまたはエポキシ樹脂が含まれる。典型的には、これらの材料は
２成分で製造者から得られる：この２成分は所定の割合で一緒に混合され、金型
に射出されるか、または金型に注がれ、そして熱を与えて、プレポリマー液に存
在するモノマーの架橋を開始させ、そして完了させる。プレポリマー液を金型に
迅速に射出し、その後、その部分を架橋または硬化させるプロセスは、反応射出
形成（ＲＩＭ）と呼ばれることが多い。プレポリマー液を金型に注ぎ、その後、
その部分を架橋または硬化させるプロセスは、注型と呼ばれることが多い。ＲＩ
Ｍ用または注型用の金型インサートは、この分野で知られている機械加工、放電
加工および他の手段の標準的な方法を使用して作製することができる。
【００７４】 プラットホームのマイクロフルーイディックス層もまた、アクリル、ポリスチ
レン、ポリカーボネートまたはポリエチレンなどの熱可塑性材料から製造するこ
とができる。流路およびキュベットの大きさは、リザーバー層に見出される大き
さよりもはるかに小さくすることができるので、これらの材料を用いた典型的な
製造方法には、機械加工および従来の射出成形だけでなく、圧縮／射出成形およ
び型押しまたは圧印加工もまた含まれる。射出成形の場合、プラットホームのこ
の層の特徴を規定するために使用される金型インサートは、機械加工または放電
加工などの従来の方法を使用して作製することができる。従来の方法では細かす
ぎて作製することができない特徴を有する金型インサートの場合には、様々な微
細加工技術が使用される。これらには、パターンがフォトレジストおよびフォト
マスクの使用によりシリコンウエハー基板上に作製されるシリコン微細加工が含
まれる（Ｍａｄｏｕ、１９９７、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）
。シリコンウエハーがエッチング剤に付されると、フォトレジストは、フォトレ
ジスト下のシリコンへのエッチング剤の侵入を妨げ、同時に、エッチングをシリ
コンの露出領域において生じさせることができる。このようにして、パターンが
シリコンにエッチングされ、このパターンは、型押しによって直接的に微細加工
されたプラスチック部品を作製するために使用することができる。このプロセス
において、エッチングされたシリコンは、高圧のもと、プラスチックのガラス転
移温度に近い温度で平坦な熱可塑性シートと接触させられる。その結果、パター
ンがプラスチックにネガで移される。
【００７５】 エッチングされたシリコンはまた、例えば、金属ニッケルを使用する電気メッ
キによって金属の金型インサートを作製するためにも使用することができる。異
方性または等方性の湿式エッチングあるいは深部反応性イオンエッチング（ＤＲ
ＩＥ）などの様々な技術のいずれかを使用してエッチングされたシリコンは、金
属性金型の基部として役立ち得る。ニッケルのシード層がシリコン上に蒸発によ
り蒸着される：電気伝導性のシード層が形成されると、従来の電気メッキ技術を
使用して厚いニッケル層を組み立てることができる。典型的には、その後、シリ
コンは除かれる（Ｌａｒｓｓｏｎ、１９９７、Ｍｉｃｒｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
Ｂｕｌｌ．１：３）。その後、インサートは、従来の射出成形または圧縮／射
出成形において使用される。
【００７６】 金型インサートのためにシリコンを微細加工することに加えて、金型は、シリ
コンをエッチングすることなくフォトリソグラフィーを使用して代わりに作製す
ることができる。フォトレジストのパターンが、シリコン上に、または他の適切
な基板上に作製される。シリコンを微細加工する場合のようにシリコンウエハー
をエッチングするのではなくむしろ、フォトレジストパターンおよびシリコンが
、この分野で知られている電気メッキ、熱気相蒸着または他の手段によって金属
化される。金属の浮き彫りパターンは、その後、上記に記載されているような圧
印加工、射出成形または圧縮／射出成形の金型として役立つ。
【００７７】 プラットホームのマイクロフルーイディック層もまた、リザーバー層の製造に
関して上記に記載されているように熱硬化性材料を使用して製造することができ
る。この場合、マイクロフルーイディックス層の熱硬化物に対する金型パターン
は、上記に記載されているように調製される。反応−射出成形および注型は射出
成形の高い圧力および温度を必要としないので、より広範囲の金型パターンを使
用することができる。シリコンまたは金属金型インサートの使用に加えて、記載
されているようなフォトレジストパターンはまた、金型浮き彫りそのものとして
使用することができる。フォトレジストは射出成形の高い圧力および温度に耐え
られないが、注型またはＲＩＭのより穏やかな条件は著しい損傷をもたらさない
。
【００７８】 プラットホームの組み立ては、マイクロフルーイディック層のリザーバー層へ
の位置決めおよび取り付けを含む。プラットホーム上のマイクロフルーイディッ
クス構造体が本明細書中に記載されているようなアッセイを行うことに関して有
用であるためには、リザーバー層内のいくつかのマイクロフルーイディックス経
路をマイクロフルーイディックス層内のいくつかのマイクロフルーイディックス
経路に接続しなければならない。これらのマイクロフルーイディックス経路の位
置決めは、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層における基点マー
カーの光学的アラインメントによって、あるいはピンを有するマイクロフルーイ
ディック層における穴もしくは凹部、またはリザーバー層における突起した特徴
の機械的なアラインメントによって達成され得る。位置決めの必要な許容差は、
マイクロフルーイディックス層におけるマイクロフルーイディックス経路よりも
はるかに大きくなるようにリザーバー層内のマイクロフルーイディックス経路を
設計することによって、またはその逆によって緩和され得る。
【００７９】 取り付けは、コンフォーマルシール、ヒートシールまたは融合結合、両面接着
テープまたはヒートシール可能なフィルムを用いた結合、紫外線（ＵＶ）硬化性
接着剤または熱硬化性接着剤を用いた結合、化学的結合、または溶媒を用いた結
合を含む多くの方法で達成され得る。
【００８０】 コンフォーマルシールに必要な条件は、層の一方または両方がエラストマー材
料から作製されていること、そして結合させる表面が、２つの層の物理的接触を
制限し得るほこりまたは破片を有しないことである。好ましい組み立て方法では
、エラストマー性のマイクロフルーイディックス層が堅いリザーバー層に関して
位置決めされ、その後、堅いリザーバー層に押し付けられる。エラストマー性の
マイクロフルーイディックス層は、好都合にはシリコーンから作製することがで
き、堅いリザーバー層は、好都合にはアクリルまたはポリカーボネートから作製
することができる。手動圧により、層をファンデルワールス力によって接着させ
ることができる。
【００８１】 ヒートシールまたは融合結合に必要な条件は、リザーバー層およびマイクロフ
ルーイディックス層の両方が熱可塑性材料から作製されていること、そしてシー
ルが、非晶質ポリマーの場合には層材料の両方のガラス転移温度よりも高い温度
で生じること、あるいは半結晶性ポリマーの場合には層材料の両方の融解温度よ
りも高い温度で生じることである。好ましい組み立て方法では、マイクロフルー
イディックス層がリザーバー層に関して位置決めされ、その後、リザーバー層に
押し付けられる。その後、このコンポジットディスクは、２つの平坦な加熱され
たブロックの間に置かれ、圧力が、加熱されたブロックによってこのコンポジッ
トに加えられる。コンポジットディスクの各面における温度対時間プロフィルを
調節することによって、そしてコンポジットシステムに加えられる圧力対時間プ
ロフィルを調節することによって２つの層の結合を可能にして、それぞれの層に
おける特徴の変化を最小限にする時間−温度−圧力プロフィルを決定することが
できる。例えば、２５０ｐｓｉの一定圧力のもとでアクリルのガラス転移温度の
すぐ上の温度に室温から１時間かけて２つのアクリル製ディスクを加熱すること
は、２５０μｍ幅のフルーイディック流路の最小変動を考慮する１つの方法であ
る。別の組み立て方法において、マイクロフルーイディックス層およびリザーバ
ー層の結合表面が放熱ランプで非接触様式で別々に加熱され、そして結合表面が
それらのガラス転移温度に達したときに、マイクロフルーイディックス層がリザ
ーバー層に関して位置決めされて、リザーバー層に押し付けられる。
【００８２】 両面接着テープまたはヒートシール可能なフィルムを使用して、マイクロフル
ーイディックス層およびリザーバー層を結合させることができる。結合させる前
に、流体的な連絡を２つの層の間で可能にする穴が最初にテープ（またはフィル
ム）に開けられ、テープ（またはフィルム）がリザーバー層に関して位置決めさ
れて、リザーバー層に貼り付けられ、そしてマイクロフルーイディックス層がテ
ープ（またはフィルム）／リザーバー層コンポジットに関して位置決めされて、
テープ（またはフィルム）／リザーバー層コンポジットに貼り付けられる。ヒー
トシール可能なフィルムを表面に結合させるためには、フィルムの温度を、非晶
質ポリマーの場合にはフィルムの接着剤ポリマー材料のガラス転移温度よりも高
い温度に、あるいは半結晶性ポリマーの場合にはフィルムの接着剤ポリマー材料
の融解温度よりも高い温度に上げることが必要である。接着テープまたはヒート
シール可能なフィルムを用いた結合の場合、十分な結合が、典型的には手動圧で
達成され得る。
【００８３】 光重合性ポリマー（例えば、ＵＶ硬化性接着剤）または熱硬化性ポリマーを使
用して、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層を接着させることが
できる。１つの方法において、この接着剤が層の一方または両方に塗布される。
塗布方法には、塗装、スプレー、浸せき塗装またはスピンコーティングが含まれ
る。接着剤を塗布した後、層が組み立てられ、そして接着剤の架橋または硬化を
開始させて完了させるために紫外線または熱にさらされる。別の方法では、マイ
クロフルーイディックス層およびリザーバー層はそれぞれ、接着剤のためにのみ
使用され得る１組の流体流路とともに製造される。これらの流路は、例えば、ア
ッセイのために使用される流体流路またはキュベットを取り囲むことができる。
マイクロフルーイディックス層がリザーバー層に関して位置決めされ、そしてリ
ザーバー層に押し付けられる。接着剤が様々な指定流路にピペットで注入され、
そして接着剤でこれらの流路が満たされた後、組み立てられたシステムは、接着
剤の架橋または硬化を行わせる紫外線または熱にさらされる。
【００８４】 ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはシリコーンが最初に酸素プラズマ
にさらされ、その後、同様に処理されたシリコーン表面に周囲の環境で押し付け
られた場合、２つの表面は接着される。プラズマ処理によってシリコーンの表面
はシラノール表面に変換され、そしてこれらの表面が一緒にされたときにシラノ
ール基がシロキサン結合に変換されると考えられる（Ｄｕｆｆｙ他、１９９８、
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：４９７４〜４９８４）。この化学的な結合方法は、
シリコーンのマイクロフルーイディックス層およびリザーバー層を接着させるた
めに使用される。
【００８５】 溶媒結合に必要な条件は、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層
の両方の結合表面が揮発性溶媒で溶媒和され得るか、または可塑化され得ること
である。溶媒結合の場合、結合表面は適切な溶媒和流体がそれぞれ塗装されるか
、または適切な溶媒和蒸気にさらされ、その後に位置決めがなされ、一緒に押し
付けられる。可塑化により、ポリマー分子をより可動性にすることができ、そし
て表面を接触させたときにポリマー分子は絡み合う；溶媒が蒸発すると、ポリマ
ー分子はもはや可動性ではなく、分子は絡まったままであり、それにより、物理
的な結合が２つの表面の間にもたらされる。別の方法では、マイクロフルーイデ
ィックス層およびリザーバー層がそれぞれ、溶媒のためにのみ使用され得る１組
の流体流路とともに製造され、そして上記に記載されているようにＵＶ硬化性接
着剤または熱硬化性接着剤によって層が結合されるのと非常に類似して層が結合
させられる。
【００８６】 組み立てられると、マイクロフルーイディックマニホールドの内側表面をパリ
レンコーティング剤で不動態化することができる。パリレンは、組み立て後のマ
イクロフルーイディックデバイスの内側の流体接触表面にバリア層を形成する気
相蒸着型コンフォーマルポリマーコーティング剤である。このコーティング剤に
より、流体と、デバイスを組み立てるために使用された材料との間における物質
の何らかの交換を防げる不透過性層が形成される。低い温度の気相蒸着方法を使
用することにより、デバイスをその最終形態で製造し、その後、不動態化するこ
とができる。この不動態化法は、アッセイの性能を向上させるために使用するこ
とができる。特に、接着剤がディスクの組み立てにおいて使用される場合、接着
剤物質（またはプラスチック基板またはカバー）によって流体が汚染される可能
性がある。接着剤から染み出る妨害物質、または接着剤による物質の吸着および
結合は、化学反応または生化学的反応を妨害し得る。これは、高温ではより大き
な問題になり得るか、あるいは溶媒の場合には強酸または強塩基が必要になる。
【００８７】 温度制御エレメントを含む電気的または電子的なプラテンの組み立て 本発明は、熱サイクル処理用チャンバーおよび犠牲弁などのマイクロフルーイ
ディックス構造体に対応するようにプラテンに配置された温度制御エレメントを
含む電気的または電子的なプラテンを提供する。プラテンおよびマイクロフルー
イディックス構造体は、それぞれのプラットホーム層に構成要素を相互に正しく
配置させるための基点または他の位置決め物を使用してアラインメントされる。
【００８８】 本発明はまた、プラテンおよびマイクロフルーイディックプラットホームを回
転させるための微量操作装置を提供し、これは、電気的接触がデバイスと回転中
のプラテンとの間で維持されることを可能にするスリップリング構造体を回転中
心軸または回転軸において含むことが最も好ましい。温度制御エレメントは、抵
抗ヒーターおよびペルチェ素子を含むサーミスターおよび加熱エレメントを使用
してディスク表面の特定位置において任意の特定温度を維持するためにデバイス
において提供される。このデバイスは、マイクロフルーイディックスディスクの
回転を制御し、そしてマイクロフルーイディックスディスクと一緒に回転するプ
ラテンに対する電気的シグナルをリアルタイムで分配し、かつ受け取る。
【００８９】 デバイスとプラテンとの関係を図２０に例示する。図に関して、プラテン５０
９が、２４チャンネルのスリップリング（Ｌｉｔｔｏｎ社から市販、パーツ番号
ＡＣ６０２３−２４）を含む中心軸５１０に挿入されている。中心軸の周りにお
けるプラテンの回転は、Ｍｉｃｒｏｍｏ社から市販されているエンコーダー（パ
ーツ番号３５５７Ｋ０１２ＣＲ）などのエンコーダーをも含むことが好ましい駆
動モーター５０７によって駆動ベルト５０８を介して制御される。駆動モーター
５０７は、駆動モーター動力線５０５、および適用される場合にはエンコーダー
シグナル配線５０６を介してデバイスによって制御される。
【００９０】 デバイスは、ＰＣなどのコンピューターを含むことが最も好ましいマイクロプ
ロセッサー５０１によって制御される。プラットホームの回転は、例えば、Ｊ．
Ｒ．Ｋｅｒｒ社（パーツ番号ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）から市販されているようなサ
ーボモーター制御器５０３によって制御される。サーボモーター５０３は、Ｓｋ
ｙｎｅｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社（パーツ番号ＡＲＣ−２１３３）から市販さ
れている電源５０４を備えている。サーボモーターは、例えば、ＰＣのＣＯＭポ
ートに接続されたシリアルポート変換器（パーツ番号Ｚ２３８−４８５、Ｊ．Ｒ
．Ｋｅｒｒ社）を使用するインターフェースを介してＰＣによって制御される。
【００９１】 プラテンに対する電気出力を制御するために制御システムを有するデバイスも
また提供される。複線ケーブル５１１により、スリップリングは、温度センサー
配線５１２によってＰＣ内の市販のＡ／Ｄボード盤（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｂｏａ
ｒｄｓ、パーツ番号ＣＩＯ−ＤＡＳ１６００）に接続されている比例・積分・微
分（ＰＩＤ）回路に接続される分岐ボード盤５１７に接続される。この回路は、
下記においてより詳細に開示されているプラテン表面のサーミスターからの温度
データを受け取り、そしてプログラム可能な電流源５１５および電源５１６によ
って温度制御エレメントに対する電流送達を制御する。
【００９２】 プラテン自体は図２１に平面図で示されている。プラテンは、電子的エレメン
ト（電気リード線、サーミスター、ペルチェ素子、マイクロフルーイディックス
ディスクとの熱接触を提供するための青銅ブロック、および熱を消散させるため
の放射フィンを含む）が取り付けられている印刷された回路ボード盤５５１から
組み立てられることが最も好ましい。
【００９３】 図２１は、ペルチェ素子５５４とともに図に例示されているプラテンにおける
温度制御エレメントの配置を示している。プラテンは、マイクロフルーイディッ
クスディスクにおけるマイクロフルーイディックス構造体に対応させるためにプ
ラテン表面に配置された青銅の熱接点５５２および５５３を有する。青銅の接点
５５２は、温度検知エレメントを収容するために、その中に埋め込まれた溝５５
５を有する。それぞれの組合せにおける熱接点との間には、ペルチェ素子５５４
が配置されている。図には、青銅の熱接点５５７および５５８、溝５５９ならび
にペルチェ素子５５８を含む別の温度制御エレメントもまた例示されている。こ
れらのエレメントを配置することにより、特定のマイクロフルーイディックス構
造体の多数の構成要素（例えば、熱サイクル処理用チャンバーおよび溶解チャン
バーなど）の温度制御および加熱が可能になる。
【００９４】 プラテンにおける温度制御エレメントを制御する電気リード線は、図２２にお
いてより詳細に示されている。ペルチェ素子５５４は、６０７および６０８を介
して接続されているリード線６０１および６０５によって制御される。溝５５５
に含有されるサーミスター６０６は、６０９および６１０を介して接続されてい
るリード線６００および６０２によって制御される（すなわち、温度情報が、加
熱時または冷却時のサーミスターにおける電流の流れに対する抵抗の変化の形態
でＰＣ内の温度制御エレメントに伝えられる）。同様に、ペルチェ素子５５８は
、６１２および６１３を介して接続されているリード線６０３および６０５によ
って制御される。溝５５９に含有されるサーミスター６１１は、６１４および６
１５を介して接続されているリード線６０２および６０４によって制御される（
すなわち、温度情報が、加熱時または冷却時のサーミスターにおける電流の流れ
に対する抵抗の変化の形態でＰＣ内の温度制御エレメントに伝えられる）。プラ
テン上のエレメントとスリップリングとの電気的接続を構築することにおいて、
同じリード線を「アース」として使用すること（例えば、サーミスター６０６お
よびサーミスター６１１との間のリード線６０２に対する共通した接続を参照の
こと）は、エレメントあたりに使用される接続の数を保存し、プラテンあたり８
個までのエレメントの制御を可能にする。
【００９５】 温度制御エレメントの構造が図２３に断面で示されている。ペルチェ素子５５
４は、プラテン表面５５１において青銅の接点５５２と５５３との間に配置され
、そしてボルト６５３および６５４を用いてつながれる。青銅の接点５５２およ
び５５３は、ペルチェ素子５５４に対して、そしてペルチェ素子５５４にから熱
を移動させるための熱源およびヒートシンクとして作用する。マイクロフルーイ
ディックディスクは青銅の接点５５２に位置する。ディスクを加熱するとき、ペ
ルチェ素子５５４の上部表面が青銅の接点５５２を加熱し、青銅の接点５５３が
冷却される。ディスクを冷却するとき、ペルチェ素子５５４の上部表面が青銅の
接点５５４を冷却し、青銅の接点５５３を加熱する。さらなるアルミニウムヒー
トシンク６５２が、青銅の接点５５３と熱的に接触した状態で配置される。これ
により、さらなるヒートシンク能力がもたらされ、ペルチェ素子５５４の性能が
高められる。アルミニウムのヒートシンク６５２は、ねじ６５１および６５５を
使用してプラテン５５１に取り付けられる。青銅の接点５５２は、サーミスター
の温度感度を増大させるアルミナが満たされたエポキシ樹脂６５０を含有するく
ぼみにサーミスター６０６を含有する。熱グリースが、部品間の熱接触を増大さ
せるために、部品５５２、５５４、５５３および６５２の間に塗布される。
【００９６】 本発明のプラテンを使用する際、本発明のプラットホームは、青銅の接点とプ
ラスチックのマイクロフルーイディックス層との間に熱グリースを使用して組み
立てられる。あるいは、青銅の接点が、柔軟なプラスチックのマイクロフルーイ
ディックス層に機械的に固定されている凸状の層として提供される。
【００９７】 本発明のプラテンの代わりの実施形態には、１つまたは多数のマイクロプロセ
ッサーを含むいわゆる「インテリジェント」プラテンが含まれ、それによって、
スリップリングと、プラテンの基板を含む印刷された回路ボード盤との間の接続
の組合せを減らすことができる。ＢＡＳＩＣ ＳＴＡＭＰ ＩＩの埋め込み型制
御器などの一体化された回路パッケージは、プラテンの電気回路を介するシグナ
ルの分配を制御するためにＰＣによって事前にプログラムすることができる。そ
れによって、入力電源とアースとの接続のみがスリップリングとプラテンとの間
に必要となるだけである。
【００９８】 ＤＮＡサンプル調製プラットホーム 本発明は、細菌細胞または真核生物（最も好ましくは哺乳動物）細胞からプラ
スミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを調製するためのＤＮＡサンプル適用プラット
ホームを提供する。本発明のこの局面は、本明細書中では単一のマイクロフルー
イディックス構造体について記載される。しかし、多数のこれらのマイクロフル
ーイディックス構造体を含むプラットホームが提供され、そして本発明によって
包含される。この場合、本明細書中に記載されている多数のマイクロフルーイデ
ィックス構造体がプラットホーム上に提供されている。
【００９９】 次に本発明をより十分に説明するために図を参照すると、図１４は、マイクロ
フルーイディックディスクのサンプル処理構造の１つの実施形態を詳細に例示し
ている。向きに関して、ディスクの中心は図の上方にある。チャンバー１００５
は、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有し、
幅が約０．７ｃｍ〜１．５ｃｍで、長さが約０．４ｃｍ〜約０．８ｃｍであり、
かつサンプル入力チャンバーおよび混合チャンバーの組合せにおいて約５０μＬ
〜約１．０ｍＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：１．４３１５ｃｍ、長
さ：０．７８７９ｃｍ）を有する。チャンバー内には、ディスク回転時に、特に
、方向を迅速かつ／または反復的に変化させるディスク回転時に、チャンバー内
に乱流的な流体の動きを生じさせるために、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの幅
および約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの長さ（幅：０．１１５５ｃｍ、長さ：０．
３７２０ｃｍ）である混合用バッフル１００６が存在する。回転の中心から最も
半径方向に最も離れたチャンバー１００５内の位置には、プラットホーム表面に
おける約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有するスロット１００８（深さ：
０．２２８６ｃｍ、幅：１．０５３７ｃｍ、長さ：０．０７９４ｃｍ）が存在し
、スロットには、フィルター１００９が設置されたフリット材が含まれる。フリ
ット材はＰｏｒｅｘ、Ｘ−４５８８（７０μｍの細孔サイズ）によって製造され
、フィルターはＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４であり、これは、ディスクにおいてフ
リット材から半径方向のさらに外側に置かれる。フリット材は、この適用におい
ては、多孔質メンブランとして液体を通過させるが、沈殿物を保持するフィルタ
ーとして作用する。この場合のろ紙は、最終ろ過工程として使用されている；フ
リットは沈殿物の大部分をろ過するが、ろ紙は、沈殿物をほとんど通り抜けさせ
ないより細かい細孔サイズを有する。チャンバー１００５はまた、傾斜部１００
７を備えている。この傾斜部は、プラットホームの深さが半径方向の外向き方向
で減少し、かつチャンバーの底から約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍ（深さ：０．
２２８６ｃｍ）の深さまで隆起して、フィルター用スロット１００８の内側縁を
形成している；スロットの内側部分の深さ（深さ：０．１５２４ｃｍ）はチャン
バー１００５の底とディスクの上部表面との中間であり、従って、十分な速度で
ディスクが回転したときに流体が通り抜けるすき間を形成する。流入ポート１０
１５は、約０．００１ｃｍ〜０．２ｃｍの深さ、０．０１２５ｃｍ〜約０．０２
５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．
０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．２１１８ｃｍ）を有する微小
流路１０１４を介してチャンバー１００５に流体的に接続されている。流入ポー
ト１０１５は、好ましくは、ピペッターおよびその自動化された実施形態などの
フルーイディックス充填デバイスに適合する。
【０１００】 フィルター１００９の半径方向の遠位側において、チャンバー１００５からの
半径方向の外向きの出口が、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約
０．２ｃｍの深さ、約０．０１ｃｍ〜約０．０２５ｃｍの長さ、および約０．０
０１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０
８ｃｍ、長さ：０．２６３１ｃｍ）を有する微小流路１０１０に流体的に接続さ
れている。微小流路１０１４は、犠牲弁１０１２の縁を規定するポケット１０１
１に流体的に接続されている。このポケット１０１１は、プラットホーム表面に
おける約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの深さ、約０．０４ｃｍ〜約０．０８ｃｍ
の長さ、および約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの断面寸法（深さ：０．１０１６
ｃｍ、幅：０．１０６０ｃｍ、長さ：０．０７６２ｃｍ）を有し、その半径方向
の遠位端には、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１
６日発行、これは参考として組み込まれる）においてより詳しく示されているよ
うなワックスまたは他の材料を使用して好ましくは作製される犠牲弁１０１２、
および融解したワックスが流路を阻止することなく再固化する再結晶化チャンバ
ー１０１３が存在する。犠牲弁１０１２は、プラットホーム表面における約０．
００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さ、およ
び約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：
０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０５６ｃｍ）を有し、再結晶化チャンバー１０
１３は、約０．７５ｃｍ〜約０．１５ｃｍの深さ、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃ
ｍの長さ、および約０．１ｃｍ〜約０．２ｃｍの幅の大きさを有する（深さ：０
．１５２４ｃｍ、幅：０．２０３１ｃｍ、長さ：０．２３５１ｃｍ）。本明細書
中においてより十分に開示されているように、犠牲弁１０１２は、加熱エレメン
ト（最も好ましくは、抵抗ヒーターまたはペルチェ素子）と熱的に接触している
。この場合、弁を含むワックスは、ヒーターを作動させることによって融解され
る。好ましい実施形態において、ヒーターは、プラットホーム層内において、弁
の下部に、最も好ましくは弁の直下に組み立てられるか、あるいは、ヒーターが
弁の上方または下方にあるように、最も好ましくは弁のすぐ上方またはすぐ下方
にあるように配置された別のプラテンを含む。微小流路１０１１および再結晶化
チャンバー１０１３は、犠牲弁１０１２の長さを規定するために役立ち、そして
ワックスは、溶融状態で堆積したときに、１０１１および１０１３の開口部によ
って流路のこの短い長さに自然に制限される。
【０１０１】 溶解液リザーバー１０１６が、回転軸からチャンバー１００５と実質的には同
じ距離でディスク上に半径方向に配置されている。溶解液リザーバー１０１６は
、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜０．２５ｃｍの深さ、約０．１８
ｃｍ〜０．３６ｃｍの幅、および約０．３ｃｍ〜約０．８ｃｍの長さを有し、か
つ約２５μＬ〜約３００μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．３５
７９ｃｍ（上部）および０．５５３６ｃｍ（底部）、長さ：０．７２９２ｃｍ）
を有し、微小流路１０１７を介してチャンバー１００５に流体的に接続されてい
る。溶解液は、最も好ましくは、微小流路１０１７を介して溶解液リザーバー１
０１６に流体的に接続されている流入ポート１０１９を使用して使用前にプラッ
トホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０１９は
、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディ
ックス充填デバイスに適合する。微小流路１０１７は、約０．００１ｃｍ〜約０
．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃ
ｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：
０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４８４５ｃｍ）。
【０１０２】 沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０もまた、回転軸からチャンバー１００５と
実質的には同じ距離でディスク上に半径方向に配置されている。沈殿化剤緩衝液
リザーバー１０２０は、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜０．２５ｃ
ｍの深さを有し、幅が約０．４ｃｍ〜０．８ｃｍで、長さが約０．２５ｃｍ〜０
．５０ｃｍであり、かつ約３５μＬ〜約４００μＬの容量能（深さ：０．２２８
６ｃｍ、幅：０．７３４９ｃｍ、長さ：０．４９６０ｃｍ）を有し、微小流路１
０２３を介してチャンバー１００５に流体的に接続されている。沈殿化剤緩衝液
リザーバー１０２０と微小流路１０２３との間には、犠牲弁１０２１および再結
晶化チャンバー１０２２が存在し、これらは、実質的には、犠牲弁１０１２およ
び再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置されて
いる。沈殿化剤緩衝液溶液は、最も好ましくは、微小流路１０２４を介して沈殿
化剤緩衝液リザーバー１０２０に流体的に接続されている流入ポート１０２５を
使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において
、流入ポート１０２０は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施
形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０２４は、
約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ
、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：
０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４８４５ｃｍ）。
【０１０３】 犠牲弁１０１２に対して半径方向の遠位には、微小流路１０２６が存在する。
これは、それによってチャンバー１００５に流体的に接続されている。微小流路
１０２６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０２５ｃｍ〜約０
．０５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさ
を有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．７０６
０ｃｍ）。微小流路１０２６は結合カラム１０２７に流体的に接続されており、
これはＤＮＡ親和性マトリックスをさらに含む。結合カラム１０２７は、約０．
１０ｃｍ〜０．２ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６５ｃｍの長さ、約０．２
ｃｍ〜約０．４ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約５μＬ〜約２０μＬの容
量能（深さ：０．１８７５ｃｍ、幅：０．３５１１ｃｍ（底部）、０．０４ｃｍ
（上部）、長さ：０．５７２７ｃｍ）を有する。結合カラム１０２７はまた、プ
ラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有し、約０．
０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さで、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの断面寸法で
あるマトリックス材用スロット１０２８を含み、そして約５μＬ〜約１５μＬの
容量能（深さ：０．２３８３ｃｍ、幅：０．５０８２ｃｍ、長さ：０．０９２１
ｃｍ）を有する。これは、組み立てられたときに、フリットによって構造的に支
持されたマトリックス材１０２９を含有する。結合材は、ＤＮＡの水和殻が破棄
されるカオトロピック性の塩溶液中にＤＮＡが存在するときにＤＮＡと結合する
ガラス繊維であるＷｈａｔｍａｎガラス繊維フィルター（ＧＦ−Ｆ）からなる。
フリット材は、この場合には、柔軟すぎて構造体内において自身を支持すること
ができないガラスフィルターに対して固体の担体支持材を提供する固体の多孔質
材料（７０μｍの細孔サイズ）である。結合カラム１０２７はまた、プラットホ
ーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、約１．７５ｃ
ｍ〜約３．５ｃｍの長さで、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ
：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：３．１９５５ｃｍ）である
空気移動流路１０５１と、空気通気孔１０５２とを備えている。これらは、流体
を空気移動流路１０５１に流れ込ませることなく流体がそれらを通って流れたと
きに、空気を結合カラムから追い出すことができるように組み立てられる。
【０１０４】 プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．
００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法を有し、かつ約０．１ｃｍ〜約０．２ｃｍ
の長さ（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．２０４１
ｃｍ）である微小流路１０３０が、犠牲弁１０３２の縁を規定するポケット１０
３１に流体的に接続されている。このポケットは、プラットホーム表面における
約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの深さ、約０．０４ｃｍ〜約０．０８ｃｍの長さ
、および約０．０６ｃｍ〜約０．１２ｃｍの断面寸法（深さ：０．１０１６ｃｍ
、幅：０．１１２１ｃｍ、長さ：０．０７６２ｃｍ）を有する。ポケット１０３
１は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約
０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法を有し、かつ約０．０５ｃｍ〜約０．
１ｃｍの長さであり（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：
０．０８７６ｃｍ）、そして犠牲弁１０１２および１０２１に関して上記に記載
されているように組み立てられる犠牲弁流路１０３２によってサンプル回収リザ
ーバー１０５３から分離されている。サンプル回収リザーバー１０５３は、約０
．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、および
約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約２０μＬ〜約２
５０μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．６１３２ｃｍ、長さ：０
．３７４８ｃｍ）を有する。サンプル回収リザーバーは空気移動流路１０５４お
よび空気通気孔１０５５を備えている。空気移動流路１０５４は、プラットホー
ム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、約０．２ｃｍ〜
約０．４ｃｍの長さで、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法である（深
さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．３３１６ｃｍ）。こ
れらの構造体は、流体を空気移動流路１０５４に流れ込ませることなく流体がそ
れらを通って流れたときに、空気を結合カラムから追い出すことができるように
組み立てられる。
【０１０５】 ポケット１０３１から半径方向の内側には、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍ
の深さ、約０．０２５ｃｍ〜約０．５０ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜
約０．２ｃｍの断面寸法の大きさ（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４
ｃｍ、長さ：０．４１９５ｃｍ）を有する微小流路１０３３がつながる。いくつ
かの実施形態において、微小流路１０３３は、流体による濡れに対して抵抗性を
有する疎水性表面を提供するように処理される。この微小流路の区域に沿って、
微小流路の方向を半径方向の外側に向け、そして廃棄物リザーバー１０３４に至
る屈曲部が存在する。廃棄物リザーバー１０３４は、約０．１５ｃｍ〜約０．３
ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、および約２．５ｃｍ〜約５．
０ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約３５０μＬ〜約１．５ｍＬの容量能（
深さ：０．２７９４ｃｍ、幅：４．４７８３ｃｍ、長さ：０．５６８７ｃｍ）を
有する。廃棄物リザーバーは空気移動流路１０３５および空気通気孔１０９９を
備えている。空気移動流路１０３５は、プラットホーム表面における約０．００
１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、かつ約０．５ｃｍ〜約１．０ｃｍの長さで
、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法である（深さ：０．０２５４ｃｍ
、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．９２４０ｃｍ）。これらの構造体は、流体
を空気移動流路１０３５に流れ込ませることなく流体がそれらを通って流れたと
きに、空気を結合カラムから追い出すことができるように組み立てられる。
【０１０６】 プラットホームのサンプル調製マイクロ構造体はまた、第１および第２の洗浄
リザーバー１０３６および１０４７を含む。第１の洗浄リザーバー１０３６は、
約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．２３ｃｍ〜約０．４６ｃｍの長さ
、および約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約５０
μＬ〜約６００μｍＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：１．３３５７ｃ
ｍ、長さ：０．４６００ｃｍ）を有する。このリザーバーは、微小流路１０３９
によって微小流路１０２６に流体的に接続されている。微小流路１０３９は、実
質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載
されているように配置された犠牲弁１０３７および再結晶化チャンバー１０３８
によって遮断されている。犠牲弁１０３７は、約０．０１ｃｍ〜約０．０３ｃｍ
、約０．０８ｃｍ〜約０．１２ｃｍの長さ、および約０．０１ｃｍ〜約０．０３
ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４
ｃｍ、長さ：０．１００７ｃｍ）。再結晶化チャンバー１０３８は、約０．１ｃ
ｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．
１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ
、幅：０．２１２６ｃｍ、長さ：０．２３０２ｃｍ）。微小流路１０３９は、約
０．０１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、およ
び約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１
５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．５９１０ｃｍ）。第１の洗浄液
は、最も好ましくは、微小流路１０４１を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０
３６に流体的に接続されている流入ポート１０４０を使用して使用前にプラット
ホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０４０は、
好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディッ
クス充填デバイスに適合する。微小流路１０４１は、約０．００１ｃｍ〜約０．
２ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ
〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０
．０５０８ｃｍ、長さ：０．２５２１ｃｍ）。
【０１０７】 第１の洗浄リザーバー１０４７は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約
０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの断
面寸法の大きさを有し、かつ約７５μＬ〜約８５０μｍＬの容量能（深さ：０．
２３８８ｃｍ、幅：１．４１８０ｃｍ、長さ：０．５０６５ｃｍ）を有する。こ
のリザーバーは、微小流路１０５０によって微小流路１０２６に流体的に接続さ
れている。微小流路１０５０は、実質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャ
ンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置された犠牲弁１０４８
および再結晶化チャンバー１０４９によって遮断されている。犠牲弁１０４８は
、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長
さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ
：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０２３ｃｍ）。再結
晶化チャンバー１０４９は、約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの深さ、約０．１５
ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の
大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２１７９ｃｍ、長さ：０．
２４３５ｃｍ）。微小流路１０５０は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ
、約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍ
の断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ
、長さ：０．３７２４ｃｍ）。第２の洗浄液は、最も好ましくは、微小流路１０
５６を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０４７に流体的に接続されている流入
ポート１０５７を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これら
の構造体において、流入ポート１０５７は、好ましくは、ピペッターまたはその
自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小
流路１０５６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約
０．５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさ
を有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４３４
７ｃｍ）。
【０１０８】 溶出緩衝液リザーバー１０４２が、回転の中心から、第１または第２の洗浄リ
ザーバー１０３６および１０４７よりも遠位の半径方向に配置される。溶出緩衝
液リザーバー１０４２は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．１５ｃ
ｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．４ｃｍ〜約０．８ｃｍの断面寸法の大き
さを有し、かつ約２０μＬ〜約２５０μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、
幅：０．７３０８ｃｍ、長さ：０．２７８７ｃｍ）を有する。このリザーバーは
、微小流路１０４４によって微小流路１０２６に流体的に接続されている。微小
流路１０４４は、実質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３
に関して上記に記載されているように配置された犠牲弁１０５８および再結晶化
チャンバー１０４３によって遮断されている。犠牲弁１０５８は、約０．００１
ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さ、および約０
．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４
ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０１２ｃｍ）。再結晶化チャンバー
１０４３は、約０．０７５ｃｍ〜約０．１５ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０
．３ｃｍの長さ、および約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の大きさを有
する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２１２６ｃｍ、長さ：０．２３０２ｃ
ｍ）。微小流路１０４４は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０
２５ｃｍ〜約０．０５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断
面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長
さ：０．８５８６ｃｍ）。第２の洗浄液は、最も好ましくは、微小流路１０５６
を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０４７に流体的に接続されている流入ポー
ト１０５７を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構
造体において、流入ポート１０５７は、好ましくは、ピペッターまたはその自動
化された実施形態などのフルーイディック充填デバイスに適合する。微小流路１
０５６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約１．０ｃｍ〜約２．０ｃ
ｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する
（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：１．６６２３ｃｍ）
。
【０１０９】 本明細書中に開示されているようなマイクロフルーイディックス構造体は、好
ましくは、別の層であり得るか、または本明細書中に開示されているように別個
のプラテンエレメントとして提供され得るヒーター層と熱的に接触して操作され
る。
【０１１０】 ヒーター層がプラテン自体の別個の層を含むプラットホームの実施形態におい
て、ヒーター層は、リザーバー層をシールし、それによってそのディスクの表面
におけるポケットから離れて包まれたチャンバーを形成すること、そして電気リ
ード線およびヒーターのアレイによって局所的な加熱を提供することの両方に役
立つ。ヒーター層１１０１およびその構成要素構造体が図１５に例示されている
。ヒーター層１１０１は、ヒーター層の表面に配置された、約０．０５ｃｍ〜約
０．０７ｃｍの幅（幅：０．０５０８ｃｍ）および約１ｃｍ〜１０ｃｍの長さを
有する印刷されたか、またはそれでなければ蒸着された電気リード線１１０４が
存在する柔軟なプラスチックシート１１０２（最も好ましくは、ＩＣＩから市販
されている、約０．００７６２ｃｍの厚さを有するマイラーシート）からなる。
ヒーター１１０８もまた、柔軟なプラスチックシート１１０２に印刷されている
か、またはそれでなければ蒸着されており、約０．１ｃｍ〜約１ｃｍの幅（幅：
０．６８９１ｃｍ〜０．２０３２ｃｍ）および約０．１ｃｍ〜約０．５ｃｍの長
さ（長さ：０．２０３２ｃｍ〜０．２０６７ｃｍ）を有する。電気リード線１１
０４は、好ましくは、銀系インクなどの導電性材料から組み立てられ、一方、ヒ
ーター１１０８は、好ましくは、炭素系インクなどの抵抗性材料から組み立てら
れる（マイラーシート上の印刷体は約１０μｍの厚さを有する）。電気回路は、
微量操作装置においてピンアセンブリーによって接続され得るヒーター層の中心
近くに配置された、約０．１ｃｍ〜０．２ｃｍの半径（半径：０．１３９７ｃｍ
）を有する接点パッド１１０５からなる；これらのピンが接触している場合、装
置によって１つの部分が形成され、そしてヒーター層によってもう一方の部分が
形成される閉じた電気回路が形成され得る。ヒーター層と装置との間におけるこ
れらのタイプの電気的接続は、共同所有の米国特許第６．０６３，５８９号（２
０００年５月１６日発行、これは参考として本明細書中に組み込まれる）におい
てより詳しく開示されている。リード線１１０６は、電流の共通した供給源また
はシンクを形成する。リード線１１０７は、ヒーターエレメント１１０８を通っ
てこの共通リード線から分岐し、次いで様々なパッド１１０５に接続される。高
電圧源が個々のヒーターに対応するパッドに加えられ、そして１１０６と結合し
た接点パッドがアースされた場合、電気電流が、リード線、およびエネルギーを
消散して発熱する抵抗エレメントを通って流れる。
【０１１１】 最後に、いくつかの実施形態において、プラットホームはまた、ヒーターをそ
の後に使用して、より効率的に加熱するためにプラットホームを断熱するのに役
立つ基層１２０１を含む。基層１２０１の構造は単に、本発明の微量操作デバイ
スのローターまたは中心軸と一致させるための中心孔１２０２（約１ｃｍ〜１．
５ｃｍの半径を有する：半径：１．４３５１ｃｍ）を有する断熱性物質である。
【０１１２】 本発明のＤＮＡ調製プラットホームの使用において、細胞培養物（特に、細菌
細胞培養物）がプラットホームに加えられ、そしてプラスミドＤＮＡが、細胞溶
解；プラスミドＤＮＡの細菌細胞破片、細胞タンパク質および細胞ゲノムＤＮＡ
からの分離；緩衝液交換を行い、それによって単離プラスミドＤＮＡのその後の
使用と適合しない単離溶液の成分を除くために洗浄される親和性マトリックスに
おけるプラスミドＤＮＡの捕捉；プラスミドＤＮＡの溶出および回収によって単
離される。
【０１１３】 本発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームのマイクロフルーイディックス
構造体を通過する流体の動きの順序が図１７に例示されている。プラットホーム
の使用を説明することにおいて、マイクロフルーイディックス構造体、試薬およ
びサンプルのサイズおよび量が例示的な実施形態ではかっこ内に示されている。
【０１１４】 使用されるプラットホームを準備するために、試薬溶液が下記のように加えら
れる。下記溶液の量がプラットホームに加えられる：約２５μＬ〜約３００μＬ
（５０μＬ）のアルカリ細胞溶解液が、流入ポート１０１９および微小流路１０
１８を使用してリザーバー１０１６に充填される；約２０μＬ〜約２５０μＬ（
４０μＬ）の溶出緩衝液が、流入ポート１０４６および微小流路１０４５を使用
してリザーバー１０４２に充填される；約５０μＬ〜約６００μＬ（１００μＬ
）の第１の洗浄液が、流入ポート１０４０および微小流路１０４１を使用してリ
ザーバー１０３６に充填される；約７５μＬ〜約８５０μＬ（１５０μＬ）の第
２の洗浄液が、流入ポート１０５７および微小流路１０５６を使用してリザーバ
ー１０４７に充填される；そして約３５μＬ〜約４００μＬ（７０μＬ）の沈殿
化溶液が、流入ポート１０２５および微小流路１０２４を使用してリザーバー１
０２０に充填される。
【０１１５】 その後、サンプルが、細菌培養物の約２５μＬ〜約３００μＬ（５０μＬ）の
量で、流入ポート１０１５および流路１０１４を介してチャンバー１００５に加
えられる。
【０１１６】 その後、プラットホームが、本明細書中に記載されているようにヒーターを作
動させるために、微量操作デバイスの中に置かれ、好ましくは、本明細書中およ
び共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、こ
れは参考として組み込まれる）に記載されているようにスリップリングを含むロ
ーターに置かれる。ヒーター層を伴う実施形態において、スリップリングアセン
ブリーのピンはヒーター層のパッド１１０５と接触させられる。これらの実施形
態において、アライメント用の溝１００３は、図１５に示されているように、デ
ィスクに対するスリップリングアセンブリーの向きを設定するために役立つ。ヒ
ーター層が、スリップリングのピンによってヒーター層のピンマークがそろうよ
うな方法でフルーイディックス層とともにアラインメントされる。
【０１１７】 その後、ディスクは、リザーバー１０１６から微小流路１０１７を通ってチャ
ンバー１００５内に至るアルカリ細胞溶解液の流体の流れが駆動されるのに十分
な約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第１の回転速度に加速される。その後、
プラットホームは、急激な正および負（すなわち、前方向および後方向）の角加
速度に供され、それにより、混合を行うためにその角速度を増減させることによ
って攪拌される。混合用バッフル１００６は、図に例示されているように、流体
の大部分に対して折り返される長い部分に流体を引き入れることによって流体を
「薄層化」する流体内の円運動を生じさせるのに役立つ。流体は繰り返し薄層化
されるので均質化される。微細加工されない大きな容量およびシステムの場合、
十分な角加速度により、チャンバー１００５内の流れもまた、混合を助ける乱流
になる。
【０１１８】 均質な混合を達成するために十分な時間（これは、サンプル量およびチャンバ
ー１００５のサイズに依存しており、従って経験的に決定される）の後、サンプ
ル内の細菌は溶解を受け、ＤＮＡが溶液中に放出される。その後、ディスクの回
転速度は約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍ（？？？）の第２の回転速度で維持
され、そして毛管１０２１内のワックス弁が、この弁と熱的に接触している対応
するヒーターパッドに電圧を加えることによって融解される。熱は、ワックスを
融解し、そして流れる流体が融解したワックスを毛管から再結晶化チャンバー１
０２２内に移動させるのに十分な時間にわたって加えられる。角速度は、沈殿化
溶液のすべてが混合チャンバー内に移動させられるまで維持される。
【０１１９】 その後、ディスクは、混合のために、上記に記載されているように再度攪拌さ
れる。沈殿化溶液の作用は、均質な溶解混合物のゲノムＤＮＡ、タンパク質およ
び細胞破片成分を沈殿させることである。この沈殿化は、フィルター１００９に
よって捕捉され得る凝集物を生じさせる。これは、上記および本文の組み立ての
部分に記載されているように、Ｐｏｒｅｘフリット材Ｘ−４５８８（７０μｍの
細孔サイズ）およびＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４から構成される。
【０１２０】 十分な混合の後、ディスクの回転速度は約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの
第３の回転速度で維持され、その後、毛管１０１２内のワックス弁が、この弁と
熱的に接触している対応するヒーターパッドに電圧を加えることによって融解さ
れる。熱は、ワックスを融解し、そして流れる流体が融解したワックスを毛管か
ら再結晶化チャンバー１０１３内に移動させるのに十分な時間にわたって加えら
れる。角速度は、流体のすべてが混合チャンバーから毛管１０１０、１０１２お
よび１０２６を通って結合カラム１０２７内に移動させられるまで維持される。
細胞破片および望まれない沈殿物はフィルター１００９上に捕捉される。
【０１２１】 プラットホームは、流体が向心加速度によって結合マトリックスを通って移動
させられるのでこの角速度で回転させられる。微小毛管１０３２は犠牲弁によっ
て阻止されているので、流体は、流路の表面処理の疎水性に打ち勝つ向心力によ
って誘導される圧力によって微小流路１０３３内に移動させられる。その後、流
体は廃棄物チャンバー１０３４に送達される。
【０１２２】 プラットホームの回転は、典型的には多孔質材料である結合チャンバー１０２
７内のマトリックス１０２８をすべての流体が通過するまで維持される。廃棄物
チャンバー１０３４に流体的に接続されている微小流路１０３３の端はプラット
ホームの回転軸からチャンバーの反対側の端よりも遠位にあるので、結合チャン
バー１０２７、微小流路１０３０およびポケット１０３１からサイフォン吸上げ
作用によってすべての流体を引き寄せることができる。これは、様々な工程の工
程間の汚染または逆流を減らす利点を有する。
【０１２３】 流体のすべてがマトリックス１０２８を通って移動させられると、プラスミド
ＤＮＡはそれに結合する。典型的には、これらのマトリックス材は、ＤＮＡの負
電荷を引き寄せる正の電荷を示す。ＤＮＡとマトリックスとの電荷の違いを利用
する、ディスク上に提供されている親和性マトリックスには、いくつかの異なる
タイプが存在する。けいそう土、精製シリカ樹脂、ＤＥＡＥならびにガラス繊維
フィルターを含むイオン交換樹脂ならびにシリカおよびガラス繊維はともに、電
荷の違いを使用してＤＮＡと結合する能力をディスク上において明らかにするた
めに使用されている。その後、プラットホームは約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒ
ｐｍの第４の回転速度で回転させられ、同時に、熱が毛管１０３７内のワックス
弁に加えられ、第１の洗浄液が、結合カラム１０２７に流体的に接続されている
微小流路１０３９、次いで微小流路１０２６を通って放出される。この流体は、
前記に記載されているように、結合マトリックスを通って廃棄物チャンバー内に
移動させられる。この洗浄は、マトリックス材内に捕捉されている溶解液および
沈殿化溶液の成分を除くことを目的としている。
【０１２４】 その後、リザーバー１０４７内に含有されている第２の洗浄液が、その犠牲弁
１０４８の融解によって放出され、流体は微小流路１０５０および１０２６を通
って結合チャンバー１０２７内に流れ、結合チャンバー１０２７を洗浄して、マ
トリックス１０２８を通って廃棄物チャンバー１０３４に至る。
【０１２５】 これらの処理の後、マトリックスに結合しているプラスミドＤＮＡは、サンプ
ル調製工程において使用された他の流体および材料を微量含有するだけである。
その後、プラットホームは約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第５の回転速度
で回転させられ、そして毛管１０３２内の犠牲弁が、熱を加えることによって開
けられ、結合チャンバー１０２７内のマトリックス１０２８とサンプル回収リザ
ーバー１０５３との流体接続が開けられる。熱は、毛管１０５８内の犠牲弁にも
加えられる。溶出緩衝液は、微小流路１０４４および１０２６ならびに結合カラ
ム１０２７を通って、最も詳細には、マトリックス１０２８を通って移動させら
れる。微小流路１０３２は開いているので、流体は優先的にサンプル回収リザー
バー１０５３内に流れる。これらの条件のもとにおいて、微小流路１０３３のト
ポグラフィー、その疎水性コーティング、またはその両方は、好都合なことに、
流体が廃棄物リザーバー１０３４に流れることを妨げる。疎水性コーティングも
また、好都合なことに、微小流路１０３３を通ってサンプル回収チャンバー１０
５３内への廃棄溶液の逆流を妨げる。
【０１２６】 その後、プラットホームは停止させられ、そして単離されたプラスミドＤＮＡ
を含有する流体サンプルがポート１０５５および微小流路１０５４を介して回収
される。
【０１２７】 サンプル調製およびインビトロ増幅の一体化プラットホーム 本発明はまた、ＤＮＡサンプル調製、インビトロ増幅および生成物の回収また
は分析を含む一体化された１組の生化学的反応を行うことができるマイクロフル
ーイディックス構造体を有するプラットホームを提供する。本発明のこの局面は
、本明細書中では１つのマイクロフルーイディックス構造体について記載される
。しかし、多数のこれらのマイクロフルーイディックス構造体を含むプラットホ
ームが提供され、本発明によって包含される。この場合、本明細書中に記載され
ている多数のマイクロフルーイディックス構造体がプラットホーム上に提供され
ている。
【０１２８】 次に、本発明をより詳しく説明するために図面を参照すると、図１は、多数の
インビトロ増幅反応を行うためのディスクの一例の分解図を示している。このプ
ラットホームの例示された実施形態は、６つの個々のサンプルについて６つの独
立したサンプル調製およびＰＣＲ操作を行うことができる。より多くのサンプル
数、ならびにサンプルの分割および／または組合せに対してプラットホームの能
力が拡大される本発明の別の実施形態は容易であり、下記に議論されている。こ
こに示されたディスクにより、一般的な形態の９６個のアッセイが行われる：第
１の流体Ａが第２の流体Ｂと混合され、 このディスクは、マイクロフルーイディックス構造体を所定の半径でディスク
の周りに繰り返すことによって、そして異なる半径位置のところに設置するため
に構造体を改変することによって、同一のアッセイが行われ得ることを例示する
。このようにして、アッセイを行うためのマイクロフルーイディックス構造体で
ディスクの表面を完全に覆うことが可能である。行うことができるアッセイの最
大数は、再現性よく操作され得る流体の容量、すなわち、ディスクが製造され得
る最小の再現可能な大きさに依存し、そして小容量の流体を、都合のよい回転速
度で微小流路を通って移動させるために必要とされる流体力学的圧力の量に依存
する。これらの事項を考慮に入れると、６ｃｍの半径を有する円形プラットホー
ムにおいて、１ｎＬ〜５ｎＬの容量を有する１０，０００を越えるアッセイが行
われ得ることが見積もられる。
【０１２９】 図１において、ディスク１００は、マイクロフルーイディックスディスク２０
１、シール層３０１、および１つまたは２つ以上の熱シール層４０１の少なくと
も３つの構成要素を含む。いくつかの実施形態において、マイクロフルーイディ
ックスディスク２０１はさらに、少なくとも２つの構成要素層の組合せとして提
供される。この場合、リザーバー層５０１がマイクロフルーイディックス層６０
１に結合している。これらの実施形態において、リザーバー層の底面は、下記に
記載されているマイクロフルーイディックスディスクと一致している場合、閉じ
た流路およびリザーバーの完全なネットワークを形成し、これを介して、流体が
、中心軸の周りにおけるプラットホームの回転によって生じる向心力の推進力の
もとで流れる。すべての実施形態において、流体の流れは、アッセイにおける様
々な成分流体の混合、ならびにサンプルリザーバーおよび試薬リザーバーから混
合用構造体を通ってアッセイ回収チャンバー内への流体の移動を可能にする。さ
らに、流体の流れが、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年
５月１６日発行、これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されてい
る構造体を使用して、インキュベーション工程および洗浄工程を含むように達成
され得る。約１ｎＬ／ｓ〜約１０００μＬ／ｓの流体流速が約４ｒｐｍ〜約３０
，０００ｒｐｍの回転速度で達成される。好ましくは、「受動」的な弁または毛
管弁が、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発
行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６
１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１
９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１
２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同
第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，
４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（
２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらの
それぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されて
いるようにプラットホーム内における流体の流れを制御するために使用される。
本発明のプラットホームの操作において、回転によって誘導される静水圧と、小
さな流路およびオリフィスにおいて及ぼされる毛管圧との競合が、回転に依存し
たゲート操作システムまたは弁操作システムを提供するために利用される。流体
がプラットホームの外縁に向かって配置された検出チャンバー内に入った後、シ
グナル（最も好ましくは、光学的シグナル）が検出される。
【０１３０】 プラットホーム１００は、好ましくは、ディスクの形状で提供され、約１０ｍ
ｍ〜約５０ｍｍの直径および約０．１ｍｍ〜約２５ｍｍの厚さを有する円形の平
面状プラットホームである。マイクロフルーイディックスディスク２０１の構造
を図２に示す。図２には、「底」面が、本発明のプラットホームのこの実施形態
をより明瞭に例示するために示されている。
【０１３１】 マイクロフルーイディックスディスク２０１は、好ましくは、ディスクの形状
で提供され、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍの直径および約０．１ｍｍ〜約２５ｍｍの
厚さを有する円形の平面状プラットホームである。このディスクは、好ましくは
、約１ｍｍ〜約２０ｍｍの直径を有する中心軸に固定するための中心孔２０２を
含む。中心孔２０２は、中心軸に対する接続のために押出し成形された取り付け
部品によって置き換えることができ、あるいは完全に存在しなくてもよく、その
ような場合、中心軸に対する位置決めおよび接続は、プラットホーム表面の別の
部分を使用して達成される。マイクロフルーイディックスディスク２０１はまた
、プラットホームが中心軸に載せられたときに、プラットホーム上方の固定用取
り付け具が、プラットホームの上部表面と接触することなくプラットホームの上
部表面の近くに置かれることを可能にする溝２０３などの位置決め構造体を含む
ことができる。この特徴を有する実施形態において、ディスクが低ｒｐｍで回転
すると、固定用取り付け具におけるピン（好ましくは、スプリング付きピン）が
溝内を滑り、固定用取り付け具を捕まえる。従って、これにより、プラットホー
ムの向きがそれに関して決定される。別の実施形態において、プラットホームは
、「ホームフラッグ」２０４、すなわち、プラットホームの表面に配置されて、
ディスクが回転したときに発光体／フォトダイオードの対によって検知すること
ができ、従って、装置に関してディスクの向きを決定することを可能にする反射
縞または吸収縞を含む。
【０１３２】 図３には、ディスクの中心が図の上方にあるマイクロフルーイディックスディ
スクの断面の分解図が例示されている。リザーバー２０４、２０５および２０６
は、それぞれ、流体サンプル、細胞アルカリ溶解液および中和緩衝液を含有する
ように設計されている。リザーバー２０４および２０５は、ディスク上における
それらの半径位置および範囲が同一であるように設計され、そしてリザーバー内
に置かれる流体の所望する比に等しい比を形成する断面積（すなわち、プラット
ホーム内の深さｘ横方向の大きさ）を有する。それぞれのリザーバーは、ディス
クの中心に近い位置においてリザーバー内に設置された充填孔（それぞれ、２０
７、２０８および２０９）を有する。それぞれのリザーバーは、約０．０５ｍｍ
〜約５ｍｍの幅、約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍの長さ、および約０．０５ｍｍ〜
約５ｍｍの厚さの大きさを有し、そして約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を
有する。充填孔２０７、２０８および２０９は、好ましくは、マイクロピペッタ
ーなどの自動化された充填デバイス、例えば、１．５ｍｍのチップ直径を有する
標準的な２００μＬのプラスチック製ピペットチップ；直径１ｍｍのマイクロピ
ペッターチップ；圧電的またはセラミックスの液滴送達システム（ＩＶＥＫ Ｃ
ｏｒｐ．（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＴ）によって販売されているものなど）
；インクジェット型流体送達システムに適合した大きさを有する。圧電的送達ま
たはインクジェット送達などの非接触的な送達システムの場合、ポートの大きさ
は、液滴のサイズより数倍大きくなければならない（例えば、１ｎＬの液滴の場
合には０．２ｍｍ）。
【０１３３】 リザーバー２０４の反対側の端は、プラットホーム表面における深さがリザー
バーとは異なる深さで好ましくは組み立てられる微小流路２１０に流体的に接続
されている。この微小流路は、プラットホーム表面における深さが微小流路２１
０とは異なる深さで好ましくは組み立てられる毛管２１１において終了する。毛
管２１１は、ディスクの中心に対してリザーバーの内端よりも近位に位置する空
気通気孔２１２において終了する。リザーバー２０５は、回転軸に対して遠位に
あるリザーバー内の位置において微小流路２１３に流体的に接続されている。微
小流路２１３もまた、微小流路２１０について記載されているように、毛管２１
１において終了する。微小流路２１０および２１３の組み立てならびに毛管２１
１に対するこれらの微小流路の接続は、リザーバー２０４および２０５からの流
体の流れによって空気を追い出することができるが、毛管２１１の断面積は、小
さすぎて、液状の流体がそれらを通って流れることができないように組み立てら
れる。リザーバー２０６は、毛管接合２１５において終了する微小流路２１４に
流体的に接続されている。
【０１３４】 微小流路２１０および２１３は、混合用微小流路２１６に流体的に接続され、
（サンプルを含有するために本明細書中では例示される）リザーバー２０４の内
容物と（アルカリ細胞溶解液を含有するために本明細書中では例示される）リザ
ーバー２０５の内容物との混合を可能にする。混合用微小流路は、混合物が微小
流路の長さ方向の範囲を横切るときに種々の溶液の混合をもたらすように構成さ
れる。混合の程度は、流体の流速および混合用微小流路の長さ方向の範囲に依存
し、２つの流体が接触して一緒に混合される時間の量に比例する。混合の程度は
また、混合用微小流路の横方向の広がりに依存し、そして混合される流体の拡散
定数にさらに依存する。有用な範囲の粘度を有する流体を混合するために十分な
長さを有する混合用微小流路を収容するために、混合用微小流路は、示されてい
るように提供される。混合は、回転方向に対して直交するが、回転軸に対してよ
り近位の位置から回転軸に対してより遠位の位置にまでプラットホーム表面上の
半径方向に広がるプラット表面上の経路を横切るように数回曲げるために微小流
路を構成することによって促進させられる。混合用微小流路２１６は約１ｍｍ〜
約１００ｍｍの長さを有する。その長さは、いくつかの場合には曲げを使用する
ことによって達成される。
【０１３５】 デバイス内の混合は拡散によって促進させられる。２つの小容量ＡおよびＢが
１つの容器に加えられたとき、ＡからＢへの拡散および／またはＢからＡへの拡
散は混合をもたらす。この混合に必要とされる時間の量は、混合が所望される溶
液内の分子の拡散定数、および分子が拡散しなければならない距離に依存する。
例えば、拡散定数Ｄを有する分子を含む０．５マイクロリットルの溶液Ａを、１
辺が１ｍｍのリザーバーに加える。その拡散定数もまたＤである分子を含む溶液
Ｂを加える。これらの溶液は、最初、それらを仕切る境界を有する容量を占める
。流体が非常に混和しやすい場合でさえ、完全に均質な溶液を生じさせるための
拡散時間はほぼ、ｔ＝２ｘ２／Ｄである。ｘ＝０．０５ｃｍ（０．５ｍｍ）およ
びＤ＝１０−５ｃｍ２／ｓの場合、混合時間は５００秒であり、これは、大部分
の反応に関して受け入れられないほど長い時間である。この混合時間は、例えば
、機械的な攪拌によって短くすることができるが、攪拌は、小さな構造体内に制
限された流体において得ることは困難である。これは、流体の流れが層状であり
、そして混合を促進することが知られている乱流的な渦を含有しないからである
。流体Ａを１ｍｍ３の容器に入れ、次いで溶液Ｂを入れる代わりに、流体Ａおよ
びＢが、横方向の大きさがｄである長くて薄い毛管に並んで入れられた場合、混
合に関連する時間ははるかに短くなる。例えば、ｄが１００ミクロンである場合
、混合時間ｔは２０秒である。デバイスの混合用流路は、流体流ＡおよびＢを毛
管微小流路内に同時に注入することによって長い毛管内への流体の導入をまねる
。これらの流体は、最初に、流路を並んで下方向に流れる。プラットホームの回
転によって生じる遠心力により流体が微小流路を通って押し出されると、拡散が
流体間で生じる。十分に狭い直径で、十分な長さの毛管、および十分に小さい送
液速度を選ぶことによって、送液時に流路内に存在するＡおよびＢの総容量のＡ
およびＢの一部を混合させることができる。
【０１３６】 これらの選択は、流体が流路を横切るために必要な時間の量に等しい、混合に
必要な時間を設定することによって決定され得る。拡散に必要な時間は、
【数１】 である（式中、ωは流路の横方向のサイズである）。流路を横切るために必要な
時間の量は単に、流体の速度で除算された流路の長さである。この場合、速度は
、共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／９１０，７２６号（１９９７年
８月１２日出願）およびＤｕｆｆｙ他（１９９９、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：
４６６９〜４６７８）に記載されているように計算される：
【数２】 式中、流体の性質は密度ρおよび粘度ηであり、ΔＲおよび＜Ｒ＞は、向心加速
度にさらされている流体の半径に沿った広がりおよび平均半径位置であり、ｌお
よびｄＨは流路の長さおよび水力直径である。ｔｔがｔｍに少なくとも等しいか
、またはそれよりも大きくなるように変数を選ぶことによって、微小流路内の混
合が保証される。
【０１３７】 混合用微小流路は、回転軸に対して遠位にあるその端においてリザーバー２１
７に流体的に接続されている。リザーバー２１７は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５
ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが約０．０５ｍｍ〜約５ｍ
ｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有し、そして回
転軸に対して近位にあるリザーバーの端に空気移動毛管２２０および空気通気孔
２２１を備えている。これにより、流体が混合用微小流路２１６を通って流れ、
リザーバー２１７に送達されるときに、空気をリザーバーから追い出すことがで
きる。
【０１３８】 混合用微小流路は、回転軸に対して遠位にあるその端においてリザーバー２１
７に流体的に接続されている。リザーバー２１７は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５
ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが約０．０５ｍｍ〜約５ｍ
ｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有し、そして回
転軸に対して近位にあるリザーバーの端に空気移動毛管２２０および空気通気孔
２２１を備えている。これにより、流体が混合用微小流路２１６を通って流れ、
リザーバー２１７に送達されるときに、空気をリザーバーから追い出することが
できる。
【０１３９】 毛管接合２１５は、微小流路２１８流体的に接続されている。図３に例示され
ているように、この微小流路は、リザーバー２０４および２０５からリザーバー
２１７への流体の送達、そしてリザーバー２０７からリザーバー２１９への流体
の送達が同時かつ調和して達成されることを最も容易に可能にするために、混合
用微小流路２１６と同じ長さおよび直径を有するように構成されることが好まし
い。代わりの実施形態において、混合が微小流路２１８において生じないので、
混合用微小流路２１６とは異なる長さを有する微小流路２１８が提供される。別
の代わりの実施形態において、流体がリザーバー２１９に直接充填される。リザ
ーバー２１９は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約
２０ｍｍで、厚さが０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ
〜約５００μＬの容量能を有し、そして回転軸に対して近位にあるリザーバーの
端に空気移動毛管２２０および空気通気孔２２１を備えている。これにより、流
体が混合用微小流路２１８を通って流れ、リザーバー２１９に送達されるときに
、空気をリザーバーから追い出すことができる。リザーバー２１７および２１９
は、ディスクにおけるそれらの半径位置が同一であるように設計され、リザーバ
ー内に置かれる流体の所望する比に等しい比を形成する断面積（すなわち、プラ
ットホーム内の深さｘ横方向の大きさ）を有する。
【０１４０】 リザーバー２１７は、約０．１５ｃｍ〜約０．３０ｃｍの長さ（長さ：０．２
５５２ｃｍ）を有する微小流路２２２に流体的に接続されており、毛管接合２２
３において終了する。毛管接合の反対側には、約０．０１５ｃｍ〜約０．０３０
ｃｍの長さ（長さ：０．０２１８ｃｍ）を有し、かつ空気移動毛管２２５におい
て終了する微小流路２２４が存在する。空気移動毛管２２５は、毛管２２７によ
って拡大容量２２８に接続されている；あるいは、いくつかの実施形態では、拡
大容量２２８は空気通気孔２２８によって置き換えられる。微小流路２２２およ
び２２４の組み立てならびに毛管２２７に対するこれらの微小流路の接続は、リ
ザーバー２１７および２１９からの流体の流れによって空気を追い出すことがで
きるが、毛管２２７の断面積は、小さすぎて、液状の流体がそれらを通って流れ
ることができないように組み立てられる。これらの構造体は、図４においてより
詳しく例示されている。
【０１４１】 リザーバー２１９は、約０．２０ｃｍ〜約０．４０ｃｍの長さ（長さ：０．３
２０５ｃｍ）を有する微小流路２２６に流体的に接続されており、空気移動毛管
２２５において終了し、それとの毛管接合を形成している。微小流路２２６の深
さおよび幅は、毛管２２５につながる場合、好ましくは、微小流路２２２および
２２４の深さおよび幅とは異なる。
【０１４２】 微小流路２２４および２２６は、リザーバー２１７および２１９からの流体の
混合を確実にするために混合用微小流路２１６と同様に設計されている混合用微
小流路２２９に流体的に接続されている。混合用微小流路２２９は、約１ｍｍ〜
約１００ｍｍの長さ（その長さは、いくつかの場合には曲げを使用することによ
って達成される）を有し、そして空気通気孔２３１をも含有するリザーバー２３
０において終了する。リザーバー２３０は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、
長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大
きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有する。リザーバー２３０
は微小流路２３２に流体的に接続されており、これは、半径方向の内側の方向で
プラットホーム表面に配置され、かつ空気移動毛管２３３において終了する。微
小流路２３２と毛管２３３との間の接合２９９は、下記においてより詳しく記載
されているように、毛管停止（ｐｉｎｎｉｎｇ）（弁調節）作用を実質的に阻害
するために、滑らかに広がる拡大部を伴って設計されている。この接合２９９は
混合用微小流路２３４に流体的に接続されており、その半径方向の内側端は拡大
容量２３５内において終了する。リザーバー２３６は、回転軸からリザーバー２
３０と同じ半径距離のところに配置されている。リザーバー２３６は、幅が約０
．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが０．０
５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を
有する。好ましい実施形態において、回転軸から半径方向のより遠位にあるリザ
ーバー２３６の部分２３７は、回転軸に対して半径方向のより近位にある部分２
３８のプラットホーム表面内の深さより浅いプラットホーム表面内の深さを有す
る。リザーバー２３６もまた充填ポートとして役立つ空気通気孔２３９を含む。
【０１４３】 約０．１５ｃｍ〜０．３ｃｍの長さ（長さ：０．２５ｃｍ）および約０．００
１ｃｍ〜約０．０２ｃｍの断面積の大きさを有する微小流路２４０は、空気移動
毛管２３３を伴うリザーバー２３６に毛管接合２９８において流体的に接続され
ている。毛管接合２９９とは対照的に、この微小流路の結合は、「停止（ｐｉｎ
ｎｉｎｇ）」作用をもたらすように設計されている。すなわち、接合により、流
体の流れが阻害される。微小流路２４０は、逆行方向（すなわち、回転軸に向か
って逆向き）にフレア状の開口部が続く制限部２９７を含有するように設計され
ており、毛管２３３に接続される。毛管接合の代わりの実施形態は、共同所有の
米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）および共同所有
で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／９１０，７２６（１９９７
年８月１２日出願）（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）において
より詳しく開示されている通りである。
【０１４４】 約１ｍｍ〜約１００ｍｍの長さを有する混合用微小流路２３４は、その長さは
いくつかの場合には曲げを使用することによって達成されることが最も好ましく
、熱サイクル処理用チャンバー２４１において終了する。熱サイクル処理用チャ
ンバー２４１のプラットホーム表面内の深さは、より詳しくは下記に開示されて
いるように、サイクル処理の熱的条件によって決定される。図３に示されている
ように、熱サイクル処理用チャンバー２４１の回転軸に近い方の部分が、空気通
気孔２４３において終了する空気流路２４２に接続されている。このチャンバー
はまた、熱サイクル処理用チャンバー２４１の直径よりも大きな直径を有する凹
部である断熱用空気ポケット２４５をディスク２０１の反対側の面に含む。
【０１４５】 図５には、熱サイクル処理用チャンバーの領域における組み立てられたディス
クが断面で例示されている。外向きの半径方向が矢印によって示されている。熱
サイクル処理用チャンバー２４１は、示されているように、ディスク２０１の面
における凹部であり、流路２３４が回転軸から半径方向の遠位の位置において進
入する。シール層３０１が、熱サイクル処理用チャンバー２４１を覆うために、
下記に示されているように提供される。断熱用空気ポケット２４５が、シール層
３０１によって覆われてプラットホーム２０１の表面に示されている。
【０１４６】 本発明の微量システムプラットホームは、インビトロ増幅反応を行うために、
最も好ましくは、ＤＮＡ単離、増幅（最も好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）を使用する増幅）、およびディスク上での検出またはディスク以外での
検出（例えば、従来のゲル電気泳動を使用する検出）を行うための増幅フラグメ
ントの単離を含む一体化された１組の生化学的反応を行うために提供される。
【０１４７】 本発明のプラットホームのこの使用が図１〜図５に示されている；この使用は
本開示および実施例から当業者によって理解されるが、プラットホームの機能は
下記に明示的に記載される。
【０１４８】 本発明のプラットホームは、最も好ましくは、細菌細胞または真核生物細胞を
含有する未処理の生物学的流体または予め最大に希釈された生物学的流体、ある
いは細菌培養物または真核生物（最も好ましくは哺乳動物細胞）培養物のサンプ
ル、あるいは哺乳動物細胞を含む血液などの生物学的流体を受け入れ、そして細
胞からのＤＮＡ放出および増幅（最も好ましくは、ＰＣＲによる増幅）の工程に
よってこれらの流体を処理する。
【０１４９】 流体サンプルが流入ポート２０７を介してリザーバー２０４に加えられ、アル
カリ細胞溶解液（一例において、ＮａＯＨ）が流入ポート２０８を介してリザー
バー２０５に加えられ、調整用または中和用の緩衝液溶液（一例において、Ｔｒ
ｉｓＨＣｌ）が流入ポート２０９を介してリザーバー２０６に加えられる。濃度
が約２００μＭである各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１ユ
ニット〜１０ユニットのポリメラーゼ（最も好ましくは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑ
ｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼ）、なら
びにサンプル中の標的ＤＮＡの量および酵素に適切な緩衝液および塩（特に、Ｍ
ｇＣｌ２）（塩化マグネシウムの量は、典型的には、この塩の濃度に対する増幅
反応の感度のために経験的に決定される）のバランスの取れた混合物を含む増幅
溶液が、流入ポート２３９を介してリザーバー２３７に加えられる。これは図９
ａに示されている。その後、プラットホームは、本明細書中に、そしてより詳し
くは共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号ならびに共同所有で同時係属中
の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第
０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；および同第０８／９
１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）（これらは参考として組み込まれ
る）に記載されている微量操作デバイスに載せられる。プラットホームは、ディ
スク上のマイクロフルーイディックス構造体の設置および大きさによって決定さ
れる様式でディスク上における流体の流れを駆動させるために回転させられる。
例示的な回転プロフィルが図８に示されている。示されているように、プラット
ホームは、最初に、角加速度α１で、（図８において４００ｒｐｍよりもわずか
に大きな）初期回転速度ω１にまで緩やかに加速される。回転は、サンプルおよ
びアルカリ細胞溶解液が微小流路２１０および２１３に進入し、その後、それら
が、微小流路２１１を伴う毛管接合において停止させられる（本明細書中におい
て使用されているように「止められる」）まで流れることを可能にするのに十分
な時間（図８において約１０秒間）にわたって維持される。同様に、リザーバー
２０６内の流体は、毛管接合２１５において止められるまで微小流路２１４内に
流れる。その後、ディスクは角加速度α２で速度ω２（図８において約１８００
ｒｐｍ）にまで急速に加速され、これは（図８に示されているように）所定の期
間にわたって維持され得る。この速度での回転によって誘導される圧力により、
微小流路２１１において止められている一方または両方の流体は、微小流路の狭
いすき間を越えて、もう一方の流体と接触させられるか、またはもう一方の流体
を「濡らす」；これにより、このときに接触している流体を回転速度ω３（図８
において約５００ｒｐｍ）の推進力のもとで混合用微小流路２１６内に排出させ
ることができる。
【０１５０】 図３に示されているように、微小流路２１０は、微小流路２１３よりも大きな
断面積を有しており、結果として、この微小流路よりも小さな毛管圧を支える。
その結果、サンプル流体は、最初に微小流路２１１にまたがるすき間を埋める。
【０１５１】 同時に、流体をリザーバー２０４および２０５から混合用リザーバー２１６内
へ駆動させる速度の増大はまた、毛管接合２１５に打ち勝ち、それによって、リ
ザーバー２０６から混合用リザーバー２１６内への流体の流れが駆動される。
【０１５２】 リザーバー２０４、２０５および２０６からの流体の流れを妨げる毛管接合を
乗り越えると、回転速度は、加速度α３で速度ω３（図３において約５００ｒｐ
ｍ）にまで減らされる；好ましい実施形態において、加速率α３は、実質的には
加速率α２に等しい（しかし、この場合は減速であるので、逆の符号を有する）
；これは図に示されている。このより低い速度において、混合用微小流路２１６
内への流れを駆動させる全体的な圧力が低下する。混合用微小流路２１６は狭く
て長いために、混合用微小流路２１６は、流れに対してかなりの水力抵抗を示す
。この低速度において、リザーバー２０４と２０５における流体間の圧力差（例
えば、これは、例えば、異なる容量を有するこれらのリザーバーによって引き起
こされ得る）は、流体が混合用微小流路２１６内に流れるときに「釣り合う」。
例えば、リザーバー２０４からの流体が、リザーバー２０５からの流体が流れる
よりも早く最初に流れる場合、リザーバー２０４における半径方向の流体の広が
りは、大部分の時間でリザーバー２０５における広がりよりも少なくなる；従っ
て、微小流路２１１において及ぼされる圧力は、リザーバー２０５内の流体によ
って及ぼされる圧力よりも低くなり、その結果、リザーバー２０５内の流体の流
速はリザーバー２０４内の流体の流速に対して増大し、半径方向における流体の
広がりたは水頭の「均衡」がもたらされる。その結果、流体は、これらのリザー
バーの断面積比に等しい厳密な比率で進入する。流体によって追い出される空気
は、流路２２０を通って空気通気孔２２１に逃される。図９ｂには、回転速度ω ３ におけるある時刻での状況が例示されている。
【０１５３】 リザーバー２０６から混合用微小流路２１９を通る並行した流体の流れが、回
転速度ω３において達成される。通常の場合、混合が実際には生じないので、微
小流路２１８の形状は、それを通って押し出される流体が大きすぎる回転速度で
チャンバー２１９を満たさない限り（すなわち、速度がω３に低下しないうちは
）重要ではない。
【０１５４】 回転速度ω３における回転は、リザーバー２０４、２０５および２０６からリ
ザーバー２１７および２１９への流体の流れを駆動させる。リザーバー２０４お
よび２０５からの流体の混合比における変化を防止することに加えて、それより
も低い速度は、リザーバー２１７および２１９の外側端において及ぼされる圧力
が、流体を保持するように設計された毛管接合を流体が通り抜けられないほど十
分に低いことを意味する。
【０１５５】 十分な時間が、リザーバー２０４、２０５および２０６からリザーバー２１７
および２１９への流体の流れを押し出すために過ぎた場合、回転速度は、さらに
加速度α４でω４に減らされる。これは、図８には、４００ｒｐｍよりもわずか
に小さいことが示されている。ディスク上における流体のこの配置が図９ｃに示
されている。その後、熱が、サンプルおよびアルカリ細胞溶解緩衝液の混合物を
含有するリザーバー２１７に加えられる。８５℃〜９５℃の間で行われるこの加
熱工程は６０秒間〜１２０秒間にわたって加えられ、これは、細菌の細胞壁また
は哺乳動物細胞の原形質膜を破壊するには十分であり、それによって、ＤＮＡが
溶液中に放出される。アルカリ細胞溶解液もまた、ポリメラーゼ酵素の活性を妨
害し得る、血液サンプルに見出されるヘモグロブリンなどのタンパク質を変性さ
せる作用を有する。
【０１５６】 その後、速度は、図８に示されているようにα５でω５（約８００ｒｐｍ）に
まで急速に上げられ、これにより、毛管接合２２３および２２６において保持さ
れている流体は、毛管圧を乗り越えたときに接触する。２２３の断面積が２２６
の断面積よりも大きく、溶解物が最初に流れることを保証するマイクロフルーイ
ディックス構造体が提供される。これらの流体は、接触した状態で、上記に記載
されているように混合用微小流路２２９内に流れ、混合される；速度は、溶解物
流体および中和液の制御された混合のために加速度α６でω６（図８において約
５００ｒｐｍ）に減らされる。図９ｄには、リザーバー２３０内への流体混合物
の動きが例示されている。図９ｅには、流体が押し出された後の流体の配置が例
示されている。
【０１５７】 細胞溶解物および中和緩衝液の混合物がリザーバー２３０内に移されたとき、
プラットホームの速度はα７で速度ω７（図８において約１２００ｒｐｍ）に上
げられる。この加速は、典型的には、他の加速と比較して穏やかである（これは
、図８に示されている加速度プロフィルのより小さい傾きによって示される）；
これは、チャンバー２３０および２３７ならびに毛管接合２３３および２４０の
設計は、図９ｆに示されているように非常に小さい「圧力水頭」を示すからであ
る。遠心力による毛管接合における圧力は、次式によって表される：
【数３】 式中、ρは流体の密度であり、ωは角速度＝２πｘ速度（ｒｐｍ）ｘ６０であり
、＜Ｒ＞は流体の回転中心に対する平均位置であり、ΔＲは毛管接合の半径位置
の内向き半径方向における流体の広がりである。幾何形状は、例えば、リザーバ
ーの底部から半径方向の外向きに出る流路に対してΔＲが小さくなるように設計
されているので、与えられた回転速度における圧力は、かなり低くすることがで
きる。これは、リザーバー２３６におけるＰＣＲ反応混合物を、微小流路２３３
を有する毛管接合を越えて非常に大きく移動させるために、そして速度プロフィ
ルにおける早い段階の急激な加速および減速の途中でさえも流体を保持すること
を可能にするのに必要とされる回転速度を作るという利点を有する。これに対し
て、微小流路２３３内への微小流路２３２の出口は、前進するメニスカスの停止
を防止するために、フレア状に開いており、少なくとも１つの滑らかな縁を提供
する。その結果、流体は保持されず、微小流路２３３内に移動して、保持された
ＰＣＲ反応混合物を濡らす。回転速度が徐々に上げられると、流体は混合用微小
流路２３４内に押し出される。図９ｇに示されているように、リザーバー２３０
および２３６内の流体位置に対する微小流路２３３および微小流路２４０の接合
の形状により、流体は、部分的にはサイフォン吸上げ作用によって混合用微小流
路２３４内に引き入れられる。中和された細胞溶解物およびＰＣＲ反応混合物は
、拡散によって混合を生じさせるのに十分な時間にわたって混合用微小流路２３
４において接触している；図８に示されているように、この混合は、比較的大き
な速度（約１２００ｒｐｍ）で行われる。
【０１５８】 図９ｈには、ディスクの最終的なマイクロフルーイディックス状態が例示され
ている。すべての流体が熱サイクル処理用チャンバー２４１に送達されている。
プラットホームの速度は、緩やかな加速と同様である遅い減速プロフィルα８で
回転速度ω８（図８において約５００ｒｐｍ）に下げられる。
【０１５９】 熱サイクル処理が、様々な熱サイクル処理プロトコルおよび温度プロフィルを
使用して熱サイクル処理用チャンバー２４１において行われる。そのような温度
プロフィルの例は下記を含む： １．二本鎖ＤＮＡを変性させるために高い温度（例えば、約９５℃）で反応混合
物を保持すること ２．１サイクルの工程を行うこと、ただし、ｎサイクルの場合、下記の工程が、
ｎ−１回、同一的に繰り返される： ａ）プライマーを一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせるために、温度を、一時的
に、あるいはアニーリング期間にわたってアニーリング温度（例えば、４５℃〜
７５℃）に低下させること ｂ）温度を、一時的に、あるいはより好ましくは、増幅プライマーの伸長を可
能にするプライマー伸長期間とともに伸長温度（例えば、６０℃〜７０℃）に上
げること；および ｃ）増幅されたフラグメントの変性温度に温度を上げること。
【０１６０】 必要に応じて、最後の反応工程は、混合物をアニーリング温度に下げ、その後
、熱サイクル処理用チャンバーの温度を、すべての伸長生成物について伸長反応
を実質的に完了させるのに十分な時間にわたって伸長温度に上げることを含む。
【０１６１】 その後、サンプルの温度は、通常、反応を停止させるために室温以下に下げら
れる。
【０１６２】 次に、私が理解しているように、熱サイクル処理用チャンバーは単に、断熱層に
よって覆われた大きなリザーバーである。正しいか？ 下記の実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態をさらに例示すること
を目的とし、決して限定するものではない。
【０１６３】 実施例１ 大腸菌に由来するゲノムＤＮＡのサンプル調製およびＰＣＲ 図１〜図４に示されているようなマイクロフルーイディックスプラットホーム
を使用して、大腸菌のサンプルからＤＮＡ標的を調製し、増幅した。回転プロフ
ィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置の様々な局面は、共
同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならび
に共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３
号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１
２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）
；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３
１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（
２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年
６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの
開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。本実
施例において使用された装置は、「好適な実施形態の詳細な説明」において上記
に記載されている。
【０１６４】 マイクロフルーイディックス構造体を、Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社のＶ
ＭＣ５０００フライス盤を操作するＬｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社の「Ｂｅｎ
ｃｈｍａｎ」ソフトウエア（Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＨ）を使用するコンピューター／数値コード
加工を使用してアクリルを加工することによって製造した。その後、ディスクを
、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによって蒸気研磨して、加工マ
ークを除き、そして加工された表面を滑らかにした。両面テープ（７９５３ＭＰ
（１．５−０．５−１．５）など）の層をディスクの加工面に貼り付けた。テー
プは、貼り付ける前に型切断されたか、あるいは貼り付け後に熱サイクル処理用
チャンバーの開口部から切り取られた。これは、テープの接着剤における知られ
ているＰＣＲ阻害剤にさらされる可能性を最小限にするために行われた。その後
、マイラー（ＩＣＩ）の層を両面テープに貼り、ディスクの流体構造体のシール
を完全にした。多くの場合、その後、ディスクは、共同所有で同時係属中の米国
特許出願第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願、これは参考と
して組み込まれる）においてより詳しく開示されている方法を使用してパリレン
にさらすことによって不動態化された。
【０１６５】 サンプル調製およびＰＣＲのために使用された溶液は、アルカリ細胞溶解液、
中和緩衝液、および特定の標的配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含有
するＰＣＲ反応混合物であった。
【０１６６】 大腸菌の懸濁物をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で供給した。これは、標準
的な実験室用分光光度計での６００ｎｍの吸光度を使用して計算されるように２
．７ｘ１０９細胞／ｍｌ〜３．３ｘ１０９細胞／ｍｌの細胞濃度を有していた：
所望する細胞数を達成するための培養物の希釈物を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎ
ｉ培養液を使用して作製し、その後、脱イオン水で４０倍に希釈した。
【０１６７】 使用したアルカリ細胞溶解液は１０ｍＭのＮａＯＨであり、中和緩衝液は１６
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）であった。ＰＣＲ反応混合物は、Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のＲｅａｄｙ−ｔｏ−ＧｏビーズまたはＳｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社のＴａｑ２０００のいずれかであった。Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−
Ｇｏビーズを再懸濁して、２５μＬの最終容量にした。両方の系は、適切な塩お
よび安定化剤とともに２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭのＭｇＣｌ２の
最終濃度をもたらす。この混合物に、目的とするプライマーを、反応における各
プライマーが２０ｐｍｏｌの濃度で加えた。これらのプライマーは、大腸菌ゲノ
ムのランダムに選択された３００塩基対（ｂｐ）の非コード配列を規定するプラ
イマー対であるＥｃｏＣｔｌ、またはｌａｃＩリプレッサータンパク質に対する
４２２ｂｐコドンを規定するプライマー対であるｌａｃＩであった。
【０１６８】 ＥｃｏＣｔｌ−Ｆ配列：５’−ＡＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡ
ＡＧＴＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１）； ＥｃｏＣｔｌ−Ｒ配列：５’−ＧＴＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡ
ＴＡＡＣＣＧＣ−３’（配列番号２）； ＬａｃＩ−Ｆ配列：５’−ＣＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣ−
３’（配列番号３）； ＬａｃＩ−Ｒ配列：５’−ＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡ−３’
（配列番号４）。
【０１６９】 プライマーはすべて、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕ
ｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から得た。
【０１７０】 ＰＣＲプロトコルは、Ｒｕｄｂｅｃｋ＆Ｄｉｓｓｉｎｇ（１９９８、ＢｉｏＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２５：５８８〜５９２）から改変した。ＰＣＲプロトコル
は下記の工程からなる：５μＬのサンプルを５μＬのＮａＯＨと混合すること；
混合物を約９５℃に１２０秒間加熱して、細胞を溶解すること；溶解物を５μＬ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ中和緩衝液と混合すること；および中和された混合物を、選
択されたプライマーを含有する１０μＬのＰＣＲ反応混合物と混合すること。そ
の後、この最終溶液を熱サイクル処理に供した。
【０１７１】 コントロールの反応を、上記のサンプル調製工程を手作業で行うことによって
実験台において従来的に行った。熱サイクル処理を、ホットボンネットサーマル
サイクラーを用いるＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のモデルＰＴＣ−１００において
行った。この反応に対するサイクル処理パラメーターは下記の通りであった：
【表１】 同様のプロフィルを、プラットホームを使用して用いた。使用した勾配率また
は温度変化率は、使用した熱電気素子がサイクル処理に供された場合に「できる
限り早い」ことを可能にした。脱ハイブリダイゼーション、アニーリングおよび
伸長に対する一定の温度時間は、従来的に行われたコントロールについて使用さ
れた温度時間とほぼ等価であったが、ディスクにおける流体の応答は、ディスク
を熱電気構成要素とつなげるために使用された金属ブロックに埋め込まれた温度
センサーの応答よりも遅いことが認識される。
【０１７２】 適切な容量を、図３に示されているチャンバー２０４、２０５、２０６および
２３６に充填した後、ディスクを装置のプラテンに載せた。ディスクの中心孔が
、ねじ切られたねじを覆ってプラテンの軸に置かれた。熱グリースを、ディスク
と熱電気構成要素との良好な熱的接触を保証するために使用した。保持用のねじ
を使用して、ディスクを所定位置に保持した。
【０１７３】 使用した回転プロフィルは下記の工程からなった：
【表２】 その後、上記に記載されているような熱サイクル処理プロフィルを、プラテン
およびディスクを５００ｒｐｍで回転させながら使用した。
【０１７４】 代表的なアッセイの結果を図１０に示す。この図は、従来のＰＣＲ装置と比較
される、本発明のプラットホームによって得られたＤＮＡフラグメントの（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されているような）従来のゲル電気泳動分析を表してい
る。これらの結果は、本発明のプラットホームにおいてＰＣＲを行うことにより
、従来的に増幅されたフラグメントとの比較によって決定されるように正しいサ
イズを有する増幅された標的フラグメントが、従来の熱サイクル処理装置を使用
して増幅されたフラグメントの収量に等しい収量で得られたことを明らかにして
いる。
【０１７５】 ＰＣＲ産物フラグメントの収量を、照明源（ニコン、超高圧水銀ランプ電源、
モデルＨＢ−１０１０１ＡＦ）を用いるエピ蛍光顕微鏡を使用して定量的に評価
した。典型的な収量は、実験台方法と比較して６０％〜１００％の収量である（
２００００コピーの標的出発材料を用いて３５ｎｇ〜４０ｎｇ）。
【０１７６】 上記に記載された装置によるサイクル処理において、主として蒸発による容量
損失は、典型的には、２５μＬの反応に関して、総投入容量の約２０％であり、
典型的な回収量は約２０μＬである。この容量損失は増幅の経過とともに徐々に
生じている。蒸発物の大部分は、サイクル処理チャンバーのすぐ上方の流路内に
凝縮し、そしてサイクル処理チャンバー内に回転させて戻すために十分な液体が
集まるまで集められる。
【０１７７】 ディスク上でサンプルを熱サイクル処理することによる多重化もまた、大腸菌
サンプルを用いて明らかにされた。２００００個の細胞を、上記に記載されたプ
ロトコルに従って実験台において溶解し、ＰＣＲ試薬と混合した。使用されたプ
ライマーは、上記に記載されたＥｃｏＣｔｌプライマーおよびｌａｃＩプライマ
ーであった。サンプルをサイクル処理チャンバー内にピペットで直接入れ、上記
に概略されているパラメーターを使用してサイクル処理した。速度プロフィルも
また、プロフィルのサイクル処理部分について上記の通りであった：温度サイク
ル処理の継続期間中は５００ｒｐｍ。熱サイクル処理された多重サンプルに対す
る典型的な結果を図２７に見出すことができる。ＰＣＲ産物フラグメントの収量
を、上記に記載されているように、照明源を用いるエピ蛍光顕微鏡を使用して定
量的に評価した。ディスクから回収されたＰＣＲフラグメントの収量は、一般に
、実験台での収量の約７０％であった。これは、単一アンプリコンサンプルの収
量の範囲内である。
【０１７８】 実施例２ ウシ血液に由来するゲノムＤＮＡのサンプル調製およびＰＣＲ 実施例１に示されている実験を、全血サンプルを使用して繰り返した。これら
の実験において、ヘパリン処理されたウシ血液を脱イオン水で１：４０に希釈し
た。ウシ血液の白血球（ＷＢＣ）の正確な数は測定されなかったが、平均値は約
５ｘ１０６細胞／ｍｌであることが知られている。
【０１７９】 使用したアルカリ細胞溶解液、中和溶液およびＰＣＲ試薬は、上記に記載され
ている通りであった。ＰＣＲ反応混合物には、目的とするプライマー対が加えら
れた。プライマー対はβ−アクチンの２８９ｂｐコドンを規定する。
【０１８０】 β−アクチン−Ｆ配列：５’−ＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ−３
’（配列番号５） β−アクチン−Ｒ配列：５’−ＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣ−３’（配
列番号６）。
【０１８１】 使用した一般的なプロトコルは、上記に記載されているプロトコルと同様であ
った。白血球は細菌よりも頑丈ではないので、選ばれた溶解温度は９１℃であっ
た。
【０１８２】 使用した回転プロフィルは、実施例１に記載されている通りである。
【０１８３】 熱サイクル処理パラメーターは下記の通りであった：
【表３】 典型的な結果を図１１に示す。この図は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上記）に記
載されているような）従来のゲル電気泳動分析を示している。これらの結果は、
本発明のプラットホームにおいてＰＣＲを行うことにより、従来的に増幅された
フラグメントとの比較によって決定されるように正しいサイズを有する増幅され
た標的フラグメントが、従来の熱サイクル処理装置を使用して増幅されたフラグ
メントの収量に等しい収量で得られたことを明らかにしている。
【０１８４】 実施例３ 大腸菌に由来するｐＴｒｃＨｉｓＡプラスミドＤＮＡのサンプル調製およびＰ
ＣＲ 図１４に示されているプラットホームを、大腸菌のサンプルを処理して、プラ
スミドＤＮＡの単離および精製を行うために使用した。回転プロフィルおよび熱
サイクル処理の制御のために使用された装置は、記載されている通りであった。
回転プロフィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置は、パー
ソナルコンピューター、ＰＣとサーボ制御型駆動モーターとのインターフェース
電子工学、およびＰＣとスクリーン印刷回路とのインターフェース電子工学から
なった。この例の場合、中心軸は、エンコーダーを有するサーボ制御型ＤＣモー
ター（Ｍｉｃｒｏｍｏ、パーツ番号３５５７ＫＯ１２ＣＲ）によって駆動される
。シリアルポート変換器（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、パーツ番号Ｚ２３２−４８５）お
よびモーター制御ボード盤（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）は、ＰＣ
とモーターとの連絡インターフェースを提供する。スリップリング（Ｌｉｔｔｏ
ｎ、パーツ番号ＡＣ６０２３−２４）は、回転中のプラットホームと固定された
電源との電気的な接続を提供した。
【０１８５】 マイクロフルーイディックスディスクは、上記に記載されているようにコンピ
ューター／数値コード加工を使用してアクリルを加工することによって製造され
た。その後、ディスクを、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによっ
て蒸気研磨して、加工マークを除き、そして加工された表面を滑らかにした。
【０１８６】 融点が約５４℃であるパラフィンワックスの弁を、少量の融解ワックスを犠牲
弁の毛管にピペットで入れ、そしてワックスが固化する前に平らな縁でワックス
を素早く平坦に押し付けることによって挿入した。過剰量を流路の端からふき取
り、流路の両端における余分なワックスを、Ｅｘａｃｔｏの刃を使用して切り取
った。ディスクを（下記に記載されているように）完全に組み立てた後、５Ｖを
ワックス弁に対応するリード線のそれぞれに加えて、ワックスを流路内で融解さ
せ、そして再度結晶化させた。これにより、ワックスが流路の断面を連続的に覆
うことができる。
【０１８７】 １枚のＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４および１片のフリット材（Ｐｏｒｅｘから得
られる：＃Ｘ−４５８８、７０μｍの細孔サイズを有する）を、チャンバー１０
０５の底にあるスロットの幅に切断した。ろ紙およびフリット材を、「光る」面
をろ紙の方に向かせてスロットに挿入した。フリット材をディスクの中心に最も
近いスロットの側面に置いた。ろ紙の向きは重要ではなかった。その後、ろ紙お
よびフリット材の高さを、ディスクの高さと等しくなるように切断した。
【０１８８】 １枚のガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎから得られるＧＦ−Ｆ、住所）
および１片のフリット材を、上記のように、結合チャンバー１０２７内のスロッ
ト１０２９の幅に切断した。ガラス繊維フィルターをスロット内に置き、その後
、フリット材を、光る面をガラス繊維フィルターの方に向かせてディスクの端に
最も近い側面においてガラス繊維の背後に挿入した。その後、両方の材料の高さ
を、ディスクの高さと等しくなるように切断した。
【０１８９】 フッ素化されたコーティング剤（Ｃｙｔｏｎｉｘ、パーツ番号ＭＥ０００）Ｐ
ｅｒｆｌｕｏｒｏｃｏａｔを流路Ｘ、Ｙ、Ｚに塗った。過剰なＰｅｒｆｌｕｏｒ
ｏｃｏａｔをディスクの周囲の領域からふき取り、その後、Ｅｘａｃｔｏの刃な
どの鋭利物を流路に走らせ、流路が詰まっていないことを確保した。その後、フ
ッ素化されたコーティング剤を硬化させるために、ディスクを約７０℃で１時間
硬化させた。
【０１９０】 その後、１片の接着剤（３Ｍ、パーツ番号７９５３ＭＰ）をディスクの全面に
わたって置き、チャンバーのすべての縁の周りを注意深くシールした。銀導電性
インクおよび炭素抵抗性インクがワックス弁および結合カラムの位置に対応して
いるマイラーシートをディスクとともにアラインメントして、フルーイディック
ス構造体に向いたインクを含有する面と接着した。最後に、同じ３Ｍテープの別
のシートをマイラーシート表面の裏側全体に置き、（断熱性基層を含む）加工し
ていないアクリルディスクを、マイラー層に対する構造的一体性を得るためにテ
ープのこの層に対して配置した。
【０１９１】 プラスミドＤＮＡを、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液で増殖させたトラン
スフェクション大腸菌の一晩培養物から得られる、ＣＲＰインサートを含有する
ｐＴｒｃＨｉｓベクターを有する大腸菌細菌培養物の約４０μＬの懸濁物から単
離した。使用した懸濁物の容量には、約１ｘ１０８個〜約１．５ｘ１０８個の細
胞が４０マイクロリットルのサンプルに含有されていた。使用した試薬溶液は、
Ｑｉａｇｅｎ社のミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ ミニプレップハンドブ
ック、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｘ−Ｖｏｌｍｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ ４、
４０７２４ Ｈｉｌｄｒｅｎ、ドイツ）から改変したか、あるいは原料から作製
した。アルカリ細胞溶解液は、ミニプレップキットにおける溶液Ｐ２に対応する
、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ； 重量対容量）を含む２００ｍＭのＮ
ａＯＨであった。沈殿化溶液は、ミニプレップキットにおける溶液Ｎ３に対応す
る、１．０Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）および３Ｍグアニジン塩酸塩であった
：この溶液は溶解混合物のｐＨを調節して、大きなゲノムＤＮＡフラグメント、
ＳＤＳおよびタンパク質を沈殿させる；さらに、カオトロピック性の塩はＤＮＡ
の水和殻を破壊し、ＤＮＡをケイ酸物質に結合させることができる。第１および
第２の洗浄液は７０％エタノール／水（ｖ／ｖ）であり、ミニプレップキットに
おける溶液ＰＥに対応する；この溶液により、残留する塩がガラス繊維マトリッ
クスから除かれた。溶出緩衝液は、０．１ＸのＴＥ（この場合、ＴＥは１０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１ｍＭのＥＤＴＡである）であり、結合し
たプラスミドＤＮＡをガラス繊維マトリックスから溶出させた。
【０１９２】 実験台コントロールおよび本発明のプラットホームの使用に対するプロセス工
程はともに下記の通りであった： （１）サンプル（約５０マイクロリットル）をアルカリ細胞溶解液（約５０マイ
クロリットル）と混合して、溶解させる （２）得られた溶液を沈殿化溶液（約７０マイクロリットル）と混合する （３）流体をろ過して、沈殿物および細胞破片を除く （４）結合マトリックス（ガラス繊維フィルター）に加える （５）エタノール／水（７０％ｖ／ｖ）の２回連続した洗浄を行う（最初の洗浄
には約１００マイクロリットルを使用し、２回目の洗浄工程には約１５０マイク
ロリットルを使用する） （６）プラスミドＤＮＡを、４０マイクロリットルの０．１Ｘ ＴＥ液を使用し
て溶出する。
【０１９３】 工程（１）〜（６）はＱｉａｇｅｎ社のミニプレッププロトコルからの改変で
ある：発表されたプロトコルからの変更は溶液の容量割合だけである。上記に列
記された容量を実験台コントロールおよびディスクの両方に使用した。実験台コ
ントロールに対する材料および手順は、ミニプレップキットの場合と同様である
；本発明のディスクは、下記の工程によって流体を負荷した後に操作された： １）１０００ＲＰＭに加速する。アルカリ細胞溶解液をリザーバー１０１６から
混合用チャンバー１００５に流す（図１７ａ〜図１７ｃに示す；矢印により記さ
れるωは回転方向を示す（反時計回りであるように自由に選ばれる））。
【０１９４】 ２）完全な停止および５００ｒｐｍ／ｓの加速を使用して５分間攪拌して、溶液
およびサンプルを混合する（図１７ｄ〜図１７ｅに示す）。
【０１９５】 ３）１０００ＲＰＭに加速する。
【０１９６】 ４）１０２１における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加える。沈殿化溶液を
１００５に移動させる（図１７ｆ）。
【０１９７】 ５）上記の工程（２）のように混合する。
【０１９８】 ６）１０００ＲＰＭに加速する。１０１２における犠牲弁に対応するリード線に
電圧を加える。溶液を１００５から結合カラム１０２７に放出させる（図１７ｇ
）。沈殿混合物がガラスフィルターを通って廃棄物チャンバー１０３４に完全に
移動するのに十分な時間にわたって１０００ＲＰＭで維持する。
【０１９９】 ７）１０３７における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、第１の洗浄液を
放出させる。第１の洗浄液がガラス繊維を通って廃棄物チャンバー１０３４内に
完全に入るまで回転速度を１０００ＲＰＭで維持する（図１７ｇに示す）。
【０２００】 ８）１０４８における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、第２の洗浄液を
放出させる。第２の洗浄液がガラス繊維を通って廃棄物チャンバー１０３４内に
完全に入るまで回転速度を１０００ＲＰＭで維持する（図１７ｈに示す）。
【０２０１】 ９）１０３２における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、サンプル回収チ
ャンバーを開ける。
【０２０２】 １０）５秒後、１０５８における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、溶出
緩衝液を放出させる。
【０２０３】 １１）洗浄されたすべての溶出緩衝液がガラス繊維フィルターを通ってサンプル
回収チャンバー内に入るまで、プラットホームの回転を１０００ｒｐｍで維持す
る。さらなる溶出緩衝液が微小流路１０３２を通って流れていることが見えなく
なった後、プラットホームの回転速度を少なくともさらに１分間維持する（図１
７ｊ〜ｋに示す）。
【０２０４】 １２）ポート１０５５を使用してプラットホームから流体サンプルを取り出す。
【０２０５】 実験台コントロールおよび本発明のディスクで処理されたサンプルの両方につ
いて、回収された流体をＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥した（Ｓａｖａｎｔ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ Ｄｒｙｉｎｇは、分析される液体の容量を少なくする（そして
濃度を増大させる）ために役立つ）；これは残留エタノールをも除く。その後、
乾燥サンプルを１０マイクロリットルの脱イオン水に再懸濁した。場合により、
９塩基切断酵素であるＡｌｗＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、
Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）などの制限酵素を使用して、サンプルを消化した。こ
の酵素は、残留する塩に対して敏感であり、その結果、サンプルの清浄度の試験
として役立つ。すべての場合において、未消化サンプルのすべてまたは一部のい
ずれかを、１ＸＴＢＥ緩衝液における１％アガロースゲルでの臭化エチジウムゲ
ル電気泳動を使用して分離した。得られたバンドは、サイズラダーと比較したと
きにサンプル中のプラスミドＤＮＡのサイズを示している。より大きなゲノムＤ
ＮＡは、サンプルに混入している場合にはゲルのウエル内に視認される。消化さ
れたサンプルの場合、未切断バンドが残らないサンプルの完全な切断により、サ
ンプルの清浄度が示される。
【０２０６】 図１８には、いくつかの異なる制限酵素を使用することによるサンプルの純度
を例示するゲルが示されている。最初に、ゲル上の単独で泳動された未切断サン
プルにより、プラスミドが、サンプル自体に塩をほとんど含まないいくつかの異
なる配座異性体で示されている。プラスミドをＥｃｏＲＶ酵素で切断した。この
酵素はプラスミドを線状化して、すべての配座異性体をラダーに対して１つのサ
イズで泳動させる。これにより、すべての配座異性体が切断され得ることが明ら
かにされる。第２の消化は、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの両方の部位を使用
する二重消化であった。これらの部位はＣＲＰインサートの両端に含まれ、２つ
の長いフラグメントと６５３塩基のインサートフラグメントとを生じさせる。消
化としての最後はＡｌｗＮ１であった。これは９塩基切断酵素であり、生成物中
の塩混入に対して非常に敏感である。これらのアッセイの結果により、本発明の
プラットホームを使用して得られたプラスミドＤＮＡは、品質および純度におい
て、従来の実験台方法を使用して単離されたプラスミドＤＮＡに匹敵し得ること
が明らかにされる。
【０２０７】 図１９には、ゲノムＤＮＡ混入に対するアッセイの結果が示されている。ＰＣ
Ｒが、プラスミド特異的プライマーならびに大腸菌ゲノムＤＮＡのフラグメント
に特異的なプライマーを使用して行われる。陰性コントロールおよび陽性コント
ロールにはゲノムＤＮＡおよびゲノムプライマーを使用した。最初の増幅シリー
ズは、プラスミド特異的プライマーを使用して、プラスミドのテンプレートＤＮ
Ａが減少する量で増幅された予想されるフラグメントを示す。第２の増幅シリー
ズは、ゲノムＤＮＡプライマーおよびプラスミドＤＮＡテンプレートを使用する
ゲノムＤＮＡフラグメントの増幅（またはその非存在）を示す。
【０２０８】 理解され得るように、連続した１０倍希釈物は、１：１０００希釈までのプラ
スミド特異的プライマーを使用して有意なＰＣＲ産物をもたらしている。１：１
００００希釈においてのみ、増幅がほとんど得られなかった。逆に、ゲノムＤＮ
Ａ特異的プライマーは、サンプル自体および１：１０希釈の場合にだけ増幅を示
している。これらの観測結果は、ゲノムＤＮＡに対してプラスミドが約１０００
倍過剰であることを示している。
【０２０９】 実施例４ 大腸菌に由来するゲノムＤＮＡのＰＣＲ 図６、図７、図２４、図２５および図２６に示されているようなマイクロフル
ーイディックスプラットホームを使用して、大腸菌のサンプルからＤＮＡ標的を
増幅した。
【０２１０】 図６は、マイクロフルーイディックスプラットホームの２つの主要な構成要素
の分解図を示している。加工されたフルーイディックスディスク７０１が、スク
リーン印刷された電気回路ディスク７１０に結合される。
【０２１１】 図７は、フルーイディックスディスク内における８個のサイクル処理用チャン
バー７０３の配置を示している。熱サイクル処理用チャンバーは円形であり、７
ｍｍの直径および０．５ｍｍの深さを有する。各チャンバーは反応混合物充填流
路７０４および空気流路７０２を有する。両方の流路は０．５ｍｍ幅×０．５ｍ
ｍ深さである。空気流路は、回転させて反応チャンバーに戻される前に蒸気が冷
えて、その壁に沿って凝縮した場合の加熱時の液体損失を防止することを助ける
。
【０２１２】 図２４は、抵抗ヒーターがどのように電気回路ディス上に配置されているかを
示している。抵抗ヒーターパッチ７１３は、１辺が１０ｍｍの正方形である。ヒ
ーターの大きさは、サイクル処理チャンバーにおける熱勾配を最小限にするため
に、サイクル処理チャンバーの大きさよりも大きくなるように選ばれた。電流は
、陽極７１２およびアース７１１のリード線を介してヒーターに供給される。
【０２１３】 図２５は、サイクル処理チャンバー、結合層および抵抗ヒーターの断面図であ
る。フルーイディックスディスク７０１が、０．１ｍｍ厚のマイラーシート７２
６（ＩＣＩ、パーツ番号ＳＴ５０５）に両面テープ７２７（３Ｍ、パーツ番号７
９５３ＭＰ）を使用して合わせられる。両面テープは、テープからの反応汚染を
最小限にするために、反応チャンバーの下部の領域から除かれている。マイラー
層７２６が、電気回路層７１０に両面テープ７２３を使用して合わせられる。こ
れらの２つの層は、反応チャンバーの配置が抵抗ヒーターの配置とそろうことを
保証するために半径方向にアラインメントされる。熱伝導性エラストマー７２４
（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ、パーツ番号ＣＰＵ Ｐａｄ）が、サイクル処理チャンバ
ーにおける考えられる熱勾配を最小限にするために抵抗ヒーター７１３とマイラ
ーシート７２６との間に挿入される。サイクル処理の温度制御のために使用され
る０．１ｍｍの熱電対７２５（Ｏｍｅｇａ、パーツ番号ＣＨＡＬ００５−Ｋ型）
が、マイラーシート７２６と伝導性エラストマー７２４との間に挿入される。電
気回路層７１０が、底部のポリカーボネート支持ディスク７２１に両面テープ７
２２を使用して合わせられる。
【０２１４】 マイクロフルーイディックス構造体を、Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社のＶ
ＭＣ５０００フライス盤を操作する「Ｂｅｎｃｈｍａｎ」ソフトウエア（Ｌｉｇ
ｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎ
Ｈ）を使用してポリカーボネートディスクを加工することによって製造した。構
造体は、コンピューター製図プログラムを使用して設計され、コンピューター機
械コードに変換された。ディスクは、エタノールで、次いで空気で清浄化され、
その後、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによって研磨され、表面
の不完全性が除かれた。
【０２１５】 電気回路ディスクは、当業者によって知られ、そして第６，０６３，５８９号
において詳細に開示されているスクリーン印刷技術を用いて製造された。炭素系
抵抗インク（Ｄｕｐｏｎｔ、７１０２／７０８２混合物）を使用して、抵抗ヒー
ターを印刷し、そして銀系インク（Ｄｕｐｏｎｔ、５０２８）を使用して、導電
性リード線を０．１ｍｍ厚のマイラーシート上に印刷した。
【０２１６】 回転プロフィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置は、パ
ーソナルコンピューター、ＰＣとサーボ制御型駆動モーターとのインターフェー
ス電子工学、およびＰＣとスクリーン印刷回路とのインターフェース電子工学か
らなった。この例の場合、中心軸は、エンコーダーを有するサーボ制御型ＤＣモ
ーター（Ｍｉｃｒｏｍｏ、３５５７ＫＯ１２ＣＲ）によって駆動される。シリア
ルポート変換器（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、Ｚ２３２−４８５）およびモーター制御ボ
ード盤（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）は、ＰＣとモーターとの連絡
インターフェースを提供する。スリップリング（Ｌｉｔｔｏｎ、ＡＣ６０２３−
２４）は、回転中のプラットホームと固定された電源との電気的な接続を提供し
た。熱電対によって測定される温度依存性電圧は、小型の転送器（Ｏｍｅｇａ、
パーツ番号ＴＸ９１Ａ）を使用して電流に変換され、スリップリングを介して出
力された。この電流は、ＰＣ内の市販のアナログ／デジタルボード盤（Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｂｏａｒｄｓ、パーツ番号ＣＩＯ−ＤＡＳ１６００）によって電圧に
変換されて読み取られた。抵抗ヒーターにかかる電圧はまた、スリップリングを
介して加えられ、温度を所望する温度にするために変化させられた。
【０２１７】 定電力制御ループが、反応チャンバーの温度を制御するために使用された。経
験的なデータは、６０℃〜１００℃の温度を維持するためには０．４Ｗ〜１．２
Ｗの電力が必要であることを示していた。この例において、ＰＣのソフトウエア
制御プログラムは熱電対の温度を読み取り、設定点の温度に比例した制御電圧を
出力する。この電圧は、抵抗ヒーターと直列になっている定電力回路に入力され
た。温度が上昇すると、ヒーター抵抗が増大した。一定の電力を維持するために
、回路はその出力電流を低下させた。ゼロ出力における冷却が、プラットホーム
の露出面からの対流によってもたらされ、そしてディスクを５００ｒｐｍの一定
速度で回転させることによって助けられた。加熱速度は１．５℃／秒もの大きさ
であり、冷却速度は１．０℃／秒であった。
【０２１８】 ディスクは、ディスク７０５内の中心孔を介してモーターの中心軸に取り付け
られた。スリップリングが、ねじを使用してディスクの上部に固定された。スリ
ップリングは、適切な電力制御および温度測定のリード線が接続されるように電
気回路層とともに並べられた。
【０２１９】 ＰＣＲ溶液は、脱イオン水、大腸菌のゲノムテンプレート（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、大腸菌ゲノムＤＮＡのβ−ガラクトシダーゼコドンの２
１５塩基対部分を増幅するプライマー組ＥＢＧＡ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ）、およびＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）からなった。ＥＢＧＡフォワード配列は５’−ＡＣＣＴＧＣＡＴ
ＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号７）によって示され、ＥＢＧＡリバ
ース配列は５’−ＣＧＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣ−３’（
配列番号８）によって示される。変性温度、アニーリング温度、伸長温度は、そ
れぞれ、９５℃、６０℃および７２℃であるように選ばれた。ＰＣソフトウエア
の設定値は、１００℃、６０℃および７２℃であった。設定値と得られた温度と
の差は、反応チャンバーの下部にある熱電対の位置およびディスクによる温度勾
配に基づいて予想される。
【０２２０】 図２６には、このシステムで３０サイクルを行った後におけるゲル電気泳動結
果が示されている。これらの結果は、このゲルで示されているように、市販のサ
ーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、モデル番号ＰＴＣ−１００）で行
われた増幅と比較して勝っている。
【０２２１】 前記の開示は本発明のいくつかの特定の実施形態を強調していること、そして
それらに対して均等論的な改変または代替はすべて本発明の精神および範囲に含
まれることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の微量システムプラットホームの分解斜視図を示す。
【図２】 図２は、図１に分解斜視図で示された微量システムプラットホームの１つの構
成要素であるマイクロフルーイディックス層の平面図を示す。
【図３】 図３は、図２に例示されたマイクロフルーイディックス層の断面の細部である
。
【図４】 図４は、図３に例示された構造体の一領域の細部を示す。
【図５】 図５は、熱サイクル処理用チャンバーの近傍における図１の微量システムプラ
ットホームの断面図である。
【図６】 図６は、マイクロフルーイディックスディスクおよび印刷された回路の分解斜
視図を示す。
【図７】 図７は、図６に示されたマイクロフルーイディックスディスクの平面図を例示
する。
【図８】 図８は、実施例１および実施例２における微量システムプラットホームを通過
する流体の動きを行わせるために使用される速度プロフィルの回転速度（ｒｐｍ
）対時間を例示する。
【図９】 図９は、図８の速度プロフィルによって駆動される流体の動きの順序を例示す
る。
【図１０】 図１０は、大腸菌から単離されたＤＮＡに含有される標的フラグメントのＰＣ
Ｒ増幅のゲル電気泳動分析の写真である。
【図１１】 図１１は、ウシ血液から単離されたＤＮＡに含有される標的フラグメントのＰ
ＣＲ増幅のゲル電気泳動分析の写真である。
【図１２】 図１２は、ＤＮＡサンプル調製ディスクの分解斜視図を示す。
【図１３】 図１３は、図１２に示されたこのディスクの平面図である。
【図１４】 図１４は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対するマイクロフルーイデ
ィックス構造体の平面図を示す。
【図１５】 図１５は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対する加熱層の平面図を示
す。
【図１６】 図１６は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対する基層の平面図を示す
。
【図１７】 図１７Ａ〜図１７Ｋは、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対するマイク
ロフルーイディックス構造体を通過する流体の動きを例示する。
【図１８】 図１８は、従来的に調製されたプラスミドＤＮＡ（コントロール）、または本
発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームを使用して調製されたプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素消化プロフィルのゲル電気泳動分析の写真である。写真において
、外側のレーンはサイズマーカーである。
【図１９】 図１９は、本発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームを使用して、プラス
ミドＤＮＡまたは細菌ゲノムＤＮＡに特異的なプライマーを使用するインビトロ
増幅反応のゲル電気泳動分析の写真である。写真において、テンプレートＤＮＡ
の量は、左側から右側に移動する各組の増幅反応において少なくなる；外側のレ
ーンはサイズマーカーである。
【図２０】 図２０は、本発明の電気的プラテンおよび制御エレメントの平面ダイアグラム
である。
【図２１】 図２１は、本発明の電気的プラテンにおける温度制御エレメントの平面ダイア
グラムである。
【図２２】 図２２は、プラテンおよび温度制御エレメントの印刷された回路ボード盤にお
ける電気リード線間の電気的接続の平面ダイアグラムである。
【図２３】 図２３は、ペルチェ素子を含む本発明による温度制御エレメントの構造体の断
面図である。
【図２４】 図２４は、図６に示された電気的回路層の平面図を示す。
【図２５】 図２５は、図６に示されたディスクに対する断面図を示す。
【図２６】 図２６は、図６に示されたディスクを使用して大腸菌サンプルから増幅された
ＤＮＡ標的のゲル電気泳動分析の写真である。
【図２７】 図２７は、熱サイクル処理用チャンバーで行われた多重ＰＣＲの例を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月９日（２００２．４．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 37/00 １０１ 37/00 １０１ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アーノルド、 トッド アメリカ合衆国 コネチカット州 06033 グラストンベリー ロングヒル ドライ ブ 179 (72)発明者 カルヴァロー、 ブルース エル． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02472 ウォータータウン メリル ロー ド 59 (72)発明者 リン、 ジョゼフ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02139 ケンブリッジ ロリンズ コート 10 (72)発明者 キーファー−ヒギンズ、 スティーブン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02115 ボストン アパートメント ナン バー16 パーク ドライブ 117 (72)発明者 シェパード、 ノーマン エフ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01730 ベッドフォード バトル フラッ グ ロード ６ Ｆターム(参考） 2G042 BD19 CA10 CB03 GA01 HA02 2G058 BA07 BB02 BB09 BB27 CC03 CC17 CC18 CD04 EA03 EA05 EA14 EA19 EB11 EB19 EC03 EC05 FA03 FB01 FB12 GA01 GA11 GE02 4B024 AA11 AA19 CA01 CA11 CA20 HA11 4B029 AA07 AA23 BB20 CC01 FA12 FA15 4G057 AB00 AB38

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 向心力によって駆動される微量システムプラットホームであ
    って、 ａ）プラットホームの表面に埋め込まれた１つまたは多数のマイクロフルーイデ
    ィックス構造体を含む表面を有する基板を含む回転可能なプラットホームであっ
    て、それぞれのマイクロフルーイディックス構造体は、 ｉ）流体的にｉｉ）に接続されているサンプル入口ポート ｉｉ）温度制御エレメントと熱的に接触しているチャンバー、および ｉｉｉ）サンプル出口ポート を含むプラットホーム を含み、 前記温度制御エレメントは、チャンバー内の流体の温度を周囲温度よりも高い
    温度で変化させるか、または維持し、そして前記プラットホームの回転は、チャ
    ンバー内の流体の温度を、周囲温度に実質的に等しくなるように維持するか、ま
    たは変化させる、微量システムプラットホーム。
  2. 【請求項２】 前記温度制御エレメントは抵抗ヒーターである、請求項１に
    記載の微量システムプラットホーム。
  3. 【請求項３】 前記温度制御エレメントはペルチェヒーターである、請求項
    １に記載の微量システムプラットホーム。
  4. 【請求項４】 前記チャンバーまたは前記温度制御エレメントまたはその両
    方と熱的に接触している温度検知エレメントをさらに含む、請求項１に記載の微
    量システムプラットホーム。
  5. 【請求項５】 前記温度検知エレメントはサーミスターである、請求項４に
    記載の微量システムプラットホーム。
  6. 【請求項６】 プラットホームは、 ｂ）１つまたは多数の温度制御エレメントを有する基板を含む電気的プラテンで
    あって、前記温度制御エレメントのそれぞれは少なくとも２つの電気リード線に
    電気的に接続され、かつ前記電気リード線はスリップリングを介して電源に接続
    されている電気的プラテン をさらに含み、 前記サンプル入口ポート、前記チャンバーおよび前記サンプル出口ポートを含
    む前記基板は前記プラテンから隔てられ、かつ各温度制御エレメントはプラット
    ホームの基板内のチャンバーと熱的に接触している、請求項１に記載の微量シス
    テムプラットホーム。
  7. 【請求項７】 前記プラテン基板は印刷された回路ボード盤である、請求項
    ６に記載の微量システムプラットホーム。
  8. 【請求項８】 前記温度制御エレメントは、加熱エレメントと熱的に接触し
    ている１つまたは多数の金属接触プレートをさらに含む、請求項６に記載の微量
    システムプラットホーム。
  9. 【請求項９】 少なくとも１つの金属接触プレートは前記チャンバーと熱的
    に接触している、請求項８に記載の微量システムプラットホーム。
  10. 【請求項１０】 少なくとも１つの金属接触プレートはヒートシンクと熱的
    に接触している、請求項８に記載の微量システムプラットホーム。
  11. 【請求項１１】 前記金属接触プレートは黄銅である、請求項８に記載の微
    量システムプラットホーム。
  12. 【請求項１２】 チャンバー内における流体の温度は、インビトロ増幅反応
    を行うために十分な速度で変化させることができる、請求項１に記載の微量シス
    テムプラットホーム。
  13. 【請求項１３】 前記インビトロ増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である、
    請求項１２に記載の微量システムプラットホーム。
  14. 【請求項１４】 円形のディスクである請求項１に記載の微量システムプラ
    ットホーム。
  15. 【請求項１５】 ＤＮＡサンプル調製を行うための、向心力によって駆動さ
    れる微量システムプラットホームであって、 ａ）プラットホームの表面に埋め込まれた１つまたは多数のマイクロフルーイデ
    ィックス構造体を含む表面を有する基板を含む回転可能なプラットホームであっ
    て、それぞれのマイクロフルーイディックス構造体は、 ｉ）流体的にｉｉ）に接続されているサンプル入口ポート ｉｉ）温度制御エレメントと熱的に接触している細胞溶解チャンバーであって
    、細胞破片ならびに沈殿したタンパク質および核酸を保持する細孔度を有するフ
    ィルターエレメントをチャンバー内に有する細胞溶解チャンバー、 ｉｉｉ）溶解緩衝液を含有し、微小流路によって前記細胞溶解チャンバーに流
    体的に接続されている溶解緩衝液リザーバー； ｉｖ）犠牲弁を含む微小流路によって前記細胞溶解チャンバーに流体的に接続
    されている沈殿化緩衝液リザーバー； ｖ）犠牲弁により遮断されている微小流路によって前記細胞溶解チャンバーに
    流体的に接続され、かつさらに下記のｖｉ）を含むＤＮＡ結合チャンバー： ｖｉ）ＤＮＡに対する結合親和性を有するＤＮＡ結合フィルター； ｖｉｉ）それぞれが洗浄緩衝液を含有し、かつ犠牲弁により遮断されている微
    小流路によってそれぞれが前記ＤＮＡ結合チャンバーに流体的に接続されている
    １つまたは多数の洗浄緩衝液リザーバー； ｖｉｉｉ）微小流路によって前記ＤＮＡ結合チャンバーに流体的に接続されて
    いる廃棄物リザーバー； ｉｘ）犠牲弁により遮断されている微小流路によって前記ＤＮＡ結合チャンバ
    ーに流体的に接続されているサンプル回収チャンバー；および ｘ）犠牲弁により遮断されている微小流路によって前記ＤＮＡ結合チャンバー
    に流体的に接続されている溶出緩衝液リザーバー を含むプラットホームを含み、 前記マイクロフルーイディックス構造体を通過する流体の流れは、プラットホ
    ームの回転から生じる向心力によって駆動され、そして犠牲弁によって遮断され
    ている微小流路を通過する流体の流れはこれらの弁の一体性に依存している、微
    量システムプラットホーム。
  16. 【請求項１６】 前記細胞溶解チャンバーは約５０μＬ〜約１０００μＬの
    容量能を有する、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  17. 【請求項１７】 前記溶解緩衝液リザーバーは約２５μＬ〜約３００μＬの
    容量能を有する、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  18. 【請求項１８】 前記沈殿化緩衝液リザーバーは約３５μＬ〜約４００μＬ
    の容量能を有する、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  19. 【請求項１９】 前記洗浄緩衝液リザーバーはそれぞれが約５０μＬ〜約８
    ５０μＬの容量能を有する、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  20. 【請求項２０】 前記溶出緩衝液リザーバーは約２０μＬ〜約２５０μＬの
    容量能を有する、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  21. 【請求項２１】 前記廃棄物リザーバーは約３５０μＬ〜約１５００μＬの
    容量能を有する、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  22. 【請求項２２】 前記ＤＮＡ結合チャンバーは約５μＬ〜約２０μＬの容量
    能を有する、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  23. 【請求項２３】 前記サンプル回収チャンバーは約２０μＬ〜約２５０μＬ
    の容量能を有する、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  24. 【請求項２４】 前記サンプル回収チャンバーはサンプル出口ポートをさら
    に含む、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  25. 【請求項２５】 前記細胞溶解チャンバーは１つまたは多数の混合用バッフ
    ルをさらに含む、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  26. 【請求項２６】 前記細胞溶解チャンバーに含有される前記フィルターは、
    前記細胞溶解チャンバーを前記ＤＮＡ結合チャンバーに接続する微小流路の近位
    に位置し、流体は前記フィルターを通って前記微小流路に進入しなければならな
    い、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  27. 【請求項２７】 前記ＤＮＡ結合チャンバーに含有される前記ＤＮＡ結合フ
    ィルターは、前記ＤＮＡ結合チャンバーを前記廃棄物リザーバーおよび前記サン
    プル回収チャンバーに接続する微小流路の近位に位置し、流体は前記フィルター
    を通って前記微小流路に進入しなければならない、請求項１５に記載の微量シス
    テムプラットホーム。
  28. 【請求項２８】 前記ＤＮＡ結合チャンバーを前記廃棄物リザーバーに接続
    する前記微小流路は、前記ＤＮＡ結合チャンバーを前記サンプル回収チャンバー
    に接続する微小流路と同じであり、前記ＤＮＡ結合チャンバーを前記サンプル回
    収チャンバーに流体的に接続する微小流路の一部を遮断する前記犠牲弁が無傷で
    あるときにだけ、流体が、前記廃棄物リザーバーに流体的に接続している微小流
    路の一部を通って流れる、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  29. 【請求項２９】 犠牲弁のそれぞれは、ワックスを融解し、かつ弁を開ける
    ために十分な熱を生成し得る加熱エレメントと熱的に接触しているワックス弁で
    ある、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  30. 【請求項３０】 犠牲弁のそれぞれは、ワックス弁を含むワックスを含有し
    、かつ流体が微小流路を通って流れることを可能にするのに十分な断面の大きさ
    を有する再結晶化チャンバーをさらに含む、請求項２９に記載の微量システムプ
    ラットホーム。
  31. 【請求項３１】 前記細胞溶解チャンバーは加熱エレメントと熱的に接触し
    ている、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
  32. 【請求項３２】 １つまたは多数の温度制御エレメントを有する基板を含む
    電気的プラテンをさらに含み、前記温度制御エレメントはそれぞれが少なくとも
    ２つの電気リード線に電気的に接続され、前記電気リード線はスリップリングを
    介して電源に接続され、そして前記細胞溶解チャンバーを含む前記基板は前記プ
    ラテンから隔てられ、前記温度制御エレメントは前記細胞溶解チャンバーと熱的
    に接触している、請求項３１に記載の微量システムプラットホーム。
  33. 【請求項３３】 インビトロ増幅反応を行うための、向心力によって駆動さ
    れる微量システムプラットホームであって、 ａ）プラットホームの表面に埋め込まれた１つまたは多数のマイクロフルーイデ
    ィックス構造体を含む表面を有する基板を含む回転可能なプラットホームであっ
    て、それぞれのマイクロフルーイディックス構造体は、 ｉ）サンプル入口ポートを含むサンプルチャンバー； ｉｉ）細胞溶解緩衝液を含有する細胞溶解緩衝液リザーバー； ｉｉｉ）微小流路によって第１のリザーバーに流体的に接続されている、中和
    緩衝液を含有する中和緩衝液リザーバー； ｉｖ）サンプル緩衝液チャンバーおよび前記細胞溶解緩衝液リザーバーに流体
    的に接続されている第１の混合用微小流路であって、サンプルおよび前記細胞溶
    解緩衝液を混合して溶解細胞混合物にするために十分な長さを有する長さ方向の
    経路をプラットホームの表面において規定し、かつ下記のｖ）に流体的に接続さ
    れている第１の混合用微小流路 ｖ）第２のリザーバー、この場合、第１および第２のリザーバーは下記のｖｉ
    ）に流体的に接続されている、 ｖｉ）前記溶解細胞混合物および前記中和緩衝液を混合してＤＮＡサンプル混
    合物にするのに十分な長さを有する長さ方向の経路をプラットホームの表面にお
    いて規定する第２の混合用微小流路、この場合、第１の混合用微小流路は下記の
    ｖｉｉ）に流体的に接続されている、 ｖｉｉ）第３のリザーバー； を含み、さらに ｖｉｉｉ）ＤＮＡ増幅試薬混合物を含む溶液を含有する第４のリザーバー、こ
    の場合、第３および第４のリザーバーは下記のｉｘ）に流体的に接続されている
    、 ｉｘ）前記ＤＮＡサンプル混合物および前記ＤＮＡ増幅試薬混合物を混合して
    、ＤＮＡ増幅反応混合物を得るのに十分な長さを有する長さ方向の経路をプラッ
    トホームの表面において規定し、かつ下記のｘ）に流体的に接続されている第３
    の混合用微小流路 ｘ）下記のｘｉ）と熱的に接触している熱サイクル処理用チャンバー ｘｉ）温度制御エレメント を含み、 プラットホームの微小流路内の流体は、微小流路を通って流体を移動させるの
    に十分な時間および回転速度のプラットホームの回転運動から生じる向心力によ
    って前記微小流路を通って移動し、そしてＤＮＡの増幅が、テンプレートＤＮＡ
    を変性させ、プライマーをアニーリングさせ、かつプライマーをポリメラーゼに
    よって伸長させるために温度を交互に変化させることによって前記熱サイクル処
    理用チャンバーにおいて行われる、微量システムプラットホーム。
  34. 【請求項３４】 前記サンプルチャンバーは約２ｎＬ〜約１０００μＬの容
    量能を有する、請求項３３に記載の微量システムプラットホーム。
  35. 【請求項３５】 前記細胞溶解緩衝液リザーバーは約２ｎＬ〜約１０００μ
    Ｌの容量能を有する、請求項３３に記載の微量システムプラットホーム。
  36. 【請求項３６】 前記中和緩衝液リザーバーは約２ｎＬ〜約１０００μＬの
    容量能を有する、請求項３３に記載の微量システムプラットホーム。
  37. 【請求項３７】 前記第１、第２、第３および第４のリザーバーはそれぞれ
    が約２ｎＬ〜約１０００μＬの容量能を有する、請求項３３に記載の微量システ
    ムプラットホーム。
  38. 【請求項３８】 前記サンプルチャンバーはサンプル入口ポートをさらに含
    む、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
  39. 【請求項３９】 前記細胞溶解緩衝液リザーバー、前記中和緩衝液リザーバ
    ーならびに前記第３および第４のリザーバーはそれぞれがサンプル入口ポートを
    さらに含む、請求項３３に記載の微量システムプラットホーム。
  40. 【請求項４０】 混合用微小流路のそれぞれは９０ｏよりも大きな角度を有
    する多数の屈曲部を含む、請求項３３に記載の微量システムプラットホーム。
  41. 【請求項４１】 前記混合用微小流路のそれぞれを通過する流体の流速は約
    １ｎＬ／ｓ〜約１００μＬ／ｓである、請求項３３に記載の微量システムプラッ
    トホーム。
  42. 【請求項４２】 前記熱サイクル処理用チャンバーはサンプル出口ポートを
    さらに含む、請求項３３に記載の微量システムプラットホーム。
  43. 【請求項４３】 １つまたは多数の温度制御エレメントを有する基板を含む
    電気的プラテンをさらに含み、前記温度制御エレメントはそれぞれが少なくとも
    ２つの電気リード線に電気的に接続され、前記電気リード線はスリップリングを
    介して電源に接続され、そして前記熱サイクル処理用チャンバーを含む前記基板
    は前記プラテンから隔てられ、前記温度制御エレメントは前記熱サイクル処理用
    チャンバーと熱的に接触している、請求項３３に記載の微量システムプラットホ
    ーム。
  44. 【請求項４４】 前記マイクロフルーイディックス構造体の内側表面はパリ
    レンでコーティングされている、請求項１５に記載の微量システムプラットホー
    ム。
  45. 【請求項４５】 前記マイクロフルーイディックス構造体の内側表面はパリ
    レンでコーティングされている、請求項３３に記載の微量システムプラットホー
    ム。
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