KR102209903B1 - Rna를 표적으로 하는 증폭 구조체 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 - Google Patents

Abstract

본 명세서에는, 5 내지 60 머(mer)의 길이를 갖는 RNA를 표적으로 하는 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 및 핵산 증폭 장치가 개시된다. 상기 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 핵산 증폭 반응을 수행 시, 각 표적 RNA 증폭 구조체 별로 표적 RNA의 역전사 및 실시간 다중 핵산 증폭반응이 매우 우수한 효율로 잘 일어나며, 표적 RNA 외에 기타 핵산, 특히 전구체 형태의 RNA 또는 단일 염기 차이가 있는 RNA가 혼재되어 있어도 표적 RNA를 특이적으로 식별하여 매우 우수한 효율로 다중 검출 내지 진단할 수 있다.

Description

RNA를 표적으로 하는 증폭 구조체 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 {AMPLIFICATION STRUCTURE TARGETING RNA AND METHOD FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID USING SAME}

본 명세서에는 RNA를 표적으로 하는 프라이머가 고정된 증폭 구조체 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 및 핵산 증폭 장치가 개시된다.

중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 많은 표적 핵산을 한 채널에서 동시에 분석하고자 하는 기술이 개발되었다. 고체 기반 핵산 증폭 기술(Solid-phase PCR)은 여러 표적 핵산을 동시에 분석하기 위한 기술로, 그 중 하나로 다공성 구조체 기반 핵산 증폭 기술은 구조체 내에서 표적 핵산이 높은 효율 및 높은 선택성으로 증폭되고, 핵산 증폭에 의한 신호를 구조체 내에 가두어 다공성 구조체 별로 여러 유전자를 동시에 분석할 수 있다.

한편, 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)의 경우 짧은 길이로 인해 PCR을 진행하기 위해서는 역전사 과정을 통해 추가적인 길이를 확보해야 한다. 이를 위해 일반적으로 가장 널리 사용되는 방법은 마이크로 RNA 3' 말단에 아데닌(adenine, A)을 붙여 티민(thymine, T)을 지닌 역전사 프라이머와 반응시키는 방법과 스템-루프(stem-loop) 구조를 지닌 역전사 프라이머를 이용하여 증폭 대상이 되는 핵산의 길이를 늘리는 방법이 있다. 전자인 아데닌을 붙이는 방법은 모든 마이크로 RNA에 공통적으로 사용 가능하지만, 전구체(precursor)와 구분할 수 없고 시료 상에 존재하는 모든 RNA를 역전사하므로 역전사 후 결과물의 질이 떨어지는 문제가 있다. 후자인 스템-루프 구조를 지닌 역전사 프라이머를 이용하는 방법은 각 마이크로 RNA에 특이적으로 반응하여 순도가 높은 산물을 얻을 수 있지만, 여러 개의 마이크로 RNA를 동시에 한 반응 내에서 진행할 수 없다는 문제가 있다.

따라서, 마이크로 RNA를 표적으로 하는 핵산 증폭 반응 수행 시 순도가 높으면서도 다중성을 확보할 수 있는 기술이 필요하다.

KR 10-2015-0048964 A

Allon M Klein. et al., Cell. 2015 May 21; 161(5): 1187-1201 Roberto Rinaldi. et al., Angewandte. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2-54 Daniela Hartmann Jornada. et al., Molecules 2016, 21, 42

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 높은 효율로 다수의 RNA를 표적으로 하는 실시간 다중 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있는 표적 RNA 증폭 구조체를 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명은, 공극을 포함하는 다공성 구조체; 및 상기 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 표적(target) RNA의 역전사(reverse transcription, RT) 프라이머로서 스템-루프 프라이머(stem-loop primer);를 포함하고, 상기 스템-루프 프라이머는 루프(loop) 구조에 아크릴기(acryl group), 아민기(amine group), 카복실기(carboxyl group) 및 이중결합(double bond)으로 이루어진 화학적 반응기 중 하나 이상을 포함하고, 표적 RNA의 길이는 5 내지 60 머(mer)인, 표적 RNA 증폭 구조체를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은, 표적 RNA의 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머가 다공성 구조체의 공극 내부에 고정되도록 상기 역전사 프라이머에 링커(linker)를 합성하는 단계; 프레폴리머(pre-polymer) 및 상기 링커가 합성된 역전사 프라이머를 포함하는 구조체 형성 용액을 제조하는 단계; 상기 구조체 형성 용액을 3차원 구조체 형태로 토출하고, 이를 경화시켜 표적 RNA 증폭 구조체를 형성하는 단계를 포함하는, 표적 RNA 증폭 구조체 제조방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 표적 RNA의 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머가 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체; 및 상기 표적 RNA 증폭 구조체가 배열된 반응 챔버(chamber);를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭장치를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 RNA의 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머가 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 반응 챔버(chamber)에 주입하는 단계; 하나 이상의 표적 RNA를 포함하는 용액을 상기 반응 챔버에 주입하는 단계; 상기 표적 RNA를 역전사시켜 상보적 DNA를 합성하는 단계; 및 상기 cDNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 표적 RNA를 증폭시키는 단계;를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭 방법을 제공한다.

일 측면에 있어서, 5 내지 60 머(mer)의 길이의 표적 RNA의 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머가 루프 구조에 포함된 화학적 반응기에 의해 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 핵산 증폭 반응을 수행 시, 각 표적 RNA 증폭 구조체 별로 RNA의 역전사 및 실시간 다중 핵산 증폭반응이 매우 우수한 효율로 잘 일어나며, 표적 RNA 농도가 매우 낮은 경우에도 반응성이 우수하다. 또한, 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 표적 RNA 외에 기타 핵산이 존재하더라도, 표적 RNA가 아닌 핵산에 영향을 받지 않고 우수한 효율로 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있고, 성숙 형태와 전구체 형태의 RNA, 특히 마이크로 RNA가 혼재되어 있어도 성숙 형태의 RNA, 특히 마이크로 RNA를 특이적으로 식별할 수 있으며, RNA 내에서 단일 염기 차이가 있다 하여도 표적이 되는 RNA를 특이적으로 식별할 수 있는 우수한 효과가 있다. 따라서, 각기 다른 RNA를 표적으로 하는 본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 매우 우수한 효율로 다중 검출 내지 진단이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 RNA를 표적(target)으로 하는 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머가 다공성 구조체 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 마이크로 RNA의 실시간 다중 핵산 증폭 수행하는 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-16-5p 마이크로 RNA를 표적(target)으로 하는 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머가 다공성 구조체 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용한 마이크로 RNA의 실시간 다중 핵산 증폭 수행 시의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 표적 RNA 증폭 구조체로서, 도 3a는 스템-루프 역전사 프라이머의 스템(stem) 구조 내의 5' 말단에 작용기(화학적 반응기)로서 아크리다이트(acrydite) 작용기가 합성된 프라이머를 개략적으로 나타낸 도이고, 도 3b는 스템-루프 역전사 프라이머의 루프(loop) 구조에 작용기(화학적 반응기)로서 아민(amine) 작용기가 합성된 프라이머(도 3b)를 개략적으로 나타낸 도이다. 또한, 도 3c 및 도 3d는 스템-루프 역전사 프라이머가 다공성 구조체 공극 내부에 고정되도록 하는 스템-루프 역전사 프라이머의 작용기(화학적 반응기) 위치에 따른 실시간 정량 PCR (real-time qPCR, RT-qPCT)의 용액 상에서(도 3c) 및 다공성 구조체에 고정된 상태에서(도 3d)의 효율을 각각 나타낸 것이다. 도 3e 및 도 3f는 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 상기 스템-루프 역전사 프라이머의 작용기(화학적 반응기)가 상기 스템-루프 역전사 프라이머의 스템 구조에 위치하였을 때(도 3e)와 루프 구조에 위치하였을 때(도 3f) 실시간 정량 PCR (real-time qPCR, RT-qPCT)을 수행한 형광 이미지를 나타낸 것이다. 도 3의 Intermediate modification은 스템-루프 역전사 프라이머의 루프(loop) 구조의 염기에 화학적 반응기가 합성된 경우이고, 5' modification은 스템-루프 역전사 프라이머의 5' 말단에 화학적 반응기가 합성된 경우의 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-16-5p 마이크로 RNA를 표적(target)으로 하는 스템-루프 역전사 프라이머가 다공성 구조체 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시, 표적 마이크로 RNA의 농도에 따른 실시간 PCR의 효율(도 4a) 및 실시간 정량 PCR의 효율(도 4b)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-16-5p 마이크로 RNA를 표적(target)으로 하는 스템-루프 역전사 프라이머가 다공성 구조체 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시, 표적 마이크로 RNA만 존재하는 경우(도 5의 without E.coli RNA)와 표적 마이크로 RNA 외의 핵산이 존재하도록 음성 토탈 RNA(negative total RNA, 도 5에서는 E.coli RNA)를 추가 주입한 경우(도 5의 with E.coli RNA)의 실시간 정량 PCR의 효율을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-miR-16-5p 마이크로 RNA를 표적(target)으로 하는 스템-루프 역전사 프라이머가 다공성 구조체 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시, 성숙 형태(mature form)의 마이크로 RNA의 PCR 반응성을 100%로 할 때, 전구체 형태(precursor form)의 마이크로 RNA의 상대적 PCR 반응성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 hsa-let-7a 마이크로 RNA를 표적(target)으로 하는 스템-루프 역전사 프라이머가 다공성 구조체 공극 내부에 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용한 PCR 반응성을 100%로 할 때, hsa-let-7a 마이크로 RNA와 단일 염기 차이가 있는 hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d 및 hsa-let-7e 마이크로 RNA 각각의 상대적 PCR 반응성을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 측면에서, 본 발명은 공극을 포함하는 다공성 구조체; 및 상기 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 표적(target) 마이크로RNA(microRNA, miRNA)의 역전사(reverse transcription, RT) 프라이머로서 스템-루프 프라이머(stem-loop primer);를 포함하고, 상기 스템-루프 프라이머는 루프(loop) 구조에 아크릴기(acryl group), 아민기(amine group), 카복실기(carboxyl group) 및 이중결합(double bond)으로 이루어진 화학적 반응기 중 하나 이상을 포함하고, 표적 RNA의 길이는 5 내지 60 머(mer)인, 표적 RNA 증폭 구조체 를 제공한다.

본 발명의 표적 RNA의 길이는 60 머(mer) 이하일 수 있고, 구체적으로 5 내지 60 머(mer)일 수 있으며, 보다 구체적으로 5 머 이상, 10 머 이상, 11 머 이상, 12 머 이상, 13 머 이상, 14 머 이상, 15 머 이상, 16 머 이상, 17 머 이상, 18 머 이상, 19 머 이상, 20 머 이상, 21 머 이상, 22 머 이상, 23 머 이상, 24 머 이상, 25 머 이상, 26 머 이상, 27 머 이상, 28 머 이상, 29 머 이상, 30 머 이상, 31 머 이상, 32 머 이상, 33 머 이상, 34 머 이상, 35 머 이상, 36 머 이상, 37 머 이상, 38 머 이상, 39 머 이상, 40 머 이상, 41 머 이상, 42 머 이상, 43 머 이상, 44 머 이상, 45 머 이상, 46 머 이상, 47 머 이상, 48 머 이상, 49 머 이상, 50 머 이상, 51 머 이상, 52 머 이상, 53 머 이상, 54 머 이상, 55 머 이상, 56 머 이상, 57 머 이상, 58 머 이상 또는 59 머 이상일 수 있고, 60 머 이하, 59 머 이하, 58 머 이하, 57 머 이하, 56 머 이하, 55 머 이하, 54 머 이하, 53 머 이하, 52 머 이하, 51 머 이하, 50 머 이하, 49 머 이하, 48 머 이하, 47 머 이하, 46 머 이하, 45 머 이하, 44 머 이하, 43 머 이하, 42 머 이하, 41 머 이하, 40 머 이하, 39 머 이하, 38 머 이하, 37 머 이하, 36 머 이하, 35 머 이하, 34 머 이하, 33 머 이하, 32 머 이하, 31 머 이하, 30 머 이하, 29 머 이하, 28 머 이하, 27 머 이하, 26 머 이하, 25 머 이하, 24 머 이하, 23 머 이하, 22 머 이하, 21 머 이하, 20 머 이하, 19 머 이하, 18 머 이하, 17 머 이하, 16 머 이하, 15 머 이하, 14 머 이하, 13 머 이하, 12 머 이하, 11 머 이하, 10 머 이하, 9 머 이하, 8 머 이하, 7 머 이하 또는 6 머 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 표적 RNA는 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)일 수 있고, 상기 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)는 약 60 머(mer) 이하의 짧은 길이를 갖는 RNA 분자로, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 마이크로 RNA는 세포, 조직 등의 시료로부터 추출한 마이크로 RNA일 수 있고, 인공적으로 합성된 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 마이크로 RNA는 표적 마이크로 RNA 외에도 표적이 아닌 마이크로 RNA를 포함하는 토탈 RNA(total RNA)일 수 있고, 표적 마이크로 RNA만을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 마이크로 RNA는 일차 마이크로 RNA(primary microRNA, primary miRNA)가 핵 속의 드로셔(Drosha)라 불리는 RNA 절단 효소(RNase)에 의해 편집된 전구체 형태(precursor form)의 마이크로 RNA(precursor microRNA, precursor miRNA, pre-miR)일 수 있으며, 상기 전구체 형태의 마이크로 RNA는 RNA 헤어핀 구조(RNA hair-pin structure)를 이루며 대략 70 내지 80 개의 뉴클레오티드로 구성된다. 또한, 상기 마이크로 RNA는 상기 전구체 형태의 마이크로 RNA가 세포질 내에서 다이서(Dicer)라 불리는 또 다른 RNA 절단 효소(RNase)에 의해 가공된 성숙 형태(mature form)의 마이크로 RNA(mature microRNA, mature miRNA)일 수 있다. 구체적으로, 상기 마이크로 RNA는 성숙 형태의 마이크로 RNA일 수 있다.

본 발명의 다공성 구조체에 고정된 프라이머는 RNA를 표적으로 하는 역전사 프라이머로, 스템-루프 프라이머(stem-loop primer)일 수 있다. 상기 스템-루프 프라이머는 단일가닥의 RNA 또는 DNA의 상보적인 역 반복서열 간에 수소결합으로 생긴 스템(stem) 부분과 루프(loop) 형태를 하고 있는 고리(루프, loop) 부분을 가진 구조의 프라이머로서, 헤어핀 구조(hairpin loop)의 프라이머로 불릴 수 있다. 상기 스템 구조는 상기 스템-루프 프라이머의 내부적으로 상보적인 서열로 인해 상보적 결합 또는 수소결합을 하는 구간일 수 있고, 상기 루프 구조는 상기 스템-루프 프라이머의 스템 부분을 제외한 나머지 구간, 구체적으로 상기 스템-루프 프라이머 중 내부적으로 상보적인 서열로 인해 상보적 결합 또는 수소결합을 하는 부분을 제외한 나머지 구간일 수 있다. 상기 스템-루프 프라이머는 스템과 스템 사이에 형성된 염기쌍간의 수소결합 및 스템 사이의 동축 적층에 의해 다른 프라이머에 비해 보다 안정하므로, 이러한 스템-루프 프라이머가 고정된 본 발명의 다공성 구조체는 짧은 길이의 표적 RNA, 구체적으로 60 머(mer) 이하의 길이를 갖는 표적 RNA, 보다 구체적으로 표적 마이크로 RNA만 특이적으로 역전사시킬 수 있음과 동시에 역전사 프라이머를 안정된 상태로 보관할 수 있어 반응 효율을 높일 수 있다. 상기 스템-루프 프라이머의 전체 길이는 30 내지 100 머(mer)일 수 있고, 스템 부분의 길이는 상기 스템-루프 프라이머 전체 길이의 30 내지 80%일 수 있으며, 루프 부분의 길이는 상기 스템-루프 프라이머 전체 길이의 10 내지 50%일 수 있고, 스템-루프 프라이머 내에서 표적 RNA에 특이적으로 반응하는 구조의 길이는 상기 스템-루프 프라이머 전체 길이의 5 내지 20%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 역전사 프라이머는 화학적 반응기를 포함함으로써 다공성 구조체의 공극 내부에 화학적으로 고정된 것일 수 있으며, 구체적으로, 역전사 프라이머에 포함된 화학적 반응기에 링커(linker)를 반응시켜 다공성 구조체에 화학적으로 고정된 것일 수 있다. 상기 화학적 반응기는 작용기로 불릴 수 있고, 아크릴기(acryl group), 아민기(amine group), 카복실기(carboxyl group) 및 이중결합(double bond)으로 이루어진 화학적 반응기 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 링커는 역전사 프라이머를 다공성 구조체에 고정시키기 위한 것이라면 어느 것이든 가능하며, 구체적으로 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리머나 알킬사슬(alkyl chain)과 같은 폴리머 사슬일 수 있으며, 보다 구체적으로, 2-카복실에틸 아크릴레이트(2-carboxylethyl acrylate)(CEA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화학적 반응기는 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머의 루프 구조의 염기에 포함된 화학적 반응기일 수 있고, 구체적으로, 상기 스템-루프 프라이머의 고리 부분인 루프 구조의 염기에 포함된 화학적 반응기일 수 있다. 또한, 보다 구체적으로 상기 스템-루프 프라이머의 루프 구조에 포함된 전체 염기 중 5'에서 3'방향의 첫 번째 염기의 상대적 위치를 0, 마지막 염기의 상대적 위치를 100이라 할 때, 상기 화학적 반응기는 상대적 위치가 0 내지 100, 구체적으로 10 내지 90인 염기 중 하나 이상에 포함될 수 있고, 보다 구체적으로 20 내지 80인 연기 중 하나 이상에 포함될 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 화학적 반응기는 상대적 위치가 0 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상, 55 이상, 60 이상, 65 이상, 70 이상, 75 이상, 80 이상, 85 이상, 90 이상 또는 95 이상인 염기 중 하나 이상에 포함될 수 있고, 상기 화학적 반응기는 상대적 위치가 100 이하, 95 이하, 90 이하, 85 이하, 80 이하, 75 이하, 70 이하, 65 이하, 60 이하, 55 이하, 50 이하, 45 이하, 40 이하, 35 이하, 30 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하, 10 이하 또는 5 이하인 염기 중 하나 이상에 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 스템-루프 역전사 프라이머의 루프(loop) 구조의 염기에 화학적 반응기가 합성된 경우에는 용액과 표적 RNA 증폭 구조체 내에서 안정적인 실시간 정량 PCR 결과를 보여주는 반면, 스템-루프 역전사 프라이머의 스템(stem) 구조의 5' 말단에 화학적 반응기가 합성된 경우에는 용액과 표적 RNA 증폭 구조체 내 모두에서 실시간 정량 PCR 결과가 나타나지 않았는바, 이를 통해 스템-루프 역전사 프라이머의 스템(stem) 구조에 화학적 반응기가 존재하면 표적 RNA(마이크로 RNA)가 실시간 정량 PCR을 진행하는 데 방해요인으로 작용하지만, 루프 구조 내에 화학적 반응기가 존재하면 그렇지 않음을 확인하였다(시험예 1 및 도 3).

본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 상기 다공성 구조체의 공극 내부에 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 프라이머로서 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 하나 이상의 프라이머가 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 상기 다공성 구조체의 공극 내부에 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 모두가 고정된 것일 수 있고, 또는 상기 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 한 방향의 프라이머만이 고정된 것일 수 있고, 또는 상기 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두가 고정되지 않은 것일 수 있다. 상기 다공성 구조체에 고정되지 않은 프라이머는 상기 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하는 실시간 다중 핵산 증폭 장치에 주입되는 용액에 포함될 수 있다. 상기 다공성 구조체에 프라이머가 고정되지 않은 경우, 표적 RNA 증폭 구조체 내의 공극에서 자유롭게 이동할 수 있어 반응성을 향상시킬 수 있다.

상기 표적 RNA 증폭 구조체는 상기 말단에 아크릴기(acryl group)를 포함하는 PCR 프라이머를 포함하여 상기 아크릴기가 다공성 구조체에 화학적으로 결합함으로써 PCR 프라이머를 다공성 구조체에 고정시킨 것일 수 있다. 또한, 상기 PCR 프라이머는 다공성 구조체와 링커(linker)로 연결된 것일 수 있으며, 이 경우 링커에 의해 프라이머가 공극 내에 움직일 수 있는 자유도가 높아지므로 반응성이 향상된다. 상기 링커의 길이는 5 내지 100 nm일 수 있고, 구체적으로 20 내지 50 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리머나 알킬사슬(alkyl chain)과 같은 폴리머 사슬일 수 있으나, PCR 프라이머 및 다공성 구조체와 화학적으로 결합할 수 있는 것이면 그 종류가 제한되지 않는다.

상기 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 PCR 프라이머는 PCR 과정 중 고정되었던 기공의 표면으로부터 분리되어 상기 다공성 구조체의 공극 내부로 유출되는 것일 수 있다. 상기 분리는 다공성 구조체에 연결된 링커의 열, 빛 또는 화학반응에 의한 분해에 따른 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 열, 빛 또는 화학반응에 의한 분해는, 특정 온도, 특정 파장의 빛 또는 특정 반응조건에서의 화학반응에서 상태가 변화하는 물질로 이루어진 입자 내부에 PCR 프라이머인 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 하나 이상의 프라이머가 포함되어 상기 다공성 구조체에 고정됨으로써, PCR 과정 중 특정 온도, 특정 파장의 빛 또는 특정 반응조건에서 수행되는 특정 단계에서 상기 물질로 이루어진 입자 내부에 포함된 PCR 프라이머가 상기 다공성 구조체 공극 내부로 유출되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, PCR 과정 중 특정 온도, 특정 파장의 빛 또는 특정 반응조건에서 수행되는 특정 단계 이전에는 상기 입자 내에 포함된 PCR 프라이머가 상기 입자 외부로 유출되지 않아 핵산 증폭 반응 직전까지 PCR 프라이머를 매우 안정적으로 포함하고 있을 수 있으므로, 서로 다른 표적 핵산 프라이머들이 만드는 비특이적 신호를 효과적으로 방지할 수 있다. 상기 특정 단계에서는 상기 입자의 상태가 변화, 예를 들어 용융되어 상기 입자 내부에 포함된 PCR 프라이머가 상기 다공성 구조체 공극 내부로 유출됨으로써 PCR 프라이머의 다공성 구조체의 내부 또는 외부에서 자유로운 이동이 가능한 높은 효율의 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있다. 보다 더 구체적으로, 상기 열에 의한 분해는, 임계 용해 온도(critical solution temperature) 이하의 온도에서는 고상으로 존재하고 상기 임계 용해 온도 이상에서는 액상으로 존재하는 물질로 이루어진, UCST(Upper Critical Solution Temperature) 입자 내부에 PCR 프라이머가 고정되어 이루어진 것일 수 있으며, 상기 UCST 입자는 아가로스(agarose), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), LMPA(low melting point agarose) 및 PEG-aCD(Polyethylene glycol 및 alpha-cyclodextrin의 혼합물)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 그 외에도 상온 안정성 및 핵산 증폭 반응성에 따라 다양한 UCST 물질이 선택될 수 있다. 또한, 상기 빛에 의한 분해는, 다공성 구조체의 공극 내부에 고정되는 프라이머의 5' 말단에 광-분해 사이트(photo-cleavage site)를 삽입하여 상기 구조체의 공극 내부에 고정시킨 후, 핵산 증폭 과정(예로 PCR 과정) 이전에 특정 파장의 빛을 조사하여 상기 고정된 프라이머가 상기 다공성 구조체 공극 내부로 유출 되는 것일 수 있다(Allon M Klein. et al., Cell. 2015 May 21; 161(5): 1187-1201 및 Roberto Rinaldi. et al., Angewandte. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2-54 참조). 또한, 상기 화학반응에 의한 분해는, 다공성 구조체의 공극 내부에 고정되는 프라이머의 5' 말단에 카르보네이트(carbonate)기, 카바메이트(carbamate)기, 이민(imine)기, 에테르(ether)기, 포스페이트(phosphate)기, 에스터(ester)기 및 아미드(amide)기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응기를 삽입하여 상기 구조체의 공극 내부에 고정시킨 후, 핵산 증폭 과정(예로 PCR 과정) 이전에 특정 조건, 예를 들어 특정 효소, 특정 조건의 pH, 온도 또는 화합물에 노출시켜 상기 고정된 프라이머가 상기 다공성 구조체 공극 내부로 유출 되는 것일 수 있다(Daniela Hartmann Jornada. et al., Molecules 2016, 21, 42 및 Roberto Rinaldi. et al., Angewandte. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2-54 참조).

본 발명의 다공성 구조체의 기공율은 다공성 구조체의 총 부피에 대하여 10 내지 95 부피%일 수 있다. 구체적으로, 다공성 구조체의 기공율은 다공성 구조체의 총 부피에 대하여 10 부피% 이상, 15 부피% 이상, 20 부피% 이상, 25 부피% 이상, 30 부피% 이상, 35 부피% 이상, 40 부피% 이상, 45 부피% 이상, 50 부피% 이상, 55 부피% 이상, 60 부피% 이상, 65 부피% 이상, 70 부피% 이상, 75 부피% 이상, 80 부피% 이상, 85 부피% 이상 또는 90 부피% 이상일 수 있고, 95 부피% 이하, 90 부피% 이하, 85 부피% 이하, 80 부피% 이하, 75 부피% 이하, 70 부피% 이하, 65 부피% 이하, 60 부피% 이하, 55 부피% 이하, 50 부피% 이하, 45 부피% 이하, 40 부피% 이하, 35 부피% 이하, 30 부피% 이하, 25 부피% 이하, 20 부피% 이하 또는 15 부피% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위를 벗어날 경우 다공성이 떨어지거나 다공성 구조체의 구조적 안정도가 불안정하여 핵산 증폭 반응에 불리할 수 있다.

본 발명의 다공성 구조체의 입경은 5 μm 내지 2 mm 일 수 있으며, 형태는 3차원의 구조체라면 제한되지 않으며, 구체적으로 구형, 반구형, 디스크형, 판상형 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다공성 구조체의 재료는 경화(curing)가 가능한 폴리머(pre-polymer)라면 제한없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 폴리에틸렌 글리콜-디아크릴레이트(Polyethylene Glycol-Diacrylate, PEG-DA) 또는 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide, PA)와 같은 친수성 폴리머일 수 있다.

본 발명의 PCR 형광 표지 방법으로는 SYBR green I dye 등을 이용하여 핵산 증폭 반응 중 생기는 증폭산물 사이에 끼어들어 형광을 내는 비특이적 형광 표지 방법과 프로브(probe)를 사용하여 핵산 증폭 반응에 의하여 생기는 증폭산물의 특정 서열에 결합하여 있다가 핵산 증폭 반응에 의해 형광을 내는 특이적 형광 표지 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체가 특이적 형광 표지 방법을 이용할 경우 상기 표적 RNA 증폭 구조체는 프로브(probe)를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 프로브는 선택적 형광 프로브일 수 있다. 상기 형광 프로브는 표적 핵산에 결합하여 형광 시그널을 제공하여 표적 핵산을 실시간으로 검출할 수 있게 한다. 일 실시예로서 상기 표적 핵산이 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭되면서 상기 형광 강도도 함께 증가하게 되므로, 형광 강도를 검출함으로써 증폭되는 핵산을 정량할 수 있다. 상기 형광 프로브는 표적 핵산에 상보적으로 결합하여 형광성을 나타내는 것이면 종류에 한정되지 않고 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택적 형광 프로브는 택맨 프로브(TaqMan probe), LNA(Locked Nucleic acid) 등을 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 택맨 프로브(TaqMan probe)는 5' 말단을 형광물질(FAM 등)로, 3' 말단을 퀀처(quencher) 물질(BHQ 등)로 수식한 핵산으로, 어닐링 단계(annealing step)에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화 결합하지만, 프로브상에 퀀처(quencher)에 의해 형광 발생이 억제되고, 신장(Extension) 반응 시에 Taq DNA 폴리머레이즈가 갖는 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성으로 주형에 혼성화 결합한 택맨 프로브가 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리됨으로서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광을 발현한다.

본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 물 또는 오일로 코팅된 것일 수 있다. 상기 코팅은 핵산 증폭 반응을 수행을 위한 용액을 표적 RNA 증폭 구조체에 주입한 후에 표적 RNA 증폭 구조체 각각을 물 또는 오일로 코팅하는 하는 것일 수 있으며, 상기 오일은 구체적으로 미네랄 오일(mineral oil)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 코팅된 표적 RNA 증폭 구조체 각각은 독립적으로 핵산 증폭 반응, 구체적으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행할 수 있으며, 이로 인해 형광 및 증폭 산물이 표적 RNA 증폭 구조체 밖으로 빠져나가지 않아, 다른 종류의 RNA를 표적으로 하는 표적 RNA 증폭 구조체 각각을 제조 후 상기 코팅을 하는 경우, 표적 RNA 증폭 구조체 간 교차 효과(cross-effect, CE)가 없이 각 표적 RNA 증폭 구조체 별로 RNA의 역전사 및 실시간 다중 핵산 증폭 반응이 일어나 다중 분석이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 오일로 코팅된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 마이크로 RNA의 실시간 다중 핵산 증폭 반응을 수행 시, 각 표적 RNA 증폭 구조체 별로 마이크로 RNA의 역전사 및 실시간 다중 핵산 증폭반응이 정상적으로 잘 일어남을 확인하였다(실시예 2 및 도 2).

본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 핵산 프라이머 정보를 제공하는 인코더(encoder) 및 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 형광표식인자 중 하나 이상을 공극 내에 더 포함할 수 있다. 상기 인코더는 색이나 모양 등으로 각 표적 RNA 증폭 구조체 내의 핵산 프라이머가 무엇인지를 구분짓는 물질을 의미하며, 예를 들어 여러 색깔의 형광을 내는 염료(dye), 양자점이나 특정 모양을 지닌 금속, 플라스틱, 유리, 실리콘 등을 사용할 수 있다. 혹은 인코더를 사용하지 않고, 표적 RNA 증폭 구조체 자체의 크기나 형태를 변화시키거나 표적 RNA 증폭 구조체의 표면에 특정 표식을 함으로써 각 표적 RNA 증폭 구조체 내의 핵산 프라이머를 구분할 수 있다. 또는 각 표적 RNA 증폭 구조체의 어레이 내 위치를 특정함으로써 각 표적 RNA 증폭 구조체 내의 핵산 프라이머를 구분할 수 있다.

본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 표적 RNA, 구체적으로 표적 마이크로 RNA 외에 기타 핵산이 존재하는 것과 무관하게 표적 RNA, 구체적으로 마이크로 RNA의 핵산 증폭 반응을 수행하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 핵산 증폭 반응 수행 시, 음성 토탈 RNA(negative total RNA)가 존재할 때도 실시간 정량 PCR의 효율 및 측정 한계가 상기 음성 토탈 RNA가 존재하지 않을 때와 유사하였는바, 이를 통해 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 표적 마이크로 RNA 외에 기타 핵산이 존재하더라도, 표적 마이크로 RNA가 아닌 핵산에 영향을 받지 않고 우수한 효율로 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있음을 확인하였다(시험예 3 및 도 5).

본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 전구체 형태의 RNA, 구체적으로 전구체 형태의 마이크로 RNA(전구체 마이크로 RNA)로부터 성숙 형태의 RNA, 구체적으로 성숙 형태의 마이크로 RNA(성숙 마이크로 RNA)를 식별하는 것일 수 있다. 구체적으로, 60 머 이하의 길이의 표적 RNA, 예를 들어 마이크로 RNA의 특이성으로 인해 표적 RNA, 예를 들어 마이크로 RNA의 정성, 정량 분석은 더욱 까다로울 수 있다. 예를 들어, 우선 성숙 형태(mature form)의 마이크로 RNA(miRNA)의 길이는 23 bp(base-pair) 이하로 mRNA에 비해 아주 짧고, 성숙 형태의 마이크로 RNA의 염기 서열이 표적 전사체(target transcript)나 전구체 형태(precursor form)의 마이크로 RNA(pri-, pre-miRNA)에도 나타난다. 이는 현재 주로 마이크로 RNA의 정량에 사용되는 실시간 정량 PCR(RT-qPCR)에서 정량적 특이성(specificity)을 저하시킨다. 본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 상기 문제를 해결한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 핵산 증폭 반응 수행 시, 전구체 형태의 마이크로 RNA는 성숙 형태의 마이크로 RNA에 비해 1% 미만의 상대적 반응성을 보이는 바, 이를 통해 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 성숙 형태와 전구체 형태의 마이크로 RNA가 혼재되어 있어도 성숙 형태의 마이크로 RNA를 특이적으로 식별할 수 있음을 확인하였다(시험예 4 및 도 6).

본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 단일 염기 차이가 있는 60 머 이하의 길이의 표적 RNA, 예를 들어 마이크로 RNA를 식별하는 것일 수 있다. 구체적으로, 마이크로 RNA는 GC 염기의 비율이 큰 범위에서 변하여 이로 인하여 PCR 반응 시 최적의 반응 조건을 결정하기 어렵고 분석결과의 재연성(reproducibility)이 낮아지는 등의 결과의 부정확성을 유도한다. 특히 염기서열이 아주 비슷한 60 머 이하의 길이의 표적 RNA, 예를 들어 마이크로 RNA들은 PCR 반응시 프라이머와의 비-특이적 어닐링(non-specific annealing)에 의한 공동-증폭(co-amplification)의 가능성이 높아 이러한 비-특이적 증폭(non-specific amplification)을 분석 결과에서 배제할 필요가 있다. 본 발명의 표적 RNA 증폭 구조체는 상기 문제를 해결한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면 hsa-let-7a 마이크로 RNA를 표적으로 하는 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 핵산 증폭 반응 수행 시, hsa-let-7a 마이크로 RNA와 단일 염기 차이가 있는 hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d 및 hsa-let-7e 마이크로 RNA는 hsa-let-7a 마이크로 RNA에 비해 각각 0.1%, 4.0%, 2.7% 및 2.9%의 상대적 반응성을 보이는 바, 이를 통해 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 짧은 길이의 마이크로 RNA 내에서 단일 염기 차이가 있다 하여도 표적이 되는 마이크로 RNA를 특이적으로 식별할 수 있음을 확인하였다(시험예 5 및 도 7).

다른 측면에서, 본 발명은 상기와 같은 표적 RNA 증폭 구조체를 제조하는 방법으로, 표적 RNA의 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머가 다공성 구조체의 공극 내부에 고정되도록 상기 역전사 프라이머에 링커(linker)를 합성하는 단계; 프레폴리머(pre-polymer) 및 상기 링커가 합성된 역전사 프라이머를 포함하는 구조체 형성 용액을 제조하는 단계; 상기 구조체 형성 용액을 3차원 구조체 형태로 토출하고, 이를 경화시켜 표적 RNA 증폭 구조체를 형성하는 단계를 포함하는, 표적 RNA 증폭 구조체 제조방법을 제공한다. 또한, 상기 표적 RNA 증폭 구조체 제조방법은 구조체 형성 용액이 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 프라이머로서 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 하나 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 표적 RNA 증폭 구조체 제조방법은 상기 형성된 표적 RNA 증폭 구조체를 물 또는 오일로 코팅하는 것일 수 있다. 상기 표적 RNA, 마이크로 RNA, 역전사 프라이머, 스템-루프 프라이머, 링커, PCR 프라이머, 물 또는 오일로 코팅 및 다공성 구조체 등은 전술한 바와 같다.

상기 역전사 프라이머에 링커를 합성하는 단계는 상기 스템-루프 역전사 프라이머가 다공성 구조체의 공극 내부에 고정되도록 스템-루프 역전사 프라이머 내의 염기에 화학 반응기를 합성하는 것을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 스템-루프 역전사 프라이머의 루프 구조의 염기에 화학적 반응기를 포함하도록 합성하는 것일 수 있다.

본 발명의 "프레폴리머(pre-polymer)"란 폴리머의 성형 가공을 용이하게 하기 위해 중합 또는 중축합 반응을 적당한 단계에서 정지한 예비 중합물을 의미하는 것으로, 본 발명의 경우 경화되기 이전의 성형 가공이 용이한 상태의 폴리머일 수 있으며, 친수성 폴리머일 수 있다. 상기 프레폴리머 용액은 공극유도중합체(porogen)이 포함된 것일 수 있으며, 상기 제조방법은 프레폴리머 용액에 포함된 공극유도중합체의 크기를 변형시킴으로써 다공성 구조체 내에 형성되는 공극의 크기를 조절하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 공극유도중합체는 폴리에틸렌글리콜(Polyehtylene glycol; PEG) 또는 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide; PAM) 등일 수 있으며, 상기 폴리에틸렌글리콜로는 구체적으로 PEG200, PEG300, PEG400, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG2000, PEG3000, PEG3350, PEG4000, PEG6000, PEG8000, PEG10000, PEG12000, PEG20000, PEG 35000, PEG40000 등(제조사: Sigma Aldrich)일 수 있다.

상기 구조체 형성 용액을 3차원 구조체 형태로 토출하는 것에서, 상기 3차원 구조체 형태는 액적(droplet) 형태일 수 있고, 또는 구형, 반구형, 디스크형, 판상형 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 토출은 마이크로채널을 이용한 방법, 압전(piezo) 방식 또는 솔레노이드 밸브(solenoid valve) 방식, 마이크로스파팅(microspotting) 등에 의한 토출을 포함할 수 있으며, 이를 통해 다양한 형태 및 크기의 표적 RNA 증폭 구조체를 제조할 수 있다.

또한, 상기 3차원 구조체의 경화는 경화 전의 3차원 구조체의 형상을 유지하여 경화하는 것으로, 그 형상을 유지할 수 있다면 광학적, 화학적 또는 열적 경화방법 등 그 방법은 제한되지 않으며, 자외선에 의한 경화를 예로 들 수 있다.

또한, 상기 제조방법은 3차원 구조체를 경화시킨 후 세척하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 세척 단계를 통하여 반응하지 않은 공극유도중합체 및 반응하지 않은 프라이머 등을 제거할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법을 사용하여 표적 RNA 종류에 따라 표적 RNA 역전사 프라이머의 종류를 달리하여 주입함으로써, 서로 다른 표적 RNA 역전사 프라이머를 포함하는 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법을 사용하여 상기 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체 각각이 표적 RNA 종류에 따라 다른 종류의 PCR 프라이머로, 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 하나 이상을 추가로 포함하도록 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체를 제조할 수 있다. 상기 프레폴리머 용액은 각 표적 RNA 증폭 구조체가 포함하는 표적 RNA 역전사 프라이머 또는 PCR 프라이머의 정보를 제공하는 인코더(encoder) 및 증폭되는 표적 RNA의 정량적 정보를 제공하는 형광 표식인자 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기와 같은 표적 RNA 증폭 구조체를 하나 이상 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭장치를 제공한다. 구체적으로, 상기 실시간 다중 핵산 증폭장치는 서로 다른 표적 RNA에 대한 역전사 프라이머를 각각 포함하는 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체를 포함할 수 있으며, 또는 상기 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체는 서로 다른 표적(target) RNA에 대한 PCR 프라이머를 각각 포함할 수 있다. 또한, 상기 표적 RNA 증폭 구조체 각각은 물 또는 오일로 코팅된 것일 수 있다. 상기 다공성 구조체, 표적 RNA, 마이크로 RNA, 역전사 프라이머, PCR 프라이머, 및 물 또는 오일로 코팅은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 상기 실시간 다중 핵산 증폭장치는 반응 챔버(chamber)를 더 포함할 수 있으며, 상기 반응 챔버는 상기 표적 RNA 증폭 구조체가 배열되는 어레이(array) 또는 튜브(tube)를 포함할 수 있다. 상기 어레이(array)의 재질은 유리, 플라스틱, 폴리머, 실리콘 등 핵산 증폭반응의 온도 조건을 적용할 수 있다면 물질 종류에 제한되지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기와 같은 하나 이상의 표적 RNA 증폭 구조체를 반응 챔버(chamber)에 주입하는 단계; 하나 이상의 표적(target) RNA를 포함하는 용액을 상기 반응 챔버(chamber)에 주입하는 단계; 상기 표적 RNA를 역전사(reverse transcription, RT)시켜 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성하는 단계; 및 상기 cDNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 표적 RNA를 증폭시키는 단계;를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭 방법을 제공한다. 상기 다공성 구조체, 표적 RNA, 마이크로 RNA 및 역전사 프라이머는 전술한 바와 같다.

상기 실시간 다중 핵산 증폭방법은 서로 다른 표적 RNA에 대한 역전사 프라이머를 각각 포함하는 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체를 포함할 수 있으며, 또는 상기 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체는 서로 다른 표적 RNA에 대한 PCR 프라이머를 각각 포함할 수 있다.

상기 상보적 DNA를 합성하는 단계는 표적 RNA를 포함하는 용액에 RNase 억제제 및 역전사 효소 등을 더 포함하는 것일 수 있으며, RNA를 역전사시켜 상보적 DNA를 합성할 수 있다면, 어떤 방법이든 제한없이 사용할 수 있다.

상기 표적 RNA를 증폭시키는 단계는 상기 중합효소 연쇄반응 수행 시 주입되는 용액에 3'-locked nucleic acid primer와 같은 LAN(Locked nucleic acid)를 포함하는 프로브, DNA 폴리머라제 등을 더 포함하는 것일 수 있으며, 핵산을 증폭할 수 있다면, 어떤 방법이든 제한없이 사용할 수 있다.

또한, 상기 반응 챔버는 상기 표적 RNA 증폭 구조체가 배열되는 어레이(array) 또는 튜브(tube)를 포함할 수 있으며, 상기에 어레이는 전술한 바와 같다.

또한, 상기 표적 RNA를 증폭시키는 단계는 상기 표적 RNA 증폭 구조체 각각을 물 또는 오일로 코팅하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 물 또는 오일로 코팅은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 상기 실시간 다중 핵산 증폭방법은 상기 하나 이상의 각 표적 RNA 증폭 구조체 내에서 중합되는 핵산을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예로서, 상기 방법은 상기 중합효소 연쇄반응시키는 단계와 동시에 중합되는 상기 하나 이상의 각 표적 RNA 증폭 구조체 내에서 중합되는 핵산을 실시간으로 정량적 분석하는 단계를 더 포함하며, 상기와 같은 각기 다른 종류의 표적 RNA들을 동시에 증폭시키면서 실시간으로 검출하고 정량적으로 분석할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예를 통하여 설명한다. 하기 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 표적 RNA 증폭 구조체의 제조

[ 실시예 1-1] hsa - miR -16-5p 마이크로 RNA를 표적으로 하는 표적 RNA 증폭 구조체의 제조

프라이머 및 프로브 설계

hsa-miR-16-5p 마이크로 RNA를 표적(target)으로 하는 표적 RNA 증폭 구조체를 제조하기 위해, 먼저 하기 표 1의 염기서열의 스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머, PCR 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 및 프로브를 설계하였다. 하기 서열번호 1의 스템-루프 역전사 프라이머 중 5'말단의 GTT GGC TCT GGT GC 서열 및 5'에서 3' 방향의 서열 중 GCA CCA GAG CCA AC 서열은 스템 부분(하기 표 1의 서열번호 1의 밑줄)이고, 5'에서 3' 방향의 서열 중 A GGG TCC GAG GTA TTC 서열은 루프 부분(하기 표 1의 서열번호 1의 이탤릭체)이며, 3' 말단의 C GCC AA는 표적 miRNA를 인지하고 반응하는 부분이다.

구분	염기서열	서열번호
스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머	5' - GTT GGC TCT GGT GC A GGG T * CC GAG GTA TTC GCA CCA GAG CCA ACC GCC AA - 3'	서열번호 1
PCR 전방향 프라이머(PCR forward primer)	5' - CGC GCT AGC AGC ACG TAA AT - 3'	서열번호 2
PCR 역방향 프라이머(PCR reverse primer)	5' - GTG CAG GGT CCG AGG T - 3'	서열번호 3
프로브	5' - CAG AGC CA - 3'	서열번호 4

스템-루프 역전사 프라이머를 다공성 구조체에 고정하기 위해, 역전사 프라이머 염기 서열 중 T* 위치의 티민(thymine)에 아민(amine) 작용기가 합성된 프라이머를 사용하였으며, 전방향 프라이머를 다공성 구조체에 고정하기 위해, 5' 말단에 아크리다이트(acrydite) 작용기가 합성된 프라이머를 사용하였다. 또한, 프로브(Probe library 21, Thermo, USA)는 FAM 형광 물질이 고정된 LNA(Locked Nucleic acid)를 사용하였다.

스템 -루프 역전사 프라이머와 링커(linker)의 합성

스템-루프 역전사 프라이머의 아민 작용기를 아크리다이트(acrydite) 말단으로 합성하여 구조체에 고정하기 위해 링커(linker)로 하기 화학식 1의 2-카복실에틸 아크릴레이트(2-carboxylethyl acrylate)(CEA, Sigma Aldrich)를 사용하였다.

[화학식 1]

상기 합성은 EDC-NHS 반응을 통해 진행되었으며, 에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS), 상기 CEA 및 상기 서열번호 1의 스템-루프 역전사 프라이머를 10:10:1:4 의 몰농도 비율로 혼합 후 38℃에서 하룻밤 동안(12시간 이상) 반응시켜 링커가 합성된 스템-루프 역전사 프라이머를 수득하였다. 상기 비율에서 스템-루프 역전사 프라이머의 농도는 500uM으로 반응을 진행하였다.

다공성 구조체의 제조

하이드로겔 다공성 구조체를 제조하기 위해, 먼저, PEG700DA (제조사: Sigma-Aldrich) 20% v/v, PEG600 (제조사: Sigma-Aldrich) 40% v/v, 광개시제 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 (제조사: Sigma-Aldrich) 5% v/v 및 1X PBST (Tween-20 0.25%) 버퍼 35% v/v 를 혼합하여 프레폴리머 용액(pre-polymer solution)을 제조하였다.

그런 다음, 상기 제조된 프레폴리머 용액, 상기 링커가 합성된 스템-루프 역전사 프라이머 및 상기 표 1의 PCR 전방향 프라이머(2mM)를 각 90% v/v, 5% v/v 및 5% v/v로 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 쉐이킹(harsh shaking)을 통해 섞고 PDMS 표면상에 떨어뜨린 다음(spotting) UV(360nm 파장, 35mJ/cm2)를 1 분간 조사하여 경화(curing)시켰다. 그리고 PBST 버퍼로 세척하여(washing) 고정되지 않은 PEGDA, PEG 및 프라이머를 구조체 내에서 제거함으로써, hsa-miR-16-5p 마이크로 RNA를 표적으로 하는 스템-루프 역전사 프라이머 및 PCR 전방향 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 제조하였다.

[ 실시예 1-2] hsa -let-7a 마이크로 RNA를 표적으로 하는 표적 RNA 증폭 구조체의 제조

상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 hsa-let-7a 마이크로 RNA를 표적(target)으로 하는 표적 RNA 증폭 구조체를 제조하였으며, 스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머, PCR 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 및 프로브의 염기서열은 하기 표 2와 같다. 하기 서열번호 5의 스템-루프 역전사 프라이머 중 5'말단의 GTT GGC TCT GGT GC 서열 및 5'에서 3' 방향의 서열 중 GCA CCA GAG CCA AC 서열은 스템 부분(하기 표 2의 서열번호 5의 밑줄)이고, 5'에서 3' 방향의 서열 중 A GGG TCC GAG GTA TTC 서열은 루프 부분(하기 표 2의 서열번호 5의 이탤릭체)이며, 3' 말단의 C TCA AC는 표적 miRNA를 인지하고 반응하는 부분이다.

구분	염기서열	서열번호
스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머	5' - GTT GGC TCT GGT GC A GGG T * CC GAG GTA TTC GCA CCA GAG CCA ACC TCA AC - 3'	서열번호 5
PCR 전방향 프라이머(PCR forward primer)	5' - CGC GCT GAG GTA GTA GGT TGT - 3'	서열번호 6
PCR 역방향 프라이머(PCR reverse primer)	5' - GTG CAG GGT CCG AGG T - 3'	서열번호 3
프로브	5' - CAG AGC CA - 3'	서열번호 4

[ 실시예 2] 표적 RNA 증폭 구조체를 이용한 마이크로 RNA의 실시간 다중 핵산 증폭

마이크로 RNA의 역전사를 통한 cDNA의 합성

상기 실시예 1-1의 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Thermo, USA)를 사용하여 역전사 과정을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 1-1의 표적 RNA 증폭 구조체 주변의 버퍼를 제거한 후 표적 RNA 증폭 구조체만 남겨두었다. 그런 다음, 상기 표적 RNA 증폭 구조체에 반응 버퍼(reaction buffer)(10X) 1.5μL, dNTP 0.15 μL, RNase 억제제 0.19μL, 역전사 효소 1μL, 및 hsa-miR-16-5p 마이크로 RNA를 포함하는 RNA를 혼합 후 RNase가 없는 물을 첨가해 총 부피가 15 μL인역전사 반응용액을 주입하고 16℃에서 30분, 42℃에서 30분, 그리고 85℃에서 5분간 배양하였다. 이후, 합성된 cDNA를 포함하는 표적 RNA 증폭 구조체를 PBST 버퍼로 교체 후 -20℃에서 저장하였다. 발명의 일 실시예에 따른 표적 RNA 증폭 구조체의 마이크로 RNA의 실시간 다중 핵산 증폭 효과를 확인하기 위해, 비교예로서 상기 서열번호 1의 스템-루프 역전사 프라이머와 동일한 염기서열을 갖되, hsa-16-5p 마이크로 RNA TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (제조사: Thermo, USA)의 과정에 따라 표적 RNA 증폭 구조체 실험과 동량의 RNA를 첨가해 역전사를 실시하였다. 상기 비교예의 프라이머는 다공성 구조체에 고정되지 않고 반응 용액에서 포함된 상태로 역전사에 의한 cDNA 합성 및 하기 PCR 과정이 수행되었다.

실시간 중합효소 연쇄반응( PCR ) 수행

상기 실시예 1-1에서 제조된 표적 RNA 증폭 구조체의 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)을 UltraFast LabChip Real-time PCR G2-4 System (제조사: Nanobiosys, Korea)에서 다음과 같이 수행하였다. 상기 역전사 과정을 거친 다공성 구조체의 실시간 PCR을 위하여, 8 μL 2X TaqMan master mix (제조사: Nanobiosys, Korea), 10 μM 의 프로브 12.8 μL (Probe library 21, 제조사: Thermo, USA) 및 10 μM 의 역방향 프라이머 6.4 μL를 혼합 후 뉴클레아제(nuclease)가 없는 물을 첨가해 최종 부피 16 μL가 되도록 하였다. 상기 혼합액을 상기 실시예 1-1의 합성된 cDNA를 포함하는 표적 RNA 증폭 구조체가 존재하는 채널 내로 주입한 후 4℃에서 30분간 배양하였다. 그런 다음 배양이 완료된 표적 RNA 증폭 구조체를 미네랄 오일(제조사: Sigma Aldrich)을 이용해 각 표적 RNA 증폭 구조체를 코팅하여 각각을 독립시켰다.

상기 PCR 반응을 하기의 온도 사이클에 따라 수행하였으며, 총 40 내지 50 사이클로 수행하고, 매 사이클이 끝날 때마다 증폭된 핵산의 형광표식인자에 의해 나타나는 형광강도를 측정하여 정량분석하였다.

- 전변성(pre-denature): 95℃에서 8초간, 1 사이클

- 변성(denature): 95℃에서 4초간,

- 어닐링(annealing) 및 신장(elongation): 60℃에서 30초간

도 2는 상기 실시예 1-1의 표적 RNA 증폭 구조체를 이용한 마이크로 RNA의 실시간 다중 핵산 증폭 수행 시의 형광 이미지를 나타낸 것이다. 구체적으로, 상기 실시예 1-1의 표적 RNA 증폭 구조체에서 역전사 과정 후 실시간 PCR이 진행됨을 보여주며, 총 40 사이클의 PCR 과정 중 형광이 20 내지 25 사이클 사이에서 밝아졌다. 또한, 표적 RNA 증폭 구조체 각각은 미네랄 오일로 코팅되어 독립적으로 실시간 PCR이 진행되기 때문에, 형광 및 PCR 산물이 표적 RNA 증폭 구조체 밖으로 빠져나가지 않음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 마이크로 RNA의 실시간 다중 핵산 증폭 반응을 수행 시, 각 표적 RNA 증폭 구조체별로 마이크로 RNA의 역전사 및 실시간 다중 핵산 증폭반응이 정상적으로 잘 일어남을 확인할 수 있었다.

[ 시험예 1] 스템 -루프 역전사 프라이머의 화학적 반응기 위치에 따른 실시간 정량 PCR (real-time qPCR , RT- qPCT ) 효율 비교

스템-루프 역전사 프라이머를 다공성 구조체에 고정시키기 위한 화학적 반응기의 스템-루프 역전사 프라이머 내 위치에 따른 정량 PCR의 효율을 비교하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기 표 1의 서열번호 1의 스템-루프 역전사 프라이머와 같이 프라이머 염기 서열 중 루프(loop) 구조 내의 T* 위치의 티민(thymine)에 아민(amine) 작용기가 합성된 프라이머(도 3b)와, 비교예로서 상기 표 1의 서열번호 1의 스템-루프 역전사 프라이머와 염기서열이 동일하되 T* 위치의 티민이 아닌 스템(stem) 구조 내의 5' 말단에 아크리다이트(acrydite) 작용기가 합성된 프라이머(도 3a)를 각각 준비하였다. 그런 다음, 각각의 스템-루프 역전사 프라이머와 상기 표 1의 PCR 전방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브를 이용하여 용액 상에서, 그리고 다공성 구조체에 고정된 상태에서 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실시간 정량 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 3c 내지 도 3f에 나타내었다.

도 3c 및 도 3d에 나타난 바와 같이, 스템-루프 역전사 프라이머의 루프(loop) 구조의 염기에 작용기가 합성된 경우(도 3c 및 도 3d의 Intermediate modification)에는 용액(도 3c)과 표적 RNA 증폭 구조체 내(도 3d)에서 안정적인 실시간 정량 PCR 결과를 보여주는 반면, 스템-루프 역전사 프라이머의 스템(stem) 구조의 5' 말단에 작용기가 합성된 경우(도 3c 및 도 3d의 5' modification)에는 용액(도 3c)과 표적 RNA 증폭 구조체 내(도 3d) 모두에서 실시간 정량 PCR 결과가 나타나지 않았다. 특히, 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하였을 때, 스템-루프 역전사 프라이머의 스템 구조의 5' 말단에 작용기가 합성된 경우(도 3e)에는 PCR 이후(40 cycle) 형광이 검출되지 않으나, 루프 구조에 작용기가 합성된 경우(도 3f)에는 형광이 검출되는 바, 이를 통해 스템-루프 역전사 프라이머의 스템 구조에 작용기가 존재하면 마이크로 RNA가 역전사 과정 및 실시간 정량 PCR을 진행하는 데 방해요인으로 작용하지만, 루프 구조 내에 작용기가 존재하면 그렇지 않음을 알 수 있었다.

[ 시험예 2] 스템 -루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체의 실시간 정량 PCR (real-time qPCR , RT- qPCT ) 효율 및 측정 한계

스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용한 실시간 PCR 및 실시간 정량 PCR의 효율을 계산하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 제조된 표적 RNA 증폭 구조체를 실시예 2와 동일한 방법으로 실시간 다중 핵산 증폭을 수행하였다. 구체적으로, 표적 마이크로 RNA인 hsa-miR-16-5p (제조사: IDT, USA) 100 μM 을 용액 상에서 상기 실시예 2의 방법에 따라 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Thermo, USA)의 프로토콜로 cDNA를 합성한 후, 도 4a에 나타난 바와 같이 합성된 cDNA를 10분의 1씩 희석하여 연속 희석(serial dilution) 실험을 수행하였다. 이 때, 실시간 PCR 반응액(16 μL)의 1/10인 1.6 μL의 연속 희석된 cDNA 각각을 상기 실시예 1-1의 표적 RNA 증폭 구조체가 존재하는 채널 내로 주입하여 실시간 PCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1-1에서 제조된 표적 RNA 증폭 구조체의 마이크로 RNA을 표적으로 하는 실시간 PCR의 효율은 92.4%였다.

또한, 상기 실시예 1-1에서 제조된 표적 RNA 증폭 구조체의 실시간 정량 PCR(RT-qPCR) 효율 계산을 위해 상기 표적 마이크로 RNA인 hsa-miR-16-5p (제조사: IDT, USA) 10 μM 을 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 및 1 pM로 연속 희석 (serial dilution)한 후, 역전사 반응용액(15 μL)의 1/10인 1.5 μL의 각 농도의 마이크로 RNA 각각을 상기 실시예 1-1의 표적 RNA 증폭 구조체가 존재하는 채널 내로 주입하여 실시간 정량 PCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.

도 4b에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1-1에서 제조된 표적 RNA 증폭 구조체의 마이크로 RNA을 표적으로 하는 실시간 정량 PCR의 효율은 97.2%로 효율이 매우 높음을 알 수 있었으며, 측정 한계는 1 pM, 표적 RNA 증폭 구조체당 2 mol까지 측정할 수 있음을 확인하였다.

[ 시험예 3] 스템 -루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체의 음성 토탈 RNA(negative total RNA)가 존재할 때의 실시간 정량 PCR 효율 확인

본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체가 음성 토탈 RNA(negative total RNA)가 존재할 때도 우수한 실시간 정량 PCR 효율을 갖는지 확인하기 위해, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 제조된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 상기 시험예 2에서 연속 희석된 마이크로 RNA 각각에 음성 토탈 RNA로 E.coli 토탈 RNA(E.coli total RNA)를 100 ng 주입한 후 상기 시험예 2와 동일한 방법으로 실시간 다중 핵산 증폭을 수행하였으며, 반응 효율을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 실시간 정량 PCR의 효율은 99.4%, 측정 한계는 1 pM로, PCR 효율이 달라지지 않음을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 표적 마이크로 RNA 외에 기타 핵산이 존재하더라도, 표적 마이크로 RNA가 아닌 핵산에 영향을 받지 않고 우수한 효율로 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 시험예 4] 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 성숙 형태(mature form)와 전구체 형태(precursor form)의 마이크로 RNA 식별 능력 확인

본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 성숙 형태(mature form)와 전구체 형태(precursor form)의 마이크로 RNA를 식별할 수 있는지 확인하기 위해, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1의 성숙 형태인 표적 마이크로 RNA의 전구체 형태(precursor form)를 인-비트로-전사(In-Vitro-Transcription, IVT) 방법으로 합성한 후, 농도를 측정하고 성숙 형태의 마이크로 RNA와 전구체 형태의 마이크로 RNA를 동일한 몰수로 준비하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1-1의 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 실시간 정량 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 전구체 형태의 마이크로 RNA는 성숙 형태의 마이크로 RNA에 비해 0.36%의 상대적 반응성을 보였다. 이는 상기 실시예 2의 비교예(역전사 프라이머가 다공성 구조체에 고정되지 않고 반응 용액에 포함된 상태로 역전사 및 PCR 수행)의 전구체 형태의 마이크로 RNA가 성숙 형태의 마이크로 RNA에 비해 1.45%의 상대적 반응성을 보인 것과 유사하다. 이를 통해 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 성숙 형태의 마이크로 RNA와 전구체 형태의 마이크로 RNA가 혼재되어 있어도 성숙 형태의 마이크로 RNA를 특이적으로 식별할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 시험예 5] 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 단일 염기 차이가 있는 마이크로 RNA 식별 능력 확인

본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 단일 염기 차이가 있는 마이크로 RNA를 식별할 수 있는지 확인하기 위해, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-2의 hsa-let-7a 마이크로 RNA를 표적으로 하는 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 제조한 후, 제조된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실시간 정량 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이 때, 역전사 반응용액 내에는 10 nM의 hsa-let-7a 마이크로 RNA와 함께, hsa-let-7a와 단일 염기 차이가 있는 let-7 패밀리 마이크로 RNA로 hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d 및 hsa-let-7e 마이크로 RNA 각각을 10 nM씩 포함시켰다.

도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시, 표적 핵산이 hsa-let-7a 마이크로 RNA의 실시간 정량 PCR 수행 반응성을 100%로 하였을 때, 상기 표적 핵산과 단일 염기 차이가 있는 hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d 및 hsa-let-7e 마이크로 RNA는 각각 0.1%, 4.0%, 2.7% 및 2.9%의 상대적 반응성을 보였다. 이는 상기 실시예 2의 비교예(역전사 프라이머가 다공성 구조체에 고정되지 않고 반응 용액에 포함된 상태로 역전사 및 PCR 수행)의 상대적 반응성을 보인 것과 유사하다. 이를 통해 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 짧은 길이의 마이크로 RNA 내에서 단일 염기 차이가 있다 하여도 표적이 되는 마이크로 RNA를 특이적으로 식별할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 5 내지 60 머(mer)의 길이의 표적 RNA의 역전사 프라이머로서 스템-루프 프라이머가 구조체 공극 내부에 고정된, 표적 RNA 증폭 구조체를 이용하여 핵산 증폭 반응을 수행 시, 각 표적 RNA 증폭 구조체 별로 표적 RNA의 역전사 및 실시간 다중 핵산 증폭반응이 매우 우수한 효율로 잘 일어나며, 표적 핵산 농도가 매우 낮은 경우에도 반응성이 우수하고, 특히 스템-루프 역전사 프라이머의 루프(loop) 구조 내에 화학적 반응기가 위치할 때 그 효율이 매우 우수함을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 스템-루프 역전사 프라이머가 고정된 표적 RNA 증폭 구조체를 이용 시 표적 RNA 외에 기타 핵산이 존재하더라도, 표적 RNA가 아닌 핵산에 영향을 받지 않고 우수한 효율로 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있고, 성숙 형태의 RNA와 전구체 형태의 RNA가 혼재되어 있어도 성숙 형태의 RNA를 특이적으로 식별할 수 있으며, 표적 RNA 내에서 단일 염기 차이가 있다 하여도 표적 RNA를 특이적으로 식별할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> AMPLIFICATION STRUCTURE TARGETING RNA AND METHOD FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID USING SAME <130> 18p107ind <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stem-loop RT primer <400> 1 gttggctctg gtgcagggtc cgaggtattc gcaccagagc caaccgccaa 50 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 2 cgcgctagca gcacgtaaat 20 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer <400> 3 gtgcagggtc cgaggt 16 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 cagagcca 8 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stem-loop RT primer <400> 5 gttggctctg gtgcagggtc cgaggtattc gcaccagagc caacctcaac 50 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 6 cgcgctgagg tagtaggttg t 21

Claims (24)

1. 공극을 포함하는 다공성 구조체; 및
   상기 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 표적(target) RNA의 역전사(reverse transcription, RT) 프라이머로서 스템-루프 프라이머(stem-loop primer);를 포함하고,
   상기 스템-루프 프라이머는 루프(loop) 구조에 아크릴기(acryl group), 아민기(amine group), 카복실기(carboxyl group) 및 이중결합(double bond)로 이루어진 화학적 반응기 중 하나 이상을 포함하고,
   표적 RNA의 길이는 5 내지 60 머(mer)인, 표적 RNA 증폭 구조체.
2. 제1항에 있어서,
   상기 표적 RNA는 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)인, 표적 RNA 증폭 구조체.
3. 제1항에 있어서,
   상기 역전사 프라이머의 길이는 30 내지 100 머(mer)인, 표적 RNA 증폭 구조체.
4. 제1항에 있어서,
   상기 표적 RNA 증폭 구조체는 상기 다공성 구조체의 공극 내부에 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 프라이머로서 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 하나 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 것인, 표적 RNA 증폭 구조체.
5. 제4항에 있어서,
   상기 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 PCR 프라이머는 말단에 아크릴기(acryl group)를 포함하는 것인, 표적 RNA 증폭 구조체.
6. 제4항에 있어서,
   상기 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 PCR 프라이머 중 하나 이상은 다공성 구조체와 링커(linker)로 연결된, 표적 RNA 증폭 구조체.
7. 제6항에 있어서,
   상기 링커의 길이는 1 내지 100 nm인, 표적 RNA 증폭 구조체.
8. 제4항에 있어서,
   상기 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 PCR 프라이머는 PCR 과정 중 고정되었던 공극의 표면으로부터 분리되어 상기 다공성 구조체의 공극 내부로 유출되는, 표적 RNA 증폭 구조체.
9. 제8항에 있어서,
   상기 다공성 구조체의 공극 내부에 고정된 PCR 프라이머의 분리는 다공성 구조체에 연결된 링커의 열, 빛 또는 화학반응에 의한 분해에 따른 것인, 표적 RNA 증폭 구조체.
10. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 구조체의 공극률은 다공성 구조체의 총 부피에 대하여 10 내지 95 부피%인, 표적 RNA 증폭 구조체.
11. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 구조체의 입경은 5 μm 내지 2 mm인, 표적 RNA 증폭 구조체.
12. 제1항에 있어서,
    상기 표적 RNA 증폭 구조체는 프로브(probe)를 더 포함하는, 표적 RNA 증폭 구조체.
13. 제12항에 있어서,
    상기 프로브는 선택적 형광 프로브인, 표적 RNA 증폭 구조체.
14. 제1항에 있어서, 상기 표적 RNA 증폭 구조체는 물 또는 오일로 코팅된 것인, 표적 RNA 증폭 구조체.
15. 제1항에 있어서, 상기 표적 RNA 증폭 구조체는 고정된 역전사 프라이머 정보를 제공하는 인코더(encoder) 및 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 형광표식 중 하나 이상을 공극 내에 더 포함하는, 표적 RNA 증폭 구조체.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 표적 RNA 증폭 구조체의 제조방법으로,
    표적 RNA의 역전사 프라이머인 스템-루프 프라이머가 다공성 구조체의 공극 내부에 고정되도록 상기 역전사 프라이머에 링커(linker)를 합성하는 단계;
    프레폴리머(pre-polymer) 및 상기 링커가 합성된 역전사 프라이머를 포함하는 구조체 형성 용액을 제조하는 단계;
    상기 구조체 형성 용액을 3차원 구조체 형태로 토출하고, 이를 경화시켜 표적 RNA 증폭 구조체를 형성하는 단계를 포함하는, 표적 RNA 증폭 구조체 제조방법.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 표적 RNA 증폭 구조체; 및
    상기 표적 RNA 증폭 구조체가 배열된 반응 챔버(chamber);
    를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭장치.
18. 제17항에 있어서,
    상기 실시간 다중 핵산 증폭장치는 서로 다른 표적(target) RNA에 대한 역전사(reverse transcription, RT) 프라이머를 각각 포함하는 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체를 포함하는, 실시간 다중 핵산 증폭장치.
19. 제18항에 있어서,
    상기 복수 개의 표적 RNA 증폭 구조체는 서로 다른 표적(target) RNA에 대한 PCR 프라이머를 각각 포함하는, 실시간 다중 핵산 증폭장치.
20. 실시간 다중 핵산 증폭 방법으로서,
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 표적 RNA 증폭 구조체를 반응 챔버(chamber)에 주입하는 단계;
    하나 이상의 표적(target) RNA를 포함하는 용액을 상기 반응 챔버(chamber)에 주입하는 단계;
    상기 표적 RNA를 역전사(reverse transcription, RT)시켜 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성하는 단계; 및
    상기 cDNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 표적 RNA를 증폭시키는 단계;
    를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭 방법.
21. 제20항에 있어서,
    상기 하나 이상의 표적 RNA 증폭 구조체는 서로 다른 표적(target) RNA에 대한 역전사(reverse transcription, RT) 프라이머를 각각 포함하는, 실시간 다중 핵산 증폭 방법.
22. 제20항에 있어서,
    상기 하나 이상의 표적 RNA 증폭 구조체는 서로 다른 표적(target) RNA에 대한 PCR 프라이머를 각각 포함하는, 실시간 다중 핵산 증폭 방법.
23. 제20항에 있어서,
    상기 표적 RNA를 증폭시키는 단계는 상기 표적 RNA 증폭 구조체 각각을 물 또는 오일로 코팅하는 단계를 포함하는, 실시간 다중 핵산 증폭 방법.
24. 제20항에 있어서,
    상기 실시간 다중 핵산 증폭 방법은 상기 하나 이상의 각 표적 RNA 증폭 구조체 내에서 중합되는 핵산을 분석하는 단계를 더 포함하는, 실시간 다중 핵산 증폭 방법.

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