KR102003976B1 - CTG DNA를 붙인 금 나노입자와 환형 DNA에 기반한 miRNA 탐지 기술 - Google Patents

CTG DNA를 붙인 금 나노입자와 환형 DNA에 기반한 miRNA 탐지 기술 Download PDF

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Abstract

본 발명은 짧은 핵산 분자를 신속하고 정확하게 검출하기 위한 조성물 및 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 표적 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 환형 DNA 탬플릿 및 (b) 핵산물질, 형광물질 및 형광감쇄물질로 구성된 분자탐침을 포함하는 miRNA 검출용 조성물 및 이를 이용하여 표적 miRNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 짧은 miRNA의 단일염기다형성(SNP)이나 점 돌연변이 등 한 개의 염기서열의 변이까지도 구별해낼 수 있을 뿐 만 아니라, 체내에 극소량으로 존재하는 miRNA를 아토몰 수준까지 검출할 수 있는 시스템이다. 또한, 종래 방법보다 검출방법이 단순하고 짧은 시간에 높은 민감도 및 정확도를 가지고 표적 miRNA를 검출할 수 있다.

Description

CTG DNA를 붙인 금 나노입자와 환형 DNA에 기반한 miRNA 탐지 기술{Gold Nanoparticle-Based CTG Repeat Probing System with Rolling Circle Amplification for the Detection of miRNA}
본 발명은 짧은 핵산 분자를 신속하고 정확하게 탐지하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)는 단일 서열로 구성된 보통 21개에서 22개의 뉴클레오티드로 구성된 매우 작은 크기의 비암호화 RNA이며, mRNA의 번역을 방해하는 과정을 통해 다른 유전자들을 조절함으로써 세포 분화, 배아 발생, 대사 조절 및 암 발생과정을 제어한다. 대략 인간 유전체는 전체 유전자의 30% 가량을 miRNA에 의해 조절되는 것으로 추정된다.
많은 종류의 miRNA와 이에 조절되는 표적 유전자는 다양한 질환의 기작에 miRNA의 중요한 역할을 예측 할 수 있다. 따라서 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 따라 비정상적인 miRNA 발현의 증가 혹은 감소양상을 보임으로써 miRNA를 질환의 진단, 예측 및 예후에 이용될 수 있는 바이오마커로써 인식되고 있다. 특히, miRNA는 세포 뿐 아니라 혈청, 혈장 혹은 타액, 눈물 그리고 뇨 등과 같이 다양한 생체 물질에서 발견되고 특정 miRNA의 농도가 질환에 따라 정상인에 비해 차이를 보임으로써 다양한 질환 관련 바이오마커로써의 가능성 연구 및 질환의 진단에 적용할 수 있다.
현재 miRNA의 발현 분석을 위해 많은 실험 기법들이 개발되고 있다. 주로 노던 블랏(Northern blot), 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction) 등을 이용하여 발현양상을 조사하였다. 그러나 이 방법은 유전자의 증폭을 위해 극소량의miRNA를 연장하는 단계와 다시 유전자 증폭을 위한 DNA로 전환하는 단계 및 전환된 DNA를 증폭하는 단계 등 여러 단계의 복잡한 과정을 거치다 보니 조기 진단이 어렵고 현장에 직접 적용이 어려우며 경제적으로도 큰 비용이 지출되는 문제점을 안고 있다. 종래 방법의 한계를 극복하기 위해 miRNA를 역전사하거나 증폭하지 않고 RCA 시스템을 이용하는 intercalative dyes, 스템/루프 기반의 분자표지(stem/loop-based molecular beacons), 그라핀 산화물 기반 형광 탐침 시스템(grapheme oxide-based fluorescent probing systems) 및 G-quadruplex/ gold systems 등의 시도가 있으나(비특허문헌 001, 002, 003, 004), 검출 한계에서 낮은 감도 때문에 생체 내 미량으로 존재하는 miRNA 측정에 한계가 있고, 전기적 방법은 표적 물질을 검출하기 위한 복잡한 설정 과정이 필요하기 때문에 단순하고 고감도로 극소량의 miRNA를 탐지하는 시스템의 개발이 필요한 실정이다.
Cheng, Y.; Zhang, X.; Li, Z.; Jiao, X.; Wang, Y.; Zhang, Y. Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 3268. Mestdagh, P.; Feys, T.; Bernard, N.; Guenther, S.; Chen, C.; Speleman, F.; Vandesompele, J. Nucleic Acids Res., 2008, 143, 32. Wang, L.; Luo, Y. Z.; Zhang, L.; Jiao, X. M.; Wang, M. B.; Fan, Y. L. Nucleic Acids Res., 2008, 36, 149. Hong, C.; Baek, A.; Hah, S. S.; Jung, W.; Kim, D. E. Anal. Chem. 2016, 88, 2999.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 세포내에 극소량으로 존재하는 miRNA를 간편하게 높은 민감도로 검출할 수 있는 분석법을 확립하고자 노력한 결과, CNG 서열, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응 및 나노골드를 소광체로 포함하는 분자탐침을 이용하면 이들 miRNA에 상보적인 서열을 분자 탐침에 포함시키거나 별도의 링커 서열 없이도 표적 miRNA를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 세포내 극미량으로 존재하는 miRNA 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 miRNA를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 1 아토몰 이하의 극소량의 miRNA 검출용 조성물로서, (a) 상기 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 환형 DNA 탬플릿; 및 (b) 핵산물질, 형광물질 및 형광감쇄물질을 포함하되, 상기 형광물질은 상기 핵산물질의 일 말단에 결합되어 있고, 상기 형광감쇄물질은 상기 핵산물질의 다른 말단에 결합되어 있는 분자탐침을 포함하는 miRNA 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 표적 miRNA의 존재 하에 단일가닥 환형 DNA를 형성한 후 롤링 서클 증폭반응에 의해 CNG 반복서열을 포함하는 긴 단일가닥 DNA를 합성하는 단계; (b) CNG 서열이 반복되어 헤어핀 구조를 가지는 핵산물질, 형광물질 및 형광감쇄물질을 포함하는 분자 탐침을 상기 긴 연속 단일가닥 CNG DNA와 반응시켜 혼성화가 일어나도록 하는 단계; (c) 상기 단계(b)에서 수득된 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 측정한 형광강도로부터 표적 miRNA의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 시료 내 miRNA의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 miRNA 검출용 조성물에 의하면, 중요한 유전자 발현 조절에 관련된 miRNA의 발현 여부를 단시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 검출 및 분석할 수 있다.
본 발명의 miRNA 검출용 조성물에 의하면, 표적 miRNA의 단일염기다형성(SNP)이나 점 돌연변이 등 한 개의 염기서열의 변이까지도 구별해낼 수 있고 극소량으로 존재하는 miRNA를 아토몰 수준까지 검출해낼 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물에 의하면, 표적 염기서열 대신 CNG 반복 서열만으로 분자탐침을 구성하여 구조 안정화를 위한 추가적인 서열 조정이 요구되지 않고, 표적 핵산서열과 연결되는 링커 서열이 요구되지 않아 더욱 안정적인 스템-루프 구조를 형성할 수 있어 생체 내 환경에서의 낮은 민감도 등의 문제점을 해결할 수 있다.
더욱이 본 발명의 검출방법에 의하면, 짧은 miRNA를 길게 연장하거나 역전사 시킬 필요가 없으므로 진단 과정이 단순하고, 오염된 유전자 증폭에 의한 잘못된 신호의 검출문제로부터 자유롭기 때문에 정확하고 신속하게 타겟 miRNA를 검출해낼 수 있다.
또한, 본 발명의 검출방법에 의하면 유전자 증폭을 위해 온도를 큰 변이로 조절해야하는 복잡한 과정 및 PCR과 같은 고가의 장비가 필요 없고, 진단 키트와 단순한 형광 검출기만 있으면 이동성 검진이 용이함으로 실제 현장에 적용이 용이하여 유전성 질환 및 바이러스성 질환과 관련된 다양한 miRNA를 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 검출 시스템 및 miRNA 검출방법을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3a는 표적 miRNA인 miRNA 146a 특이적인 환형 DNA 생성을 확인하기 위하여 T4 리가아제를 첨가한 ODN RCT 용액에 miRNA의 종류를 달리하여 처리한 결과를 나타낸 것이다(레인 1 : 주형 ODN RCT, 레인 2 : miRNA 146a, 레인 3 : T4 리가아제로 라이게이션 된 miRNA 146a + ODN RCT, 레인 4 : miRNA 146a + ODN RCT의 원형 구조를 확인하기 위하여 exonuclease I을 처리한 것, 레인 5 : miRNA 21, 레인 6 : T4 리가아제와 라이게이션 된 miRNA 21 + ODN RCT, 레인 7 : miRNA 21 + ODN RCT의 원형 구조를 확인하기 위하여 exonuclease I을 처리한 것).
도 3b는 표적 miRNA 특이적인 RCA 증폭산물 생성을 전기영동을 통해 확인한 것이다(M : 마커 1 kb; 레인 1 : miRNA 146a + ODN RCT + T4 리가아제 및 RCA 반응; 레인 2 : miRNA 21 + ODN RCT + T4 리가아제 및 RCA 반응).
도 3c는 본 발명의 조성물이 표적 miRNA 존재 하에서만 형광신호를 방출하는지 확인하기 위하여 ODN H1-G를 RCA 시스템에 첨가한 후 형광 스펙트럼을 측정한 것이다(ODN H1-G 단독, miRNA21 및 표적 miRNA 146a의 존재 하에서 RCA 생성물 형성의 형광 스펙트럼; 모든 시료는 25℃, pH 7.2 에서 25 mM Trizma 완충액 (50 mM NaCl, 10 mM MgCl2)에 AuNP 기반 CNG 분자탐침 0.2 M 의 농도로 준비되었다. dTF 형광에 대한 여기 파장 : 485 nm).
도 4는 본 발명의 조성물의 miRNA 농도에 따른 민감도를 측정한 결과를 나타낸 것으로,
도 4a는 miRNA의 농도에 따른 RCA 증폭산물의 양을 전기영동으로 확인한 것이고(레인 1 : 10-1μM, 레인 2 : 10-3μM, 레인 3 : 10-6μM, 레인 4 : 10-9μM 및 레인 5 : 10 -12μM),
도 4b 및 4c는 miRNA의 농도( 10-1μM, 10-3μM, 10-6μM, 10-9μM 및 10 -12μM)에 따른 형광 스펙트럼을 측정한 결과를 나타낸 것이며 한계 민감도를 측정한 값이다(모든 샘플은 25℃, pH 7.2, 25mM Trizma 완충액(50 mM NaCl, 10 mM MgCl2) 조건에서 AuNP 기반 분자탐침 0.2μM 농도, dTF 형광에 대한 여기 파장은 485 nm).
도 5는 본 발명의 AuNP 분자탐침에 있어서, 나노골드의 입자크기에 따른 민감도를 측정한 결과를 나타낸 것으로, 나노골드의 입자직경이 5 nm인 경우와 20 nm인 경우의 형광세기 차이를 나타낸 도면이다.
도 6은 표적 miRNA의 1 또는 2 염기 미스 매치에 따른 검출 특이도를 측정한 결과를 나타낸 것으로,
도 6a는 표적 miRNA의 1 또는 2 염기가 미스 매치된 경우 환형 DNA가 생성되지 않는 것을 확인한 것이다(레인 1 : ODN RCT, 레인 2 : miRNA 146a, 레인 3 : miRNA 146a + ODN RCT + T4 리가아제, 레인 4 : miRNA 146a + ODN RCT + T4 리가아제에 exonuclease I을 처리하여 원형 DNA 구조를 확인한 겔 데이터, 레인 5 : miRNA 146a에서 1 염기만 변형시킨 ORN 1, 레인 6 : ORN 1 + ODN RCT + T4 리가아제, 레인 7 : ORN 1 + ODN RCT + T4 리가제 + Exo I, 레인 8 : miRNA 146a에서 2 염기만 변형시킨 ORN 2, 레인 9 : ORN 2 + ODN RCT + T4 리가아제, 레인 10: ORN 2 + ODN RCT + T4 리가제 + Exo I).
도 6b는 표적 miRNA의 1 또는 2 염기가 미스 매치된 경우 RCA 증폭산물이 생성되지 않는 것을 전기영동을 통해 확인한 것이다(M : 마커 1 kb, 레인 1 : miRNA 146a + ODN RCT + T4 리가아제 + Phi29 DNA 중합효소, 레인 2 : ORN 1 + ODN RCT + T4 리가아제 + phi29 DAN 중합효소, 레인 2 : ORN 2 + ODN RCT + T4 리가아제 + phi29 DAN 중합효소, ORN 1:ODN RCT와 ORN 2:ODN RCT는 miRNA 146a:ODN RCT와 동일한 방법으로 어닐링 되었다).
도 6c는 표적 miRNA의 1 또는 2 염기가 미스 매치된 경우 형광신호를 방출하지 않는 것을 확인하기 위하여 ODN H1-G를 RCA 시스템에 첨가한 후 형광 스펙트럼을 측정한 것이다(ODN H1-G 단독, 표적 miRNA 146a, ORN 1 및 ORN 2의 존재 하에서 RCA 생성물 형성의 형광 스펙트럼; 모든 시료는 25℃, pH 7.2 에서 25 mM Trizma 완충액 (50 mM NaCl, 10 mM MgCl2)에 AuNP 기반 CNG 분자탐침 0.2 M 의 농도로 준비되었다. dTF 형광에 대한 여기 파장 : 485 nm).
본 발명의 일 양태에 따르면 본 발명은 1 아토몰 이하의 극소량의 miRNA 검출용 조성물로서, (a) 상기 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 환형 DNA 탬플릿(ODN RCT) 및 (b) 핵산물질, 형광물질 및 형광감쇄물질을 포함하되, 상기 형광물질은 상기 핵산물질의 일 말단에 결합되어 있고, 상기 형광감쇄물질은 상기 핵산물질의 다른 말단에 결합되어 있는 분자탐침을 포함하는 miRNA 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 짧은 서열의 핵산을 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 방법에 대해 연구 노력한 결과, 표적 핵산서열에 상보적인 염기서열을 포함하지 않되, CNG 반복서열에 의한 헤어핀 구조로 구성된 분자 탐침(molecular beacon probe)을 합성하였으며, 표적 miRNA를 롤링 서클 증폭(RCA) 반응에 의해 반복 염기서열을 포함하는 CNG DNA를 증폭시켜 상기 CNG 반복서열로 구성된 분자탐침과 반응시켰을 때 CNG DNA 반복염기 서열 증폭만큼 CNG 서열 간에 혼성화가 이루어져 형광강도가 증가되는 것을 확인하였다.
본 발명의 '분자 탐침'은 (ⅰ) 핵산물질, (ⅱ) 상기 핵산물질의 일 말단에 결합되어 있는 형광물질, 및 (ⅲ) 상기 핵산물질의 다른 말단에 결합되어 있는 형광감쇄물질로 이루어져 있다.
본 발명의 '분자 탐침'은 일반적인 분자 탐침이 표적 DNA 또는 RNA의 염기서열과 상보적인 염기서열을 가지는 것과는 다르게 표적 염기서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
따라서 본 발명의 분자 탐침을 구성하는 상기 '핵산물질'은 본 발명에서 궁극적으로 검출하고자 하는 표적 miRNA 서열을 포함하지 않는 대신 CTG 서열 또는 CAG 서열이 10회 반복된 뉴클레오티드 30개(30 mer)로 구성된다.
본 발명의 분자 탐침의 다른 구성성분인 '형광감쇄물질'은 스템-루프 구조를 이루는 핵산물질의 일 말단에 결합되어 다른 말단에 결합되어 있는 형광물질을 소광시키는 소광체 역할을 하는 물질로 바람직하게는 '나노입자'를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 "나노입자"는 나노 단위의 직경을 가지는 입자를 의미한다. 상기 나노입자는 금속 나노입자인 것이 바람직하고, 금속 입자의 구체예로서는, Au, Ag, Pd, Pt, Cu, Ni, Co, Fe, Mn, Ru, Rh, Os, Ir 등을 들 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 다르면, 본 발명에서 이용되는 나노입자는 금 나노입자를 의미한다. 금 나노입자는 안정한 입자의 형태로 제조가 쉬우며, 망간, 알루미늄, 납, 수은, 코발트 등의 중금속과 달리 인체에 무해하여 높은 생체친화성을 가진다. 또한 금 나노입자는 특이적인 surface plasmon resonance 성질로 인하여 다른 금속 나노입자에 비하여 형광체와 만났을 때 높은 소광 현상을 보인다. 이러한 높은 소광 현상은 본 발명의 검출 대상인 미량의 miRNA를 만났을 때에도 상대적으로 높은 형광 차이를 나타냄으로 효율적인 탐지체가 될 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 금 나노입자는 바람직하게는 3~15 nm, 보다 바람직하게는 5~10 nm, 가장 바람직하게는 5 nm의 직경을 가지는 입자를 의미한다. 금 나노입자의 입자직경이 20 nm 를 초과하여 커질 경우 형광체의 소광 효율이 급격히 감소하기 때문에 바람직하지 않고, 3 nm 미만으로 작아지면 CNG DNA 탐지 물질을 금 나노입자에 충분하게 올리지 못함으로 인해 민감도에 있어서 문제가 된다.
본 발명의 분자 탐침의 다른 구성성분인 '형광물질'은 상기 금 나노입자에 의해 소광된 상태에 있다가 표적 서열이 존재하면 특이적인 혼성화에 의하여 분자 탐침의 구조가 변하여 형광을 발하게 된다. 따라서 사용 가능한 형광물질에 특별히 제한이 있는 것은 아니다. 예를 들면 바이오틴, 로다민, 사이아닌(Cyanine) 3, 사이아닌 5, 피렌(pyrene), 사이아닌 2, 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein), 칼세인(Calcein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알렉사(Alexa) 488, 6-카르 복시-플루오레세인(FAM), 2',4',5',7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디클로 로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(TET), 플루오레세인 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플루오레세인, 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(calcium Green), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE), 테트라메틸로다민 (Tetramethylrhodamine), 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 카르복시테트라메틸 로다민(TAMRA), 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX(X-rhodamine), 칼슘 크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red) 및 티아디카르보시아닌 (Thiadicarbocyanine)을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, '환형 DNA 탬플릿(ODN RCT)'은 CNG 서열을 포함하는 단일가닥의 올리고 뉴클레오티드로서 양 말단은 표적 miRNA에 상보적인 서열을 일부 포함한다. 따라서, 상기 'ODN RCT'는 표적 miRNA가 존재하게 되면 표적 miRNA와 혼성화하여 라이게이션되는 주형으로 작용하게 되고, 이를 통해 단일가닥의 환형 DNA를 생성하게 된다. 이렇게 생성된 단일가닥의 환형 DNA를 주형으로 하여 롤링 서클 증폭 반응이 개시되고 증폭된 CNG 반복 서열을 상기 분자 탐침의 CNG 반복 서열이 탐지하여 miRNA의 발현 여부를 알 수 있게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 환형 DNA 템플릿은 100~500 nM 함유하는 것이 바람직하고, 상기 AuNP 기반의 분자탐침은 200~1000 nM 함유하는 것이 바람직하며, 환형 DNA 템플릿과 분자탐침은 1:2의 비율로 함유하는 것이 바람직하다. DNA 환형 템플릿의 양이 지나치게 적은 경우 타겟 miRNA를 탐지하는 데 너무 오랜 시간이 걸리고 높은 민감도의 효과를 보기도 어려우며 분자탐침의 양이 지나치게 적은 경우는 실제 탐지 자체가 어렵거나 높은 민감도의 효과를 보기 어렵다. 또한, 분자탐침의 양을 많이 쓰는 경우 탐지효율에 비해 너무 높은 비용이 발생하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 miRNA 검출용 조성물은 하기 표 1에 나타낸 miRNA 146a를 인식하여 검출할 수 있다. miRNA 146a 는 갑상선 유두암, 소의 Staphaphylococcus aureus enterotoxin 등 다양한 포유류 질병에 관련된다. 그러나, 본 발명에서 사용한 miRNA는 암이나 중요 유전자 조절에 밀접하게 관련된 대표 miRNA를 모델로 한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들로 제한되는 것은 아니며, 다양한 miRNA를 표적으로 하여 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 miRNA 검출용 조성물이 검출할 수 있는 miRNA의 예를 들면, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, miR-1, miR-1b, miR-1d, miR-2, miR-7, miR-7b, miR-9, miR-10b, miR-12a, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-16-1, miR-17-5p, miR-17-92 클러스터, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20a, miR-21, miR-22, miR-23a, miR-23b, miR-24, miR-29, miR-29b, miR-29c, miR-31, miR-34, miR-34a, miR-102, miR-103, miR-107, miR-122, miR-124, miR-124b, miR-125a, miR-125b, miR-127, miR-128, miR-133b, miR-135b, miR-142-5p, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-151, miR-153, miR-155, miR-181, miR-181a, miR-181b, miR-181c, miR-182, miR-183, miR-184, miR-186, miR-189, miR-195, miR-196a, miR-196b, miR-199b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-206, miR-208, miR-211, miR-212, miR-213, miR-214, miR-215, miR-221, miR-222, miR-223, miR-224, miR-296, miR-301, miR-363, miR-372, miR-373, miR-376, miR-380 및 miR-430가 있으며, 이들 중 선택되는 어느 하나의 miRNA와 특이적으로 결합하여 CNG 서열을 증폭한 후 분자 탐침에 의해 상기 CNG 서열이 탐지되는 것으로부터 표적 miRNA를 검출할 수 있게 된다.
이름 염기서열 서열번호
ODN H1 5'-dTFCTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG-thiol 1
ODN H1-G 5'-dTFCTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG-thiol-Gold 1
miRNA 146a 5'-uga gaa cug aau ucc aug ggu u 2
ORN 1 5'-uga gaa cug aaa ucc aug ggu u 3
ORN 2 5'-uga gaa cug aaa gcc aug ggu u 4
miRNA 21 5'-uag cuu auc aga cug aug uug a 5
ODN RCT 5'-CPho-ATT CAG TTC A CTG CTG CTG CTG CT G CTG CTG CTG CTG CTG AA ACC CAT GGA 6
본 발명의 조성물은 다른 miRNA(예를 들면, 상기 표 1의 miRNA 21)와 구별하여 표적 miRNA(예를 들면, 표 1의 miRNA 146a)를 정확하게 검출할 수 있고, 염기 하나의 차이(표 1의 ORN 1, ORN 2)에도 miRNA 표적을 정확하게 분리하는 우수한 검출 특이성을 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 miRNA의 검출방법을 제공한다:
(a) 표적 miRNA의 존재 하에 단일가닥 환형 DNA를 형성한 후 롤링 서클 증폭반응에 의해 CNG 반복서열을 포함하는 단일가닥 DNA를 합성하는 단계;
(b) CNG 서열이 반복되는 핵산물질, 형광물질 및 형광감쇄물질을 포함하는 분자 비컨을 상기 단일가닥 DNA와 반응시켜 혼성화가 일어나도록 하는 단계;
(c) 상기 단계(b)에서 수득된 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (b)에서 측정한 형광강도로부터 표적 miRNA의 존재를 확인하는 단계.
본 발명에서, 용어 "극소량"은 시료 내 아토몰(atto mole, aM) 단위로 존재할 정도의 소량을 의미한다. 본 발명의 "극소량"은 바람직하게는 500 aM, 보다 바람직하게는 100 aM, 가장 바람직하게는 15 aM 이하의 양이다.
본 발명의 검출방법에 있어서 상기 "시료"는 혈액, 소변, 정액, 우유, 객담, 점액, 구강상피세포의 채취(buccal swab), 질액 채취(vaginal swab), 직장세포의 채취(rectal swab), 아스피레이트(aspirate), 경피경침생검(needle biopsy), 수술 또는 부검에 의해서 수득된 조직, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨생식관의 외부 분비물, 눈물, 타액, 종양, 기관, 시험관내(in vitro) 세포 배양 성분의 샘플, 및 폴리 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 라이브러리(recombinant library)일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험재료 및 실험방법
1. CNG 반복서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드의 합성(분자탐침 및 ODN RCT)
CTG 반복 서열을 포함하는 ODN RCT의 합성을 위하여, 포스포아미다이트법으로 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이 방법은 고체상 합성 방법을 이용하였다. 먼저 포스포아미다이트 시약을 5'- 말단 위치에 도입하여 조절된 - 공극 유리 (CPG) 고체 지지체 (1-O-dimethoxytrityl-propyl-disulfide,1'-succinyl-lcaa-CPG) 에 올리고 데옥시 뉴클레오티드(oligodeoxynucleotides, ODN) 자동 DNA 합성기 (MERMADE DNA-Synthesizer)를 이용하여 각 시퀀스에 해당하는 포스포아미다이트를 차례대로 도입하여 CTG 반복 서열을 포함하는 ODN RCT를 합성하였다. 합성된 ODN RCT는 30% 수성 NH4OH (1.0 mL)로 처리하여 55 ℃에서 10 시간 동안 고체 지지체로부터 절단되었다. 자동화 된 ODN 합성으로부터 얻어진 생성물을 동결 건조시키고 증류수 (1 mL)로 희석시켰다. ODN은 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC : Merck LichoCART C18 컬럼, 10 x 250 mm, 10 m, pore size : 100Å)를 통해 정제 하였다. HPLC 이동상은 [5 % MeCN / 0.1 M 트리 에틸 암모늄 아세테이트 (TEAA); pH 7.0] 2.5 mL/min의 조건을 10분 동안 유지한 후 점차적으로 5 %에서 50 % MeCN / 0.1 M TEAA 로 10분에 걸쳐 증가 시키며 분리를 진행하였다. 정제된 ODN을 함유하는 분획을 냉각시키고 동결 건조시켰다. 이어서, 80 % 수성 아세트산 (1 mL)을 ODN에 첨가 하였다. 상온에서 1 시간 후, 아세트산을 감압 하에 동결 건조시켰다. 잔류물을 물 (1 mL)로 추가로 희석한 다음, 상기 조건을 사용하여 HPLC를 통해 용액을 정제 하였다.
2. 분자 탐침(ODN H1-G)의 제조
CTG 반복서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 금 나노 입자에 부착하기 위해, DTT(dithiothreitol)를 첨가하여 고체상 합성법을 통해 합성된 3 '말단 디설파이드 올리고 뉴클레오티드를 절단하고, 생성된 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 배양하였다 (0.1M DTT, 0.18M 인산 완충액 (PB), pH 8.0). 절단된 올리고 뉴클레오티드를 HPLC를 사용하여 정제하고 0.01 % SDS(sodium dodecyl sulfate)를 함유하는 0.01M 인산 완충액 (PB)의 용액에서 1M 농도가 되도록 금 나노 입자 (10 OD / 1mL)에 첨가 하였다. 올리고 뉴클레오티드 / 금 나노 입자 용액을 실온에서 20 분 동안 인큐베이션 시키고, NaCl을 첨가하고 0.01 % SDS 농도를 유지하는 0.01M 인산 완충액 (PB) 용액에서 0.05M로 조정 하였다. 올리고 뉴클레오티드 / 금 나노 입자 용액을 10 초간 초음파 처리 한 후 실온에서 20 분간 배양 하였다. 0.1 M NaCl을 첨가하면서 1.0 M NaCl에 이를 때까지 이 과정을 반복했다. NaCl salt aging 공정 후에 실온에서 밤새 항온 배양 하였다. 과량의 올리고 뉴클레오티드를 제거하기 위해, 금 나노 입자를 포함한 용액을 13500 rpm에서 3 시간 동안 원심 분리하고 상등액을 제거하여 바닥에 금 나노 입자 펠릿을 남겼다. 이 침전물을 750 L의 물에 녹여 올리고 뉴클레오티드가 부착된 금 나노 입자의 분산액을 만들고 이 용액을 10 초 동안 초음파 처리한 다음 25 mM Trizma 완충액, 10 mM MgCl2 및 50 mM NaCl 용액 1 ml에 넣어 분자탐침으로 작동하기 위한 준비를 하였다.
3. ODN-RCT의 합성
miRNA 146a를 표적 miRNA로 선택하고 표적 miRNA에 대한 상보적인 서열과 CTG 반복 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 롤링 서클 템플릿(rolling circle template)인 ODN RCT를 디자인했다.
4. 형광 방출 스펙트럼 분석 조건
OAS의 형광 방출 스펙트럼은 JASCO FP-6500 Cary spectrofluorometer에서 quartz cuvette (경로 길이 : 1 cm)를 사용하여 25 ℃에서 실험에 따라 485 nm 여기 파장에서 기록되었다. UV-Vis 스펙트럼은 Cary 100 UV-Vis 분광 광도계 (Agilent Technologies) 및 석영 셀 (경로 길이 : 1cm)을 사용하여 기록했다.
5. 롤링 서클 증폭(RCA) 반응
miRNA 146a : ODN RCT는 95 ℃에서 가열 한 후 실온으로 서서히 냉각 시켜서 어닐링 시켰다. T4 리가아제 (2 U) 및 완충액을 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 후, Phi29 DNA 중합 효소 (1 U)를 포함하는 1xPhi29 완충액 [50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 10mM (NH4) 2SO4, 4mM DTT, pH 7.5] 20㎕ 용액과 1x BSA 완충용액을 이용하여, 37 ℃에서 3 시간 동안 RCA 증폭 반응을 수행하였다.
실시예 1. 타겟 miRNA 특이적인 환형 DNA 생성 확인(도 3a)
표적 miRNA 146a에 대한 상보적 서열로 환형 템플릿 ODN RCT를 디자인하는 한편, 실험 조건을 최적화하기 위해 음성 대조군에 대한 참조 시퀀스로 miRNA 21을 선택했다. miRNA 146a가 존재하면 ODN RCT는 miRNA 146a와 혼성화되어 라이게이션을 위한 주형으로 기능하고, ODN RCT 템플릿의 닉 위치는 환형 템플릿을 형성하기 위해 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결되게 된다. 그 후 환형 연결 ODN RCT와 miRNA 146a의 상보적인 상태에서, phi29 DNA 중합 효소를 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응이 개시되어 AuNP-기반 CTG 반복 분자탐침에 상보적인 수많은 10-CAG 반복 서열을 보유하는 긴 반복된 단일 가닥 DNA를 생성한다.
이에, 먼저 miRNA와 T4 리가아제를 넣은 ODN RCT 용액에 환형 DNA는 제거하지 않고 3'에서 5'말단으로 단일 가닥 DNA를 제거할 수 있는 exonuclease I을 처리하여 환형 DNA가 생성되는지 확인하고자 하였다. miRNA21을 넣은 ODN RCT 용액에서는 exonuclease I을 첨가하였을 때 환형 DNA가 확인되지 않고 단일 가닥 ODN RCT 밴드만 관찰되었다 (도 3a, 레인 6). 그러나 표적 물질인 miRNA 146a를 넣은 ODN RCT 용액에 exonuclease I을 처리했을 때, 단일 가닥 밴드는 사라졌으며 환형 DNA가 분해되지 않고 남은 것으로부터 환형 ODN RCT가 miRNA 146a (도 3a, 레인 3)의 존재 하에서 연결되어 환형 DNA를 형성했음을 확인하였다(도 3a, 레인 4). 이로부터 표적 miRNA가 존재할 때만 ODN RCT로부터 환형의 DNA가 생성됨을 명백히 확인할 수 있었다.
실시예 2. 타겟 miRNA 특이적인 RCA 증폭산물 확인(도 3b)
제작한 ODN RCT가 표적 miRNA가 존재하였을 때만 환형의 DNA를 생성함을 확인한 후 상기 환형 DNA를 주형으로 하여 CNG 반복 서열을 포함하는 증폭산물이 생성되는지 확인하고자 Phi중합효소를 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 실시해본 결과, CAG 반복 단일가닥의 반복 복제증폭에 의해 형성된 긴 단일 가닥 DNA (> 10 kb)를 확인할 수 있었다(도 3b의 레인 1). 반대로, miRNA21이 존재할 때 긴 단일 가닥의 반복 복제된 DNA는 관찰되지 않았다(도 3b의 레인 2). 이는 CAG 반복 단일가닥의 반복 복제증폭(RCA) 반응이 miRNA 146a가 있는 RCT DNA에서만 환형 DNA를 형성하여 작동하였다는 것을 의미한다.
실시예 3. 분자 탐침에 의한 표적 miRNA의 검출(도 3c)
AuNP 기반 CTG 반복 탐침 시스템(ODN H1-G)이 표적 miRNA 146a를 검출할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 제조한 ODN H1-G를 환형 DNA에 의한 CAG 시퀀스 반복 증폭(RCA) 시스템에 첨가 한 후 형광 스펙트럼을 측정 하였다.
그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이 표적 miRNA 146a가 존재할 때는 형광이 극적으로 증가하지만 miRNA 146a가 없을 때 또는 비표적물질인 miRNA21이 존재할 때 전혀 증가하지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 AuNP 기반 CTG 탐침 시스템이 스템/루프의 접힘 구조에서 소광 상태에 존재하지만 CAG 반복 순서를 특징으로 하는 RCA의 존재 하에서 다중 이중 DNA 구조로 변화하고 dTF 형광체의 본래 형광을 되찾음으로 형광 신호가 증가하기 때문이며, 이로부터 AuNP 기반 CTG 반복 탐지 시스템이 표적 miRNA의 검출을 위해 잘 기능함을 확인하였다.
실시예 4. 검출시스템의 민감도 확인(도 4의 a, b, c)
AuNP 기반 CTG 반복 탐침 시스템인 ODN H1-G의 민감도를 평가하기 위해 0에서 100 nM 범위의 표적 miRNA 146a 농도에서 형광 스펙트럼을 측정했다. 먼저, RCA 반응과 긴 단일 가닥 DNA 생성물이 miRNA 146a의 농도에 의존하는지 여부를 조사했다. 그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이 miRNA 146a의 함량 증가시 RCA 생성물이 증가함을 확인할 수 있었으며, 이는 miRNA 146a의 농도를 1 aM에서 100 nM까지 증가시킬 때 형광 신호가 점차적으로 증가하는 도 4b의 형광 스펙트럼과 관련이 있음을 알 수 있다. 따라서 형광 강도는 극소량 (13.7 aM 정도)으로 존재하는 경우에도 miRNA 146a를 검출 할 수 있을 정도로 충분히 민감하여 등온 증폭이 있는 AuNP 기반 CTG 반복 헤어핀 탐색 시스템의 검출 한계(도 4c)가 적어도 13.7 aM 이상임을 의미한다. 따라서, AuNP 기반 CTG 반복 탐침 시스템은 miRNA를 탐지하는데 있어 RCT DNA와 조합되어 13.7 aM의 극미량의 miRNA도 탐지가 가능한 높은 민감도를 보임을 확인하였다.
실시예 5. 나노골드의 입자크기에 따른 민감도 확인(도 5)
나노골드(AuNP) 기반 CTG 반복 헤어핀 탐색 시스템을 이용하여 최적의 소광 효율을 찾기 위해 나노골드의 사이즈를 변화시키는 실험을 진행하였다. 40nm이상의 경우 소광 효율이 현저히 떨어진다는 보고가 있고 3nm이하의 사이즈의 경우 CTG DNA를 많이 나노골드에 올릴 수가 없어서 이 사이즈에 대한 검토는 배제하고, 20nm와 5nm에 대한 실험을 진행하였다. 소광효율을 측정하기 위해 형광 분석 방법을 이용하였다. 먼저 나노골드(AuNP) 기반 CTG 반복 헤어핀 탐색 시스템의 형광을 측정한 후 여기에 타겟 CAG 반복서열을 도입하여 혼성화에 따른 형광의 소광 성질을 확인하였다. 그 결과 도 5에 나타난 바와 같이 20nm 사이즈의 나노골드(AuNP) 기반 CTG 반복 헤어핀 탐색 시스템에서는 5nm 사이즈의 나노골드(AuNP) 기반 CTG 반복 헤어핀 탐색 시스템에 비해 형광의 변화가 극히 적은 것을 확인할 수 있다.
실시예 6. 검출시스템의 검출 특이성 확인(도 6의 a, b, c)
검출 특이성을 평가하기 위해 하나(ORN 1) 및 2 개(ORN 2)의 염기가 miRNA 146a와 다른 RNA 서열을 합성했다.
먼저, 완벽하게 일치하는 표적 miRNA 146a와 1개 또는 2개의 염기가 일치하지 않는 서열 (각각 ORN 1과 ORN 2)을 사용하여 환형 DNA 형성여부를 확인했다. 도 6a는 표적 miRNA 146a (도 6a, 레인 3)의 존재 하에서 환형 DNA가 생성되지만, ORN 1 (도 3a, 레인 6) 또는 ORN 2 (도 3a, 레인 9 )의 경우 환형 DNA가 생성되지 않는 것을 확인하였다.
다음 단계로, 완벽한 표적 miRNA 146a를 사용한 경우 RCA 증폭산물이 생성되었지만 1 염기 또는 2 염기가 미스 매치된 ORN 1 또는 ORN 2 (도 6b의 레인 2, 3)를 사용할 때는 생성되지 않는 것을 확인했다. 도 6b는 표적 miRNA 146a가 있을 때만 긴 단일 가닥 DNA 산물(10kb 이상)이 생성되는 것을 보여준다(도 6b의 레인 1).
마지막으로, 완벽하게 일치하는 표적 miRNA 146a와 1 및 2 염기 미스 매치 된 miRNA 서열을 시각적으로 구별할 수 있는지 확인하기 위하여 형광 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과, 형광 스펙트럼은 miRNA의 종류에 따라 극적으로 다른 신호 강도를 나타내는 것을 확인하였다(도 6c). 즉, 강력한 형광은 표적 miRNA 146a의 존재 하에서만 나타났고 ORN 1 또는 ORN 2의 경우 시스템은 소광 상태를 유지했다. 이로부터 AuNP 기반 CTG 탐침 시스템은 표적 miRNA 146a와 1 또는 2 염기 미스 매치된 miRNA 서열까지도 선택적으로 구별할 수 있음을 확인할 수 있다.
따라서, 강한 소광 (quenching)성질의 구현을 위한 CTG 반복 서열을 가지는 견고한 폴딩 구조와 AuNP를 이용한 AuNP 기반 CTG 반복 시스템은 RCT DNA에 의한 환형 DNA와 조합되어 표적 miRNA의 검출에 있어 고감도 및 선택성을 가지는 탐지 시스템이 된다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Gold Nanoparticle-Based CTG Repeat Probing System with Rolling Circle Amplification for the Detection of miRNA <130> 17-10911 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN H1 DNA oligonucleotide <400> 1 tctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct g 31 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA 146a <400> 2 ugagaacuga auuccauggg uu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORN 1 RNA oligonucleotide <400> 3 ugagaacuga aauccauggg uu 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORN 2 RNA oligonucleotide <400> 4 ugagaacuga aagccauggg uu 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA 21 <400> 5 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN RCT DNA oligonucleotide <400> 6 chattcagtt cactgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgaaacccat gga 53

Claims (11)

  1. 적어도 13.7 아토몰 이상의 miRNA 검출용 조성물로서, (a) 상기 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 환형 DNA 탬플릿 및 (b) 핵산물질, 형광물질 및 형광감쇄물질을 포함하되, 상기 형광물질은 상기 핵산물질의 일 말단에 결합되어 있고, 상기 형광감쇄물질은 상기 핵산물질의 다른 말단에 결합되어 있는 분자탐침을 포함하는 miRNA 검출용 조성물로서,
    상기 핵산물질은 CNG 서열이 반복되는 것이고, 상기 형광물질은 상기 핵산물질의 5' 말단에 연결된 FAM으로 표지된 티민이며, 상기 형광감쇄물질은 thiol로 변형된 상기 핵산물질의 3' 말단에 연결된 나노골드이고,
    상기 나노골드의 입자크기는 5 내지 10 nm이며,
    상기 환형 DNA 탬플릿과 분자탐침은 100~500 nM : 200~ 1000 nM의 비율로 혼합되되, 상기 환형 DNA 탬플릿과 분자탐침이 1:2의 비율로 혼합되고,
    상기 miRNA는 miRNA 146a인, miRNA 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 환형 DNA 탬플릿은 CNG 반복서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 miRNA 검출용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (a) 표적 miRNA의 존재 하에 단일가닥 환형 DNA를 형성한 후 롤링 서클 증폭반응에 의해 CNG 반복서열을 포함하는 긴 단일가닥 DNA를 합성하는 단계;
    (b) CNG 서열이 반복되는 핵산물질, 형광물질 및 형광감쇄물질을 포함하는 분자 비컨을 상기 단일가닥 DNA와 반응시켜 혼성화가 일어나도록 하는 단계;
    (c) 상기 단계(b)에서 수득된 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (b)에서 측정한 형광강도로부터 표적 miRNA의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 시료 내 miRNA의 검출방법으로서,
    상기 형광물질은 상기 핵산물질의 5' 말단에 연결된 FAM으로 표지된 티민이며, 상기 형광감쇄물질은 thiol로 변형된 상기 핵산물질의 3' 말단에 연결된 나노골드이고,
    상기 나노골드의 입자크기는 5 내지 10 nm이며,
    상기 miRNA는 miRNA 146a인, 시료 내 miRNA의 검출방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서, 상기 시료는 세포, 혈청, 혈장, 타액, 눈물 또는 뇨인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  11. 삭제
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