KR20160105197A

KR20160105197A - 나노골드를 포함하는 cng dna 반복 염기서열 탐지용 분자탐침 및 이를 이용한 분석방법

Info

Publication number: KR20160105197A
Application number: KR1020150028555A
Authority: KR
Inventors: 서영준; 주한나
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2016-09-06

Abstract

본 발명은 분자탐침, 구체적으로, 나노골드를 소광체 즉, 형광 감쇄물질로 포함하고, CNG DNA 반복 염기서열을 탐지할 수 있는 하는 CNG DNA 반복 염기서열을 탐지할 수 있는 분자탐침 및 상기 분자탐침을 이용한 분석방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 핵산물질, 검출수단 및 형광감쇄물질을 포함하고, 상기 검출수단은 형광을 발광하는 염료이고, 상기 형광감쇄물질은 나노골드(nano-Gold)이며, 상기 핵산물질은 CNG 서열이 반복된 것인 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침, 더욱 구체적으로, 상기 핵산물질은 CTG 서열 또는 CAG 서열이 10회 반복된 뉴클레오타이드가 30개(30 mer)로 구성된 것이고, 상기 검출수단은 상기 핵산물질의 5' 말단에 연결된 5-카복시플루오레세인(FAM)으로 표지된 티민이며, 상기 형광감쇄물질은 thiol로 변형된(modified) 상기 핵산물질의 3' 말단에 연결된 나노골드(nano-Gold)인 것을 특징으로 하는 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침 및 이의 응용에 관한 것이다.

Description

나노골드를 포함하는 CNG DNA 반복 염기서열 탐지용 분자탐침 및 이를 이용한 분석방법{A MOLECULAR PROBE FOR PROBING CNG DNA REPEAT SEQUENCE COMPRISING NONO-GOLD AND A METHOD FOR ANALYSIS USING THE SAME}

본 발명은 CNG DNA 반복 염기서열을 탐지할 수 있는 분자탐침, 구체적으로, 나노골드를 소광체 즉, 형광 감쇄물질로 포함하는 CNG DNA 반복 염기서열을 탐지할 수 있는 분자탐침 및 상기 분자탐침을 이용한 분석방법에 관한 것이다.

3개의 DNA가 다수 반복되는 구조(DNA trinucleotide repeat expansions, TNR expansions, TNRs)는 인체의 게놈 내에 배치되어 있으며, 이 구조가 여러 질환의 발병과 관련된 것으로 알려지면서, 게놈 내 DNA 탐지의 주요 표적으로 강조되고 있다. 상기 TNRs는 복제 및 회복(replication and repair) 기간 동안 형성되는 DNA 구조(DNA structure) 내로 잠입하여, 그 구조를 교란시키거나, 유전서열에 문제를 일으키는 것으로 알려져 있다.

최근 연구 결과에 의하면, 특히, CNG 반복 서열(CNG repeat sequences)은 헌팅턴 병(Huntingtons disease)과 취약 X 증후근(fragile X syndrome)을 포함한 많은 뇌신경질환(neurological disorder) 및 퇴행성 질환의 원인이 되는 헤어핀 구조(hairpin structure)를 형성하는 것으로 알려져 있다. 상기 CNG 반복 서열은 CAG 반복 서열과 CTG 반복 서열로 구분된다. 이들은 암호화 영역(coding region), 비암호화 영역(noncoding region), 3' - 비해석부위(3' - untranslated region)를 포함한 게놈 전체 영역에 걸쳐서 넓게 분포되어 있는 것으로 보고되고 있다.

이와 관련하여, 최근에는 유전적 질환(genetic disorder)을 진단하기 위한 진단 방법(diagnostic tool), 일 예로, 써던 블롯팅(southern blotting), 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 전기적 센싱법(electric sensing method) 등이 활용되고 있다.

특히, CNG 반복 서열은 상기 질환 외에 소위 TRD(trinucleotide repeat disorders)라 불리우는 많은 뇌신경 질환의 원인과 관련진 것으로 연구되고 있으므로, 상기 CNG 반복 서열을 확인하기 위한 효과적이고 민감한 새로운 탐침 시스템에 대한 개발이 요구된다.

상기한 바와 같이, 현재까지 DNA 검출의 경우, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 유사한 표적-증폭 방법이 우수한 신뢰도 및 민감도로 인해 가장 광범위하게 사용되고 있으나, 최근에는 직접적인 검출 방법으로, 형광물질 등을 이용한 방법들이 제안되고 있다. 특히, 형광물질은 높은 민감도(sensitivity)와 해상도(resolution)로 인해 생체영상분석(Bioimaging analyzer)에서 가장 많이 사용되는 분자인식 수단에 해당한다. 이러한 형광물질을 이용한 다양한 탐지방법 및 탐지수단이 제시도어 있다.

이 중, 특정 핵산 표적 서열을 용이하게 탐지하기 위하여, 분자표지(molecular beacon)라고 불리는 새로운 그룹의 올리고뉴클레오티드 프로브가 개발되었으며, 현재 상기 분자표지는 RT-PCR(real time PCR), 시험관내 분석(in vitro diagnostics), 생체내 DNA 또는 RNA 영상화(in vivo DNA and RNA imaging) 등 다양한 방법으로 응용되고 있다.

상기 분자표지는 형광물질(fluorophore)과 형광감쇄물질(quencher)을 각각 5'과 3' 말단에 갖는 핵산 서열을 갖는 표지로, 상기 분자표지는 관심대상의 표적 DNA 또는 RNA의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖도록 설계된다. 상기분자 표지는 스템-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있고, 형광물질을 여기(excitation)시킬 수 있는 빛을 받을 때 형광물질로부터 발산된 형광이 형광감쇄물질에 의해 흡수되는 구조를 갖는다.

상기 분자표지를 이용한 표적 DNA 또는 RNA의 탐지는 상기 분자 표지가 갖는 서열과 상보적인 서열을 갖는 표적 서열을 만날 때, 서열들간의 혼성화가 일어나서 이중 나선을 형성하게 되고, 그 결과 생성된 비틀림 힘(torsional force)은 분자표지의 스템 영역이 풀리는 것을 유도하여, 결과적으로, 형광물질이 형광감쇄물질로부터 잡아당겨져서 떨어지게 됨으로써, 형광감쇄물질의 역할을 제어하여, 형광물질이 발산된 형광을 확인하는 방법으로 수행한다.

이러한 분자표지에서 형광을 제어하는 소광체로 주로 Dabcyl 또는 BHQ와 같은 유기 모이어티를 사용하고 있으나, 이 경우, 복잡하고 고가의 합성방법이 요구되며, 세포 내의 주입 효율이 낮고, 세포 내에서 뉴클리아제 효소 작용에 의한 낮은 안전성으로 인한 생체 내 환경(in vivo)에서의 낮은 민감도 등의 문제가 제기되고 있다. 또한, 기존 분자표지의 경우, 스템-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있도록 서열을 조정하는 것이 요구되고, 표적 DNA 또는 RNA의 탐지와 상보적 서열로 혼성화가 이루어지는 부분 외에, 형광물질 또는 소광체 즉, 형광감쇄물질과 표적 DNA 또는 RNA의 탐지와 상보적 서열을 갖는 핵산서열과 연결되는 연결부위(linker) 서열이 요구되는 등, 그 구조를 구성함에 있어 여러 제한이 있는 단점이 있다.

10-2011-0109759A 10-1449843B

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서 본 발명은 경제적이면서도 효과적인 형광감쇄물질인 나노골드를 이용한 CNG 반복서열을 탐지할 수 있는 분자탐침 및 및 이의 응용에 관한 내용을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CNG 반복서열을 효과적으로 탐지할 수 있고, 제작이 용이하며, 기존 소광체가 가지는 문제점 즉, 유기 모이어티가 가지는 문제점인 복잡하고 고가의 합성방법이 요구되며, 세포 내의 주입 효율이 낮고, 세포 내에서 뉴클리아제 효소 작용에 의한 낮은 안전성으로 인한 생체 내 환경(in vivo)에서의 낮은 민감도 등의 문제점을 해결한 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침 및 이의 응용에 관한 것으로, 구체적으로 핵산물질, 검출수단 및 형광감쇄물질을 포함하고, 상기 검출수단은 형광을 발광하는 염료이고, 상기 형광감쇄물질은 나노골드(nano-Gold)이며, 상기 핵산물질은 CNG 서열이 반복된 것인 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침 및 이의 응용에 관한 것일 수 있다. 상기 분자탐침의 응용은 상기 분자탐침을 이용한 바이오 물질의 모니터링 장치, 검색키트 또는 검색방법일 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 핵산물질, 검출수단 및 형광감쇄물질을 포함하고, 상기 검출수단은 형광을 발광하는 염료이고, 상기 형광감쇄물질은 나노골드(nano-Gold)이며, 상기 핵산물질은 CNG 서열이 반복된 것인 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침에 관한 것일 수 있다.

상기 형광을 발광하는 염료는 형광 물질이 표지된 뉴클레오타이드 또는 시아닌 염료인 것일 수 있다.

상기 핵산물질은 CNG 서열이 3회 내지 30회, 바람직하게는 CTG 서열 또는 CAG 서열이 5회 내지 15회 반복된 것일 수 있다.

상기 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침은 바람직하게는 상기 핵산물질은 CTG 서열 또는 CAG 서열이 10회 반복된 뉴클레오타이드가 30개(30 mer)로 구성된 것이고, 상기 검출수단은 상기 핵산물질의 5' 말단에 연결된 5-카복시플루오레세인(FAM)으로 표지된 티민이며, 상기 형광감쇄물질은 thiol로 변형된(modified) 상기 핵산물질의 3' 말단에 연결된 나노골드(nano-Gold)인 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 분자탐침을 포함하는 CNG 반복서열 탐지용 조성물에 관한 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 분자탐침 또는 상기 CNG 반복서열 탐지용 조성물을 포함하는 CNG 반복서열 탐지장치에 관한 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 분자탐침 또는 상기 CNG 반복서열 탐지용 조성물을 시료와 반응시켜 임의의 가능한 혼성화가 일어나도록 하는 혼성화 단계; 및 상기 혼성화 단계에 의해 수득된 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광의 강도 또는 변화를 측정하는 단계를 포함하는 CNG 반복서열 검색 방법에 관한 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 분자탐침 또는 상기 CNG 반복서열 탐지용 조성물을 포함하는 CNG 반복서열 탐지용 검색키트에 관한 것일 수 있다.

본 발명의 분자탐침은 기존 형광감쇄물질인 유기 모이어티가 가지는 문제점을 해결하기 위하여, 나노골드를 사용하고, 탐지의 표적 대상인 CNG 반복서열의 특징을 이용하여, 스템-루프(stem-loop) 구조를 갖거나, 검출수단 또는 형광감쇄물질가 연결을 위하여 별도의 서열구조를 설계(design)할 필요가 없으므로, 제조공정이 용이하고 비용이 저렴하며, 자체적으로 이중 구조(formation of duplex)를 형성하고, 이러한 이중 구조는 탐지 대상이 되는 CNG 반복서열이 있는 경우, 탐지 대상과 이중 구조를 형성하므로, 검출수단인 형광물질과 형광감쇄물질인 나노골드가 분리되어, 형광을 확인할 수 있게 되므로, 기존 CNG 반복서열을 탐지하는 수단을 효과적으로 대체할 수 있어, CNG 반복서열 탐지가 요구되는 다양한 산업분야 및 연구분야에 활용될 수 있을 것으로 판단되어, 그 효과가 매우 크다 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침이 표적 CNG 반복서열을 탐지하는 과정을 나타내는 개략도(Schematic diagram)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, CNG 반복서용 탐지용 분자탐침의 원평광2색성(CD)를 나타낸 그래프로, 도 2a는 CTG 반복서열로 검출수단인 형광물질은 연결되어 있으나, 형광감쇄물질인 나노골드가 연결되지 않은 탐지수단(ODN C1)과 이의 표적 서열인 CAG 반복서열(ODN C3)가 혼성된 경우의 결과를 나타낸 그래프이고, 도 2b는 CAG 반복서열로 검출수단인 형광물질은 연결되어 있으나, 형광감쇄물질인 나노골드가 연결되지 않은 탐지수단(ODN C2)과 이의 표적 서열인 CTG 반복서열(ODN C4)가 혼성된 경우의 결과를 나타낸 그래프이며, 도 2c는 CTG 반복서열로 검출수단인 형광물질과 형광감쇄물질인 나노골드가 연결된 탐지수단(ODN C1-G)과 이의 표적 서열인 CAG 반복서열(ODN C3)가 혼성된 경우의 결과를 나타낸 그래프이고, 도 2d는 CAG 반복서열로 검출수단인 형광물질과 형광감쇄물질인 나노골드가 연결된 탐지수단(ODN C2-G)과 이의 표적 서열인 CTG 반복서열(ODN C4)가 혼성된 경우의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, CNG 반복서용 탐지용 분자탐침의 발광 스펙트럼(Fluorescence spectra) 결과를 측정한 그래프로, 도 2a는 ODN C1과 ODN C3가 혼성된 경우의 결과를 나타낸 그래프이고, 도 2b는 ODN C2과 ODN C4가 혼성된 경우의 결과를 나타낸 그래프이며, 도 2c는 ODN C1-G와 ODN C3가 혼성된 경우의 결과를 나타낸 그래프이고, 도 2d는 ODN C2-G와 ODN C4가 혼성된 경우의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, ODN C1-G(좌측, L)과 ODN C1-와 ODN C3가 혼성된 경우(우측, R)의 결과를 촬영한 사진(Photoimaging)이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 또는 균등한 방법들 및 물질들은 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으며, 이러한 측면에서 본 명세서에서 언급된 모든 문헌들은 참고문헌이 인용되는 특정 물질들 및 방법들을 개시하고 설명하기 위한 목적으로 참고문헌에 포함될 수 있다.

본 발명은 CNG 반복서열을 효과적으로 탐지할 수 있고, 제작이 용이하며, 기존 소광체가 가지는 문제점 즉, 유기 모이어티가 가지는 문제점인 복잡하고 고가의 합성방법이 요구되며, 세포 내의 주입 효율이 낮고, 세포 내에서 뉴클리아제 효소 작용에 의한 낮은 안전성으로 인한 생체 내 환경(in vivo)에서의 낮은 민감도 등의 문제점을 해결한 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침 및 이의 응용에 관한 것으로, 구체적으로 핵산물질, 검출수단 및 형광감쇄물질을 포함하고, 상기 검출수단은 형광을 발광하는 염료이고, 상기 형광감쇄물질은 나노골드(nano-Gold)이며, 상기 핵산물질은 CNG 서열이 반복된 것인 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침 및 이의 응용에 관한 것일 수 있다. 상기 분자탐침의 응용은 상기 분자탐침을 이용한 바이오 물질의 모니터링 장치, 검색키트 또는 검색방법일 수 있다.

본 발명을 보다 상세히 설명하기 이전에, 본 발명의 방법, 장치, 용액, 기구 또는 키트는 본 발명의 특징, 일 예로 본 발명의 분자탐침을 사용한다는 것을 제외하고는 매우 다양하게 응용될 수 있으므로, 이러한 측면에서 본 발명은 본 발명의 특징에 해당하는 분자탐침을 사용한다는 점외에 특정 방법, 특정 장치, 특정 용액 특정 기구 또는 특정 키트 들에 한정되지 않음을 이해한다. 또한, 본 명세서에 사용된 전문용어는 특정 실시양태들만을 설명하기 위한 목적으로 사용되므로, 이러한 전문용어에 의하여 본 발명의 범주가 제한되지 않는 것으로 간주됨을 이해한다.

본 명세서에서 특별히 다르게 특정되거나 또는 문맥에 의해 명확하게 기술된 것으로 인정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서에 있어서, 단수 형태의 사용은 문맥에 의해 단수임이 명확하게 기술되지 않는 한 복수 형태를 포함할 수 있다. 따라서, 일 예로 시료에 포함되는 표적 폴리뉴클레오타이드는 복수개의 표적 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 개념으로 해석될 수 있다.

본 명세서에 있어서, 수치 또는 값의 범위가 인용되는 경우에, 각 개입되는 정수 값 및 범위의 상한 및 하한 사이에서 그의 각 구간은 상기 값들 사이의 각 서브범위에 따라 특정될 수 있다. 수치 또는 값의 범위의 상한 및 하한은 범위 내에 독립적으로 포함되거나 또는 배제될 수 있고, 둘 중 한 한계 값 또는 모든 한계 값이 포함되는 각 범위가 본 발명 내에 포함되는 것으로 해석된다. 또한, 값이 고유의 한계값을 가지는 경우에, 예를 들면 성분이 0 % 내지 100 %의 농도로 존재하는 경우 또는 수용액의 pH가 1 내지 14의 범위일 수 있는 경우에, 고유의 범위들로 특정될 수 있다. 또한, 값이 명시적으로 한정되는 경우에, 인용된 값과 동일한 정량 또는 양에 관한 값들이 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 해석되고, 이에 기초된 범위로 이해될 수 있다.

또한, 수치 또는 값이 2개, 3개 또는 2개 이상 등과 같은 특정 복수 형태를 사용하는 경우에, 해당 수치로 발명의 효과가 한정되는 것으로 문맥에 의해 명확하게 기술되지 않는 한, 다수의 동일한 대상으로 해석될 수 있다.

본 명세서에 있어서, 연결된, 부착된 또는 결합된 등의 용어들은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본 명세서에 있어서, 조합예가 기술되는 경우에, 상기 조합 요소의 서브조합은 본 발명의 범주 내에 해당되는 것으로 해석되고, 역으로, 다른 요소들 또는 요소 조합이 개시되는 경우에, 그의 조합예들도 또한 본 발명의 범주 내에 해당되는 것으로 해석된다.

본 명세서에 있어서, 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 핵산(nucleic acid) 및 핵산 분자(nucleic acid molecule)와 같은 용어들은 특정 길이의 뉴클레오티드의 중합 형태를 의미하는 것으로 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체들 또는 이들의 혼합물들을 포함할 수 있다.

또한, 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 핵산(nucleic acid) 및 핵산 분자(nucleic acid molecule)와 같은 용어는 2-데옥시-D-리보오스를 함유하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드, D-리보오스를 함유하는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 스플라이싱(splicing)되거나 또는 스플라이싱되지 않은 tRNA, rRNA, hRNA 및 mRNA, 및 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드 또는 C-글리코시드인 다른 종류의 폴리뉴클레오티드, 및 인산염 또는 다른 다중음이온 골격을 함유하는 다른 폴리머들, 및 다른 합성 서열-특이적 핵산 폴리머들을 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 핵산 분자와 같은 용어들은 길이에 있어서의 구별이 없으며, 상기 용어들은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 뉴클레오시드(nucleoside) 및 뉴클레오티드(nucleotide)와 같은 용어들은 공지된 퓨린 염기 및 피리미딘 염기들뿐만 아니라, 변형된 다른 헤테로환형(heterocyclic) 염기들도 포함한다. 상기 변형 염기들은 메틸화 퓨린 또는 피리미딘, 아크릴화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 헤테로환형물들을 포함한다. 상기 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드들은 또한 당(sugar) 성분에서의 변형을 포함하며, 여기서 1개 이상의 히드록실기가 할로겐, 지방족기로 치환되고, 에테르, 아민 등에 의해서 관능화된 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 우선적 결합(preferential binding) 또는 우선적 하이브리드화(preferential hybridization)는 시료 중의 비 상보적 폴리머와 비교하여 시료 중의 1개의 폴리뉴클레오티드 가 이의 상보물과 결합하려는 경향이 증가되는 것을 나타낸다.

본 명세서에 있어서, 멀티플렉싱(multiplexing)은 다수의 분석물을 동시에 분석할 수 있는 분석 방법을 나타낸다.

본 명세서에 있어서, 선택적(optional) 또는 선택적으로(optionally)라는 표현은 연이어 기술된 경우 또는 상황이 발생될 수도 있고 또는 발생되지 않을 수도 있는 것으로 이해되며, 명세서에서는 경우 또는 상황이 발생하는 예와 발생되지 않는 예를 포함한다.

본 명세서에 있어서, 시료(sample) 또는 샘플이란 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 포함하는 것으로 추측되는 시료의 일부를 의미하며, 상기 시료는 세포, 조직 또는 유액(fluid)을 포함한 생물체 상기 생물체에 의해 남겨진 퇴적물 일 예로, 바이러스, 마이코플라즈마 및 화석을 포함, 로부터 직접 또는 간접적으로 수득될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 물질이 공급원일 수 있다. 또한, 상기 시료는 합성 수단을 통해서 제조된 표적 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부를 포함하는 것일 수 있다.

전형적으로, 상기 시료는 주로 수성 배지의 형태로 또는 수성 배지 중에 분산된 형태로 수득될 수 있다. 상기 시료는 일 예로, 혈액, 소변, 정액, 우유, 객담, 점액, 구강상피세포의 채취(buccal swab), 질액 채취(vaginal swab), 직장세포의 채취(rectal swab), 아스피레이트(aspirate), 경피경침생검(needle biopsy), 수술 또는 부검에 의해서 수득된 조직, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨생식관의 외부 분비물, 눈물, 타액, 종양, 기관, 시험관내(in vitro) 세포 배양 성분의 샘플(세포 배양 배지, 추정의 바이러스 감염된 세포, 재조합 세포 및 세포 성분에서 세포의 성장으로부터 기인되는 조건화된 배지에 제한되지 않고 포함됨), 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 라이브러리(recombinant library)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 시료는 희석, 용해, 현탁, 추출될 수 있고, 또는 그 밖에 존재하는 표적 폴리뉴클레오타이드를 용해 및/또는 정제하기 위해서 처리하거나, 또는 증폭에 사용되는 시약 또는 검출 시약에 접근가능하도록 제조될 수 있다.

상기 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 그 이상의 가닥일 수 있으며, 직쇄형 또는 고리형일 수 있다. 일 예로, 상기 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드는 mRNA, rRNA, tRNA, hnRNA, ssRNA 또는 ssDNA 바이러스 게놈일 수 있으며, 이들 폴리뉴클레오타이드드는 내부에 상보 서열 및 중요한 2차 구조를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드는 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, dsRNA 또는 dsDNA 바이러스 게놈, 플라스미드, 파아지 및 비로이드(viroid)일 수 있다.

상기 표적 폴리뉴클레오타이드는 합성으로 제조될 수 있거나 또는 생물학적 공급원으로부터 정제된 것일 수 있다. 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 정제되어 샘플 중의 1개 이상의 목적하지 않는 성분들을 감소 또는 제거시키거나 또는 표적 폴리뉴클레오타이드를 농축시킬 수 있으며, 반대로 표적 폴리뉴클레오타이드가 특정의 분석을 위해서 너무 농축되면, 표적 폴리뉴클레오타이드를 희석시킨 것일 수 있다.

본 발명의 발명자들은 다양한 신경질환, 뇌질환 및 퇴행성 질환의 원인과 밀접하게 관련이 있는 유전자인 CNG 반복 서열(CNG repeat sequences)을 효과적으로 탐지할 수 있는 수단에 대해 연구를 수행하던 중, 기존에 주로 사용되던 소광제, 주로 Dabcyl 또는 BHQ와 같은 유기 모이어티를 사용하는 경우, 세포 내의 주입 효율이 낮고, 안정성이 낮으며, 세포 내 측정 또는 생체 내(in vivo) 측정에서 민감도 관련 문제점의 원인이 되는 점을 개선하며, 기존 분자비콘 등이 가지는 문제점, 구체적으로 스템-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있도록 서열을 조정하는 것이 요구되고, 표적 DNA 또는 RNA의 탐지와 상보적 서열로 혼성화가 이루어지는 부분 외에, 형광물질 또는 소광체 즉, 형광감쇄물질과 표적 DNA 또는 RNA의 탐지와 상보적 서열을 갖는 핵산서열과 연결되는 연결부위(linker) 서열이 요구되는 등, 그 구조를 구성함에 있어 여러 제한이 있는 단점을 해결하기 위하여 다양한 시도를 수행한 결과, 탐지의 표적 대상이 되는 CNG 반복 서열의 상보적인 서열만으로 구성된 핵산물질의 경우, 자체적으로 이중 구조를 만들 수 있어, 구조를 구성하기 위해 여러 서열의 조절이 요구되지 않으며, 나노골드를 형광감쇄물질로 사용하는 경우, 기존 유기 모이어티가 가지는 문제점을 효과적으로 해결할 수 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 핵산물질, 검출수단 및 형광감쇄물질을 포함하고, 상기 검출수단은 형광을 발광하는 염료이고, 상기 형광감쇄물질은 나노골드(nano-Gold)이며, 상기 핵산물질은 CNG 서열이 반복된 것인 CNG 반복서열 탐지용 분자탐침에 관한 것일 수 있다.

상기 검출수단 또는 상기 형광을 발광하는 염료는 형광물질이 표지된 뉴클레오타이드 및 시아닌 염료로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 형광물질은 로다만 및 그의 유도체, 플루오레신 및 그의 유도체, 쿠마린 및 그의 유도체, 아크리딘 및 그의 유도체, 파이렌 및 그의 유도체, 에리트로신 및 그의 유도체, 에오신 및 그의 유도체, 및 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 형광물질을 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다.

상기 로다민 및 그의 유도체는 일 예로, 6-카복시-X-로다민(ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(Texas Red, TR), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 터븀 킬레이트 유도체, Alexa 유도체, Alexa-350, Alexa-405(Alexa Fluor^®405), Alexa-488(Alexa Fluor^®488), Alexa-547 및 Alexa-647(Alexa Fluor^®647) 등일 수 있다.

상기 플루오레세인 및 그의 유도체로서 5-카복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2′7′-디메톡시-4′5′-디클로로-6-카복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC), QFITC(XRITC), 플루오레스카민(fluorescamine), IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레졸 프탈레인, 니트로티로신, 파라로자닐린, 페놀 레드, 피코에리트린(phycoerythrin, PE), PE-Cy5, PE-Cy7, B-피코에리트린 및 o-프탈디알데히드 등일 수 있다.

상기 쿠마린 및 그의 유도체로서 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린(쿠마린 151), 시아노신, 4′-6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5′,5″-디브로모피로갈롤-설폰프탈레인(Bromopyrogallol Red), 7-디에틸아미노-3-(4′-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4-(4′-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2′-디설폰산, 4,4′-디이소티오시아나토스틸벤-2,2′-디설폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드 (DNS, dansyl chloride), 4-(4′-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL) 및 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4′-이소티오시아네이트(DABITC) 등을 들 수 있다.

상기 아크리딘 및 그의 유도체로서 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2′-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5디설포네이트(LuciferYellow VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드 및 Brilliant Yellow 등을 들 수 있다.

상기 파이렌 및 그의 유도체로서 파이렌(pyrene), 파이렌 부티레이트, 숙신이미딜 1-파이렌 부티레이트, Reactive Red 4(Cibacron Brilliant Red 3B-A) 등을 들 수 있다.

상기 에리트로신 및 그의 유도체로서 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트 및 에티듐 등을 들 수 있다.

상기 에오신 및 그의 유도체로서 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트 등일 수 있다.

이러한 측면에서, 상기 검출수단은 로다만 및 그의 유도체, 플루오레신 및 그의 유도체, 쿠마린 및 그의 유도체, 아크리딘 및 그의 유도체, 파이렌 및 그의 유도체, 에리트로신 및 그의 유도체, 에오신 및 그의 유도체, 및 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 표지된 뉴클레오타이드 또는 시아닌 염료 2 내지 5개가 공유 결합으로 결합된 것일 수 있다.

상기 시아닌 염료는 Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, APC(allophycocyanin), APC-Cy7 등일 수 있다.

상기 뉴클레오타이드는 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 사이토신(C), 우라실(U)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.

이러한 측면에서, 상기 검출수단은 파이렌(pyrene, PY), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 5-카복시플루오레세인(FAM) 및 피코에리트린(phycoerythrin, PE)으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 표지된 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 사이토신(C), 우라실(U)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 또는 Cy3 시아닌 염료일 수 있으며, 일 예로, 5-카복시플루오레세인(FAM)로 표시된 티민일 수 있다.

상기 검출수단은 핵산물질의 5' 말단에 결합될 수 있다.

또한, 상기 형광감쇄물질은 형광제어물질이라고도 불리우며, 나노골드 또는 금 나노입자일 수 있다.

상기 형광감쇄물질은 핵산물질의 3' 말단에 결합될 수 있으며, 구체적으로 thiol로 변형된(modified) 상기 핵산물질의 3' 말단에 연결된 나노골드(nano-Gold)일 수 있다.

또한, 상기 핵산 물질은 DNA 또는 RNA인 것일 수 있으며, 자체적으로 이중 구조(duplex structure)를 갖는 것일 수 있다.

상기 핵산물질은 CNG 서열이 3회 내지 30회, 바람직하게는 CTG 서열 또는 CAG 서열이 5회 내지 15회 반복된 것일 수 있으며, 이러한 측면에서 상기 핵산물질은 9개(9 mer) 내지 90개(90 mer)의 뉴클레오타이드로 구성된 것일 수 있다.

상기 핵산물질은 바람직하게는 CTG 서열 또는 CAG 서열이 10회 반복된 뉴클레오타이드가 30개(30 mer)로 구성된 것일 수 있다.

상기 핵산 물질은 시료 내에 포함되어 있는 탐지, 분석 또는 모니터링 등의 대상이 되는 표적 분자, 구체적으로 표적 폴리뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있는 CTG 서열 또는 CAG 서열을 포함할 뿐만 아니라, 상기 반복되는 서열에 의하여 자체적으로 이중 구조(duplex structure)를 형성한다.

본 발명의 분자탐침으로 탐지할 수 있는 표적 분자는 CNG, 구체적으로 CTG 또는 CAG 서열이 반복된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 분자탐침을 포함하는 CNG 반복서열 탐지용 조성물에 관한 것일 수 있다.

상기 분자탐침은 생체 내(in vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 에서 세포 내 표적 분자를 탐지하고, 이를 이미징하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 바이오 물질 검색용 조성물은, 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클(vehicle)을 더욱 포함할 수 있다.

상기 담체 및 비히클은 일 예로, 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트 및 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물 등의 완충물질(buffer), 물, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염 등의 염 또는 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 바이오 물질 검색용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 바이오 물질 검색용 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 일 예로, 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액 등으로 제조될 수 있다.

상기 수용성 용액은 다양한 제형으로 제조될 수 있다.

일 예로, 상기 수용성 용액은 수용성 주입(injection) 현탁액일 수 있으며, 상기 수용성 주입 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 더욱 첨가할 수 있다.

또 다른 예로, 상기 바이오 물질 검색용 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(ex. 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 이 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 상기 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 1,3-부탄디올 용액과 같은 현탁액을 더욱 포함할 수 있다.

상기 바이오 물질 검색용 조성물에 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액, 멸균 비휘발성 오일 또는 등장성 염화나트륨 용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 분자탐침 또는 상기 CNG 반복서열 탐지용 조성물을 포함하는 CNG 반복서열 탐지장치에 관한 것일 수 있다.

상기 CNG 반복서열 탐지장치는 상기 분자탐침으로부터 발생하는 형광 및 형광 특성의 변화를 측정할 수 있는 장치를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 분자탐침 또는 상기 CNG 반복서열 탐지용 조성물을 시료와 반응시켜 임의의 가능한 혼성화가 일어나도록 하는 혼성화 단계; 및 상기 혼성화 단계에 의해 수득된 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광의 강도 또는 변화를 측정하는 단계를 포함하는 CNG 반복서열 검색 방법에 관한 것일 수 있다.

상기 혼성화 단계는 상기 시료에 포함된 상기 CNG 반복서열을 검출하기 위하여, 상기 분자탐침과 상기 시료 내 표적 폴리뉴클레오타이드인 CNG 반복서열이 혼성화가 일어날 수 있도록 접촉시키거나 반응시키는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 혼성화 단계에 의해 수득된 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광의 강도를 측정하는 단계는 상기 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광의 강도 또는 형광의 변화를 측정하는 방법으로 수행할 수 있으며, 추가로 상기 측정된 형광의 강도 또는 변화 정도를 바탕으로 시료 내에 상기 CNG 반복서열이 포함되어 있는지 여부를 결정하는 단계를 더욱 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 분자탐침 또는 상기 CNG 반복서열 탐지용 조성물을 포함하는 CNG 반복서열 검색키트에 관한 것일 수 있다.

상기 CNG 반복서열 검색키트는 상기 분자탐침으로부터 발생하는 형광 및 형광 특성의 변화를 측정할 수 있는 장치를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 분자탐침을 포함하는 형광 이미징 프로브에 관한 것일 수 있다.

상기 형광 이미징 프로브의 구체적인 형태는, 본 발명에 따른 분자탐침을 포함하여 구성되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 형광 이미징 프로브는, 예를 들면, 전술한 상기 분자탐침이 특정 담체에 결합된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 상기 담체는, 예를 들면 자성 실리카 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 형광 이미징 프로브에 다른 진단 프로브를 도입할 경우, 다중 진단 프로브로 사용될 수 있다. 일 예로, 본 발명에 따른 형광 이미징 프로브에 T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면, T1자기공명영상 또는 T2자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 형광물질 외에도 추가의 광학 진단 프로브를 결합시키면, 자기공명 영상과 형광물질에 의한 광학 이미징 이외에도 다른 방식의 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상, PET 및 SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.

따라서, 상기 형광 이미징 프로브는 T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

모든 실험결과는 최소한 3회 이상 반복하여 평균치로 표시하였고, 각 군과의 비교는 ANOVA test를 이용하여 각각 p<0.05인 경우를 유의성 있는 것으로 판정하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

핵산물질, 검출수단 및 형광감쇄물질을 포함하고, 상기 검출수단은 형광을 발광하는 염료이고, 상기 형광감쇄물질은 나노골드(nano-Gold)이며, 상기 핵산물질은 CNG 서열이 반복된 것인
CNG 반복서열 탐지용 분자탐침.
제1항에 있어서,
상기 형광을 발광하는 염료는 형광 물질이 표지된 뉴클레오타이드 또는 시아닌 염료인 것을 특징으로 하는
CNG 반복서열 탐지용 분자탐침.
제1항에 있어서,
상기 핵산물질은 CNG 서열이 3회 내지 30회 반복된 것을 특징으로 하는
CNG 반복서열 탐지용 분자탐침.
제1항에 있어서,
상기 핵산물질은 CNG 서열이 5회 내지 15회 반복된 것을 특징으로 하는
CNG 반복서열 탐지용 분자탐침.
제1항에 있어서,
상기 핵산물질은 CTG 서열 또는 CAG 서열이 5회 내지 15회 반복된 것을 특징으로 하는
CNG 반복서열 탐지용 분자탐침.
제1항에 있어서,
상기 핵산물질은 CTG 서열 또는 CAG 서열이 10회 반복된 뉴클레오타이드가 30개(30 mer)로 구성된 것이고, 상기 검출수단은 상기 핵산물질의 5' 말단에 연결된 5-카복시플루오레세인(FAM)으로 표지된 티민이며, 상기 형광감쇄물질은 thiol로 변형된(modified) 상기 핵산물질의 3' 말단에 연결된 나노골드(nano-Gold)인 것을 특징으로 하는
CNG 반복서열 탐지용 분자탐침.
제1항의 분자탐침을 포함하는 CNG 반복서열 탐지용 조성물.
제1항의 분자탐침 또는 제7항의 CNG 반복서열 탐지용 조성물을 포함하는 CNG 반복서열 탐지장치.
제1항의 분자탐침 또는 제7항의 CNG 반복서열 탐지용 조성물을 시료와 반응시켜 임의의 가능한 혼성화가 일어나도록 하는 혼성화 단계; 및
상기 혼성화 단계에 의해 수득된 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광의 강도 또는 변화를 측정하는 단계
를 포함하는 CNG 반복서열 검색 방법.