KR20110109759A - 세포 내 타겟 분자의 탐지를 위한 선형 분자 비콘 - Google Patents

세포 내 타겟 분자의 탐지를 위한 선형 분자 비콘 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포내 타겟 분자 이미징을 위해 사용할 수 있는 선형 분자 비콘, 형광 이미징 프로브, 선형 분자 비콘의 제조 방법, 선형 분자 비콘을 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물, 선형 분자 비콘을 이용한 생체 또는 시료의 영상 수득 방법 및 선형 분자 비콘을 포함하는 암세포 치료용 의약 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 선형 분자 비콘은 세포 내 타겟 분자의 존재에 따라 형광 신호의 온-오프가 조절되는 방식을 취하고 있어, 특이적인 타겟 바이오 마커의 동정 또는 세포 내 유전자의 평가, 세포발달 및 질환진단/치료평가를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 형광 이미징 프로브는 인 비트로 및 인 비보에서의 타겟 분자의 탐지에 따른 광학적 이미지 뿐만 아니라 자기공명영상을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 선형 분자 비콘 또는 형광 이미징 프로브를 이용하면, 살아있는 대상체에서의 비침범적이고 반복적인 분석이 가능해질 뿐만 아니라, 질환 유발에 관여하는 물질을 타겟 분자로 정하는 경우에는 선형 분자 비콘 또는 형광 이미징 프로브와 타겟 분자의 혼성화에 따라, 질환 유발을 억제할 수 있다.

Description

세포 내 타겟 분자의 탐지를 위한 선형 분자 비콘{Linear molecular beacon for detecting intracellular target molecules}
본 발명은 세포 내 타겟 분자의 이미징 및 질환 치료를 위해 사용할 수 있는 선형 분자 비콘 및 형광 이미징 프로브에 관한 것이다.
22 개의 뉴클레오티드로 구성된 비코딩 소 RNA 분자인 MicroRNAs (miRNAs, miRs)는 세포의 증식 및 분화를 포함한 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있다. 신경 발달과 관련된 다양한 miRNA가 마이크로어레이 및 노던 블롯 분석을 이용함으로써 동정된 바 있다[L. Smirnova, et al ., Eur . J. Neurosci. 2005, 21, 1469.; A. M. Krichevsky , et al ., Stem Cells 2006, 24, 85.]. 최근, 본 발명자들은 광학적 유전자 이미징 시스템을 이용하여 신경- 및 암-특이적 miRNA 생성(biogenesis)의 인 비보 이미징을 최초로 보고한 바 있다[H. J. Kim , et al ., J. Nucl. Med. 2008, 49, 1686.; H. J. Kim , et al ., Mol . Imaging Biol. 2008, 11, 71.; J. Y. Lee , et al ., J. Nucl. Med. 2008, 49, 285.; M. H. Ko , et al ., FEBS J. 2008, 275, 2605.]. 살아있는 세포 내에서 내재적인 miRNA 발현 패턴을 모니터링하기 위해, 생물발광 리포터 유전자의 30개의 UTR(untranslated region)에 위치한 성숙한 miRNA의 완전하게 상보적인 서열이, 개별적인 miRNA를 추적하여 성숙 miRNA의 발현 패턴을 조사하기 위해 널리 사용되어 왔다[H. J. Kim, et al ., J. Nucl . Med. 2008, 49, 1686.; X. Cao , et al ., Genes Dev. 2007, 21, 531.; A. J. Giraldez, et al ., Science 2005, 308, 833.]. 그러나, 그러한 리포터에 기반한 miRNA 탐지는 miRNA가 타겟 mRNA에 결합하고 불안정화시킬 때, 시그널-오프 시스템을 나타낸다. 이 경우, 관찰된 시그널-오프 데이터가 인 비보에서의 miRNA 발현 또는 세포 사멸을 의미하는 것인지 결정하기가 어렵다. 그러므로, miRNA와 같은 세포내 타겟 분자의 탐지를 위한 시그널-온 시스템을 개발할 필요가 있다. 세포막 단백질 또는 수용체를 타겟팅하는 형광 표지된 리간드의 이미징 시그널은 세포의 외부의 경계에서의 리간드와 그들의 타겟과의 결합 친화성에 오로지 의존적이다. 그러나, 세포내 타겟에 대해 사용되는 형광 프로브의 시그널은 그들의 타겟에 대한 상호작용이 있던 없던 간에 세포내의 프로브의 존재 때문에 매우 막연하다. 세포내 타겟을 이미징하는 이러한 문제점을 극복하기 위해, 무형광 염료인 블랙 홀-퀀칭(black hole-quenching (BHQ)) 분자 또는 4-(디메틸아미노아조)벤젠 -4-카복실산(DABCYL)을 포함하는 앱타머를 포함하여, 최근 개발된 이미징 프로브인 단일쇄 또는 이중쇄 DNA를 갖는 분자 비콘(molecular beacon)은 형광 나노입자 다음에 컨쥬게이트되도록 디자인되어 있다. 이는 타겟의 부재시 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 의해 형광물질의 형광을 소거하기 위해 사용되며, 서열-특이적 결합된 타겟의 존재시 퀀처로부터의 분리에 의해 형광신호가 회복된다 [Y. Li , et al., Biochem . Biophys . Res . Commun. 2008, 373, 457.; W. Tan , et al ., Curr . Opin . Chem . Biol. 2004, 8, 547.; X. Mao , et al ., Chem . Commun. 2009, 3065.]. 분자 비콘에 기초하여 개발된 퀀처-기반의 분자-타겟팅 시스템은 세포내 타겟 단백질의 탐지 및 살아 있는 세포 내 mRNA의 분포에 대한 향상된 이해를 위한 좋은 방법을 제공해 준다[N. Nitin , et al ., Nucleic Acids Res.2004, 32, e58.1.; M. M. Mhlanga , et al ., Nucleic Acids Res. 2005, 33, 1902.]. Peng 등은 mRNA 수준에서 다양한 암-연관 유전자를 타겟팅함에 의한 분자 비콘 프로브를 이용한 세포내 분자 이미징에 대해 보고하였다[X. H. Peng , et al ., Cancer Res. 2005, 65, 1909.].
나노기술에서의 최근 진보는 생물의약 및 나노이미징 분자에서의 치료 및 진단 과정 양자와 관련하여, 폭넓은 적용을 가능하도록 이끌어 주었다[Y. Liu , et al ., Int . J. Cancer 2007, 120, 2527.; S. P. Leary , C. Y. Liu , M. L. Yu , C. Apuzzo , Neurosurgery 2006, 58, 1009.; P. Sharma, et al ., Adv . Colloid Interface Sci. 2006, 16, 123.]. 광학 및 방사성핵종 프로브를 구비한 많은 멀티모달 분자 이미징 프로브(multimodal molecular imaging probes)가 살아있는 대상체에서의 비침범적인 바이오 이미징을 위한 강력한 도구로서 출현되고 있다[W. Cai , X. Chen, Small 2007, 3, 1840.]. 양자점 및 자성 나노입자와 같은 나노크기의 물질들은 암-특이적 펩타이드를 이용하여 인 비보에서 암의 확산 범위를 탐지하기 위한 유용한 이미징 정보를 제공한다[W. Cai , et al ., Nano Lett. 2006, 6, 669.; P. C. Wu , et al ., Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1972.]. 최근, 로다민-코팅된 코발트 페라이트 자성 형광(MF) 입자가 멀티모달 이미지 획득을 위해 사용된 바 있는데, 이 기술은 바이오 이미징 프로브로서 세포의 인 비트로 추적뿐만 아니라 인 비보 추적을 위해서도 매우 적합하다[T. J. Yoon , et al ., Small 2006, 2, 209.]. 이 듀얼 MF 이미징 프로브는 중심 코어 내의 코발트 페라이트와 실리카 쉘로 코팅된 형광 염료로 구성되어 있는데, 이는 케이징 효과(caging effect)에 의한 개선된 형광성, 광표백(photobleaching)에 대한 광안정성 및 낮은 독성에 기인한 개선된 생체적합성 특성들을 갖도록 한다[T. J. Yoon , et al ., Small 2006, 2, 209.; J. S. Kim , et al ., Toxicol . Sci. 2006, 89, 338.].
본 발명은 타겟 분자의 탐지를 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 질환 치료도 가능한 새로운 선형 분자 비콘 및 형광 이미징 프로브를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 일 말단에 검출 수단이 결합되어 있고, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브; 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 형광제어 물질(quencher)이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 선형 분자 비콘을 제공한다.
이하, 본 발명의 선형 분자 비콘을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브에 포함되어 있는 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 타겟 분자의 일부분과 상보적인 서열을 가져 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 예를 들어, 상기 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 타겟 분자의 일부분과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 만일 타겟 분자가 단백질인 경우, 상기 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 핵산 프로브로서 작용하는 앱타머에 있어서 타겟 분자인 단백질과 혼성화될 수 있는 영역을 의미한다. 상기 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 타겟 분자에 따라 적절히 그 길이를 조절할 수 있고, 특정 길이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 타겟 분자가 miRNA인 경우, 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 22개 내외의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으나, 타겟 분자가 mRNA나 단백질인 경우, 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 그보다 짧거나 더 길 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브의 일 말단에 결합되어 있는 검출 수단은 생체 이미징에 사용할 수 있는 검출 수단이면 제한없이 가능하다. 본 발명에서는 상기 검출 수단으로서, 형광 물질 또는 양자점을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 형광 물질의 구체적인 종류는 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 로다만과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 및 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 형광 물질을 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다:
로다민 및 그의 유도체로서6-카복시-X-로다민(ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(Texas Red), N,N,N′,N′-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 터븀 킬레이트 유도체, Alexa 유도체, Alexa-350, Alexa-488, Alexa-547 및 Alexa-647 등을 들 수 있고;
플루오레세인 및 그의 유도체로서 5-카복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2′7′-디메톡시-4′5′-디클로로-6-카복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, QFITC(XRITC), 플루오레스카민(fluorescamine), IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레졸 프탈레인, 니트로티로신, 파라로자닐린, 페놀 레드, B-피코에리트린 및 o-프탈디알데히드 등을 들 수 있으며;
쿠마린 및 그의 유도체로서 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린(쿠마린 151), 시아노신, 4′-6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5′,5″-디브로모피로갈롤-설폰프탈레인 (Bromopyrogallol Red), 7-디에틸아미노-3-(4′-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4-(4′-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2′-디설폰산, 4,4′-디이소티오시아나토스틸벤-2,2′-디설폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드 (DNS, dansyl chloride), 4-(4′-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL) 및 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4′-이소티오시아네이트(DABITC) 등을 들 수 있고;
아크리딘 및 그의 유도체로서 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2′-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5디설포네이트(LuciferYellow VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드 및 Brilliant Yellow 등을 들 수 있으며;
피렌 및 그의 유도체로서 피렌, 피렌 부티레이트, 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트, Reactive Red 4 (Cibacron® Brilliant Red 3B-A) 등을 들 수 있고;
에리트로신 및 그의 유도체로서 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트 및 에티듐 등을 들 수 있으며;
에오신 및 그의 유도체로서 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트 등을 들 수 있고;
4- 아세트아미도 -4′- 이소티오시아나토스틸벤 -2,2′ 디설폰산이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양자점은 중심체, 상기 중심체를 둘러써고 있는 셀부 및 상기 셀부를 코팅하고 있는 고분자 코팅층의 구조로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 상기 양자점의 구체적인 종류는 특별히 제한되는 것은 아니고, 생체 이미징에 사용 가능하도록 생체적합성을 가지고 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서는 상기 양자점의 입자 직경이 5.5 nm 미만인 것을 사용할 수 있다. 상기 양자점의 중심체를 구성하는 성분은 CdSe(카드뮴-세슘), CdTe(카드뮴-텔루라이드) 또는 CdS(황화 카드뮴) 등 주로 중금속이 사용되고 있으므로, 양자점의 사용이 인체에 유해할 수도 있다. 그러나, 본 발명에서는 양자점의 직경 크기를 5.5 nm 미만으로 제어함으로써, 양자점의 빠른 체외 배출을 통해 체내에서 머무르는 시간을 단축하여 독성을 상대적으로 낮출 수 있다(Natuer biotechnology 2007 25(10), 1165-1170).
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브는 상기 검출 수단 및 상기 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역 사이에 결합된 링커(linker) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 링커 영역은 핵산 프로브의 일 말단에 전술한 검출 수단을 도입하기 용이하도록 하기 위해 사용될 수 있고, 상기 링커 영역의 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 링커 영역은 4 내지 10개의 짧은 핵산 서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머는, 상기 형광제어 물질이 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역의 일 말단에 결합되어 있되, 상기 핵산 프로브에 결합되어 있는 검출 수단과 근접하게 위치할 수 있도록 디자인될 수 있다.
본 발명에 있어서, 전술한 바와 같이, 핵산 프로브가 링커 영역을 추가로 포함하는 경우, 상기 올리고머는 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역 이외에도 상기 핵산 프로브의 링커 영역과 혼성화될 수 있는 링커 영역을 추가로 포함하도록 변형될 수 있다.
한편, 본 발명의 선형 분자 비콘은 상기 핵산 프로브와 타겟 분자와의 혼성화가 상기 핵산 프로브와 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와의 혼성화에 비해 보다 잘 이루어지도록 설계할 수 있다. 핵산 프로브와 타겟 분자와의 혼성화가 잘 이루어져야만 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머가 떨어져 나가게 될 수 있기 때문이다.
이를 위해, 본 발명에서는, 타겟 분자가 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역이, 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역에 비해 크도록 설계하여, 타겟 분자의 존재시 핵산 프로브와 혼성화되어 있던 올리고머가 쉽게 떨어져 나갈 수 있도록 할 수 있다. 보다 구체적으로, 올리고머에 포함되어 있는, 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역의 핵산서열 길이는 핵산 프로브에 포함되어 있는, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역의 핵산서열 길이의 20% 내지 25%일 수 있다.
또한, 타겟 분자가 존재하지 않을 시, 핵산 프로브와 혼성화되어 있던 올리고머가 스스로 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해, 핵산 프로브와 올리고머 간의 혼성화는 적어도 40℃에서는 안정화되도록 설계할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머에 결합될 수 있는 형광제어 물질의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않으며, 이 분야에서 통상적으로 알려진 형광제어 물질이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 형광제어물질은, 구체적으로 예를 들면, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4-카복실산(DABCYL), 4-(디메틸아미노)아조벤젠 설폰산(DABSYL), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등의 BHQ(Biosearch Technologies, Inc(제)) 또는 Eclipse(Amersham Bioscience(제)) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 선형 분자 비콘으로 탐지할 수 있는 타겟 분자의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, microRNA, mRNA 또는 단백질일 수 있다. 후술할 본 발명의 하기 실시예에서는, 타겟 분자로서 microRNA를 대상으로 하고 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 타겟 분자가 단백질일 경우, 이를 탐지할 수 있는 핵산 프로브로서 적당한 앱타머를 합성하고 이를 선형 분자 비콘으로 도입함으로써, 특정 단백질을 탐지할 수도 있다.
첨부된 도 1 은, 검출 수단이 결합되어 있는 핵산 프로브 및 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 본 발명의 일 태양에 따른 선형 분자 비콘을 모식화한 도면이다. 첨부된 도 1 에 나타난 바와 같이, 선형 분자 비콘(10)은 링커 영역(11a), 상기 링커 영역(11a)에 결합되어 있는 검출 수단(11c) 및 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역(11b)을 포함하는 핵산 프로브(11); 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역(12b)을 포함하고, 형광제어 물질(12a)이 결합되어 있는 올리고머(12)를 포함할 수 있다. 첨부된 도 1 에 나타난 바와 같이, 형광제어 물질이 검출 수단과 근접한 위치에서 상기 올리고머에 결합되어 있으므로, 검출 수단은 퀀칭(Quenching)되게 된다.
즉, 형광제어 물질이 결합되어 올리고머가 타겟 분자의 부재시에는 핵산 프로브와 혼성화되어 있으므로 형광제어 물질에 의해 형광이 나타나지 않게 된다.
반면, 첨부된 도 2 는, 검출 수단이 결합되어 있는 핵산 프로브 및 타겟 분자가 혼성화되어 있는 상태(20)를 모식화한 도면이다. 첨부된 도 2에 나타난 바와 같이, 타겟 분자(21)가 존재할 경우, 상기 선형 분자 비콘(10)의 핵산 프로브(11)는, 형광제어 물질(12a)이 결합되어 있는 올리고머(12) 대신 타겟 분자(21)와 혼성화되므로 검출 수단을 퀀칭하던 형광제어 물질(12a)가 결합되어 있는 올리고머(12)가 떨어져 나가게 되어, 다시 형광을 발하게 될 수 있다.
요약하면, 첨부된 도 3 과 같다. 첨부된 도 3 은, 선형 분자 비콘의 핵산 프로브(10)가 타겟 분자(21)의 존재시 상기 형광제어 물질(12a)이 결합되어 있는 올리고머(12)와 분리되고, 타겟 분자와 혼성화되는 과정을 모식화한 도면으로서, 첨부된 도 3 에 나타난 바와 같이, 타겟 분자가 존재하지 않을 때에는 시그널-오프(signal-off) 되어 있다가, 타겟 분자가 본 발명에 따른 선형 분자 비콘과 결합하게 되면 시그널-온(signal-on) 되는 분자 탐지 시스템을 제공할 수 있다.
따라서, 상기와 같은 본 발명의 선형 분자 비콘을 이용하면, 탐지하고자 하는 타겟 분자의 존재 여부를 형광 신호의 온-오프(on-off)를 통해 확인할 수 있고, 이를 형광 이미지로 나타냄과 동시에 자기공명(MR) 이미지로 나타낼 수 있다.
또한, 첨부된 도 3에 나타난 바와 같이, 암 유발에 관여하는 타겟 분자(21)가 선형 분자 비콘(10)에 혼성화됨에 따라, 암 유발 과정(30)에 영향을 주어, 암 유발 세포(31a, 31b 및 31c)를 사멸시킬 수도 있다.
비록, 전술한 도 1 내지 도 3 에서는 핵산 프로브의 일 말단에 검출 수단(11c)을 용이하게 도입하기 위해 링커 영역(11a)을 이용하고 있지만, 본 발명에 따른 분자 비콘의 구성에 있어서, 상기 링커 영역이 반드시 필요한 것은 아니다. 상기 핵산 프로브의 링커 영역이 존재하지 않더라도 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역(11b)의 일 말단에 검출 수단을 갖도록 개질할 수 있다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 일 말단에 검출 수단이 결합되어 있고, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브; 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 선형 분자 비콘을 포함하는 형광 이미징 프로브를 제공한다.
이하, 본 발명의 형광 이미징 프로브를 구체적으로 설명한다.
본 발명의 형광 이미징 프로브의 구체적인 형태는, 본 발명에 따른 선형 분자 비콘을 포함하여 구성되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 형광 이미징 프로브는, 예를 들면, 전술한 선형 분자 비콘이 특정 담체에 결합된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 상기 담체는, 예를 들면 자성 실리카 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편 본 발명에 따른 형광 이미징 프로브에 다른 진단 프로브를 도입할 경우, 다중 진단 프로브로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 형광 이미징 프로브에 T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면, T1 자기공명영상 또는 T2자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 형광물질 외에도 추가의 광학 진단 프로브를 결합시키면, 자기공명 영상과 형광물질에 의한 광학 이미징 이외에도 다른 방식의 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상, PET 및 SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 형광 이미징 프로브를 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 프로브는 사용되는 프로브의 작용기나 소수성/친수성 특징에 따라 형광 이미징 프로브에 결합되어 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물 및 Mn화합물 등을 포함하고, 상기 T2 자기공명 영상 진단 프로브로는 Fe3O4 및 MnFe2O4 등을 포함하며, 상기 광학 진단 프로브로는 양자점을 포함하고, 상기 CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물 및 금 나노 입자 등을 포함하며, 상기 방사선 동위원소로는 In(인듐), Tc(테크네튬) 및 F(플루오르) 등을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 형광 이미징 프로브는 엔도사이토시스 또는 트랜스펙션에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광 이미징 프로브에는 추가로 세포 내 전달 리간드가 결합되어 있을 수 있다. 상기 「세포 내 전달 리간드」는 본 발명의 형광 이미징 프로브가 세포 막 또는 추가적인 세포 내 기관 막을 쉽게 통과할 수 있도록 도와주는 물질을 말한다. 예컨대, 상기 「세포 내 전달 리간드」의 구체적인 종류로는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain), 막투과 도메인(transmembrane domain), 세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide), 앱타머(aptamer), 양친매성 고분자(amphiphilic polymer) 및 생체적합성 공중합체(biocompatible copolymer)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 상기 세포 내 전달 리간드 및 이를 이미징 프로브에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 형광 이미징 프로브에는 추가로 세포 또는 조직 타겟팅 리간드가 결합되어 있을 수 있다. 「세포 또는 조직 타겟팅 리간드」는 본 발명의 형광 이미징 프로브가 원하는 표적 핵산 분자가 존재하는 조직 또는 세포 내로 도입될 수 있도록 유도해 주는 역할을 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 「세포 또는 조직 타겟팅 리간드」로는 항체, 앱타머 또는 펩타이드 등을 이용할 수 있고, 세포나 조직의 유형에 따른 특이적 마커, 이에 대해 결합할 수 있는 타겟팅 리간드 및 상기 타겟팅 리간드를 이미징 프로브에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브의 일 말단에 검출 수단을 결합시키는 단계; 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머를 상기 핵산 프로브와 혼성화하는 단계를 포함하는, 선형 분자 비콘의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 핵산 프로브의 일 말단에 검출 수단을 결합시키는 단계는, 핵산 프로브의 일 말단에 검출 수단의 도입을 용이하게 할 수 있는 링커 영역을 추가로 도입한 후, 링커 영역의 말단에 검출 수단을 도입하는 방법에 의하거나, 핵산 프로브의 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역의 일 말단에 검출 수단이 직접 도입될 수 있도록 개질할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브의 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역의 일 말단에 링커 영역을 추가하여 검출 수단을 도입하거나, 또는 링커 영역없이 검출 수단을 직접 도입하는 경우에는 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역의 일 말단 또는 링커 영역의 말단에 도입된 기능기와 검출 수단 상에 도입된 기능기 간의 공유결합을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 핵산 프로브의 일 말단 또는 링커 영역의 말단 및 검출 수단 상에는 상호 공유결합할 수 있는 기능기가 존재하며, 이는 적절한 개질을 통해 가능하다. 즉, 상기 핵산 프로브의 일 말단 또는 링커 영역의 말단 및 검출 수단 상에 도입된 기능기는 서로 결합을 형성할 수 있도록 공지의 기능기 결합예로부터 선택될 수 있다. 상기 공지의 기능기 결합예 중 대표적인 예를 하기 표 1에 나타내었다.
I　 II III
R-NH2　 R'-COOH R-NHCO-R'
R-SH　 R'-SH R-SS-R
R-OH　 R'-(에폭시기) R-OCH2C(OH)CH2-R'
RH-NH2　 R'-(에폭시기) R-NHCH2C(OH)CH2-R'
R-SH　 R'-(에폭시기) R-SCH2C(OH)CH2-R'
R-NH2　 R'-COH R-N=CH-R'
R-NH2　 R'-NCO R-NHCONH-R'
R-NH2　 R'-NCS R-NHCSNH-R'
R-SH　 R'-COCH2 R'-COCH2S-R
R-SH　 R'-O(C=O)X R-OCH2(C=O)O-R'
R-(아지리딘기)　 R'-SH R-CH2CH(NH2)CH2S-R'
R-CH=CH2　 R'-SH R-CH2CHS-R'
R-OH　 R'-NCO R'-NHCOO-R
R-SH　 R'-COCH2X R-SCH2CO-R'
R-NH2 R'-CON3 R-NHCO-R'
R-COOH　 R'-COOH R-(C=O)O(C=O)-R' + H2O
R-SH　 R'-X R-S-R'
R-NH2 R'CH2C(NH2 +)OCH3 R-NHC(NH2 +)CH2-R'
R-OP(O2 -)OH R'-NH2 R-OP(O2 -)-NH-R'
R-CONHNH2　 R'-COH R-CONHN=CH-R'
R-NH2　 R'-SH R-NHCO(CH2)2SS-R'
I 또는 II: 핵산 프로브의 일 말단, 링커 영역의 말단, 검출 수단 상에 도입된 기능기
III: I과 II의 반응에 따른 결합예
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브의 일 말단 또는 링커 영역의 말단에 도입된 기능기는 -COOH, -CHO, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기 및 -알킬기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 검출 수단 상에 도입된 기능기는 -NH2, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH2, -SH, -CON3 및 -CH2C(NH2 +)OCH3로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브의 일 말단 또는 링커 영역의 말단에 도입된 기능기는 -COOH이고, 상기 검출 수단 상에 도입된 기능기는 -NH2일 수 있다. 즉, 5’말단에 -COOH를 갖는 핵산 프로브에 -NH2를 갖는 검출 수단을 결합시킴으로써, 핵산 프로브의 일 말단에 검출 수단을 연결시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브의 일 말단 또는 링커 영역 말단에 도입된 기능기는 -NH2이고, 상기 검출 수단 상에 도입된 기능기는 -COOH일 수 있다. 즉, 5’말단에 - NH2를 갖는 핵산 프로브에 -COOH를 갖는 검출 수단을 결합시킴으로써, 핵산 프로브의 일 말단에 검출 수단을 연결시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브의 말단 또는 링커 영역의 말단에 도입된 기능기와 검출 수단 상에 도입된 기능기 간의 결합은 공지의 가교제를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 가교제의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, N-에틸-N’-디메틸아미노프로필 카보디이미드(N-ethyl-N’-dimethylaminopropyl carbodiimide), 1,4-디이소티오시아나토벤젠(1,4-Diisothiocyanatobenzene), 1,4-페닐린 디이소시아네이트(1,4-Phenylene diisocyanate), 1,6-디이소시아나토헥산(1,6-Diisocyanatohexane), 4-(4-말레이미도페닐)뷰트릭산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(4-(4-Maleimidophenyl)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester), 포스겐(Phosgene solution), 4-(말레이미도)페닐 이소시아네이트(4-(Maleinimido)phenyl isocyanate), 1,6-헥산디아민(1,6-Hexanediamine), 파라-니트로페닐클로로포르메이트(p-Nitrophenyl chloroformate), 노말-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide), 1,3-디사이클로헥실카르보이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide), 1,1′-카르보닐디이미다졸(1,1′-Carbonyldiimidazole), 3-말레이미도벤조익산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester), 에틸렌디아민(Ethylenediamine), 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(Bis(4-nitrophenyl) carbonate), 숙시닐 클로라이드(Succinyl chloride), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride), N,N′-디숙신이미딜 카르보네이트(N,N′-Disuccinimidyl carbonate), N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), 및 숙시닉 언하이드라이드(sucinic anhydride)로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기의 결합 반응은 당업계에 공지된 적절한 용매 중에서 수행될 수도 있다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명에 따른 선형 분자 비콘을 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 선형 분자 비콘은, 인 비보 또는 인 비트로에서 세포 내 타겟 분자를 탐지하고, 이를 이미징하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물은, 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함할 수 있다. 본 발명의 타겟 분자 탐지용 조성물은, 예를 들면, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(ex. 사람 혈청 알부민 등), 완충 물질(ex. 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트 및 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물 등), 물, 염 또는 전해질(ex. 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염 등), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물은, 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액 등을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 타겟 분자 탐지용 조성물의 다른 바람직한 양태는, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(ex. 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 이 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(ex. 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액 등이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것이라도 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 투여하는 단계; 및 상기 생체 또는 시료로부터 선형 분자 비콘에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 단계를 포함하는, 생체 또는 시료의 영상 수득 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 「시료」는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 본 발명의 상기 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 투여하는 단계는, 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으나, 비경구 투여가 바람직하며, 예를 들면, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다. 본 발명의 상기 영상을 수득하는 단계에 있어서는, 상기 형광 이미징 프로브에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서 자기공명영상 장치(MRI)와 광학 이미징을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 「자기공명영상 장치」는, 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고, 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 본 발명에 있어서, 상기 자기 공명 영상 장치의 종류는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, T2 스핀-스핀 이완 자기 공명영상 장치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 본 발명에 있어서, 상기 광학 이미징을 위해서는 공초점현미경, 형광현미경 또는 생체용광학장비 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명에 따른 선형 분자 비콘을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 선형 분자 비콘의 핵산 프로브를 질환 유발물질인 타겟 분자와 혼성화될 수 있도록 디자인함으로써, 본 발명의 상기 선형 분자 비콘은 타겟 분자의 탐지를 위해서 이용될 뿐만 아니라, 질환 유발물질인 타겟 분자의 활성을 억제함으로써, 해당 질환의 치료를 위해서 이용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 선형 분자 비콘을 이용하여 치료할 수 있는 질환의 종류는 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 선형 분자 비콘과 혼성화되는 타겟 분자가 관련하는 질환의 종류에 따라 적절히 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들면, 위암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 유방암 및 난소암 등의 각종 암 질환; 파킨슨병, 알츠하이머병 등의 신경 질환; 심혈관 질환; 및 당뇨병 등의 대사 질환 등에 관여하는 miRNA(REBECCA T. MARQUEZ and ANTON P. MCCAFFREY , “ Advances in MicroRNAs : Implications for Gene Therapists”, HUMAN GENE THERAPY , 19, 2008, p.27-37)와 혼성화될 수 있는 선형 분자 비콘을 디자인할 수 있다.
상기의 구체예로서, 본 발명에 따른 선형 분자 비콘과 혼성화하고자 하는 타겟 분자를 암 유발에 관여하는 물질로 선정하는 경우에는 타겟 분자의 탐지 뿐만 아니라, 치료를 동시에 달성할 수 있다. 이는, 상기 타겟 분자인 암 유발에 관여하는 물질 존재시 상기 선형 분자 비콘에 포함되어 있던 올리고머가 핵산 프로브로부터 분리되고, 상기 타겟 분자가 선형 분자 비콘의 핵산 프로브와 혼성화됨에 따라, 암 유발 세포가 점차 사멸될 수 있기 때문이다.
본 발명에 있어서, 상기 암 치료용 의약 조성물은, 전술한 타겟 분자 탐지용 조성물과 마찬가지로, 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 전술한 타겟 분자 탐지용 조성물과 동일할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암 치료용 의약 조성물의 사용 태양 또한, 전술한 타겟 분자 탐지용 조성물과 동일한 방식일 수 있다.
본 발명에 따른 선형 분자 비콘은 세포 내 타겟 분자의 존재에 따라 형광 신호의 온-오프가 조절되는 방식을 취하고 있어, 특이적인 타겟 바이오 마커의 동정, 세포 내 유전자의 평가, 세포발달 및 질환진단/치료평가를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 형광 이미징 프로브는 인 비트로 및 인 비보에서의 타겟 분자의 탐지에 따른 광학적 이미지 뿐만 아니라, 자기공명영상을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 선형 분자 비콘 또는 형광 이미징 프로브를 이용하면, 살아있는 대상체에서의 비침범적이고 반복적인 분석이 가능해질 뿐만 아니라, 질환 유발에 관여하는 물질을 타겟 분자로 하는 경우에는 선형 분자 비콘 또는 형광 이미징 프로브와 타겟 분자의 혼성화에 따라, 질환 유발을 억제할 수 있다.
도 1은 검출 수단이 결합되어 있는 핵산 프로브 및 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 본 발명의 일 태양에 따른 분자 비콘을 모식화한 도면이다.
도 2는 검출 수단이 결합되어 있는 핵산 프로브 및 타겟 분자가 혼성화되어 있는 상태를 모식화한 도면이다.
도 3은 분자 비콘의 핵산 프로브가 타겟 분자의 존재시 상기 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와 분리되고, 타겟 분자와 혼성화되는 과정을 모식화하고, 암 유발에 관여하는 타겟 분자가 분자 비콘에 혼성화됨에 따라, 암 유발 과정에 영향을 주어, 암 유발 세포를 사멸시키는 과정을 모식화한 도면이다.
도 4는 miR221의 Real-time PCR 결과로서, 성상세포(astrocyte)에서는 miR221이 거의 발현이 되지 않고, 갑상선암세포 (NPA, TPC)와 신경교종 (C6 glioma)세포에서 과발현 됨을 확인할 수 있는 그래프이다.
도 5는 miR221이 발현되지 않는 CHO세포에서 miR221 분자 비콘의 형광 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 6는 miR221 분자 비콘의 C6 세포로의 도입에 따른 내생적인 miR221 발현에 의한 miR221 분자 비콘의 형광 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 miR221 분자 비콘의 C6 세포로의 도입에 따른 내생적인 miR221 발현에 의한 형광 변화를 보여주는 공초점 레이져 스캐닝 현미경 관찰 사진이다.
도 8은 miR221 분자 비콘의 C6 세포로의 도입에 따른 C6 세포 사멸을 보여주는 그래프이다.
도 9는 분자 비콘의 핵산 프로브가 타겟 분자의 존재시 상기 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와 분리되고, 타겟 분자인 miR23a와 혼성화되는 과정을 모식화한 도면이다.
도 10은 분자 비콘의 핵산 프로브가 타겟 분자의 존재시 상기 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와 분리되고, 타겟 분자인 miR23a*과 혼성화되는 과정을 모식화한 도면이다.
도 11은 시험관 Tube에서 miR23a 분자 비콘과 miR23a* 분자 비콘의 형광 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 12는 miR23a가 발현되지 않는 CHO세포에서 miR23a 분자 비콘의 형광 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 13은 miR23a*가 발현되지 않는 CHO세포에서 miR23a* 분자 비콘의 형광 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 14는 miR23a 분자 비콘과 관련된 도 12의 결과를 보여주는 공초점 레이져 스캐닝 현미경 관찰 사진이다.
도 15는 miR23a* 분자 비콘과 관련된 도 13의 결과를 보여주는 공초점 레이져 스캐닝 현미경 관찰 사진이다.
도 16은 2%의 아가로즈 겔 위에 로딩된 공유결합되지 않은 단일의 양자점 및 miR124a 분자 비콘과 공유결합된 양자점의 전기영동 사진이다.
도 17은 miR124a 분자 비콘의 농도 증가에 따른 양자점의 형광 이미지를 보여주는 도면 및 그래프이다.
도 18은 타겟 분자인 성숙 miR124a의 존재시 miR124a 분자 비콘과 공유결합된 양자점의 형광 회복 효과를 보여주는 도면 및 그래프이다.
도 19는 양자점(QD)-miR124a 분자 비콘의 컨쥬게이트가 트랜스펙션된 C6 세포 내부에, 각각 성숙 miR124a 올리고뉴클레오티드 및 그 돌연변이 타입(miR124a*)을 이입시켰을 때, 양자점의 형광 강도를 나타내는 그래프이다.
도 20은 miR124a 분자 비콘과 관련된 도 19의 결과를 보여주는 공초점 레이져 스캐닝 현미경 관찰 사진이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 ]
하기 실시예를 통해 나타낸 모든 데이터는 평균±표준 오차로서 표현하였으며, Student’s t-test를 이용하여 계산하였다.
실시예 1: miR221 -반응성/ 치료성 분자 비콘의 제조
타겟 분자로서 신경교종 및 갑상선 암세포에서 특이적으로 발현되는 miR221를 탐지하여 동시에 암세포를 치료 할 수 있는 직선형 부분이중가닥 miR221 분자 비콘을 제작하였다.
먼저, miR221와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브를 제작하였다. 이를 위해, 성숙 miR221의 상보적인 뉴클레오티드의 5’ 말단에 수개의 랜덤 링커 시퀀스(TTC GCT GT)와 연결시키고, 다시 5’ 말단에 Cy3.0 형광프로브를 결합시켰다. 상기 핵산 프로브의 5’말단에 Cy3.0 형광프로브를 결합시키는 것은, 우선 5’말단에 (CH2O)6를 결합시키고, 상기 5’말단에 결합된 (CH2O)6의 반대 쪽에 형성된 -COOH와 형광 물질 상에 도입된 -NH2를 공유결합시키는 과정을 통해 이루어졌다.
상기 핵산 프로브와 혼성화되며, 형광제어물질로서 Black Hole Quencher 1(BHQ1; Bionics, Inc, Korea(제))이 결합되어 있는 올리고머를 제작하였다. 전체 miR221 분자 비콘은 다음과 같다.
5’-Cy3.0-TTC GCT GT tcg atg taa cag acg acc caa ag-3’
3’-BHQ1-G CGA CA agc ta-5’
형광제어물질을 포함하는 올리고머 500 pmol 과 Cy3.0을 포함하는 핵산 프로브 500 pmol 을 1ml의 annealing buffer(1 x TE buffer, 100 mM NaCl, pH 7.8)에 혼합해서 60℃의 온도에서 15분 동안 반응을 일으켜 분자 비콘을 합성하였다.
실시예 2: 신경교종 세포에서 miR221 발현에 따른 miR221 분자 비콘의 형광 활성 향상 확인 및 치료효과 향상 확인
(1) CHO 및 C6 세포의 배양
miR221 분자 비콘을 이용하여 암세포 특이적 miR221 발현에 의한 암세포 진단 및 치료를 관찰하기 위해, 대조군 세포로 CHO (chinese hamster ovary)세포와 실험군 세포로 마우스 C6(신경교종) 세포를 선택하였다. 실험에 사용된 C6 세포 및 CHO세포는 5% CO2-습윤 챔버 내의 10 % FBS (Cellgro, Herndon, VA, USA(제)), 페니실린(10 U/ml; Invitrogen, Grand Island, NY, USA(제)) 및 스트렙토마이신(10 mg/ml; Invitrogen)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified essential medium)(Gibco, Grand Island, NY, USA(제)) 중에서 키웠다.
(2) 성숙 miR221 를 탐지하기 위한 qRT - PCR 분석
정상세포와 암세포에서 miR221발현 패턴을 평가하기 위해 정상세포인 성상세포(astrocyte)와 갑상선암세포 (NPA, TPC) 및 신경교종 (C6 glioma)세포에 small RNA 추출물을 이용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 분석을 수행하였다.
먼저, 뉴클라아제가 없는 물로 추출한 전체 small RNA를 mirVana miRNA 분리 키트 (Ambion, Austin, TX, USA(제))를 이용하여 각각의 세포로부터 분리하였다. 암세포에서 miR221의 카피(copy)수를 조사하기 위해, mirVana qRT-PCR 프라이머 세트(Ambion)와 mirVana qRT-PCR miRNA 탐지 키트(Ambion)를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 성숙 miR221 수준은 SYBR Premix Ex Taq (2×) (Takara, Japan)으로 iCycer (Bio-Rad)를 이용하여 PCR 증폭에 의해 검증하였다(95℃에서 3분, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 40회의 증폭 사이클). U6 snRNA 프라이머 세트(Ambion, Austin, TX, USA)는 내재적 대조군으로서 사용되었다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 성상세포(astrocyte)에서는 miR221이 거의 발현이 되지 않고, 갑상선암세포 (NPA, TPC)와 신경교종 (C6 glioma)세포에서 과발현 됨을 확인 하였다.
(3) miR221 분자 비콘의 C6 세포로의 도입에 따른 내생적인 miR221 발현 변화 조사
miR221 분자 비콘을 정상세포인 CHO 세포와 종양세포인 C6 세포 내로 도입시켜, 암세포에서 내생적인 miR221 발현에 대해 조사하였다.
각각의 세포를 젤라틴이 선코팅되어 있는 6-웰 플레이트에 분주하고, 멸균 커버 슬립으로 덮었다. 세포를 인산-완충 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. miR221 분자 비콘을 CHO 세포와 C6 세포에 트랜스펙션시키고, 37.8℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인 비트로 형광 분석을 위해, miR221 분자 비콘으로 트랜스팩션된 세포를 PBS로 헹군 후 트립신 처리에 의해 수확하였다. 수집된 세포를 어두운 96-웰 마이크로플레이트로 옮긴 후, 그들의 형광 강도를 Varioskan Flash 마이크로플레이트 리더기(Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland(제))로 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, miR221이 발현되지 않는 CHO세포에서 Cy3.0-핵산 프로브만 있을 때 보다 분자 비콘에서 형광신호가 뚜렷하게 억제되고 외부에서 타겟 분자 miR221을 농도별로 miR221 분자 비콘에 혼성화 시켰을 때 농도에 비례하여 형광신호가 증가됨을 확인 하였다. 아울러 miR221의 상보적인 염기서열 oligo(antagomir) 와 타겟 분자 miR221을 동시에 혼성화 시켰을 때 miR221 antagomir 와 타겟 분자 miR221 상호간에 혼성화로 miR221 분자 비콘의 형광 활성도가 원래의 상태로 억제 (퀀칭)되고 있음을 확인하였다.
또한, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 내생적인 miR221이 발현하는 C6 세포에서 Cy3.0-핵산 프로브만 있을 때만큼 내생적인 miR221 발현에 의해 분자 비콘에서 형광신호가 뚜렷하게 증가됨을 확인 하였다. 아울러 miR221의 상보적인 염기서열 oligo(antagomir) 과 타겟 분자 miR221을 동시에 C6 세포내로 이입시켰을 때 miR221 antagomir 와 타겟 분자 miR221 상호간에 혼성화로 miR221 분자 비콘의 형광활성도가 원래의 상태로 억제 (퀀칭)되고 있음을 확인하였다.
(4) 내재화된 miR221 분자 비콘의 공초점 현미경 관찰
C6세포에서 miR221의 세포내 발현 인 비트로 형광 이미지를 얻기 위해, miR221 분자 비콘의 공초점 현미경 촬영을 C6 세포 배양 동안 수행하였다. 먼저, C6 세포를 3.7% 포름알데히드 용액(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 고정시킨 후, PBS로 10분 동안 3회 헹구었다. 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드 (DAPI) 용액을 함유하는 마운팅 배지(Vector Laboratories, Inc., CA, USA(제))를 가한 후 6-웰 플레이트로부터 커버 슬립을 글래스 슬라이드 위로 옮기고, 이를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 6에서 본 정량적인 형광 결과와 유사하게, 도 7에 나타낸 공초점 레이저 스캐닝 현미경 결과는 C6 세포에서 miR221의 과발현으로 miR221 분자 비콘의 놀라운 형광 변화를 보여주었다. C6 세포 자체에서 miR221이 과발현됨으로 miR221 분자 비콘을 세포내 이입시켰을 때 형광신호가 증가되고, 반면 miR221 antagomir을 추가로 세포내 이입시켰을 때 형광신호가 퀀칭되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 직선형 부분이중가닥 miR221 분자 비콘이 매우 높은 특이성으로 세포내 miRNA의 이미지를 성공적으로 제공해 줄 수 있음을 증명한다.
(5) miR221 분자 비콘의 의한 암 세포 치료 관찰
C6세포에서 miR221 분자 비콘으로 miR221 기능을 억제함으로 암 세포의 치료효과를 분석하기 위하여 miR221 분자 비콘에 의한 C6 세포 MTT분석을 수행하였다. miR221 분자 비콘을 C6세포에 이입 한 후, 3X 104/웰 개의 C6 세포를 24웰 플레이트에 분주한다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한다. 다음날 배지를 제거한 후에 MTT(2mg/ml) 시약을 250㎕씩 첨가한 후 호일을 이용하여 빛을 차단시킨 후 37℃ incubator에서 4시간 동안 배양한다. 상등액을 제거한 뒤 1mL DMSO를 처리한 후 37℃에서 15분 동안 방치한다. 200㎕를 96 웰에 옮겨서 ELISA spectrophotometer recorder를 이용하여 540nm에서 흡광도 측정한다.
그 결과, 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 5일 동안 MTT 분석을 통하여 대조군에 비해 miR221 분자 비콘을 처리한 실험군에서 시간에 따른 급격한 세포 사멸 결과를 보여준다.
실시예 3: miR23a 및 miR23a *-반응성 분자 비콘의 제조
타겟 분자로서 miR23a 및 miR23a*를 탐지 할 수 있는 직선형 부분이중가닥 miR23a 분자 비콘 및 miR23a* 분자 비콘을 제작하였다.
먼저, miR23a 및 miR23a*와 각각 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브를 제작하였다. 이를 위해, 성숙 miR23a 및 miR23a*의 상보적인 뉴클레오티드의 5’ 말단에 수개의 랜덤 링커 시퀀스(TTC GCT GT)와 연결시키고, 다시 5’ 말단에 Cy3.0 형광 프로브를 결합시켰다. 상기 핵산 프로브의 5’말단에 Cy3.0 형광프로브를 결합시키는 것은, 우선 5’말단에 (CH2O)6를 결합시키고, 상기 5’말단에 결합된 (CH2O)6의 반대 쪽에 형성된 -COOH와 형광 물질 상에 도입된 -NH2를 공유결합시키는 과정을 통해 이루어졌다.
상기 핵산 프로브와 혼성화되며, 형광제어물질로서 Dabcyl (Bionics, Inc, Korea)이 결합되어 있는 올리고머를 제작하였다.
전체 miR23a 분자 비콘 은 다음과 같다.
5’-Cy3.0-TTC GCT GT tag tgt aac ggt ccc taa agg-3’
3’-BHQ1- G CGA CA atc ac-5’
전체 miR23a* 분자 비콘 은 다음과 같다.
5’-Cy3.0-TTC GCT GT ccc caa gga ccc cta ccc taa a-3’
3’-BHQ1- G CGA CA ggg gt-5’
형광제어물질을 포함하는 올리고머 500 pmol 과 Cy3.0을 포함하는 핵산 프로브 500 pmol을 1 ml의 annealing buffer (1x TE buffer, 100 mM NaCl, pH7.8)에 혼합해서 60℃의 온도에서 15분 동안 반응을 일으켜, 분자 비콘을 합성하였다.
실시예 4: CHO 세포에서 miR23a 및 miR23a * 발현에 따른 miR23a 분자 비콘 및 miR23a * 분자 비콘 형광 활성 향상 확인
(1) CHO 세포의 배양
miR23a 분자 비콘 및 miR23a* 분자 비콘을 이용하여 miR23a 및 miR23a*을 영상화하기 위해, CHO (chinese hamster ovary) 세포를 선택하였다. 실험에 사용된 CHO세포는 5% CO2-습윤 챔버 내의 10 % FBS (Cellgro, Herndon, VA, USA(제)), 페니실린(10 U/ml; Invitrogen, Grand Island, NY, USA(제)) 및 스트렙토마이신(10 mg/ml; Invitrogen)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified essential medium)(Gibco, Grand Island, NY, USA(제)) 중에서 키웠다.
(2) miR23a 및 miR23a *-반응성 분자 비콘의 형광제어 효과 실험
PicTar 데이터베이스(http://pictar.bio.nyu.edu)로부터 정보를 얻은 21 및 22개의 뉴클레오타이드로 구성된 성숙 miR23a 및 miR23a*를 합성하여, miR23a 분자 비콘 및 miR23a 분자 비콘의 miR23a 및 miR23a* 결합 영역에 혼성화될 수 있는지 여부와 miR23a 분자 비콘 및 miR23a 분자 비콘에서의 형광 신호가 성숙 miR23a 및 miR23a*의 존재시 밝아질 수 있는지 여부를 시험하였다. 각기 다른 농도의 성숙 miR23a 및 miR23a* (0, 10, 20, 40, 100, 250 pmol)로 마이크로튜브 내의 miR23a 분자 비콘 및 miR23a 분자 비콘의 형광 강도를 시험한 결과, 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, miR23a 및 miR23a*의 농도에 의존적으로 형광 강도가 증가하였다. 이들 결과는 miR23a 및 miR23a*에 대한 miR23a 분자 비콘 및 miR23a 분자 비콘의 특이성을 제시해주었다.
(3) miR23a 분자 비콘 및 miR23a * 분자 비콘의 세포로의 도입에 따른 형광활성 평가
miR23a 분자 비콘 및 miR23a* 분자 비콘을 각각 CHO 세포 내로 도입시켜, miR23a 및 miR23a*의 농도에 따른 각각의 분자 비콘에 대한 형광 활성도를 측정하였다.
각각의 세포를 젤라틴이 선코팅되어 있는 6-웰 플레이트에 분주하고, 멸균 커버 슬립으로 덮었다. 세포를 인산-완충 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. miR23a 분자 비콘 및 miR23a 분자 비콘을 각각 CHO 세포에 트랜스펙션시키고, 37.8℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인 비트로 형광 분석을 위해, miR221 분자 비콘으로 트랜스팩션된 세포를 PBS로 헹군 후 트립신 처리에 의해 수확하였다. 수집된 세포를 어두운 96-웰 마이크로플레이트로 옮긴 후, 그들의 형광 강도를 Varioskan Flash 마이크로플레이트 리더기(Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland(제))로 측정하였다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, Cy3.0-핵산 프로브만 있을 때 보다 분자 비콘에서 형광신호가 뚜렷하게 억제되고 외부에서 타겟 분자 miR23a을 농도별로 miR23a 분자 비콘에 혼성화 시켰을 때 농도에 비례하여 형광신호가 증가됨을 확인 하였다. 아울러 miR23a의 상보적인 염기서열 oligo(antagomir) 과 타겟 분자 miR23a을 동시에 혼성화 시켰을 때 miR23a antagomir 와 타겟 분자 miR23a 상호간에 혼성화로 miR23a 분자 비콘의 형광 활성도가 원래의 상태로 억제 (퀀칭)되고 있음을 확인하였다.
또한, 도 13에서 보는 바와 같이, miR23a*는 세포내에서 짧은 시간내 사멸하는 특징이 있다. Cy3.0-핵산 프로브만 있을 때 형광신호가 높은 것을 확인하였다. miR23a*의 세포내 안정성 (stability) 특성 때문에 외부에서 타겟 분자 miR23a*을 농도별로 miR23a* 분자 비콘에 혼성화 시켰을 때 형광신호가 증가지 못하고 계속 억제 (퀀칭)되고 있음을 확인하였다. 이는 마이크로RNA 분자 비콘의 특이성을 보여주는 결과이다.
(4) 내재화된 miR23a 분자 비콘 및 miR23a * 분자 비콘의 공초점 현미경 관찰
CHO 세포에서 miR23a 및 miR23a*의 세포내 발현 인 비트로 형광 이미지를 얻기 위해, miR23a 분자 비콘 및 miR23a 분자 비콘의 공초점 현미경 촬영을 CHO 세포 배양 동안 수행하였다. 먼저, CHO 세포를 3.7% 포름알데히드 용액(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 고정시킨 후, PBS로 10분 동안 3회 헹구었다. 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드 (DAPI) 용액을 함유하는 마운팅 배지(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 가한 후 6-웰 플레이트로부터 커버 슬립을 글래스 슬라이드 위로 옮기고, 이를 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 12에서 본 정량적인 형광 결과와 유사하게, 도 14에 나타낸 공초점 레이저 스캐닝 현미경 결과는, CHO 세포에서 miR23a의 농도 비례하여 miR23a 분자 비콘의 놀라운 형광 변화를 보여주었다. CHO 세포 자체에서 miR23a를 발현시킴으로 miR23a 분자 비콘을 세포내 이입시켰을 때 형광신호가 증가되고, 반면 miR23a antagomir을 추가로 세포내 이입시켰을 때 형광신호가 퀀칭되는 것을 확인하였다. 아울러, 도 13에서 본 정량적인 형광 결과와 유사하게, 도 15에 나타낸 공초점 레이저 스캐닝 현미경 결과는 miR23a*는 세포내에서 짧은 시간내 사멸하는 불안정성 특징이 있었다. Cy3.0-핵산 프로브만 있을 때 형광신호가 높은 것을 확인하였다. miR23a*의 세포내 안정성 (stability) 특성 때문에 외부에서 타겟 분자 miR23a*을 농도별로 miR23a* 분자 비콘에 혼성화 시켰을 때 형광신호가 증가지 못하고 계속 억제 (퀀칭)되고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 직선형 부분이중가닥 miR23a* 분자 비콘이 매우 높은 특이성으로 세포내 miRNA의 이미지를 성공적으로 제공해 줄 수 있음을 증명한다.
실시예 5: miR124a 분자 비콘과 양자점(quantum dot)의 바이오컨쥬게이션
(1) miR124a 분자 비콘과 양자점(quantum dot)의 공유결합
먼저 miR124a와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 5’말단이 -NH2로 개질된 핵산 프로브; 및 상기 핵산 프로브와 혼성화되며, 형광제어 물질로서 Black Hole Quencher 1 (BHQ1; Bionics, Inc, Korea(제))이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화된 직선형 부분이중가닥 miR124a 분자 비콘의 제작을 바이오니어(bioneer, korea)사에 의뢰하였다. 상기 의뢰하여 제작된 miR124a 분자 비콘은 하기와 같다.
5’-NH2-TT CGC TGT TGG CAT TCA CCG CGT GCC T TAA-3’
3’-BHQ1 - GCG ACA ACC GT-5’
상기 miR124a 분자 비콘과 컨쥬케이션 될 양자점으로는, 말단에 -COOH를 갖는 QD 565 ITK Carboxyl Quantum Dots(Invitrogen(제))을 사용하였다.
그 후, 5’말단에 -NH2를 가지는 miR124a 분자 비콘 300 pmol 과 말단에 -COOH를 가지는 양자점(QD 565) 10 pmol 및 EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethyl-carbodiimide hydrochloride, Fluka(제)) 40 nmol을 Trs buffer(MgCl2가 첨가된 10mM Tris HCl, pH 7.4)에서 혼합하여, 24 ℃에서 1 시간 동안 반응을 일으켜 상기 miR124a 분자 비콘과 양자점을 공유결합 시켰다. 상기 miR124a 분자 비콘과 양자점 간의 공유결합은 아민-카복실 상호 작용을 통해 이루어졌다. 상기 컨쥬게이션 혼합물의 최종 부피는 40 ㎕가 되도록 조정하였다.
다만, 상기 EDC는 그 사용 전에 즉시 Tris buffer(pH 7.4)에 용해되어야 하며, 과다 사용시 양자점 상호간의 자가 접합을 일으킬 수 있으므로, 적절한 양을 사용해야 한다.
상기 양자점과 공유결합된 miR124a 분자 비콘의 세포 내 전달 효율을 향상시키기 위해서, 양자점과 miR124a 분자 비콘을 공유결합 시킬 때, 9-mer arginine 펩타이드 2 nmol 도 함께 혼합하여, 양자점에 결합시켰다.
(2) 양자점 - miR124a 분자 비콘 컨쥬케이트의 분리
양자점과 공유결합된 miR124a 분자 비콘을 비공유결합된 단독의 miR124a 분자 비콘으로부터 분리하기 위해서, 30 분 동안 고속(22250g의 속도) 원심분리(Refrigerated microcentrifuge, micro 17TR, Hanil(제))를 수행하였다. 상기 원심 분리액 중 상층액을 깨끗이 제거하고, 상층액이 제거된 상기 원심 분리액에 pH 7.4의 Tris buffer를 넣고, 22250g의 속도로 10분 동안 다시 원심 분리하였다. 그 후 1회의 세척을 실시하였다.
이 때, 연속적인 원심 분리는 컨쥬게이트 혼합물의 희석화를 초래할 수 있으므로, 상기 원심 분리는 3회 이상 수행해서는 안된다.
상기 원심 분리 단계를 수행한 후, 수득된 양자점과 공유결합된 miR124a 분자 비콘을 pH 7.4의 Tris buffer 존재하에서 분산시키기 위하여, 짧은 초음파 처리(Ultrasionic Processor, Sonics & Materials, INC(제))를 수행하였다. 상기 초음파 처리는 진동수 22kHz, 진폭 12 ㎛ 및 초음파 처리시간 120 초의 조건에서 수행하였다. 다만, 과도한 초음파 처리는 상기 양자점과 공유결합된 분자 비콘의 파열 또는 분쇄를 일으킬 수 있으므로, 주의 해야한다.
또한, 상기 컨쥬게이션 된 혼합물은 그 사용 전에 4℃에서 Tris buffer 용액에 보관될 수 있다.
실시예 6: 양자점과 miR124a 분자 비콘의 컨쥬게이션 여부를 확인하기 위한 아가로즈 겔 전기영동
표준 DNA 로딩 다이(dye)(x6)를 가지고, 양자점과 공유결합된 miR124a 분자 비콘 또는 비결합된 단독의 양자점을 혼합한 후, 컨쥬게이션 된 양자점과 컨쥬게이션 되지 않은 양자점을 2%의 아가로즈 겔 위에 일직선 상으로 올려 놓고, 1 x TAE buffer에서 100 V의 전압을 걸어, 15분 동안 상기 샘플을 전기영동(Gel electrophoresis equipment, Bio-Rad(제))하였다. 그 후, 표준 자외선 조사기(standard ultraviolet illumimator)를 사용하여 상기 겔을 관찰하였다.
그 결과, 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, lane 1에는 비결합된 단독의 양자점이 로딩되었고, lane 2에는 miR124a 분자 비콘과 공유결합된 양자점이 로딩되었으며, 양자 사이에 크기 구별이 관찰되었다. 이는 5’말단에 -NH2를 가지는 miR124a 분자 비콘과 말단에 -COOH를 가지는 양자점 간에 컨쥬게이션이 성공적으로 이루어졌음을 암시하는 결과이다.
실시예 7: miR124a 분자 비콘의 마이크로 튜브 내에서의 형광제어 효과 실험
형광제어 물질이 결합되어 있는 miR124a 분자 비콘이 양자점과 컨쥬게이션 됨에 따른 형광 억제효과를 알아보기 위한 시험을 실시하였다.
도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 마이크로 튜브 내에 존재하는 양자점의 농도를 10 pmol 로 고정시키고, miR124a 분자 비콘의 농도(0, 20, 50, 100, 150, 200, 300 pmol)를 변화시키면서 마이크로 튜브에 투입하여, 양자점과 miR124a 분자 비콘을 컨쥬게이션 시킨 결과, miR124a 분자 비콘의 농도가 증가함에 따라, 양자점의 형광 활성은 점차 감소하였다. 형광 이미지에 따른 ROI 분석 또한, 형광 신호가 miR124a 분자비콘의 농도에 의존적인 방식으로 감소되었다는 것을 나타내었다.
또한, PicTar 데이터베이스(http://pictar.bio.nyu.edu)로부터 정보를 얻은 성숙 miR124a 및 miR124a*(mutant type)를 합성하여, miR124a 분자 비콘의 miR124a 결합 영역에 혼성화될 수 있는지 여부와 양자점 - miR124a 분자 비콘 컨쥬게이트의 형광 신호가 성숙 miR124a 및 miR124a*의 존재시 회복될 수 있는지 여부를 시험하였다.
도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, 양자점과 miR124a 분자 비콘이 컨쥬게이션 되어 있는 상태에서는 양자점의 형광 강도가 58.4% 정도로 감소되어 있었다. 상기 양자점과 miR124a 분자 비콘이 켠쥬게이션 되어 있는 마이크로 튜브 내에 합성된 성숙 miR124a 올리고뉴클레오티드 300 pmol을 넣은 결과, 퀀칭되었던 양자점의 형광 강도가 다시 회복 된 반면, mi124a*(mutant type)을 300 pmol 넣었을 때에는, 퀀칭(억제)된 양자점의 형광 강도가 회복되지 않았다. 위의 사실로부터, miR142a와 혼성화될 수 있는 영역을 가지고 있는 miR124a 분자 비콘은 성숙 miR124a 존재시 상기 성숙 miR124a가 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머의 자리를 대체하면서, 퀀칭(억제)되었던 양자점의 형광 강도가 회복됨을 알 수 있었다.
실시예 8: C6 세포에서 miR124a 및 miR124a * 발현에 따른 양자점 ( QD )- miR124a 분자 비콘 컨쥬게이트의 형광 활성 향상 확인
(1) C6 세포의 배양
miR124a 분자 비콘을 이용하여 miR124a를 영상화하기 위해, C6 세포를 선택하였다. 실험에 사용된 C6 세포는 37℃의 온도, 5% CO2-습윤 챔버 내의 10 % FBS (Cellgro, Herndon, VA, USA(제)), 페니실린(10 U/ml; Invitrogen, Grand Island, NY, USA(제)) 및 스트렙토마이신(10 ug/ml; Invitrogen)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified essential medium)(Gibco, Grand Island, NY, USA(제)) 중에서 키웠다. 그 후, 1×105 개의 C6 세포가 24-웰 플레이트로 분주되었고, 18 시간 동안 5% CO2-습윤 챔버 내에서 유지되었다.
(2) 양자점 ( QD )- miR124a 분자 비콘 컨쥬게이트의 세포로의 도입에 따른 형광활성 평가
양자점과 컨쥬게이션된 miR124a 분자 비콘을 C6 세포 내로 도입시켜, miR124a 및 miR124a*(mutant type)의 존재시 분자 비콘에 대한 형광 활성도를 측정하였다.
24-웰 플레이트로 분주된 세포는 상기 세포의 대사활동을 줄이기 위해, 4℃에서 30분 동안 배양(pre-incubation)하였다. 상기 세포를 인산-완충 식염수(PBS)로 1회 세척하고, 상기 웰에 Tris buffer 200 ㎕를 첨가하였다. 9-mer arginine 펩타이드로 표지된 양자점-miR124a 분자 비콘 컨쥬게이트를 상기 4℃에서 배양된 C6 세포에 트랜스펙션(이입)시키고, 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 후, 합성된 성숙 miR124a 올리고뉴클레오티드 및 miR124a* 올리고뉴클레오티드를 각각 lipofectamine reagent와 혼합하였다. 양자점(QD)-miR124a 분자 비콘 컨쥬게이트가 트랜스펙션된 C6 세포 내로 상기 제조된 성숙 miR124a 용액과 miR124a* 용액을 각각 투입하고, 37℃에서 다시 3 시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 C6 세포를 PBS로 2번 헹군 후, 트립신 처리에 의해 수확하였다. 수집된 세포를 어두운 96-웰 마이크로플레이트로 옮긴 후, 그들의 형광 강도를 Varioskan Flash 마이크로플레이트 리더기(Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland(제))로 측정하였다.
그 결과, 도 19에서 볼 수 있는 바와 같이, 양자점(QD)-miR124a 분자 비콘 컨쥬게이트가 트랜스펙션된 C6 세포에 성숙 miR124a 올리고뉴클레오티드(300 pmol)를 이입한 경우, 그 이입한지 3 시간 후 양자점의 형광 강도가 증가한 반면, 상기 성숙 miR124a 올리고뉴클레오티드의 돌연변이 타입인 miR124a*을 이입한 경우, 퀀칭(억제)된 양자점의 형광 강도가 회복되지 않고, 원상태 그대로 유지됨을 확인할 수 있었다. 이는 마이크로 튜브 내에서 실시된 인 비트로 시험과 동일한 결과를 나타내었다.
(3) C6 세포 내의 양자점 ( QD )- miR124a 분자 비콘의 공초점 현미경 관찰
C6 세포에서 인 비트로 형광 이미지를 얻기 위해, miR124a 분자 비콘의 공초점 현미경 촬영을 C6 세포 배양 동안 수행하였다. 먼저, C6 세포를 3.7% 포름알데히드 용액(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 고정시킨 후, PBS로 10분 동안 3회 헹구었다. 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드 (DAPI) 용액을 함유하는 마운팅 배지(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 가한 후 6-웰 플레이트로부터 커버 슬립을 글래스 슬라이드 위로 옮기고, 이를 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 19에서 본 정량적인 형광 강도 결과와 유사하게, 도 20에 나타낸 공초점 레이저 스캐닝 현미경 결과는, C6 세포에서 miR124a의 농도에 비례하여 miR124a 분자 비콘과 컨쥬게이션 되어 있는 양자점의 놀라운 형광 변화를 보여주었다. C6 세포 내부로 합성된 성숙 miR124a를 이입시켰을 때, miR124a 분자 비콘과 컨쥬게이션 되어 있던 양자점의 형광신호가 증가되고, 반면 miR124a* 을 추가로 세포내 이입시켰을 때, 형광신호가 퀀칭(억제)되어 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 직선형 부분이중가닥 miR124a 분자 비콘이 매우 높은 특이성으로 세포내 miRNA의 이미지를 성공적으로 제공해 줄 수 있음을 증명한다.
10, 40, 60: 선형 분자 비콘 11: 핵산 프로브
11a: 링커 영역
11b: 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역
11c: 검출 수단 12: 올리고머
12a: 형광제어 물질
12b: 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역
20: 선형 분자 비콘의 핵산 프로브와 타겟 분자가 혼성화된 상태
21: 타겟 분자
30: 암 유발 과정(cancer pathway)
31a, 31b, 31c: 암 유발 세포
41, 61: 핵산 프로브 41a, 61a: 링커 영역
41b: miRNA 23a(타겟 분자)와 혼성화될 수 있는 영역
41c, 61c: 검출 수단 42, 62: 올리고머
42a, 62a: 형광제어 물질
42b, 62b: 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역
50: 선형 분자비콘의 핵산 프로브와 miRNA 23a(타겟 분자)가 혼성화된 상태
51: miRNA 23a(타겟 분자)
61b: miRNA 23a*(타겟 분자)와 혼성화될 수 있는 영역
70: 선형 분자비콘의 핵산 프로브와 miRNA 23a*(타겟 분자)가 혼성화된 상태
71: miRNA 23a*(타겟 분자)

Claims (25)

  1. 일 말단에 검출 수단이 결합되어 있고, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브; 및
    상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 형광제어 물질(quencher)이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 선형 분자 비콘.
  2. 제 1 항에 있어서,
    검출 수단은 형광 물질 또는 양자점(quantum dot)인 선형 분자 비콘.
  3. 제 2 항에 있어서,
    형광 물질은 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 및 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 선형 분자 비콘.
  4. 제 1 항에 있어서,
    핵산 프로브는 검출 수단; 상기 검출 수단에 결합되어 있는 링커 영역; 및 상기 링커 영역에 결합되어 있고, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 선형 분자 비콘.
  5. 제 4 항에 있어서,
    올리고머는 형광제어 물질; 상기 형광제어 물질과 결합되어 있고, 핵산 프로브의 링커 영역과 혼성화될 수 있는 링커 영역; 및 핵산 프로브의 혼성화 영역의 일부와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 선형 분자 비콘.
  6. 제 1 항에 있어서,
    타겟 분자가 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역이, 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역에 비해 큰 선형 분자 비콘.
  7. 제 6 항에 있어서,
    올리고머의 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역의 핵산서열 길이는 핵산 프로브의 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역의 핵산서열 길이의 20% 내지 25%인 선형 분자 비콘.
  8. 제 1 항에 있어서,
    형광제어물질은 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4-카복실산(DABCYL), 4-(디메틸아미노)아조벤젠 설폰산(DABSYL), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 및 ECLIPSE로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 선형 분자 비콘.
  9. 제 1 항에 있어서,
    타겟 분자가 microRNA, mRNA 또는 단백질인 선형 분자 비콘.
  10. 일 말단에 검출 수단이 결합되어 있고, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브; 및
    상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 선형 분자 비콘을 포함하는 형광 이미징 프로브.
  11. 제 10 항에 있어서,
    형광 이미징 프로브에 T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브가 추가로 도입되어 있는 형광 이미징 프로브.
  12. 제 10 항에 있어서,
    형광 이미징 프로브에 추가로 세포내 전달 리간드가 결합되어 있는 것인 형광 이미징 프로브.
  13. 제 12 항에 있어서,
    세포내 전달 리간드는 단백질 전달 도메인, 막투과 도메인, 세포 침투 펩타이드, 앱타머, 양친매성 고분자 및 생체적합성 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 형광 이미징 프로브.
  14. 제 10 항에 있어서,
    형광 이미징 프로브에 추가로 세포 또는 조직 타겟팅 리간드가 결합되어 있는 형광 이미징 프로브.
  15. 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브의 일 말단에 검출 수단을 결합시키는 단계; 및
    상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머를 상기 핵산 프로브와 혼성화하는 단계를 포함하는,
    선형 분자 비콘의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    핵산 프로브의 일 말단과 검출 수단의 결합은 핵산 프로브의 일 말단에 도입된 기능기와 검출 수단 상에 도입된 기능기 간의 공유결합을 통해 이루어지는 것인 선형 분자 비콘의 제조 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    핵산 프로브의 일 말단에 도입된 기능기는 -COOH, -CHO, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기 및 -알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 선형 분자 비콘의 제조 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    검출 수단 상에 도입된 기능기는 -NH2, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH2, -SH, -CON3 및 -CH2C(NH2 +)OCH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 선형 분자 비콘의 제조 방법.
  19. 제 16 항에 있어서,
    핵산 프로브의 일 말단에 도입된 기능기는 -COOH이고, 검출 수단 상에 도입된 기능기는 -NH2인 선형 분자 비콘의 제조 방법.
  20. 제 16 항에 있어서,
    핵산 프로브의 일 말단에 도입된 기능기는 -NH2이고, 검출 수단 상에 도입된 기능기는 -COOH인 선형 분자 비콘의 제조 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 선형 분자 비콘을 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물.
  22. 제 21 항에 따른 조성물을 생체 또는 시료에 투여하는 단계; 및
    상기 생체 또는 시료로부터 선형 분자 비콘에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 단계를 포함하는,
    생체 또는 시료의 영상 수득 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 선형 분자 비콘을 포함하는 의약 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    의약 조성물은 암 질환, 신경 질환, 심장 질환, 혈관 질환 및 대사 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 치료용 의약 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    암 질환은, 위암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 질환 치료용 의약 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20160105197A (ko) 2015-02-27 2016-09-06 전북대학교산학협력단 나노골드를 포함하는 cng dna 반복 염기서열 탐지용 분자탐침 및 이를 이용한 분석방법
CN114814207A (zh) * 2022-04-11 2022-07-29 福建师范大学 一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法及其应用

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