KR20060127399A - 나노피브릴 구조물 및 세포와 조직 배양을 포함한 용도 - Google Patents

나노피브릴 구조물 및 세포와 조직 배양을 포함한 용도 Download PDF

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멜빈 에스 쉰들러
후 와이 청
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미시간 스테이트 유니버시티
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Abstract

세포 배양 및 조직 공학용 나노피브릴 구조물이 기술되어 있다. 나노피브릴 구조물은 세포의 증식 및/또는 미분화 및 조직의 제조 방법을 포함하는 다양한 용도에 사용될 수 있다. 또한, 지질, 친지성 분자 또는 화학적으로 개질된 표면을 포함하는 개선된 나노 섬유가 기술되어 있다. 나노 섬유는 세포 배양 및 조직 공학을 위한 나노피브릴 구조물의 형성을 포함하는 다양한 용도에 사용될 수 있다.
나노피브릴 구조물, 세포 증식, 미분화 방법, 형광 마커, 생체 활성 분자

Description

나노피브릴 구조물 및 세포와 조직 배양을 포함한 용도{Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture}
본 발명은 세포 배양 및 조직 공학용 나노피브릴 구조물 및 세포의 증식 및/또는 미분화 방법과 조직의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 나노 섬유 기질을 포함하는 세포 배양용 성장 배지에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 지질, 친지성 분자 또는 화학적으로 개질된 표면을 포함하는 개선된 나노 섬유에 관한 것이다. 개선된 나노 섬유는 다양한 용도에 유용하다. 한 용도로, 세포 배양 및 조직 공학용 나노피브릴 구조물은 개선된 나노 섬유를 사용하여 제조할 수 있다. 다른 용도로, 세포 배양용 배지는 개선된 나노 섬유를 사용하여 제조할 수 있다.
생체내에서 세포 증식 및 미분화는 세포간의 독특한 공간 상호작용에 의해 조절된다. 특정 결합 분자의 형태학적으로 구별되는 위치 및, 특정 체액 인자(예: 성장 및 미분화 인자)의 방출과 관련된 공간적 단서는 증식, 미분화, 이동, 지속 상태로 잔류하거나 아폽토시스(apoptosis)를 개시하기 위한 세포에 대한 신호로서 작용한다. 이들 신호화 트리거에 반응하는 세포의 능력은 특정 세포 표면 및 세포내 수용체의 유용성에 좌우된다. 이들 분자에 의해 자극되는 신호 형질도입 경로는 이의 구성이 세포 및 세포외 기판을 둘러싸는 이들 신호화 분자와의 다점 세포 표면 상호작용의 기능인 세포의 세포 골격의 조직 및 구조에 좌우된다.
세포 및 조직 배양 환경을 고안함에 있어서, 성장 환경으로 혼입되어야만 하는 세포 상호작용을 고려하는 것이 중요하다. 세포 형태, 공간적 단서 및 화학적 트리거와 조절제는 상호작용하는 세포내에서 유전자 발현을 조절하는데 중요한 역할을 한다(참조: Li et al., 2002, FASEB J., 17:97-99; Botarro et al., 2002, Ann. N.Y. Acad. Sci., 961:143-153; Kunz-Schughart et al., 2003, Am. J. Physiol. Cell Physiol., 284:209-C219; Cukierman et al., 2001, Science, 294:1708-1712). 세포 및 조직 배양의 실행시 과거의 진보는 조직내에서 복잡한 생체내 마이크로 환경에 근접하는 생화학적 및 물리적 상태를 제공하는 것에 관한 것이었다(참조: Cukierman et al., 2001, Science, 23:1708-1712; Li et al., 2002, FASEB J., 17:97-99; Chiu et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:2408-2413). 이들 노력은 이들의 능력이 생체내에서 조직에 존재하는 공간적 단서, 화학적 트리거 및 조절자를 결여시키는 평면 배양물 표면에서 증식되도록 계속해서 성장되어 왔고 선택되어 온 세포주의 사용을 포함하는 요인에 의해 한정되었다.
최근의 작업은 3차원인 나노피브릴(예: 콜라겐 및 다른 원섬유)의 공간적 조직으로부터 생성되는 독특한 마이크로- 및 나노-환경이 세포 유착, 신호 형질 도입 및 미분화 기능의 조직형 패턴에 대해 필수적이라고 설명하고 있다. 고체 평형 배양물 표면상의 세포의 결합 및 성장은 생체내에서 조직중 세포에 대해 관찰되는 세포 조직의 상이한 패턴을 나타낸다(참조: Walpita and Hay, 2002, Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 3:137-141; Cukierman et al., 2001, Science, 23:1708-1712; Mueller-Klieser, 1997, Am. J. Physiol., C1109-C1123). 통상의 평면 세포 배양물 표면에서 성장시, 예를 들면, 섬유아세포는 세포질내에 위치하는 악틴 네트워크가 두꺼운 스트레스 섬유의 배열로 조직화되는 상당한 확산성 및 유착 형태를 예상한다. 이와는 대조적으로, 섬유아세포가 콜라겐 겔에서 성장되거나, 조직에서 관찰되는 경우에, 이들은 외피 환에서 조직화되는 악틴에 의해 형태가 스핀들 형이 된다(참조: Tamariz and Grinnell, 2002, Mol. Biol. Cell, 13:3915-3929; Walpita and Hay, 2002, Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 3:137-141; Grinnell et al., 2003, Mol. Biol. Cell., 14:384-395). 더욱이, 2차원 세포 배양시 성장되는 암 세포에 대한 3차원 세포 배양시 성장되는 암 세포의 약제 민감성은 화학요법을 포함한 암 치료법의 디자인을 포함하는 중요한 상당히 상이한 결과이다(참조: Mueller-Klieser, 1997, Am. J. Physiol., 273:C1109-1123; Padron et al., 2000, Crit. Rev. Oncol./Hematol., 36:141-157; Jacks and Weinberg, 2002, Cell, 111:923-925; Weaver et al., 2002, Cancer Cell, 2:205-216).
세포 배양 및 조직 배양에서 상당한 발전은 생체내 및 시험관내에서 모두 세포를 분할하기 위한 비계 및 3차원 공간 형성체로서 작용하도록 고안된 비독성 및 생체 적합성의 물질로 구성되는 물질의 도입이다(참조: 미합중국 특허 제 20020133229호; 미합중국 특허 제20020042128호; 미합중국 특허 제20020094514호; 미합중국 특허 제20020090725호). 이들 디자인의 목적은 세포가 작용하는 조직에서 증식 또는 미분화되거나, 또는 손상된 구조물을 재생하도록 하는 생체내 조직형 기하와 마이크로- 및 나노-환경을 갖는 성장 표면을 제공하는 것이다. 기능 세포를 지지하는 이들 구조물은 신체에서 손상된 조직을 회복시키거나 대체하고, 새로운 조직과 기관의 성장을 촉진함을 포함하는, 다양한 용도에 사용될 수 있다.
그러나, 3차원 세포 및 조직 배양 기술의 성공적인 준비는 주로 개개 실험실내의 전문성 및 복잡한 기구의 유용성의 함수였다. 사용의 용이성, 균일성, 품질 조절 및 표준 조직 배양 플레이트와 관련된 융통성을 제공하는 간단하거나 복잡한 물질로부터 제조되는 배지에 대한 상당한 필요성이 존재한다. 또한, 배지 물질 및 디자인은 조직에서 세포층의 조직에 보다 정확히 영향을 주는 한정된 조성의 층상 어셈블리의 구성을 허용할 수 있다. 미합중국 특허 제5,672,399호에 기술된 거친 섬유 지지체(예: 섬유 배지)에 의해 분리되는 미세한 섬유의 다층을 포함하는 배지는 살아있는 세포의 성장을 위한 환경을 제공하지 못한다.
발명의 요약
나노피브릴 구조물은 반복 가능한 섬유 및 기질 차원, 사용의 용이성, 균일성, 세포 반응, 품질 조절 및 융통성을 제공하는 나노 섬유 물질로부터 제조될 수 있다. 나노피브릴 구조물의 나노 섬유 네트워크 및 공간중 나노 섬유 네트워크의 나노 섬유 배열의 토포그래피인 나노토포그래피는 단층 또는 다층 세포 배지에서 동형 또는 이형 세포 성장 및/또는 세포 미분화의 촉진을 위해 보다 조직-적합성인 시험관내 생체 유사성 기층을 제공하도록 조작된다.
본 발명의 한 측면은 지질을 포함하는 개선된 나노 섬유를 제공하는 것이다. 나노 섬유는 직경이 약 1000 ㎚ 미만이다. 개선된 나노 섬유는 세포 배양 및 조직 공학을 포함한, 다양한 용도에 유용하다.
본 발명의 바람직한 형태는 중합체의 전기 방사(electrospinning)로 부가 조성물을 함유하지 않는 중합체 용액으로부터 전기 방사된 복잡 분산성인 다수의 나노 섬유에 비하여, 보다 많은 수 또는 %의 가는 섬유를 갖는 복잡 분산성인 다수의 나노 섬유를 생성하도록 중합체의 치밀화에 영향을 주는 부가 조성물과 혼합된 중합체성 물질을 포함한다. 한 양태로, 중합체 용액은 약 0.25 내지 약 15% w/w의 부가 조성물을 포함한다. 다른 양태로, 중합체 용액은 약 1 내지 약 10% w/w의 부가 조성물을 포함한다. 바람직한 양태로, 부가 조성물은 지질이다. 다른 바람직한 양태로, 지질은 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 콜레스테롤 또는 이들의 혼합물이다. 부가 조성물은 또한 섬유에 대한 세포의 복귀를 유도하는 신호화 분자로서 작용할 수 있다.
가는 섬유는 바람직하게는 직경이 약 5 내지 약 600 ㎚이다. 한 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 50 내지 약 400 ㎚이다. 다른 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 300 ㎚이다. 다른 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 5 내지 약 200 ㎚이다. 다른 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 5 내지 약 100 ㎚이다. 다른 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 5 내지 약 50 ㎚이다.
보다 작은 직경의 나노 섬유는 생체내에서 세포외 기판에 대한 세포 결합의 특징인, 나노 섬유와 세포 사이에 다점식 결합을 촉진하는 표면을 제공한다. 바람직하게는, 복잡 분산성인 다수의 나노 섬유중 약 25% 이상이 가는 섬유이다. 한 양태로, 나노 섬유를 함유하는 복잡 분산성인 다수의 지질중 약 30% 이상이 가는 섬유이다. 다른 양태로, 나노 섬유를 함유하는 복잡 분산성인 다수의 지질중 약 40% 이상이 가는 섬유이다. 다른 양태로, 나노 섬유를 함유하는 복잡 분산성인 다수의 지질중 약 50% 이상이 가는 섬유이다. 다른 양태로, 나노 섬유를 함유하는 복잡 분산성인 다수의 지질중 약 60% 이상이 가는 섬유이다. 다른 양태로, 나노 섬유를 함유하는 복잡 분산성인 다수의 지질중 약 70% 이상이 가는 섬유이다.
한 양태로, 개선된 나노 섬유는 폴리아미드, 폴리에스테르 또는 생체내 동물 또는 인간용으로 적합한 다른 중합체로부터 제조된다. 다른 양태로, 폴리에스테르는 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(락테이트) 또는 폴리(글리콜레이트)일 수 있다. 다른 양태로, 나노 섬유는 클로로포름중 약 10 % 이상의 폴리(ε-카프롤락톤)을 포함하는 중합체 용액으로부터 제조된다. 다른 양태로, 나노 섬유는 클로로포름중 약 15 % 이상의 폴리(ε-카프롤락톤)을 포함하는 중합체 용액으로부터 제조된다.
본 발명의 다른 바람직한 형태는 이로서 제한되는 것은 아니지만, 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 다당류, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 하이브리드 혼합물을 포함한, 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함하는 나노 섬유를 포함한다. 폴리펩티드는 섬유상 단백질, 유착 단백질, 성장 인자 및 미분화 인자를 포함한다. 일부 바람직한 성장 인자에는 VEGF, NFG, PDGF- AA, PDGF-BB, PDGF-AB, FGFb, FGFa 및 BGF가 포함된다. 일부 바람직한 미분화 인자에는 뉴로트로핀, 콜로니 자극 인자 및 형질전환 성장 인자가 포함된다.
한 양태로, 생체 활성 분자는 나노 섬유가 제조되는 중합체 용액으로 혼입된다. 다른 양태로, 작용기는 나노 섬유의 외부 표면에 결합될 수 있고, 나노 섬유의 작용성화된 표면은 하나 이상의 생체 활성 분자에 결합되도록 반응한다. 한 양태로, 작용기는 플라즈마 침착을 사용하는 나노 섬유의 외부 표면에 결합된다. 다른 양태로, 작용기는 나노 섬유가 제조되는 중합체 용액으로 혼입된다.
본 발명의 다른 바람직한 형태는 형광 마커를 포함하는 나노 섬유를 포함한다. 형광 마커는, 예를 들면, 나노 섬유의 가시화, 나노 섬유 혼합물중 특정 나노 섬유의 동정, 나노 섬유 또는 나노 섬유를 둘러싸는 나노-환경의 화학적 또는 물리적 특성의 동정 및, 조직 공학용으로 유용한 3차원 구조를 포함하는, 이식 가능한 나노 섬유 및/또는 나노 섬유를 포함하는 구조물의 분해 및/또는 재분포의 평가를 허용한다.
형광 마커는 유기 염료 형광단을 포함할 수 있다. 한 양태로, 형광단은 나노 섬유의 전기 방사 전에 중합체에 가한다. 다른 양태로, 형광단은 나노 섬유 표면에 혼입되는 작용기를 통해 나노 섬유에 콘쥬게이트된다. 다른 양태로, 형광단은 나노 섬유에 결합된 생체 활성 분자에 콘쥬게이트된다. 형광 마커는 콜로이드성 무기 반도체 나노 결정을 포함할 수 있다. 한 양태로, 나노 결정은 CdSe 코어 및 ZnS 캡을 포함한다. 다른 양태로, 나노 결정은 양자 도트를 포함한다.
형광 마커는 이온-감지 원소로서 작용할 수 있다. 한 양태로, 나노 섬유는 형광 마커를 포함할 수 있으며, 이때 마커의 형광 또는 형광 세기는 이온 농도에 따라 좌우된다. 이러한 이온-감지 원소는 pH 및 칼슘, 나트륨 또는 포스페이트 플럭스를 포함한 이온 농도의 변화를 감지하는데 유용하다. 다른 양태로, 형광 마커는 나노 섬유 표면과, 이로써 제한되는 것은 아니지만, DNA/RNA 뉴클레오티드 서열, 탄수화물 또는 펩티드/아미노산 서열을 포함한 리간드 사이에 착화합물 형성을 나타내는 리포터 원소로서 작용할 수 있다. 이러한 착화합물 형성은 형광 방출 파장의 변화 및/또는 흡수체와 방출제 사이에 에너지 전달의 변화에 의해 입증될 수 있다.
본 발명은 또한 나노 섬유의 화학적 및/또는 물리적 특성을 동정하는 방법에 관한 것이다. 한 양태로, 형광 마커는 나노 섬유의 화학적 또는 물리적 특성에 대해 지정되며, 나노 섬유는 지정된 형광 마커에 의해 표지된다. 이러한 화학적 및 물리적 특성은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 섬유 직경, 생체 활성 분자, 작용기, 섬유의 용해 또는 분해, 나노 섬유를 포함하는 중합체 조성물, 섬유의 소수성 또는 친수성, 나노 섬유를 포함하는 중합체의 용해도, 중합체의 독성, 생체 활성 분자의 독성 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 형광 마커에 의한 나노 섬유의 표지화는, 예를 들면, 나노 섬유 혼합물 또는 세포 배열내에서 각각의 섬유 형태의 동정을 허용한다. 나노 섬유는 하나 이상의 형광 마커에 의해 표지되어 나노 섬유의 다중 화학적 및/또는 물리적 특성을 동정할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 하나 이상의 나노 섬유를 포함하는 나노피브릴 구조물이며, 나노피브릴 구조물은 하나 이상의 나노 섬유 네트워크에 의해 한정된다. 한 양태로, 나노 섬유 네트워크는 기판 표면에 침착된다. 나노 섬유는 다양한 중합체 또는 중합체 시스템으로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 중합체 또는 중합체 시스템은 비-세포독성이다. 한 양태로, 나노 섬유는 본 발명의 개선된 나노 섬유를 포함한다. 다른 양태로, 나노 섬유는 폴리아미드 또는 폴리에스테르로부터 제조된다. 다른 양태로, 폴리아미드 또는 폴리에스테르는 생체내 사람용으로 적합하다. 다른 양태로, 폴리에스테르는 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(락테이트) 또는 폴리(글리콜레이트)일 수 있다. 다른 양태로, 폴리아미드는 나일론 6, 나일론 66, 나일론 610 또는 다른 생체 적합성 폴리아미드일 수 있다. 한 양태로, 필름은 광학적으로 투명한 폴리에스테르 필름이다.
한 양태로, 기판은 유리 또는 플라스틱을 포함한다. 다른 양태로, 기판은 배양 용기의 표면이다. 기판은 필름을 포함한다. 필름은 수용성이거나 수불용성일 수 있다. 필름은 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능할 수 있다. 바람직하게는, 필름은 비-세포독성이다. 바람직한 양태로, 필름은 폴리비닐 알코올 필름이다.
나노피브릴 구조물은 단독으로 또는 층으로 사용되어 세포 또는 조직 배양을 위한 나노피브릴 구조물의 다층 어셈블리를 형성할 수 있다. 한 양태로, 나노피브릴 구조물은 스페이서를 포함한다. 스페이서는 지지체 구조물로서 작용할 수 있다. 스페이서는 충분한 개구를 제공하여 세포가 나노 섬유 네트워크로 침투되고 결합되도록 한다. 스페이서는 수용성이거나 수불용성일 수 있다. 스페이서는 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 스페이서는 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능할 수 있다. 바람직하게는, 스페이서는 생체 적합성이다.
한 양태로, 스페이서는 제1 및 제2 표면을 포함하며, 이때 스페이서의 제1 표면은 기판 위에 침착된 나노 섬유 네트워크의 표면과 접촉되며, 스페이서의 제2 표면은 기판의 표면과 접촉되어, 나노 섬유 네트워크 및 기판이 스페이서의 직경 또는 두께에 의해 분리되도록 한다. 다른 양태로, 스페이서는 제1 및 제2 표면을 함하며, 이때 스페이서의 제1 표면은 제1 나노피브릴 구조물의 표면과 접촉되고, 스페이서의 제2 표면은 제2 나노피브릴 구조물의 표면과 접촉되어, 두 나노피브릴 구조물이 스페이서의 직경 또는 두께에 의해 분리될 수 있도록 한다.
본 발명의 나노피브릴 구조물은 상처 회복, 인공 피부 성장, 정맥, 동맥, 힘줄, 인대, 연골, 심장판, 기관 배양, 화상 치료 및 뼈 이식을 포함한 많은 생체내 및 생체외 용도를 갖는다. 한 양태로, 세포 또는 조직에 대한 성장 환경의 상이한 배열은 개개 나노피브릴 구조물 부재를 포함하는 나노 섬유 네트워크, 기판 및/또는 스페이서로 특정 화학적 및 물리적 특성을 조작하고/하거나, 이어서 개개 나노피브릴 구조물을 층상화시켜 제조할 수 있다. 특정 양태로, 환경의 독특한 특성은 섬유 직경 및 조성의 불균질한 특성으로부터 수득할 수 있다. 이로써 제한되는 것은 아니지만, 조직, 주름, 접착성, 다공성, 경도(solidity), 탄성, 기하, 상호 결합성, 표면 대 용적비, 섬유 직경, 섬유 용해도/불용성, 친수성/소수성 및 피브릴 밀도를 포함한 개개 나노 섬유, 나노피브릴 구조물 및 나노피브릴 네트워크의 물리적 특성 및/또는 특징은 증식 및/또는 미분화를 포함한, 원하는 세포 활성을 촉진시키는 나노- 및/또는 마이크로-환경을 구성하도록 변화되고/되거나 개질될 수 있 다. 특정한 나노- 및/또는 마이크로-환경은 개개 나노피브릴 구조물내에서 또는 둘 이상의 나노피브릴 구조물을 포함하는 셀 배열에서 조작될 수 있다.
이로써 제한되는 것은 아니지만, 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질, 접착 단백질, 당단백질, 작용기, 유착성 화합물, 탈유착성 화합물 및 표적 분자를 포함한 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 다당류와 같은 특정 화학적 특성 및 인식 모티브는 등방성적으로 또는 구배로서 나노피브릴 네트워크, 기판 및/또는 개개 나노피브릴 구조물의 스페이서로 조작되어 성장 및/또는 미분화를 포함한, 하나 이상의 선택된 세포 활성을 촉진시킬 수 있다. 일부 바람직한 성장 인자에는 VEGF, NGF, PDGF-AA PDGF-BB, PDGF-AB, FGFb, FGFa 및 BGF가 포함된다. 일부 바람직한 미분화 인자에는 뉴로트로핀, 콜로니 자극 인자 및 형질전환 성장 인자가 포함된다. 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 특정 크기 및 복합성의 특정 형태의 분자 뿐만 아니라, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 구조 단백질, 효소 및 펩티드 호르몬을 포함한 당해 분자 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 조직의 제조 방법에 관한 것이다. 한 양태로, 둘 이상의 나노피브릴 구조물은 층상화시켜 다층 나노피브릴 어셈블리를 형성한다. 살아있는 세포가 섬유에 침착되며, 구조물은 침착된 세포의 성장, 이동 및/또는 미분화를 촉진하는 조건하에 배양한다. 다른 양태로, 세포 활성을 촉진하는 나노- 및/또는 마이크로-환경은 성장 기질의 선택된 물리적 및/또는 화학적 특성을 변화시키고/시키거나 개질시켜 개개 기질내에서 조작할 수 있다.
다른 양태로, 다중 세포 형태는 상이한 배양 조건하에 개개 나노피브릴 구조물 상에서 배양한다. 이어서, 개개 나노피브릴 구조물중 둘 이상을 층상화시켜 다층 나노피브릴 어셈블리를 형성하고, 어셈블리는 세포의 성장 및/또는 미분화를 포함한, 원하는 세포 활성을 촉진하는 조건하에 배양한다. 다른 양태로, 세포 활성을 촉진하는 나노- 및/또는 마이크로-환경은 개개 나노피브릴 구조물내에서 나노피브릴 구조물의 선택된 물리적 및/또는 화학적 특성을 변화시키고/시키거나 개질시키고, 또는 나노피브릴 어셈블리내에서 개개 나노피브릴 구조물을 선택적으로 층상화시켜 원하는 나노- 또는 마이크로-환경을 수득하도록 조작할 수 있다. 균질하거나 불균질한 섬유 직경 및 조성은 증식 및/또는 미분화를 최적화하도록 선택할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 세포 성장 배지이다. 한 양태로, 세포 성장 배지는 네트워크의 섬유 직경이 약 50 내지 약 1000 ㎚이고, 평균 섬유간 공간은 약 2 μ 이상이며, 기질 경도는 약 30%인 나노섬유의 기질과, 외벽의 높이가 약 10 μ 내지 약 100 ㎜이고, 상부 및 기저의 면적은 독립적으로 약 5 내지 약 4 x 105 mm2인 외벽이 있는 상부와 기저를 포함한다. 다른 양태로, 외벽의 높이 및 상부와 기저의 면적은 이용 가능한 배양 용기 또는 컨테이너의 치수에 따라 적용한다.
세포 성장 배지는 기질, 네트워크, 매트, 시트 또는 로울을 포함할 수 있다. 한 양태로, 세포 성장 배지는 나노 섬유의 네트워크를 포함한다. 다른 양태로, 나노 섬유의 네트워크는 배양 용기로 삽입하도록 적용시킨다. 다른 양태로, 세포 성 장 배지는 배양 용기 안쪽 표면 위에 침착된다.
도 1A 내지 1C는 나노피브릴 구조물의 주사전자 현미경 상이다. 도 1A 및 1B는 랜덤하게 침착된 폴리아미드 나노 섬유로 구성되는 나노피브릴 매트가 층상 표면으로 집결될 수 있음을 나타낸다. 도 1C는 나노 섬유가 특정 배위로 전기 방사될 수 있음을 나타낸다.
도 2A 내지 2E는 증가량의 지질을 포함하는 중합체 용액으로부터 전기 방사되는 마이크로 섬유의 비교를 도시한 광현미경 사진이다.
도 3A 및 3B는 지질을 포함하는 나노 섬유 또는 지질을 포함하지 않는 나노 섬유로 피복된 조직 배양 플레이트에서 성장시킨 정상적인 래트 신장 섬유아세포의 비교를 도시한 광현미경 사진이다.
도 4A 내지 4C는 폴리아미드 나노 섬유 네트워크, 유리 및 폴리리신으로 피복된 유리 위에서 성장시킨 정상적인 래트 신장 섬유아세포의 비교를 도시한 광현미경 사진이다.
도 5A 및 5B는 나노 섬유 표면 위로 아미노 작용기의 혼입을 나타내는 광현미경 사진이다.
도 6은 양자 도트에 의한 나노 섬유의 형광 표지화를 도시한 광현미경 사진이다.
I. 정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "나노피브릴 구조물"은 하나 이상의 나노 섬유를 포함하는 살아있는 세포의 성장을 위한 환경을 포함하는 구조물을 의미하며, 이때 구조물은 하나 이상의 나노 섬유의 네트워크에 의해 한정된다. 어떤 양태에 있어서, 나노피브릴 구조물은 기판을 포함하며, 이때 나노피브릴 구조물은 기판 표면 위에 침착된 하나 이상의 나노 섬유의 네트워크에 의해 한정된다. 나노피브릴 구조물의, 나노 섬유 네트워크의 토포그래피인 나노토포그래피 및 공간에서 나노 섬유 네트워크의 나노 섬유의 배열은 단층 또는 다층 세포 배양시 동형 또는 이형 세포 성장 및/또는 미분화의 촉진을 위해 보다 적합한 조직인 시험관내 생체 유사성 외층을 제공하도록 조작된다. 나노 섬유 구조물은 다층 나노피브릴 어셈블리, 세포 배열 또는 조직 구조를 형성하기 위하여 층상화될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "나노 섬유"는 직경이 약 1000 ㎚ 이하인 중합체 미세 섬유를 의미한다. 중합체는 바람직하게는 비-세포독성 중합체이다. 중합체는 수용성이거나 수불용성일 수 있다. 중합체는 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능할 수 있다. 중합체는 폴리에스테르 또는 폴리아미드일 수 있다. 폴리에스테르는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 폴리락티드, 폴리(글리콜레이트), 폴리(ε-카프롤락톤) 및 이의 공중합체를 포함하는 지방족 폴리에스테르일 수 있다. 폴리아미드는 폴리카프롤락탐, 나일론 6, 나일론 66, 나일론 6 12 또는 다른 나일론 물질일 수 있다.
나노 섬유는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 이들의 혼합물을 포함한, 지질 또는 친지성 분자를 포함할 수 있다. 나노 섬유는 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 생체 활성 분자중 하나는 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 다당류, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 하이브리드 분자이다. 나노 섬유는 하나 이상의 알코올, 알데히드, 아미노, 카복시, 설프하이드릴 또는 광활성화 가능한 작용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 광활성화 가능한 그룹은 카벤 또는 니트렌이다.
나노 섬유는 하나 이상의 성장 인자 및/또는 미분화 인자를 포함할 수 있다. 나노 섬유는 하나 이상의 성장 인자 및/또는 미분화 인자를 방출할 수 있다. 방출 속도는 나노 섬유의 분해 및/또는 용해 속도에 의해 결정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "네트워크"는 성장 및 배양 안정성을 촉진하도록 선택된 섬유 사이 공간을 가지면서 상호 결합성 네트를 형성하도록 조절되는 공간에서 나노 섬유의 랜덤하거나 배향된 분포를 의미한다. 네트워크는 네트워크에 기공 또는 채널을 형성하는 네트워크를 포함하는 섬유 사이에 작은 공간을 갖는다. 기공 또는 채널은 두께를 통해 직경이 약 0.01 내지 약 25 μ, 바람직하게는 약 2 내지 약 10 μ이다. 네트워크는 나노 섬유 단층, 연속 나노 섬유에 의해 형성되는 단층, 나노 섬유의 다층, 연속 나노 섬유에 의해 형성되는 다층 또는 매트를 포함한다. 네트워크는 부직 또는 네트일 수 있다. 네트워크는 두께가 대략 단일 나노 섬유의 직경 내지 약 2000 ㎚일 수 있다. 이로써 제한되는 것은 아니지만, 조직, 주름, 접착성, 다공성, 경도, 탄성, 기하, 상호 결합성, 표면 대 용적비, 섬유 직경, 섬유 용해도/불용성, 친수성/소수성, 피브릴 밀도 및 섬유 배향을 포함한 네트워크의 물리적 특성은 원하는 파라미터로 조작될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "기판"은 나노 섬유 또는 나노 섬유의 네트워크가 침착되는 표면을 의미한다. 기판은 침착된 나노 섬유의 네트워크를 위한 구조적 지지체를 제공하는 표면일 수 있다. 기판은 유리 또는 플라스틱을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 플라스틱은 비-세포독성이다. 기판은 필름 또는 배양 용기일 수 있다.
기판은 수용성이거나 수불용성일 수 있다. 수용성인 기판은 바람직하게는 폴리비닐 알코올 필름이다. 기판은 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 기판의 다공성은 세포 침투에 의해 결정된다. 세포는 다공성 기판을 침투할 수 있지만, 비다공성 기판은 침투할 수 없다. 바람직하게는, 다공성 기판의 기공은 직경이 약 2 내지 약 10 ㎛이다. 기판은 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능할 수 있다. 바람직하게는, 기판은 생체 적합성이다.
기판은 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 생체 활성 분자중 하나는 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 다당류, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 하이브리드 분자이다. 기판은 하나 이상의 알코올, 알데히드, 아미노, 카복시, 설프하이드릴 또는 광활성화 가능한 작용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 광활성화 가능한 그룹은 카벤 또는 니트렌이다. 기판은 하나 이상의 성장 인자 및/또는 미분화 인자를 포함할 수 있다. 기판은 하나 이상의 성장 인자 및/또는 미분화 인자를 방출할 수 있다. 방출 속도는 기판의 분해 및/또는 용해 속도에 의해 결정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "스페이서"는 기판의 표면으로부터 나노 섬유 또는 나노섬유 네트워크를 또는, 제2 나노피브릴 구조물의 표면으로부터 제1 나노피브릴 구조물의 표면을 분리하여 구조물이 스페이서의 직경 또는 두께에 의해 분리될 수 있도록 하는 층을 의미한다. 스페이서는 중합체 미세 섬유 또는 필름을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 필름은 두께가 약 10 내지 약 50 μ이다. 스페이서는 셀룰로즈, 전분, 폴리아미드, 폴리에스테르 또는 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함하는 중합체를 포함할 수 있다. 미세 섬유는 마이크로 섬유를 포함할 수 있다. 마이크로 섬유는 직경이 약 1.0 내지 약 10 ㎛인 중합체 미세 섬유이다. 마이크로 섬유는 부직 또는 네트일 수 있다.
스페이서는 수용성이거나 수불용성일 수 있다. 스페이서는 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 스페이서의 다공성은 세포 침투에 의해 결정된다. 세포는 다공성 스페이서를 침투할 수 있지만, 비다공성 스페이서는 침투할 수 없다. 스페이서는 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능할 수 있다. 바람직하게는, 스페이서는 생체 적합성이다.
스페이서는 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 생체 활성 분자중 하나는 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 아미노산 또는 이의 하이브리드 분자이다. 스페이서는 하나 이상의 알코올, 알데히드, 아미노, 카복시, 설프하이드릴 또는 광활성화 가능한 작용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 광활성화 가능한 그룹은 카벤 또는 니트렌이다. 스페이서는 하나 이상의 성장 인자 및/또는 미분화 인자를 포함할 수 있다. 스페이서는 하나 이상의 성장 인자 및/또는 미분화 인자를 방출할 수 있다. 방출 속도는 스페이서의 용해 또는 분해 속도에 의해 결정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "생체 활성 분자"는 세포 또는 조직에 영향을 주는 분자를 의미한다. 용어는 사람 또는 수의학적 치료제, 영양제, 비타민, 염, 전해질, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 다당류, 핵산, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 당단백질, 지질 단백질, 당지질, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 성장 인자, 미분화 인자, 호르몬, 신경 전달제, 페로몬, 칼론, 포스타글란딘, 면역 글로블린, 모노킨 및 다른 사이토킨, 보습제, 무기질, 전기적으로 및 자기적으로 반응성인 물질, 감광성 물질, 산화 방지제, 세포 에너지 공급원으로서 대사될 수 있는 분자, 항원 및 세포 또는 생리학적 반응을 유발할 수 있는 분자를 포함한다. 이들 분자의 효능제 또는 길항제 뿐만 아니라, 분자의 특정 조합이 사용될 수 있다. 글리코사미노글리칸은 당단백질, 프로테오글리칸 및 히알루로난을 포함한다. 다당류는 셀룰로즈, 전분, 알긴산, 키토산 또는 히알루로난을 포함한다. 사이토킨은 이로써 제한되는 것은 아니지만, 카디오트로핀, 스트로마 세포 유도 인자, 대식세포 유도된 케모킨(MDC), 멜라노마 성장 촉진 활성(MGSA), 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP-1 알파), 2, 3 알파, 3 베타, 4 및 5, 인터류킨(IL) 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-11, IL-12, IL-13, TNF-α 및 TNF-β를 포함한다. 본 발명에 유용한 면역 글로불린은 이로써 제한되는 것은 아니지만, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE 및 이들의 혼합물을 포함한다. 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 특정 크기 및 복잡성의 특정 형태의 분자 및 이러한 분자의 조합을 포함할 수 있다. 그 예로는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 구조 단백질, 효소 및 펩티드 호르몬이 포함된다.
용어 생체 활성 분자는 또한 섬유상 단백질, 접착 단백질, 유착성 화합물, 탈유착성 화합물 및 표적 화합물을 포함한다. 섬유상 단백질은 콜라겐 및 엘라스틴을 포함한다. 유착/탈유착 화합물은 피브로넥틴, 라미닌, 트롬보스폰딘 및 테나신 C를 포함한다. 접착 단백질은 액틴, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 카드헤린, 셀렉틴, 세포내 접착 분자 1, 2 및 3, 및 인테그린, 예를 들면, α5β1, α6β1, α7β1, α1β2, α2β3 및 α6β4를 포함하나 이로 한정되지 않은 세포-기질 접착 수용체를 포함한다.
용어 생체 활성 분자는 또한 렙틴, 백혈병 억제 인자(LIF), RGD 펩티드, 종양 괴사 인자 알파 및 베타, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 트롬보스폰딘, 골원성 단백질-1, 골 형태원성 단백질 2 및 7, 오스테오넥틴, 소마토메딘-형 펩티드, 오스테오칼신, 인터페론 알파, 인터페론 알파 A, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 1 알파 및 인터류킨 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17 및 18을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "성장 인자"는 세포 또는 조직의 증식을 촉진하는 생체 활성 분자를 의미한다. 본 발명에 유용한 성장 인자에는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 형질전환 성장 인자-알파(TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타), AA, AB 및 BB 이소 형태를 포함한 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), FGF 산성 이소 형태 1 및 2를 포함한 섬유아세포 성장 인자(FGF), FGF 염기성 형태 2 및 FGF 4, 8, 9 및 10, NGF 2.5s, NGF 7.0s 및 베타 NGF를 포함한 신경 성장 인자(NGF) 및 뉴로트로핀, 뇌 유도 신경 친화성 인자, 연골 유도 인자, 골 성장 인자(BGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), EG-VEGF, VEGF-관련 단백질, Bv8, VEGF-E, 과립성 백혈구 콜로니 촉진 인자(G-CSF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF) I 및 II, 간세포 성장 인자, 글리아 신경 친화성 성장 인자(GDNF), 줄기 세포 인자(SCF), 각질세포 성장 인자(KGF), TGF 알파, 베타, 베타1, 베타2 및 베타3을 포함한 형질전환 성장 인자(TGF), 골격 성장 인자, 골 기질 유도 성장 인자 및 골 유도 성장 인자와 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 성장 인자는 또한 세포 또는 조직의 미분화를 촉진할 수 있다. TGF는, 예를 들면, 세포 또는 조직의 성장 및/또는 미분화를 촉진할 수 있다. 일부 바람직한 성장 인자에는 VEGF, NGF, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, FGFb, FGFa 및 BGF가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "미분화 인자"는 세포의 미분화를 촉진하는 생체 활성 분자를 의미한다. 용어는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 뉴로트로핀, 콜로니 촉진 인자(CSF) 또는 형질전환 성장 인자를 포함한다. CSF는 과립성 백혈구-CSF, 대식세포-CSF, 과립성 백혈구-대식세포-CSF, 적혈구 생성 및 IL-3을 포함한다. 일부 미분화 인자는 또한 세포 또는 조직의 성장을 촉진할 수 있다. TGF 및 IL-3은, 예를 들면, 세포의 미분화 및/또는 성장을 촉진할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "유착성 화합물"은 유착성 화합물을 포함하는 섬유 표면에 대한 세포의 결합을 촉진하는 생체 활성 분자를 의미한다. 유착성 화합물의 예로는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 피브로넥틴, 비트로넥틴 및 라미닌이 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "탈유착성 화합물(deadhesive compound)"은 탈유착성 화합물을 포함하는 섬유로부터 세포의 이탈을 촉진하는 생체 활성 분자를 의미한다. 탈유착성 화합물의 예로는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 트롬보스폰딘 및 테나신 C가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "표적 화합물(targeting compound)"은 표적 화합물을 포함하는 섬유에 대해 세포의 부가 및/또는 결합을 유도하는 신호화 분자로서 작용하는 생체 활성 분자를 의미한다. 표적 화합물 및 이들의 동원성 수용체의 예로는 피브로넥틴 및 인테그린으로부터 유도되는 RGD 펩티드를 포함한 결합 펩티드, EGF 및 EGF 수용체를 포함한 성장 인자 및, 인슐린과 인슐린 수용체를 포함한 호르몬이 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "지질"은 물에 불용성이지만, 비극성 유기 용매에 용해되려하는 유기 분자를 의미한다. 이는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 식물 및 동물 트리글리세라이드, 스테롤, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린을 포함한 포스파티딜콜린 물질, 스핑고미엘린 및 콜레스테롤을 포함한 친지성 분자를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 구 "삽입을 위해 조정됨"은 배양 용기의 치수내로 또는 그로 사용하기 위해 제조되거나, 예를 들면, 사이즈 아래로 절단하거나, 시트, 로울 또는 매트로부터 배양 용기로 삽입하기에 적합한 크기로 조각을 절단함을 포함하여, 배양 용기의 치수내로 또는 치수까지 사용하기 위해 다시 규격화함을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "배양 용기"는 세포 또는 조직을 배양하기 위해 배지를 유지하기 위한 용기를 의미한다. 배양 용기는 유리 또는 플라스틱일 수 있다. 바람직하게는, 플라스틱은 비-세포독성이다. 용어 배양 용기는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 단일 및 다중 웰 배양 플레이트, 챔버 및 다중 챔버 배양 슬라이드, 커버슬립, 컵, 플라스크, 튜브, 병, 로울러 병, 스피너 병, 관류 챔버, 생체 반응기 및 발효기를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "매트(mat)"는 나노 섬유의 치밀하게 서로 엮기거나, 엉키거나, 부착된 매스를 의미한다. 매트중 나노 섬유의 분포는 랜덤하거나 배향될 수 있다. 매트는 부직 또는 네트일 수 있다. 매트는 기판 위에 침착되거나, 침착되지 않을 수 있다. 매트는 두께가 약 100 내지 약 1000 ㎚이다.
II. 본 발명의 수행 방법
A. 개선된 나노 섬유
본 발명의 한 측면은 지질을 포함하는 개선된 나노 섬유를 제공한다. 나노 섬유는 바람직하게는 직경이 약 1000 ㎚ 미만이다. 한 양태로, 나노 섬유는 직경이 약 50 내지 약 1000 ㎚이다. 개선된 나노 섬유는 세포 배양 및 조직 공학을 포함한, 다양한 용도에 유용하다.
i. 중합체 및 중합체 시스템
개선된 나노 섬유는 바람직하게는 비-세포독성 중합체를 포함한다. 중합체는 수용성이거나 불용성일 수 있다. 중합체는 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능할 수 있다. 중합체는 제1 중합체 및, 승온에서 조절되거나 처리되는 제2의, 그러나 상이한 중합체(중합체 형태, 분자량 또는 물리적 특성이 상이함)를 포함할 수 있다.
중합체 혼합물은 반응하여 단일 화학 그룹으로 형성되거나, 어닐링 공정에 의해 혼합 조성물로 물리적으로 혼합될 수 있다. 어닐링은 물리적 변화, 유사 결정도, 응력 완화 또는 배향을 포함한다. 바람직한 물질은 단일 중합체성 그룹으로 화학적으로 반응하여, 시차 주사 열량계 분석이 단일 중합체성 물질임을 나타내도록 한다. 이러한 물질은 바람직한 부가 물질과 혼합시, 올레오포비시티(oleophobicity), 소수성 또는 고온, 다습 및 상이한 조작 조건과 접촉되는 경우에 다른 관련된 개선된 안정성을 제공하는 나노 섬유 상에 부가제의 표면 피복물을 형성할 수 있다. 물질 그룹의 미세 섬유는 직경이 약 1000 ㎚ 내지 약 5 ㎚ 미만일 수 있다. 이러한 섬유는 부가 물질의 개별층 또는 중합체 표면에 부분 용해되거나 합금되는 부가 물질의 외부 피복물이나, 이 둘 모두를 포함하는 매끄러운 표면을 가질 수 있다. 혼합 중합체성 시스템에 사용하기에 바람직한 물질에는 나일론 6, 나일론 66, 나일론 6-10, 나일론(6-66-610) 공중합체 및 다른 선형의 일반적으로 지방족인 나일론 조성물이 포함된다. 바람직한 나일론 공중합체 수지(SVP-651)는 말단 그룹 적정법에 의해 분자량에 대해 분석한다(참조: J.E. Walz and G.B. Taylor, 나일론의 분자량 측정, Anal. Chem. Vol. 19, Number 7, pp 448-450 (1947)). 수평균 분자량(Mn)은 21,500 내지 24,800이다. 조성은 세 성분 나일론, 약 45% 나일론 6, 약 20% 나일론 66 및 약 25% 나일론 610의 융점의 상 다이아그램으로 측정한다(Page 286, Nylon Plastics Handbook, Melvin Kohan ed. Hanser Publisher, New York (1995)).
SVP 651의 보고된 물리적 특성은 다음과 같다:
특성 ASTM 법 단위 통상의 값
비중 D-792 -- 1.08
흡수성(24시간 침지) D-570 % 2.5
경도 D-240 쇼어 D 65
융점 DSC ℃(℉) 154(309)
항복 인장강도 D-638 ㎫(kpsi) 50(7.3)
파단신도 D-638 % 350
굴곡 모듈러스 D-790 ㎫(kpsi) 180(26)
부피 비저항 D-257 ohm-㎝ 1012
가수분해도가 87 내지 99.9 +%인 폴리비닐 알코올이 이러한 중합체 시스템에 사용될 수 있다. 이들은 바람직하게는 가교결합되며, 이들은 가장 바람직하게는 실질적인 양의 올레오포빅 및 소수성 부가 물질과 가교결합되어 결합된다.
중합체는 섬유 수명 또는 조작 특성을 개선하기 위하여 부가 조성물과 임의로 혼합된 단일 중합체성 물질일 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 유용한 바람직한 중합체에는 나일론 중합체, 폴리비닐리덴 클로라이드 중합체, 폴리비닐리덴 플루오라이드 중합체, 폴리비닐 알코올 중합체 및 특히, 미세 섬유 표면 위에 피복물로 형성되는 부가 물질을 함유하는 마이크로 섬유 또는 나노 섬유를 형성할 수 있는 강한 올레오포빅 및 소수성인 부가제와 혼합시 제시된 물질들이 포함된다. 또한, 유사 나일론 혼합물, 유사 폴리비닐클로라이드 중합체, 폴리비닐리덴 클로라이드 중합체의 혼합물과 같은 유사 중합체의 혼합물이 본 발명에 유용하다. 또한, 중합체성 혼합물 또는 상이한 중합체의 합금이 또한 본 발명에 의해 시도된다. 이와 관련하여, 중합체의 혼화성 혼합물은 본 발명의 나노 섬유 또는 마이크로 섬유 물질을 형성하는데 유용하다.
부가 조성물은 유기 또는 무기의, 금속 또는 비금속일 수 있다. 한 양태로, 중합체 용액은 약 0.25 내지 약 70% w/w의 부가 조성물을 포함한다. 다른 양태로, 부가 조성물은 생체 활성 분자이다. 또 다른 양태로, 부가 조성물은 세라믹이다. 부가 조성물은 현미경 기술을 위한 고유의 섬유 형광성을 증가시키거나 감소시키는 광학 부가제일 수 있다. 한 양태로, 광학 부가제는 양자 도트이다. 다른 양태로, 광학 부가제는 신호 대 소음비를 증진시켜 섬유의 형광 배경을 감소시킨다. 광학 부가제의 예로는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 양자 도트 또는 FluoroblokTM(Bectin Dickinson, Franklin Lakes, NJ)이 포함된다.
본 발명의 중합체성 조성물에 사용될 수 있는 중합체 물질에는 폴리올레핀, 폴리아세탈, 폴리아미드, 폴리에스테르, 셀룰로즈 에테르 및 에스테르, 폴리알킬렌 설파이드, 폴리아릴렌 옥사이드, 폴리설폰, 개질된 폴리설폰 중합체 및 이들의 혼합물과 같은 부가 중합체 및 축합 중합체 물질이 모두 포함된다. 이들 일반적인 그룹에 속하는 바람직한 물질에는 폴리에틸렌, 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(락테이트), 폴리(글리콜레이트), 폴리프로필렌, 폴리(비닐클로라이드), 폴리메틸렌메타크릴레이트(및 다른 아크릴 수지), 폴리스티렌 및 이의 공중합체(ABA 형 블록 공중합체 포함), 폴리(비닐리덴 플루오라이드), 폴리(비닐리덴 클로라이드), 가교결합 및 비가교결합 형태인 다양한 가수분해도(87 내지 99.5%)의 폴리비닐 알코올이 포함된다. 바람직한 부가 중합체는 유리질이 되려한다(Tg는 실온보다 큼). 이는 폴리비닐클로라이드 및 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌 중합체 조성물 또는 합금에 대한 경우이거나, 폴리비닐 플루오라이드 및 폴리비닐 알코올 물질의 경우는 결정도가 낮다.
지방족 폴리에스테르[예: 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(락테이트), 폴리(글리콜레이트) 및 이들의 공중합체]는 생분해 가능하고, 생체 적합성이며, 몇몇 합성 중합체중, 외과적 봉합 및 일부 이식 가능한 장치와 같은 특정 사람의 임상용으로 식품 의약품국(the Food and Drug Administration)에서 승인하였다. 한 양태로, 나노 섬유는 생체내 사람용으로 적합한 지방족 폴리에스테르로부터 제조된다. 바람직하게는, 폴리에스테르는 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(락테이트) 또는 폴리(글리콜레이트)이다. 한 양태로, 나노 섬유는 클로로포름중 약 10% 이상의 폴리(ε-카프롤락톤) w/w을 포함하는 중합체 용액으로부터 제조된다. 다른 양태로, 나노 섬유는 클로로포름중 약 15% 이상의 폴리(ε-카프롤락톤) w/w을 포함하는 중합체 용액으로부터 제조된다.
폴리아미드 축합 중합체의 한 그룹은 나일론 물질이다. 용어 "나일론"은 모든 장쇄 합성 폴리아미드에 대한 속명이다. 통상, 나일론 명명법은 출발 물질이 C6 디아민 및 C6 이산임을 나타내는, 나일론-6,6(첫 번째 자릿수는 C6 디아민을 나타내고, 두 번째 자릿수는 C6 디카복실산 화합물을 나타낸다)과 같은 일련의 번호를 포함한다. 다른 나일론은 소량의 물의 존재하에 ε-카프롤락탐의 중축합에 의해 제조될 수 있다. 이 반응으로 선형 폴리아미드인 나일론-6(사이클릭 락탐으로부터 제조됨 - 또한 ε-아미노카프로산으로서 공지됨)이 형성된다. 또한, 나일론 공중합체가 시도되었다. 공중합체는 다양한 디아민 화합물, 다양한 이산 화합물 및 다양한 사이클릭 락탐 구조물을 반응 혼합물에 혼합한 다음, 폴리아미드 구조에 랜덤하게 배치되는 단량체성 물질을 갖는 나일론을 형성함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 나일론 6,6-6,10 물질은 헥사메틸렌 디아민과, C6 및 C10 이산 혼합물로부터 제조되는 나일론이다. 나일론 6-6,6-6,10은 ε-아미노카프로산, 헥사메틸렌 디아민 및 C6과 C10 이산 물질의 혼합물을 공중합시켜 제조되는 나일론이다.
블록 공중합체가 또한 본 발명의 공정에 유용하다. 이러한 공중합체를 사용하면, 용매 팽윤제의 선택이 중요하다. 선택된 용매는 블록이 모두 용매에 가용성이 될 수 있도록 한다. 한 예는 메틸렌 클로라이드 용매중 ABA(스티렌-EP-스티렌) 또는 AB(스티렌-EP) 중합체이다. 한 성분이 용매에 가용성이 아닌 경우에, 겔을 형성한다. 이러한 블록 공중합체의 예로는 스티렌/부타디엔 및 스티렌/수소화 부타디엔(에틸렌 프로필렌)을 포함하는 AB 및 ABA 블록 공중합체의 Kraton
Figure 112006039319645-PCT00001
형태, ε-카프롤락탐/에틸렌 옥사이드의 Pebax
Figure 112006039319645-PCT00002
형태, Sympatex
Figure 112006039319645-PCT00003
폴리에스테르/에틸렌 옥사이드 및 에틸렌 옥사이드와 이소시아네이트의 폴리우레탄이 포함된다.
폴리비닐리덴 플루오라이드, 신디오택틱 폴리스티렌, 비닐리덴 플루오라이드와 헥사플루오로프로필렌의 공중합체, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 아세테이트, 무정형 부가 중합체[예: 폴리(아크릴로니트릴) 및, 이와 아크릴산 및 메타크릴레이트와의 공중합체], 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드) 및 이의 다양한 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 및 이의 다양한 공중합체와 같은 부가 중합체는 상대적 용이성으로 인해 용액 방사시킬 수 있는데, 이는 이들이 저압 및 저온에서 가용성이기 때문이다. 그러나, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌과 같은 상당히 결정성인 중합체는 이들이 용액 방사되는 경우에 고온, 고압 용매가 필요하다. 따라서, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌의 용액 방사는 매우 어렵다. 정전기적 용액 방사는 나노 섬유 및 마이크로 섬유의 한 제조 방법이다.
중합체 혼합물, 합금 포맷 또는 가교결합되고 화학적으로 결합된 구조에 둘 이상의 중합체성 물질을 포함하는 중합체성 조성물을 형성하는데 실질적인 이점을 또한 발견하였다. 이러한 중합체 조성물은 중합체 쇄 가요성 또는 쇄 운동성을 개선시키고, 전반적인 분자량을 증가시키며, 중합체성 물질의 네트워크의 형성을 통한 보강을 제공함과 같이 중합체 속성을 변화시켜 물리적 특성을 개선한다고 여겨진다.
본 발명의 한 양태로, 두 개의 관련 중합체 물질은 유용한 특성을 위해 혼합될 수 있다. 예를 들면, 고분자량의 폴리비닐클로라이드는 저분자량의 폴리비닐클로라이드와 혼합할 수 있다. 유사하게, 고분자량 나일론 물질은 저분자량 나일론 물질과 혼합할 수 있다. 또한, 상이한 그룹의 일반적인 중합체성 부류를 혼합할 수 있다. 예를 들면, 고분자량의 스티렌 물질은 저분자량의 고충격성 폴리스티렌과 혼합할 수 있다. 나일론-6 물질은 나일론-6; 6,6; 6,10 공중합체와 같은 나일론 공중합체와 혼합할 수 있다. 또한, 87% 가수분해되는 폴리비닐 알코올과 같이 가수분해도가 낮은 폴리비닐 알코올은 가수분해도가 98 내지 99.9% 및 그 이상인 완전 또는 우수하게 가수분해되는 폴리비닐 알코올과 혼합할 수 있다. 혼합물중 이들 물질 모두는 적절한 가교결합 메카니즘을 사용하여 가교결합시킬 수 있다. 나일론은 아미드 결합에서 질소 원자와 반응성인 가교결합제를 사용하여 가교결합시킬 수 있다. 폴리비닐 알코올 물질은 포름알데히드, 우레아, 멜라민-포름알데히드 수지 및 이의 동족체와 같은 모노알데히드, 붕산 및 다른 무기 화합물, 디알데히드, 이산, 우레탄, 에폭시드 및 다른 공지된 가교결합제와 같은 하이드록시 반응성 물질을 사용하여 가교결합시킬 수 있다. 가교결합 기술은 잘 공지되고 이해되는 현상으로, 이때 가교결합 시약은 반응하여 중합체 쇄 사이에 공유 결합을 형성함으로써 실질적으로 분자량, 내약품성, 전반적인 강도 및 기계적 분해에 대한 내성을 개선시킨다.
전기 방사법은 직경이 통상 약 5 내지 약 1000 ㎚로 상이할 수 있는 나노 섬유 그룹을 생성한다. 본 발명의 바람직한 방법은 중합체의 충전에 영향을 주는 부가 조성물과 혼합된 중합체성 물질을 포함함으로써, 중합체의 전기 방사로 전기 방사된 나노 섬유 그룹이 부가 조성물을 함유하지 않는 중합체 용액을 형성하는 것과 비교하여, 보다 큰 수 또는 %의 가는 섬유를 갖는 나노 섬유 그룹을 생성할 수 있도록 한다. 한 양태로, 중합체 용액은 약 0.25 내지 약 15% w/w 부가 조성물을 포함한다. 다른 양태로, 중합체 용액은 약 1 내지 약 10% w/w 부가 조성물을 포함한다.
가는 섬유는 바람직하게는 직경이 약 5 내지 약 600 ㎚이다. 한 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 50 내지 약 400 ㎚이다. 다른 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 300 ㎚이다. 다른 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 5 내지 약 200 ㎚이다. 다른 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 5 내지 약 100 ㎚이다. 다른 양태로, 가는 섬유는 직경이 약 5 내지 약 50 ㎚이다.
보다 작은 직경을 갖는 나노 섬유는 생체내 세포외 기질에 대한 세포 결합의 특징인, 나노 섬유 및 세포 사이에 다점식 결합을 촉진하는 표면을 제공한다. 바람직하게는, 지질 함유 나노 섬유 그룹의 약 25% 이상이 가는 섬유이다. 한 양태로, 지질 함유 나노 섬유 그룹의 약 30% 이상이 가는 섬유이다. 다른 양태로, 복잡 분산성인 다수의 지질 함유 나노 섬유의 약 40% 이상이 가는 섬유이다. 다른 양태로, 복잡 분산성인 다수의 지질 함유 나노 섬유의 약 50% 이상이 가는 섬유이다. 다른 양태로, 복잡 분산성인 다수의 지질 함유 나노 섬유의 약 60% 이상이 가는 섬유이다. 다른 양태로, 복잡 분산성인 다수의 지질 함유 나노 섬유의 약 70% 이상이 가는 섬유이다.
바람직하게는, 부가 조성물은 비-세포독성이다. 한 양태로, 중합체의 충전에 영향을 주는 부가 조성물은 생체 활성 분자이다. 생체 활성 분자는 지질일 수 있다. 바람직하게는, 지질은 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 이들의 혼합물이다.
부가 조성물은 나노 섬유에 대한 이동 또는 세포 결합을 포함한, 세포의 활성에 영향을 주거나 영향을 주지 않을 수 있다. 한 양태로, 부가 조성물을 포함하는 나노 섬유는 세포의 활성에 영향을 주지 않는다. 바람직하게는, 부가 조성물은 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함한다. 하나 이상의 생체 활성 분자는 지질일 수 있다. 바람직하게는, 지질은 콜레스테롤이다. 다른 양태로, 부가 조성물을 포함하는 나노 섬유는 세포 활성에 영향을 줄 수 있다. 이러한 나노 섬유는 나노 섬유에 대한 세포 이동을 유도하거나, 이에 대한 세포 결합을 개선할 수 있다. 바람직하게는, 부가 조성물은 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함한다. 하나 이상의 생체 활성 분자는 지질일 수 있다. 한 양태로, 지질은 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 이들의 혼합물이다. 다른 양태로, 부가 조성물은 콜레스테롤 및, 성장 인자, 미분화 인자 및/또는 유착 단백질을 포함한 세포 활성에 영향을 주는 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함한다.
중합체 또는 중합체 시스템은 이로써 제한되는 것은 아니지만, 지질 또는 친지성 분자, 섬유상 단백질, 유착 단백질, 성장 인자 및 미분화 인자를 포함한 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상이 생체 활성 분자는 지질을 포함한다. 한 양태로, 지질 분자는 섬유에 대한 세포의 부가 및 결합을 유도하는 신호화 분자로서 작용할 수 있다. 지질 분자는 또한 세포를 증식시키거나 미분화시킬 수 있다. 세포의 유도된 이동 및 치밀한 결합을 촉진하는 생체 활성 분자(예: 지질)를 포함하는 나노 섬유는 상처 회복, 인공 피부 성장, 정맥, 동맥, 힘줄, 인대, 연골, 심장판 기관 배양, 화상 치료 및 뼈 이식을 포함한 용도를 위하여 생체내 또는 생체외 사용될 수 있다. 바람직하게는, 지질은 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린 또는 이들의 혼합물이다.
바람직하게는, 하나 이상의 생체 활성 분자는 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질 및/또는 유착 단백질이다. 바람직하게는, 성장 인자는 VEGF, 골 형태원성 인자 β, EGF, PDGF, NGF, FGF, IGF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다.
본 발명의 중합체 시스템은 셀룰로즈, 폴리비닐, 폴리에스테르, 폴리스티렌 또는 폴리아미드 기판과 접촉시, 기판에 단단히 결합되어 기계적 응력과 관련된 탈적층화 효과를 견딜 수 있기에 충분한 강도로 기판에 부착되도록 하는 부착 특성을 갖는다. 본 발명의 나노 섬유는 근육 및 힘줄을 포함한, 3차원 작용성 조직을 구성하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 중합체 물질은, 예를 들면, 근육 또는 힘줄의 수축과 관련된 기계적 응력을 견디면서, 기판에 결합되어 머물러야 한다. 기판에 대한 나노 섬유의 부착은 섬유가 기판과 접촉되거나, 열 또는 압력에 의해 기판 위에서 섬유의 후처리시 섬유 형성의 용매 효과로부터 발생될 수 있다. 그러나, 중합체 특징은 Tg 위 또는 아래에서 발생되는 중합체와 기판 사이의 접촉인, 수소 결합과 같은 특별한 화학적 상호작용 등의 부착성, 및 부가제를 포함한 중합체 제형의 측정시 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 부착시 용매 또는 스팀에 의해 가소화되는 중합체는 증가된 부착력을 가질 수 있다.
ii. 작용성화된 표면
작용기는 나노 섬유의 외부 표면에서 혼입될 수 있다. 이들 작용성화된 표면은 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 다당류, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 다른 생체 활성 분자를 나노 섬유의 표면에 결합시키기 위하여 반응시킬 수 있다. 한 양태로, 나노 섬유의 작용성화된 표면은 하나 이상의 생체 활성 분자를 결합시키기 위하여 반응시킨다. 바람직하게는, 하나 이상의 생체 활성 분자는 성장 인자, 미분화 인자, 유착 단백질 또는 유착 단백질로부터 유도되는 생체 활성 펩티드이다. 바람직하게는, 성장 인자는 VEGF, 골 형태원성 인자 β, EGF, PDGF, NGF, FGF, IGF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 생체 활성 펩티드는 RGD 펩티드이다.
한 양태로, 작용기는 플라즈마 침착에 의해 나노 섬유의 외부 표면에 침착시킨다. 플라즈마 침착은 나노 섬유 표면에 국소 플라즈마를 생성한다. 그 다음에, 처리된 표면은 반응 챔버에서 기체상 분자(예: 알릴아민 및/또는 알릴 알코올)와 반응시킨다. 다른 양태로, 작용기는 전기방사 공정 도중 나노 섬유의 표면 위로 도입시킨다. 도데실 아민, 도데실 알데히드, 도데실 티올 또는 도데실 알코올을 중합체 용액에 가할 수 있다. 이어서, 중합체 용액은 나노 섬유로 전기 방사하며, 이때 부가된 아민, 알데히드, 설프하이드릴 또는 알코올 잔기의 일부가 각각 나노 섬유의 외부 표면으로 노출된다.
iii. 형광 마커
나노 섬유는 형광 마커를 포함할 수 있다. 형광 마커는, 예를 들면, 나노 섬유의 가시화, 나노 섬유 혼합물중 특정 나노 섬유의 동정, 나노 섬유의 화학적 또는 물리적 특성의 동정 및, 분해되어 본래 이식 부위로부터 먼 다른 영역으로 이동될 수 있는, 조직 공학용으로 유용한 다층 어셈블리를 포함하는, 이식 가능한 나노 섬유 및/또는 나노 섬유를 포함하는 구조물의 분해 및/또는 재분포의 평가를 허용한다. 형광 마커는 광표백 가능하거나, 광표백 가능하지 않을 수 있다. 형광 마커는 pH 민감성 또는 pH 무감성일 수 있다. 바람직하게는, 형광 마커는 비-세포독성이다.
형광 마커는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, Texas Red
Figure 112006039319645-PCT00004
, BIODIPY
Figure 112006039319645-PCT00005
, Oregon Green
Figure 112006039319645-PCT00006
, Alexa Fluor
Figure 112006039319645-PCT00007
, 형광, Cascade Blue
Figure 112006039319645-PCT00008
, Dapoxyl
Figure 112006039319645-PCT00009
, 쿠마린, 로다민, N-메틸-4-하이드라진-7-니트로벤조푸라잔, 단실 에틸렌디아민, 단실 카다베린, 단실 하이드라진 또는 이들의 혼합물을 포함한 유기 염료 형광단을 포함할 수 있다. 이들 및 다른 적합한 유기 염료 형광단에 대한 더 많은 정보는 www-probes-com(Molecular Probes, Eugene, OR)에서 동정할 수 있다. 한 양태로, 형광단은 나노 섬유의 전기 방사 전에 중합체에 가한다. 다른 양태로, 형광단은 나노 섬유 표면에 혼입되는 작용기를 통해 나노 섬유에 콘쥬게이트된다. 다른 양태로, 형광단은 나노 섬유에 결합된 생체 활성 분자에 콘쥬게이트된다.
형광 마커는 콜로이드성 무기 반도체 나노 결정을 포함할 수 있다. 한 양태로, 나노 결정은 CdSe 코어 및 ZnS 캡을 포함한다. 다른 양태로, 나노 결정은 양자 도트를 포함한다. 나노 결정 및 양자 도트에 대한 더 많은 정보는 www-evidenttech-com 및 www-quantumdots-com에서 동정할 수 있다. 나노 결정의 흡수 스펙트라는 자외선에서 가시 스펙트럼의 컷오프로 확장되어 광범위할 수 있다. 방출 스펙트라는 좁을 수 있는데, 바람직하게는 반최대에서 20 내지 40 ㎚의 전 너비가 선택된 나노 결정의 입자 크기의 특성인 파장에 집중된다. 바람직하게는, 나노 결정은 광화학적으로 안정하고/하거나, 비-세포독성이다.
형광 마커는 또한 나노 섬유의 화학적 및/또는 물리적 특성을 동정하는데 사용될 수 있다. 한 양태로, 형광 마커는 나노 섬유의 화학적 또는 물리적 특성에 대해 지정되며, 나노 섬유는 지정된 형광 마커에 의해 표지된다. 이러한 화학적 및 물리적 특성은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 섬유 직경, 생체 활성 분자, 작용기, 섬유의 용해 또는 분해, 나노 섬유를 포함하는 중합체 조성물, 섬유의 소수성 또는 친수성, 나노 섬유를 포함하는 중합체의 용해도, 중합체의 독성, 생체 활성 분자의 독성 또는 이들의 조합을 포함한다. 한 양태로, 생체 활성 분자는 성장 인자, 미분화 인자, 유착 분자 또는 이들의 혼합물이다. 특정 형광 마커에 의한 나노 섬유의 표지화는, 예를 들면, 나노 섬유 혼합물 또는 세포 배열내에서 각각의 섬유 형태의 동정을 허용한다. 나노 섬유는 하나 이상의 형광 마커에 의해 표지되어 나노 섬유의 다중 화학적 및/또는 물리적 특성을 동정할 수 있다.
형광 마커는 생화학적 환경에서의 변화를 측정하기 위하여 생체 활성 형광 프로브를 포함할 수 있다. 한 양태로, 나노 섬유는 마커의 형광 또는 형광 세기가 이온 농도에 따라 좌우되는 형광 마커를 포함할 수 있다. 이러한 이온 감지 원소는 pH 및 칼슘, 나트륨 또는 포스페이트 플럭스를 포함한 이온 농도의 변화를 감지하는데 유용하다. 한 양태로, 형광 마커는 SNARF, SNAFL, 칼슘 그린 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 양태로, 나노 섬유는 다른 분자와의 착화합물화로 이들의 형광 특성을 변화시킬 수 있는 염료를 함유한다.
iv. 적용
개선된 나노 섬유는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 필터용, 컴퓨터 하드 드라이브용 및 약제 용도를 포함한 나노 섬유를 사용하는 많은 공지된 용도에 사용될 수 있다. 개선된 나노 섬유는 세포 배양, 조직 배양 및 조직 공학 용도를 포함한, 다양한 생물학적 적용에 유용하다. 한 적용시, 세포 배양 및 조직 공학을 위한 나노피브릴 구조물은 개선된 나노 섬유를 사용하여 제조할 수 있다. 한 양태로, 나노피브릴 구조물은 하나 이상의 개선된 나노 섬유를 포함하며, 이때 나노피브릴 구조물은 하나 이상의 개선된 나노 섬유의 네트워크에 의해 한정된다. 다른 양태로, 나노피브릴 구조물은 하나 이상의 개선된 나노 섬유 및 기판을 포함하며, 이때 나노피브릴 구조물은 기판 표면에 침착되는 하나 이상의 개선된 나노 섬유 네트워크에 의해 한정된다.
다른 적용시, 세포 배양용 성장 배지는 개선된 나노 섬유를 사용하여 제조할 수 있다. 한 양태로, 성장 배지는 배양 용기로 삽입시키기 위해 적용시킬 수 있는 매트, 로울 또는 시트 형태인 나노 섬유 기질을 포함한다. 다른 양태로, 성장 배지는 배양 용기 표면에 침착되거나, 배양 용기에 섬유상 메쉬로서 부가되는 나노 섬유 기질을 포함한다.
다른 적용시, 개선된 나노 섬유는 세포 또는 조직 배양에 적합한 3차원 구조물 위로 분무 또는 방사될 수 있다. 생성된 3차원 구조물은 연속 성장을 위한 세포 배양 장치로 반송되며, 여기서 전기방사된 섬유 구조물이 세포 성장을 위한 플랫폼으로서 사용된다. 또 다른 적용시, 개선된 나노 섬유는 조직 재생을 위한 주형으로서 작용하도록 3차원 기질의 층상 구조를 위한 부직 메쉬 및/또는 브레이드로 전기방사할 수 있다. 다른 적용시, 개선된 나노 섬유는 세포 반응의 감지를 위한 보다 높은 신호를 제공하는 세포/웰의 수를 증가시키기 위하여 높은 생산성의 약제 분석 및 약제 감도 분석시 세포 배지로서 사용될 수 있다. 또 다른 적용시, 개선된 나노 섬유는 높은 생산성의 약제 분석, 약제 감도 분석 및 다른 치료학적 계획에서 세포 배지로서 사용될 수 있으며, 이때 나노 섬유는 세포가 생체외 환경에 세포의 생체내 특성을 보다 근접하게 모의하도록 하는 환경을 제공한다.
B. 나노피브릴 구조물
본 발명의 다른 측면은 나노피브릴 구조물이다. 나노피브릴 구조물은 하나 이상의 나노 섬유를 포함하는 살아있는 세포의 성장을 위한 환경을 포함하며, 이때 나노피브릴 구조물은 하나 이상의 나노 섬유의 네트워크에 의해 한정된다. 어떤 양태에 있어서, 나노피브릴 구조물은 나노피브릴 구조물이 기판 표면에 침착된 하나 이상의 나노 섬유의 네트워크에 의해 한정되는 기판을 포함한다. 나노피브릴 구조물의 나노토포그래피는 단층 또는 다층 세포 배양시 동형 또는 이형 세포 성장 및/또는 세포 미분화의 촉진을 위해 보다 조직 유사한 외층을 제공하도록 조작될 수 있다.
i. 나노 섬유 네트워크
나노피브릴 구조물을 포함하는 나노 섬유는 개선된 나노 섬유에 대해 상기 기술한 바와 같은 중합체 또는 중합체 시스템을 포함할 수 있다. 한 양태로, 나노 섬유는 생체내 사람용으로 적합한 중합체로부터 제조된다. 나노 섬유는 바람직한 전기방사 기술을 포함한, 많은 기술에 의해 제조될 수 있다. 중합체 선택 및/또는 나노 섬유가 제조되고/되거나 기판으로 향하여 배향되는 공정은 나노 섬유 네트워크의 물리적 특성의 특정 선택 및 조작을 허용한다. 섬유 크기, 섬유 직경, 섬유 공간, 기질 밀도, 섬유 조직 및 탄성을 포함한, 성장 표면의 물리적 특성은 세포의 세포골격 네트워크 및 세포외 기질 단백질중 세포 신호화 모티브의 노출을 조직화하기 위해 중요하게 고려해야 하는 것으로 설명되고 있다(참조: Meiners, S. and Mercado, M.L., 2003, Mol. Neurobiol., 27(2), 177-196). 원하는 파라미터로 조작될 수 있는 나노 섬유 네트워크의 물리적 특성에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 조직, 주름, 접착성, 다공성, 경도, 탄성, 기하, 상호 결합성, 표면 대 용적비, 섬유 크기, 섬유 직경, 섬유 용해도/불용성, 친수성/소수성 및 피브릴 밀도가 포함된다.
나노피브릴 구조물의 하나 이상의 물리적 특성은 세포 성장 및/또는 미분화를 위해 특히 한정된 환경을 생성하기 위하여 변화되고/되거나 개질될 수 있다. 예를 들면, 나노피브릴 구조물의 다공성은 이온, 대사물질 및/또는 생체 활성 분자의 확산을 개선하고/하거나, 세포와 나노 섬유 네트워크 사이에 다점식 결합을 촉진하는 환경에서 성장하도록 세포가 나노피브릴 구조물을 침투하여 스며들 수 있도록 조작될 수 있다. 나노피브릴 구조물의 나노 섬유 네트워크의 상호 결합성은 세포-세포 접촉을 용이하게 하도록 조작될 수 있다. 나노피브릴 구조물의 나노 섬유 네트워크의 탄성은 나노 섬유가 제조되는 중합체 용액에 생체 활성 분자를 가함으로써 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 한 양태로, 생체 활성 분자는 지질이다. 다른 양태로, 지질은 콜레스테롤이다.
나노피브릴 구조물의 조직 및 주름은 세포의 결합을 촉진하도록 조작될 수 있다. 균질하거나 불균질한 나노 섬유 조성물은 세포의 성장 또는 미분화 활성을 최적화하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 나노피브릴 구조물은 상이한 직경의 다중 나노 섬유 및/또는 상이한 중합체로부터 제조되는 다중 나노 섬유로 구성될 수 있다. 나노 섬유 네트워크중 나노 섬유의 용해도 또는 불용성은 나노피브릴 구조물로부터 생체 활성 분자의 방출을 조절하도록 조작될 수 있다. 한 양태로, 생체 활성 분자의 방출 속도는 나노 섬유 네트워크중 나노 섬유의 생분해 또는 생체 용해 속도에 의해 결정된다. 나노피브릴 구조물중 나노 섬유 네트워크의 소수성 및 친수성은 특정한 세포 공간을 촉진하도록 조작될 수 있다. 나노피브릴 구조물의 경도는 세포 성장 및/또는 미분화를 촉진하도록 조작될 수 있다. 한 양태로, 나노피브릴 구조물은 약 3 내지 약 70%의 경도를 갖는다. 다른 양태로, 나노피브릴 구조물은 약 3 내지 약 50%의 경도를 갖는다. 다른 양태로, 나노피브릴 구조물은 약 3 내지 약 30%의 경도를 갖는다. 다른 양태로, 나노피브릴 구조물은 약 3 내지 약 10%의 경도를 갖는다. 다른 양태로, 나노피브릴 구조물은 약 3 내지 약 5%의 경도를 갖는다. 다른 양태로, 나노피브릴 구조물은 약 10 내지 약 30%의 경도를 갖는다.
전기방사 공정은 중합체의 형성 및 침착을 조절하기 위하여 전기장을 사용한다. 중합체 용액은 전위에 따라 주입한다. 전위는 니들과 같은 방출체의 팁으로부터 중합체 용액 스트림의 방출을 유도하는 전하 불균형을 생성한다. 전기장내에서 중합체 젯은 용매가 증발되어 섬유를 형성하는 그 동안 접지 기판을 향하도록 한다. 생성된 단일 연속 필라멘트는 기판 위에 부직포로서 수거한다.
랜덤하게 또는 지시된 배향을 갖는 전기방사된 나노 섬유 네트워크를 생성할 수 있다. 도 1A 및 1B에 제시된 바와 같이, 랜덤 섬유는 층상 표면으로 조립할 수 있다. 한 양태로, 본 발명의 나노 섬유는 연동 네트워크를 형성하도록 결합될 수 있는 미세 섬유의 랜덤 분포를 포함한다. 나노섬유 연동 네트워크는 섬유 사이에 비교적 작은 공간을 갖는다. 이러한 공간은 섬유 사이에 통상 약 0.01 내지 약 25 μ, 바람직하게는 약 2 내지 약 10 μ의 범위이다. 이러한 공간은 나노 섬유 네트워크에 기공 또는 채널을 형성하여, 이온, 대사물질, 단백질 및/또는 생체 활성 분자의 확산을 허용하고/하거나, 세포가 네트워크를 침투하고 스며들어, 세포와 나노 섬유 사이에 다점식 결합을 촉진하는 환경에서 성장될 수 있도록 한다.
도 1C에 제시된 바와 같이, 나노 섬유 네트워크는 배향 방식으로 전기방사될 수 있다. 이렇게 배향된 전기방사는 단층 나노 섬유 또는 연속 나노 섬유에 의해 형성되는 단층을 포함하는 나노 섬유 네트워크의 제조를 허용하며, 이때 네트워크의 높이는 단일 나노 섬유의 직경이다. 단층 네트워크의 다공성, 경도, 피브릴 밀도, 조직, 주름 및 섬유 배향을 포함한 물리적 특성은 전기방사 공정 도중 기판 위로 나노 섬유의 유도 및/또는 배향을 조절함으로써 선택할 수 있다. 바람직하게는, 기공 크기는 세포가 단층 나노 섬유 네트워크를 통해 침투되고/되거나 이동할 수 있도록 한다. 한 양태로, 섬유 사이 공간은 약 0.01 내지 약 25 μ이다. 다른 양태로, 섬유 사이 공간은 약 2 내지 약 10 μ이다.
개개 단층 네트워크의 층상화는 나노피브릴 구조물에 채널을 형성하여, 이온, 대사물질, 단백질 및/또는 생체 활성 분자의 확산을 허용하고, 세포가 나노피브릴 구조물을 침투하여, 세포와 나노 섬유 네트워크 사이에 다점식 결합을 촉진하는 환경에서 성장될 수 있도록 한다.
상 분리 기술이 또한 나노피브릴 구조물을 제조하는데 사용될 수 있다. 상 분리 공정은 통상 중합체 용해, 상 분리 및 젤라틴, 물을 사용한 겔로부터의 용매 추출, 동결에 이어지는, 진공하에 동결 건조를 포함한다. 통상의 방법은 다음과 같이 사용될 수 있다: 중합체는 용액 약 1 내지 15%(wt/v)를 제조하기 위하여 부가되는 용매(예: THF)에 가한다. 용액은 균일해 질 때 까지 교반한다. 중합체 용액(50 ℃로 미리 가온함)을 테플론 바이알로 가한다. 그 다음에, 중합체 용액을 함유하는 바이알을 신속히 겔로 냉각시킨다. 겔-시간은 온도, 용매 및 중합체 농도에 따라 좌우된다. 겔은 120분 이상 동안 온도를 유지한다. 겔은 이어서 2일 동안 용매 교환을 위해 증류수에 침지시킨다. 용매 교환에 이어서, 겔을 물로부터 제거하고, 필터 페이퍼로 건조시켜, -18 ℃에서 동결시킨다. 그 다음에, 동결된 겔은 0.5 mmHg 미만의 진공하에 1주 동안 약 -10 ℃인 동결 건조 용기로 옮긴다. 건조된 스캐폴드는 이어서 건조기에 유지한다.
나노피브릴 구조물을 포함하는 나노 섬유는 개선된 나노 섬유에 대해 상기 기술한 바와 같은 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함할 수 있다. 생체 활성 분자는 네트워크의 제조 도중 나노 섬유 네트워크로 혼입시키거나, 작용기를 통해 네트워크 표면에 결합시킬 수 있다. 한 양태로, 나노 섬유가 제조되는 중합체 또는 중합체 시스템은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 지질, 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질 및 유착 단백질을 포함하는 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함할 수 있다. 지질은 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린 또는 이들의 혼합물이다. 바람직하게는, 성장 인자는 VEGF, 골 형태원성 인자 β, EGF, PDGF, NGF, FGF, IGF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다.
작용기를 개선된 나노 섬유에 대해 기술한 바와 같이 네트워크의 표면으로 혼입시킬 수 있다. 네트워크의 작용성화된 표면은 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 다당류, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 다른 생체 활성 분자를 네트워크 표면에 결합되도록 반응시킬 수 있다. 한 양태로, 네트워크의 작용성화된 표면 하나 이상의 생체 활성 분자를 결합하도록 반응시킨다. 바람직하게는, 하나 이상의 생체 활성 분자는 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질 및/또는 유착 단백질이다. 바람직하게는, 성장 인자는 VEGF, 골 형태원성 인자 β, EGF, PDGF, NGF, FGF, IGF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다.
ii. 기판
강도 및 가요성과 같은 나노피브릴 구조물의 구조적 특성이 나노 섬유 네트워크가 침착되는 기판에 의해 큰 부분으로 제공된다. 기판은 셀룰로즈, 유리 또는 플라스틱을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 플라스틱은 비-세포독성이다. 기판은 필름 또는 배양 용기일 수 있다. 바람직하게는, 필름의 두께는 약 10 내지 약 1000 μ 이하이다.
기판은 수용성이거나 수불용성일 수 있다. 수용성인 기판은 바람직하게는 폴리비닐 알코올 필름이고, 폴리비닐 알코올 섬유 기질과 함께 사용될 수 있다. 기판은 다공성이거나 비다공성일 수 있다. 기판의 다공성은 세포 침투에 의해 측정한다. 세포는 다공성 기판을 침투할 수 있지만, 비다공성 기판은 침투할 수 없다. 바람직하게는, 다공성 기판중 기공의 직경은 약 2 내지 약 10 ㎛이다. 기판은 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능할 수 있다. 바람직하게는, 기판은 생체 적합성이다.
기판은 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함할 수 있다. 생체 활성 분자는 기판의 제조 도중 기판으로 혼입되거나, 작용기를 통해 기판의 표면에 결합될 수 있다. 작용기는 개선된 나노 섬유에 대해 기술한 바와 같이 기판의 표면 위로 혼입시킬 수 있다. 기판의 작용성화된 표면은 펩티드, 탄수화물, 다당류, 지질, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 다른 생체 활성 분자를 기판의 표면에 결합되도록 반응시킬 수 있다.
한 양태로, 기판의 작용성화된 표면은 하나 이상의 생체 활성 분자를 결합하도록 반응시킨다. 바람직하게는, 하나 이상의 생체 활성 분자는 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질 및/또는 유착 단백질이다. 바람직하게는, 성장 인자는 VEGF, 골 형태원성 인자 β, EGF, PDGF, NGF, FGF, IGF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다. 기판은 하나 이상의 생체 활성 분자를 방출할 수 있다. 방출 속도는 기판의 용해 및/또는 분해 속도에 의해 결정한다.
iii. 스페이서
강도 및 가요성과 같은 나노피브릴 구조물의 구조적 특성은 스페이서에 의해 또한 제공될 수 있다. 스페이서는 또한 나노 섬유 네트워크와 기판 사이에 충분한 분리를 또는 둘 이상의 나노피브릴 구조물 사이에 충분한 분리를 제공하여 세포가 나노 섬유를 침투하여 결합될 수 있도록 할 수 있다.
한 양태로, 스페이서는 제1 및 제2 표면을 포함하며, 이때 스페이서의 제1 표면은 기판 위에 침착된 나노 섬유 네트워크의 표면과 접하며, 스페이서의 제2 표면은 기판 표면과 접하여, 나노 섬유 네트워크 및 기판이 스페이서의 직경 또는 두께에 의해 분리될 수 있도록 한다. 다른 양태로, 스페이서는 제1 및 제2 표면을 포함하며, 이때 스페이서의 제1 표면은 제1 나노피브릴 구조물의 표면과 접하며, 스페이서의 제2 표면은 제2 나노피브릴 구조물의 표면과 접하여, 두 나노피브릴 구조물이 스페이서의 직경 또는 두께에 의해 분리될 수 있도록 한다.
스페이서는 미세 섬유 또는 필름을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 필름은 두께가 약 10 내지 약 50 μ이하이다. 미세 섬유는 마이크로 섬유를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 마이크로 섬유는 직경이 약 1 내지 약 10 μ이다. 마이크로 섬유는 부직 또는 네트일 수 있다. 마이크로 섬유는 셀룰로즈, 폴리아미드, 폴리에스테르 및 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함하는 많은 중합체로부터 제조될 수 있다.
스페이서는 수용성이거나 수불용성일 수 있다. 스페이서는 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 스페이서의 다공성은 세포 침투에 의해 결정된다. 세포는 다공성 스페이서를 침투할 수 있지만, 비다공성 스페이서는 침투할 수 없다. 바람직하게는, 다공성 스페이서의 기공은 직경이 약 2 내지 약 10 ㎛이다. 스페이서는 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능할 수 있다. 바람직하게는, 스페이서는 생체 적합성이다.
스페이서는 하나 이상의 생체 활성 분자를 포함할 수 있다. 생체 활성 분자는 스페이서의 제조 도중 스페이서로 혼입되거나, 작용기를 통해 스페이서의 표면에 결합될 수 있다. 작용기는 개선된 나노 섬유에 대해 기술한 바와 같이 스페이서의 표면 위로 혼입시킬 수 있다. 스페이서의 작용성화된 표면은 펩티드, 탄수화물, 다당류, 지질, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 다른 생체 활성 분자를 기판의 표면에 결합되도록 반응시킬 수 있다.
한 양태로, 스페이서의 작용성화된 표면은 하나 이상의 생체 활성 분자를 결합하도록 반응시킨다. 바람직하게는, 하나 이상의 생체 활성 분자는 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질 및/또는 유착 단백질이다. 바람직하게는, 성장 인자는 VEGF, 골 형태원성 인자 β, EGF, PDGF, NGF, FGF, IGF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다. 바람직하게는, 미분화 인자는 뉴로트로핀, CSF 또는 TGF이다. 스페이서는 하나 이상의 생체 활성 분자를 방출할 수 있다. 방출 속도는 기판의 용해 및/또는 분해 속도에 의해 결정한다.
iii. 나노피브릴 구조물의 다층 어셈블리
본 발명의 나노피브릴 구조물은 세포 배양 및 조직 배양 용도, 약제 전달을 위한 높은 생산성의 용도 및 여과 용도를 포함한, 다양한 적용에 사용될 수 있다. 한 적용시, 나노피브릴 구조물은 단독으로 또는 층상으로 사용되어 세포 또는 조직 배양을 위한 다층 나노피브릴 어셈블리를 형성할 수 있다. 나노피브릴 구조물은 상처 회복, 인공 피부 성장, 정맥, 동맥, 힘줄, 인대, 연골, 심장판, 기관 배양, 화상 치료 및 뼈 이식을 포함한 많은 생체내 및 생체외 용도를 갖는다.
세포 또는 조직을 위한 성장 환경의 상이한 배열은 개개 나노피브릴 구조물을 포함하는 나노 섬유 네트워크, 기판 및/또는 스페이서로 특정 화학적 및 물리적 특성을 조작하고/하거나, 이어서 개개 나노피브릴 구조물을 층상화시켜 제조할 수 있다. 이로써 제한되는 것은 아니지만, 조직, 주름, 접착성, 다공성, 경도, 탄성, 기하, 상호 결합성, 표면 대 용적비, 섬유 직경, 섬유 용해도/불용성, 친수성/소수성, 피브릴 밀도 및 섬유 배향을 포함한 개개 나노피브릴 구조물의 물리적 특성 및/또는 특징은 성장 및/또는 미분화를 포함한, 하나 이상의 선택된 세포 활성을 촉진시키는 나노- 및/또는 마이크로-환경을 구성하도록 변화되고/되거나 개질될 수 있다. 특정한 나노- 및/또는 마이크로-환경은 개개 나노피브릴 구조물내에서 또는 둘 이상의 층상 나노피브릴 구조물을 포함하는 세포 배열에서 조작될 수 있다.
이로써 제한되는 것은 아니지만, 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질, 유착 단백질, 당단백질, 작용기, 유착성 화합물, 탈유착성 화합물 및 표적 분자를 포함한 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 다당류와 같은 특정한 인식 모티브는 등방성적으로 또는 구배로서 나노피브릴 네트워크, 기판 및/또는 개개 나노피브릴 구조물의 스페이서로 조작되어 세포 성장 및/또는 미분화를 포함한, 적절한 세포 활성을 촉진시킬 수 있다. 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한 양태는 특정 크기 및 복합성의 특정 형태의 분자 뿐만 아니라, 이러한 분자의 조합을 포함할 수 있다. 그 예로, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 구조 단백질, 효소 및 펩티드 호르몬이 포함된다.
많은 형태의 세포는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 줄기 세포, 개입된 줄기 세포, 미분화 세포 및 종양 세포를 포함한, 나노피브릴 구조물 상에서 성장할 수 있다. 줄기 세포의 예로는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 배아 줄기 세포, 골수 줄기 세포 및 제대가 포함된다. 다양한 양태에 사용되는 세포의 다른 예로는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 골아세포, 근아세포, 신경아세포, 섬유아세포, 신경 교아세포, 세균 세포, 간세포, 연골 세포, 각질 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 결합 조직 세포, 신경교 세포, 상피 세포, 내피 세포, 호르몬-분비 세포, 면역 시스템의 세포 및 뉴론이 포함된다. 어떤 양태에 있어서, 사용할 줄기 세포의 형태를 미리 선택할 필요는 없는데, 이는 개개 나노피브릴 구조물 또는 다층 어셈블리를 제시된 기관으로 전달함으로써 개개 나노피브릴 구조물 또는 다층 나노피브릴 어셈블리의 물리적 및/또는 화학적 특성을 조작하여 많은 형태의 줄기 세포가 기관 특이적 패턴으로 미분화하도록 유도할 수 있기 때문이다. 예를 들면, 줄기 세포는 적절한 미분화 및/또는 성장 인자를 나노피브릴 구조물로 조작하거나, 줄기 세포를 포함하는 나노피브릴 구조물을 간으로 이식시켜 간세포가 되도록 유도할 수 있다. 나노피브릴 구조물중 세포는 세포 씨딩(cell seeding)을 제공하고, 특정 화합물을 생성하거나, 이 둘 모두를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 유용한 세포는 생체내 배양되거나, 천연 공급원으로부터 유도되거나, 유전학적으로 조작되거나, 다른 방법에 의해 생성할 수 있다. 전핵 또는 진핵 세포의 천연 공급원이 사용될 수 있다. 나노피브릴 구조물이 유기체에 이식되는 양태는 수용자로부터의 세포, 비특이적 공급자 또는 상이한 그룹으로부터의 공급자로부터의 세포, 또는 세균이나 미생물 세포를 사용할 수 있다. 공급원으로부터 획득하여 사용 전에 배양된 세포가 포함된다.
일부 양태는 종양 세포와 같은 이형 또는 비정상 세포를 사용한다. 세포가 성장하는, 성장 및 미분화 인자를 포함하는 나노피브릴 구조물의 물리적 및/또는 화학적 특성은 종양의 본래 생체내 나노- 또는 마이크로-환경을 모의하도록 조작할 수 있다. 나노피브릴 구조물에서 배양된 종양 세포는 약제 처리 평가를 위한 신체의 본래 종양 환경의 보다 정확한 표현을 제공할 수 있다. 본 발명의 나노피브릴 구조물 상의 종양 세포 성장은 특히 종양을 표적으로 하는 약제 개발을 허용할 수 있는 생체내-유사 환경에서, 유전자 발현, 수용체 발현 및 폴리펩티드 생성을 포함한, 종양의 생화학적 경로 및 활동의 특성화를 용이하게 한다.
일부 양태는 유전학적으로 조작된 세포를 사용한다. 조작은 세포가 하나 이상의 유전자를 발현하도록 프로그래밍하거나, 하나 이상의 유전자 발현을 억제하거나, 이 둘 모두를 포함한다. 본 발명에 유용한 유전학적으로 조작된 세포의 한 예는 하나 이상의 원하는 생체 활성 분자를 제조하여 분비하는 유전학적으로 조작된 세포이다. 유전학적으로 조작된 세포를 포함하는 나노피브릴 구조물이 유기체로 이식되는 경우에, 생성된 분자는 국소 효과 또는 전체 효과를 생성할 수 있고, 가능한 물질과 같이 상기 동정된 분자를 포함할 수 있다. 세포는 또한 나노피브릴 구조물의 목적중 하나가 면역 반응을 생성하는 양태에서 항원 물질을 생성할 수 있다. 세포는 하기의 비-함축적 목적 리스트를 돕기 위한 물질을 생성할 수 있다: 염증의 억제 또는 촉진; 치유를 용이하게함; 면역-거부를 견딤; 호르몬 대체를 제공; 신경 전달 물질을 대체; 암 세포의 억제 또는 파괴; 세포 성장 촉진; 혈관의 형성을 억제하거나 촉진함; 조직 강화 및 피부, 활액, 힘줄, 연골, 인대, 뼈, 근육, 기관, 경막, 혈관, 골수 및 세포외 기질을 보충하거나 대체함.
유전 공학은, 예를 들면, 세포에 유전 물질을 가하거나 이로부터 제거하고, 존재하는 유전 물질을 변화시키거나, 이 둘 모두를 하는 단계를 포함할 수 있다. 세포가 형질감염되거나 달리 조작되어 유전자를 발현하는 양태는 간헐적으로 또는 영구적으로 형질감염된 유전자나, 이 둘 모두를 사용할 수 있다. 유전자 서열은 전 길이이거나, 부분 길이이거나, 클론화되거나, 천연으로 존재할 수 있다.
한 양태로, 살아있는 세포는 나노피브릴 구조물에 침착된다. 특별한 세포 또는 조직의 세포 활성을 촉진하는 나노- 및/또는 마이크로-환경은 나노 섬유 네트워크의 선택된 물리적 및/또는 화학적 특성을 변화시키고/시키거나, 개질시킴으로써 나노피브릴 구조물로 조작할 수 있다. 물리적 및/또는 화학적 특성은 상기 기술한 바와 같이 개개 나노피브릴 구조물로 조작될 수 있다. 세포를 포함하는 나노피브릴 구조물은 성장 및/또는 미분화를 포함한, 세포 활성을 촉진하는 조건하에 배양한다.
다른 양태로, 둘 이상의 나노피브릴 구조물은 층상화되어 다층 나노피브릴 어셈블리를 형성한다. 특별한 세포 또는 조직의 세포 활성을 촉진하는 나노- 및/또는 마이크로-환경은 물리적 및/또는 화학적 특성을 선택한 나노피브릴 구조물을 층상화시켜 구성할 수 있다. 물리적 및/또는 화학적 특성은 상기 기술한 바와 같이 개개 나노피브릴 구조물로 조작할 수 있다. 살아있는 세포는 다층 나노피브릴 어셈블리에 침착시키며, 어셈블리는 침착된 세포의 성장 및/또는 미분화를 촉진하는 조건하에 배양한다.
다른 양태에 있어서, 다중 세포 형태는 상이한 배양 조건하에 개개 나노피브릴 구조물에서 배양한 다음, 멸균 상태하에 수동으로 또는 기계적으로, 층층으로 특정 다층 나노피브릴 어셈블리로 조합한다. 특별한 세포 형태의 세포 활성을 촉진하는 나노- 및/또는 마이크로-환경은 나노피브릴 구조물의 선택된 물리적 및/또는 화학적 특성을 변화시키고/시키거나 개질시켜 개개 나노피브릴 구조물내에서, 또는 원하는 나노- 또는 마이크로-환경을 수득하기 위하여 개개 나노피브릴 구조물을 선택적으로 층상화하여 어셈블리내에서 조작할 수 있다. 물리적 및/또는 화학적 특징은 상기 기술한 바와 같이 조작할 수 있다. 이어서, 다층 나노피브릴 어셈블리는 세포 성장 및/또는 미분화를 포함한, 세포 활성을 촉진하는 상태하에 배양한다.
다른 양태로, 다중 세포 형태는 상이한 배양 조건하에 개개 나노피브릴 구조물 상에서 배양한다. 개개 나노피브릴 구조물의 물리적 및 화학적 특성은 특별한 세포 형태에 대해 맞출 수 있다. 나노피브릴 구조물의 기판 및/또는 스페이서는 배양 도중 생체 활성 분자의 서방출을 허용할 수 있도록 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능하다. 생체 활성 분자는 성장 및/또는 미분화를 포함한, 원하는 세포 활성을 촉진하도록 선택된다. 그 다음에, 개개 나노피브릴 구조물은 멸균 상태하에 수동으로 또는 기계적으로, 층층으로 다층 나노피브릴 어셈블리로 조합한다. 다층 어셈블리는 성장 및/또는 미분화를 포함한, 원하는 세포 활성을 촉진하는 나노- 및/또는 마이크로-환경을 생성하도록 층상화할 수 있다. 선택된 생체 활성 분자를 포함하는 생분해 가능하고/하거나, 생체 용해 가능한 스페이서를 어셈블리를 포함하는 층상 나노피브릴 구조물 사이에 삽입시켜, 어셈블리내에 나노- 및/또는 마이크로-환경을 미세하게 조절할 수 있다. 스페이서로부터 생체 활성 분자의 방출 속도는 스페이서를 포함하는 중합체의 생분해 및/또는 생체 용해 속도에 의해 결정할 수 있다. 이어서, 조합된 세포 배열은 세포 증식 및/또는 미분화를 포함한, 세포 활성을 촉진하는 조건하에 배양한다.
다른 양태로, 나노피브릴 구조물은 개별적으로 포장하여 멸균시킨다. 포장을 제거한 후에, 나노피브릴 구조물은 배양 용기에서 수동으로 또는 기계적으로, 층층으로 조합하여 다층 나노피브릴 어셈블리를 형성할 수 있다.
본 발명의 나노피브릴 구조물 및 다층 나노피브릴 어셈블리와 같은, 생체내 적용시 새로운 물질의 신체내 분해 및 잠재적 재분포를 평가해야 한다. 신체내에 특정 분위로 이식되는 물질은 분해된 다음, 본래 삽입 부위로부터 먼 다른 영역으로 이동될 수 있다. 신체내에서 나노 섬유의 분해 특성을 검사하기 위하여, 다층 어셈블리의 개개 나노피브릴 구조물을 포함하는 나노 섬유 네트워크, 기판 및/또는 스페이서를 개선된 나노 섬유에 대해 상기 기술한 바와 같이 형광 마커로 표지할 수 있다. 한 양태에서, 형광 마커는 양자 도트이다. 양자 도트는 자기 공명 영상화에 대해 형광이고 불투명하기 때문에, 다중 양성자 형광 현미경 기술(분리된 조직의 검사를 위해) 및 MRI(생체내 분석을 위해)가, 어셈블리의 분해 생성물이 신체내 상이한 조직 또는 부위로 혼입되는 경우에 중요한 외래 신체 반응을 나타내든지 간에, 조직내에서 다층 나노피브릴 어셈블리의 단편 또는 분해 생성물을 함유하는 양자 도트의 분포를 감지하고 추적하기 위하여 사용될 수 있다.
iv. 부가 용도
다른 적용에 있어서, 본 발명의 나노피브릴 구조물은 약제/세포 상호작용을 분석하기 위하여 높은 생산성의 적용시 사용될 수 있다. 높은 생산성의 적용은 새로운 약제의 발견을 위한 가치있는 접근이다. 높은 생산성의 적용은 밀도가 약 1536 웰/플레이트 이하인 다중 웰 조직 배양 챔버를 이용한다. 웰당 세포 그룹의 증가는 측정되는 신호를 증가시키기 위해 사용된다. 한 양태로, 나노피브릴 구조물을 웰로 삽입할 수 있다. 다른 양태로, 웰 표면은 나노 섬유 네트워크가 웰 표면으로 직접 침착될 수 있도록 하는 기판으로서 작용할 수 있다. 이러한 나노피브릴 구조물을 웰로 도입하면 광학적 측정을 수행하는 능력에 영향을 주지않고, 세포, 리간드 및/또는 효소 결합을 위한 부가의 표면을 제공한다.
다른 적용시, 나노피브릴 구조물은 정제 및/또는 분리 적용시 사용될 수 있다. 개개 나노피브릴 구조물은 층상화하여 크로마토그래피 칼럼을 형성할 수 있다. 크기, 전하, 소수성 및 다른 분자에 대한 친화성을 포함한 물리적 및/또는 화학적 특성은, 예를 들면, 용액으로부터 단백질을 분리하기 위하여 활용할 수 있다. 한 양태로, 개개 나노피브릴 구조물은 층상화하여 친화성 칼럼을 형성할 수 있다. 예를 들면, 특정 작용기, 특정 수용체를 포함한 폴리펩티드 또는 면역 글로블린을 포함한 물리적 및/또는 화학적 특성은 용액으로부터 특정 폴리펩티드를 선택적으로 결합시키기 위하여 나노피브릴 구조물로 조작하거나, 이에 결합시킬 수 있다. 용액은 다층 나노피브릴 어셈블리를 통해 통과시켜 폴리펩티드를 기질에 결합시킬 수 있다. 결합된 폴리펩티드는 용매를 사용하여 어셈블리로부터 방출시킬 수 있다. 다른 양태로, 개개 나노피브릴 구조물은 층상화하여 여과 칼럼을 형성할 수 있다. 예를 들면, 다공성 및 피브릴 밀도를 포함하는 물리적 특성은 다층 나노피브릴 어셈블리로 조작하여 이들의 크기에 따라 용액으로부터 폴리펩티드가 분리될 수 있도록 한다. 다른 양태로, 개개 나노피브릴 구조물은 층상화하여 이온 교환 칼럼을 형성할 수 있다. 예를 들면, 음 및/또는 양으로 하전된 작용기를 포함한 화학적 특성은 나노피브릴 구조물로 조작하거나, 이에 결합시킬 수 있다.
다른 적용시, 본 발명의 구조물은 생체 반응기를 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
C. 세포 성장 배지
본 발명의 다른 측면은 세포 성장 배지이다. 세포 성장 배지는 기질, 매트, 네트워크, 시트 또는 로울을 포함할 수 있다. 한 양태로, 배지는 나노 섬유의 기질을 포함한다. 나노 섬유는 개선된 나노 섬유에 대해 상기 기술한 바와 같은 중합체 또는 중합체 시스템으로부터 제조할 수 있다. 세포 성장 배지는 배양 용기 표면 위에 또는 배양 용기 내에 침착시킬 수 있다.
성장 배지는 배양 용기에 사용하기에 바람직한 치수로 제조할 수 있다. 한 양태로, 세포 성장 배지는 네트워크의 섬유 직경이 약 50 내지 약 1000 ㎚이고, 평균 섬유간 공간은 약 2 μ 이상이며, 기질 경도는 약 30% 이하인 나노섬유 기질, 및 외벽의 높이가 약 10 μ 내지 약 100 ㎜이고, 상부 및 기저의 면적은 독립적으로 약 5 내지 약 4 x 105 mm2인 외벽이 있는 상부와 기저를 포함한다. 성장 배지는 성장 배지를 포함하는 시트, 로울, 기질, 네트워크 또는 매트를 규격화하도록 절단하거나, 성장 배지를 포함하는 기질, 시트, 로울, 네트워크 또는 매트로부터 원하는 치수를 갖도록 조각을 절단하여 배양 용기에 사용하도록 선택된 치수로 규격화하거나, 재규격화할 수 있다. 다른 양태로, 세포 성장 배지는 나노 섬유의 네트워크를 포함하며, 이때 네트워크 치수는 배양 용기로 삽입하기 위해 조절한다.
세포 성장 배지는 세포 배양 및 조직 배양 적용을 포함한, 다양한 적용에 사용될 수 있다. 상기 기술된 세포는 세포 성장 배지에서 성장시킬 수 있다. 한 양태로, 세포 성장 배지는 개별적으로 포장하여 멸균시킨다. 포장의 제거후, 배지는 배양 용기로 넣고 세포 성장을 위한 표면을 형성할 수 있다. 다른 양태로, 세포 성장 배지는 배양 용기 안쪽 표면 위에 침착된다. 세포 성장 기질을 포함하는 배양 용기는 개별적으로 포장하여 멸균시킬 수 있다. 포장의 제거후, 세포는 배양 용기내에서 세포 성장 배지 위에 침착시킬 수 있다. 세포 성장 배지에서 성장한 세포는 상처 치유, 인공 피부 성장, 정맥, 동맥, 힘줄, 인대, 연골, 심장판, 기관 배양, 화상 치료 및 뼈 이식을 포함한 많은 생체내 및 생체외 용도를 갖는다.
이로써 제한되는 것은 아니지만, 조직, 주름, 접착성, 다공성, 경도, 탄성, 기하 및 피브릴 밀도를 포함한 세포 성장 배지의 물리적 특성 및/또는 특징은 성장 및/또는 미분화를 포함한, 바람직한 세포 활성을 촉진시키도록 변화되고/되거나 개질될 수 있다. 특정한 나노- 및/또는 마이크로-환경은 세포 성장 배지내에서 조작될 수 있다. 예를 들면, 세포 성장 배지의 다공성 및 피브릴 밀도는 세포가 세포 성장 배지를 침투하여 3차원 환경에서 성장하도록 변화되고/되거나 개질될 수 있다. 세포 성장 배지의 물리적 특성은 개선된 나노 섬유 및/또는 나노피브릴 구조에 대해 상기 기술한 바와 같이 조작할 수 있다.
이로써 제한되는 것은 아니지만, 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질, 유착 단백질, 당단백질, 작용기, 유착성 화합물, 탈유착성 화합물 및 표적 분자를 포함한 펩티드, 지질, 탄수화물, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 다당류와 같은 특정한 인식 모티브는 등방성적으로 또는 구배로서 세포 성장 배지로 조작되어 세포 성장 및/또는 미분화를 포함한, 원하는 세포 활성을 촉진시킬 수 있다. 세포 성장 배지의 화학적 특성은 개선된 나노 섬유 및/또는 나노피브릴 구조물에 대해 상기 기술한 바와 같이 조작할 수 있다.
다른 적용시, 본 발명의 세포 성장 배지는 약제/세포 상호작용을 분석하기 위하여 높은 생산성의 적용시 사용될 수 있다. 높은 생산성 적용은 밀도가 약 1536 웰/플레이트 이하인 다중 웰 조직 배양 챔버를 이용한다. 웰당 세포 그룹의 증가는 측정되는 신호를 증가시키기 위해 사용된다. 한 양태로, 세포 성장 배지를 분석용으로 사용되는 조직 배양 챔버의 웰로 삽입할 수 있다. 다른 양태로, 웰 표면은 나노 섬유 네트워크 또는 기질이 웰 표면으로 직접 침착될 수 있도록 하는 세포 성장 배지를 위한 기판으로서 작용할 수 있다. 이렇게 성장한 세포를 웰로 도입하면 광학적 측정을 수행하는 능력에 영향을 주지않고, 세포, 리간드 및/또는 효소 결합을 위한 부가의 표면을 제공한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 기술되며, 이는 양태를 예시화하기 위해 사용된다. 그러나, 많은 변화 및 양태가 기술된 발명에 대해 행해질 수 있다. 실시예는 어떠한 방법으로든 본 발명을 제한하고자 하지 않는다.
실시예 1
지질을 포함하는 중합체 용액의 전기방사로 개선된 가는 섬유 그룹이 생성된다
광학 현미경을 사용하여 중합체 용액에 지질을 부가하면서 관련된 섬유 직경의 변화를 가시화하기 위하여, 섬유를 전기방사하여 마이크로 섬유를 수득한다. 마이크로 섬유는 각각 0, 0.25, 0.5, 1.0 및 1-%의 콜레스테롤(w/w)(Sigma, St. Louis, MO)로 보충된 클로로포름중 15% 폴리(ε-카프롤락톤)(w/w)을 포함하는 용 액(Dow Tone Polymers, Midland, MI)으로부터 전기방사한다. 섬유는 모세관 니들 시스템을 사용하여 전기방사한다. 이펜도르프 마이크로피펫 팁(황색)으로 5 ㏄ 시린지로 피펫팅한다. 중합체 용액을 시린지로 붓고, 나노세칸드 옵티칼 펄스 래디에이터(Nanosecond Optical Pulse Radiator) 모델 NR-1(Potitron, Inc., Torrance, CA)에 연결된 양극 전극을 용액으로 삽입한다. 전기방사 전압은 18,000 V이다. 섬유는 시린지에 평면 수직으로 방사되는 접지 금속판 표적 위로 전기방사한다. 표적은 마이크로피펫의 팁으로부터 2 inch 떨어져 있다. 섬유를 표적 위에 위치한 오버헤드 트랜스페런시에 수거한다. 섬유는 20X 대물렌즈가 있는 광현미경(Insight Bilateral Scanning Confocal Fluorescene Microscope(Meridian Instruments, Okemos, MI)으로 관찰하고, 상을 CCD 카메라로 디지탈로 얻는다.
도 2A 내지 2E에 제시된 바와 같이, 중합체 용액에 대한 콜레스테롤의 부가로 점진적으로 더 작은 직경을 갖는 섬유를 생성한다. 중합체 용액에 부가되는 콜레스테롤의 양을 증가시키면 점진적으로 보다 작은 직경을 갖는 섬유가 생성된다. 콜레스테롤을 함유하지 않는 중합체 용액으로부터 생성된 섬유는 직경이 10 내지 50 μ의 범위이다(도 2A). 0.25% 콜레스테롤(w/w)을 포함하는 중합체 용액으로부터 생성된 섬유는 직경이 5 내지 30 μ의 범위이다(도 2B). 0.5% 콜레스테롤(w/w)을 포함하는 중합체 용액으로부터 생성된 섬유는 직경이 2 내지 20 μ의 범위이다(도 2C). 1.0% 콜레스테롤(w/w)을 포함하는 중합체 용액으로부터 생성된 섬유는 직경이 1 내지 15 μ의 범위이다(도 1D). 10% 콜레스테롤(w/w)을 포함하는 중합체 용액으로부터 생성된 섬유는 직경이 0.8 내지 8 μ이다(도 2E).
실시예 2
지질을 포함하는 나노 섬유는 나노 섬유에 대한 세포의 치밀한 결합을 유도한다
지질을 포함하는 나노 섬유는 세포와 나노 섬유 사이에 세포 복귀 및 치밀한 결합을 촉진하는 표면을 제공한다. 정상적인 신장 래트(NRK) 섬유아세포는 37 ℃에서 5% CO2중 둘벡코 개질 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle's Medium; DME)중 0.25% 스핑코미엘린으로 보충된 클로로포름중 10% 폴리(ε-카프롤락톤)(w/w)을 포함하는 용액으로부터 전기방사된 나노 섬유에서 배양시키고, 20X 대물렌즈가 있는 광현미경으로 가시화한다(Insight Bilateral Scanning Confocal Fluorescene Microscope(Meridian Instruments, Okemos, MI). 상은 CCD 카메라로 포착한다.
도 3A 및 3B에 제시된 바와 같이, 0.25% 스핑고미엘린을 포함하는 나노 섬유는 세포의 신속한 보충 및 나노 섬유에 대한 이들의 결합을 유도한다. 도 3A는 0.25% 스핑고미엘린을 포함하는 나노 섬유로 피복된 조직 배양 플레이트에서 2일간 배양시킨 후에 NRK 섬유아세포를 나타낸 것이다. 섬유아세포는 나노 섬유에 치밀하게 결합되며, 섬유 사이에 스페이서를 채우기 위해 퍼지고 분할하여 단층을 형성한다. 도 3B는 스핑고미엘린을 함유하지 않는 나노 섬유로 피복된 조직 배양 플레이트에서 2일간 배양시킨 후에 NRK 섬유아세포를 나타낸 것이다. 소수의 세포가 나노 섬유에 결합된다. 지질 함유 나노 섬유의 유도된 이동 및 치밀한 결합 특성은 섬유가 상처 치유, 인공 피부 성장, 정맥, 동맥, 힘줄, 인대, 연골, 심장판, 기 관 배양, 화상 치료 및 뼈 이식을 포함한 생체내 또는 생체외 용도에 유용할 수 있음을 제시하는 것이다.
실시예 3
나노 섬유 네트워크에서 성장한 세포는 조직내 세포와 유사한 악틴 네트워크를 갖는다
세포의 악틴 네트워크는 세포 배양법이 조직내 환경과 가장 근사하게 근접하는 지를 동정하기 위한 마커로서 이용될 수 있다(Cukierman et al., 2001, Science, 23:1708-1712; Walpita and Hay, 2002, Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 3; 137-141). 2차원 조직 배양액에서 성장시키는 경우에, 섬유아세포는 상당히 퍼지고 유착되는 형태가 예상되며, 이때 세포질내에 위치한 악틴 네트워크는 두꺼운 응력 섬유의 배열로 조직화된다. 대조적으로, 조직에서 관찰되는 섬유아세포는 공간이 스핀들-형이며, 악틴은 표층 환으로 조직화된다(Walpita and Hay, 2002, Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 3:137-141).
2차원 및 3차원 표면에서 성장시킨 정상적인 래트 신장(NRK) 섬유아세포의 악틴 네트워크를 비교하였다. 섬유아세포는 폴리아미드 나노 섬유 네트워크, 유리 및 폴리리신으로 피복시킨 유리에서 성장시킨다. 폴리아미드 나노 섬유는 회전식 방출기 시스템 또는 모세관 니들 시스템을 사용하여 방사한다. 두 시스템은 모두 실질적으로 동일한 섬유상 물질을 생성한다. 유량은 방출기당 1.5 mil/min이고, 표적 거리는 8 inch이며, 방출기 전압은 88 kV이고, 상대 습도는 45%이며, 회전식 방출기의 경우에는 rpm이 35이다.
악틴 네트워크의 형성은 NRK 섬유아세포에 의해 나타나는 녹색 형광 단백질(GFP)-악틴 키메라의 분포를 영상화하여 모니터한다. 간단히, GFP-악틴으로 형질감염된 NRK 섬유아세포(gift from Dr. Sanford Simon, Laboratory of Cellular Biophysics, Rockefeller University, New York, NY)는 폴리아미드 나노 섬유, 유리, 또는 37 ℃에서 5% CO2중 둘벡코 개질 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle's Medium; DME)중의 폴리 1-리신으로 피복시킨 유리 위에서 배양한 다음, 인사이트 바이래터럴 스캐닝 공촛점 형광 현미경(Insight Bilateral Scanning Confocal Fluorescene Microscope(Meridian Instruments, Okemos, MI))을 사용하여 검사한다.
도 4A 내지 4C에 제시된 바와 같이, 나노 섬유 네트워크의 3차원 성장 환경에서 성장시킨 세포는 생체내에서 관찰되는 것과 유사한 세포골격 네트워크를 조직한다. 나노 섬유 네트워크에서 성장시킨 섬유아세포는 필리포디아(filipodia)가 있는 보다 스피들 형의 형태를 나타내며, 몇몇 응력 섬유를 나타낸다(도 4A). 대조적으로, 유리 표면에서 성장시킨 섬유아세포는 많은 응력 섬유와 함께 퍼진다(도 4B). 폴리 1-리신 피복된 유리 표면에서 성장시킨 섬유아세포는 보다 잘 퍼지고, 보다 두껍고 보다 심오한 응력 섬유를 나타낸다(도 4C).
이들 마이크로그래프는 또한 공촛점 현미경이, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 조직, 주름, 접착성, 다공성, 탄성, 기하 및 피브릴 밀도를 포함한 섬유 네트 워크의 물리적 특성 및, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질, 유착 단백질, 당단백질, 작용기, 유착성 화합물, 탈유착성 화합물 및 표적 분자를 포함한 섬유 네트워크의 화학적 특성을 포함하는 다양한 섬유 조작의 기능으로서 살아있는 세포 또는 조직에서 세포골격 네트워크의 조직화시 차이를 모니터하는 신속한 방법을 제공한다고 제시하고 있다. 나노 섬유 네트워크에서 배양되는 세포 또는 조직의 세포골격 네트워크와 생체내 관찰과의 비교로 나노 섬유 네트워크의 물리적 및/또는 화학적 특성을 세포 또는 조직의 생체내 환경에 보다 근사하게 모의하도록 미세하게 조절가능하게 한다.
실시예 4
나노섬유로 작용기의 혼입
작용기(예: 알코올, 알데히드, 아미노, 카복시 및 설프하이드릴 작용기) 및 광활성화 가능한 작용기(예: 카벤 또는 니트렌)를 나노 섬유 표면 위로 혼입시킬 수 있다. 이들 그룹은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 폴리펩티드(예: 성장 인자 또는 미분화 인자), 탄수화물, 지질, 다당류 또는 치료학적 약제를 포함한 생체 활성 분자에 공유결합하는데 사용될 수 있다. 작용기는 작용기를 중합체 용액에 가하여 나노 섬유로 혼입시킬 수 있다. 나노 섬유는 실시예 1에 기술된 바와 같이 2% 도데실아민(w/w)(Sigma, St. Louis, MO)으로 보충된 클로로포름중 10% 폴리(ε-카프롤락톤)(w/w)을 포함하는 용액(Dow Tone Polymers, Midland, MI)으로부터 전기방사한다. 나노 섬유 표면에 개질 가능한 아민의 유용성을 설명하기 위하여, 나노 섬유는 pH 8.5에서 2.0% 인산나트륨 완충액중 형광 이소티오시아네이트(물중 1 ㎎/㎖ 스톡 용액)(Sigma, St. Louis, MO)와 반응시킨다. 섬유로 형광체의 혼입은 인사이트 바이래터럴 스캐닝 공촛점 형광 현미경(Insight Bilateral Scanning Confocal Fluorescene Microscope(Meridian Instruments, Okemos, MI))을 사용하여 검사한다. 도 5A에 제시된 바와 같이, 낮은 수준의 형광이 섬유 표면 위로 흡착된 반응하지 않은 형광 이소티오시아네이트의 결과인 개질되지 않은 섬유 표면에서 관찰된다. 대조적으로, 혼입된 아미노 그룹을 함유하는 나노 섬유에는, 상당한 형광이 형광 이소티오시아네이트와의 반응에 이어지는 전체 섬유를 따라 관찰된다(도 5B).
이 데이터는 나노 섬유의 개질된 표면이 생체 활성 분자와 결합될 수 있는 작용기를 함유하여 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질, 유착 단백질, 당단백질, 작용기, 유착성 화합물, 탈유착성 화합물 및 표적 분자와 같은 분자의 관습화된 혼입을 허용함으로써 성장 및/또는 미분화를 포함한, 세포 또는 조직에 하나 이상의 선택된 활성을 촉진하는 나노 섬유 네트워크내에 나노- 및/또는 마이크로-환경을 생성할 수 있음을 나타내고 있다. 이 데이터는 또한 특정 공간 및 기하학적 배열이 상이한 작용기를 포함하는 나노 섬유가 적절한 반응성 그룹을 갖는 펩티드를 도입시켜 펩티드 유도체화된 섬유의 기하학적으로 한정된 배열로 자체-조합되도록 유도될 수 있음을 제시하고 있다.
실시예 5
양자 도트에 의한 미세 섬유 표지화
상이한 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는 섬유를 제조하고, 여전히 혼합물 또는 세포 배열내에 섬유의 각 형태를 동정하기 위한 능력을 유지하면서 나노 섬유 혼합물 또는 특정 세포 배열로 이들을 혼입시키기 위하여, 본 발명자는 형광 표지물을 나노 섬유로 혼입시키는 것을 연구하였다. 양자 도트 1% 용액(gift from Dr. Sanford Simon, Laboratory of Cellular Biophysics, Rockefeller University, New York, NY)을 클로로포름중 12% 폴리(ε-카프롤락톤)(w/w)을 포함하는 중합체 용액에 가한다. 그 다음에, 용액을 실시예 1에 기술된 바와 같이 전기방사하여, 양자 도트를 함유하는 마이크로 섬유 그룹을 생성한다. 섬유는 488 ㎚에서 여기되고, 마이크로 섬유 내에 양자 도트 분포의 상은 인사이트 바이래터럴 스캐닝 공촛점 형광 현미경(Insight Bilateral Scanning Confocal Fluorescene Microscope(Meridian Instruments, Okemos, MI))을 사용하여 수거한다(도 6).
양자 도트의 형광은 수성 환경에서 없어진다. 마이크로 섬유에 물의 부가로 양자 도트의 형광은 사라지지 않으며, 이는 양자 도트가 수성 시스템에서 이들의 용도를 위해 중요하게 고려되는 점인, 섬유의 표면에 흡수되기 보다는 섬유 기질내에 혼입됨을 나타내는 것이다.
상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 설명을 제공한다. 그러나, 많은 변화 및 양태들이 기술된 발명에 행해질 수 있다. 본 발명은 이후 첨부되는 청구의 범위에 포함된다.

Claims (135)

  1. 하나 이상의 나노 섬유 및 기판을 포함하는 세포 배양중 세포의 증식 및/또는 미분화를 위한 환경을 포함하고, 하나 이상의 나노 섬유 네트워크에 의해 한정되는 나노피브릴 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 섬유 직경이 약 50 내지 1000 ㎚이고, 평균 섬유간 공간이 약 2 μ 이상이며, 경도가 약 70% 이하인 나노피브릴 구조물.
  3. 제2항에 있어서, 경도가 약 50% 이하인 나노피브릴 구조물.
  4. 제2항에 있어서, 경도가 약 30% 이하인 나노피브릴 구조물.
  5. 제2항에 있어서, 경도가 약 10% 이하인 나노피브릴 구조물.
  6. 제2항에 있어서, 경도가 약 5% 이하인 나노피브릴 구조물.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 나노 섬유 네트워크가 기판 표면 위에 침착되는 나노피브릴 구조물.
  8. 제7항에 있어서, 기판이 다공성 플라스틱 기판인 나노피브릴 구조물.
  9. 제7항에 있어서, 기판이 비-세포독성인 나노피브릴 구조물.
  10. 제7항에 있어서, 기판이 필름인 나노피브릴 구조물.
  11. 제10항에 있어서, 섬유 직경이 약 50 내지 1000 ㎚이고, 평균 섬유간 공간이 약 2 μ 이상이며, 경도가 약 70% 이하인 나노피브릴 구조물.
  12. 제11항에 있어서, 경도가 약 50% 이하인 나노피브릴 구조물.
  13. 제11항에 있어서, 경도가 약 30% 이하인 나노피브릴 구조물.
  14. 제11항에 있어서, 경도가 약 10% 이하인 나노피브릴 구조물.
  15. 제11항에 있어서, 경도가 약 5% 이하인 나노피브릴 구조물.
  16. 제11항에 있어서, 필름이 수용성인 나노피브릴 구조물.
  17. 제11항에 있어서, 필름이 수불용성인 나노피브릴 구조물.
  18. 제16항에 있어서, 필름이 폴리비닐 알코올 필름인 나노피브릴 구조물.
  19. 제11항에 있어서, 필름이 생분해 가능한 나노피브릴 구조물.
  20. 제11항에 있어서, 필름이 생체 적합성인 나노피브릴 구조물.
  21. 제7항에 있어서, 기판이 비-다공성 유리 기판인 나노피브릴 구조물.
  22. 제11항에 있어서, 필름이 다공성인 나노피브릴 구조물.
  23. 제11항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 나노피브릴 구조물.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자가 혈관 내피 성장 인자, 골 형태원성 인자 β, 상피 성장 인자, 내피 성장 인자, 혈소판-유도 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린 성장 인자 또는 형질전환 성장 인자인 나노피브릴 구조물.
  25. 제23항에 있어서, 성장 인자를 방출하는 나노피브릴 구조물.
  26. 제25항에 있어서, 방출 속도가 필름 또는 섬유의 용해 또는 분해 속도에 의해 결정되는 나노피브릴 구조물.
  27. 제11항에 있어서, 하나 이상의 미분화 인자를 포함하는 나노피브릴 구조물.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 미분화 인자가 뉴로트로핀, 콜로니 촉진 인자 또는 형질전환 성장 인자인 나노피브릴 구조물.
  29. 제27항에 있어서, 필름 또는 섬유가 미분화 인자를 방출하는 나노피브릴 구조물.
  30. 제29항에 있어서, 방출 속도가 필름 또는 섬유의 용해 또는 분해 속도에 의해 결정되는 나노피브릴 구조물.
  31. 제1항에 있어서, 나노 섬유가 비-세포독성 중합체를 포함하는 나노피브릴 구조물.
  32. 제31항에 있어서, 중합체가 생분해 가능한 나노피브릴 구조물.
  33. 제31항에 있어서, 중합체가 수용성인 나노피브릴 구조물.
  34. 제31항에 있어서, 중합체가 수불용성인 나노피브릴 구조물.
  35. 제31항에 있어서, 중합체가 폴리에스테르인 나노피브릴 구조물.
  36. 제35항에 있어서, 폴리에스테르가 폴리 ε-카프롤락톤, 폴리글리콜레이트 또는 폴리락테이트인 나노피브릴 구조물.
  37. 제31항에 있어서, 중합체가 폴리아미드인 나노피브릴 구조물.
  38. 제37항에 있어서, 폴리아미드가 나일론인 나노피브릴 구조물.
  39. 제31항에 있어서, 나노 섬유가 하나 이상의 생체 활성 분자를 추가로 포함하는 나노피브릴 구조물.
  40. 제39항에 있어서, 하나 이상의 생체 활성 분자가 지질, 탄수화물, 다당류, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 하이브리드 분자인 나노피브릴 구조물.
  41. 제40항에 있어서, 지질이 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘 린, 콜레스테롤 또는 이들의 혼합물인 나노피브릴 구조물.
  42. 제40항에 있어서, 다당류가 셀룰로즈, 전분, 알긴산, 키토산 또는 히알루로난인 나노피브릴 구조물.
  43. 제31항에 있어서, 나노 섬유가 나노 섬유에 대한 세포의 결합을 촉진하는 생물학적 화합물을 추가로 포함하는 나노피브릴 구조물.
  44. 제31항에 있어서, 나노 섬유가 하나 이상의 알코올, 알데히드, 아민, 카복시, 설프하이드릴 또는 광활성화 가능한 작용기를 추가로 포함하는 나노피브릴 구조물.
  45. 제44항에 있어서, 광활성화 가능한 그룹이 카벤 또는 니트렌인 나노피브릴 구조물.
  46. 제1항에 있어서, 나노 섬유가 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 나노피브릴 구조물.
  47. 제46항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자가 혈관 내피 성장 인자, 골 형태원성 인자 β, 상피 성장 인자, 내피 성장 인자, 혈소판-유도 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린 성장 인자 또는 형질전환 성장 인자인 나노피브릴 구조물.
  48. 제46항에 있어서, 나노 섬유가 하나 이상의 성장 인자를 방출하는 나노피브릴 구조물.
  49. 제48항에 있어서, 성장 인자의 방출 속도가 나노피브릴 구조물의 분해 또는 용해 속도에 의해 결정되는 나노피브릴 구조물.
  50. 제1항에 있어서, 나노 섬유가 하나 이상의 미분화 인자를 포함하는 나노피브릴 구조물.
  51. 제50항에 있어서, 하나 이상의 미분화 인자가 뉴로트로핀, 콜로니 촉진 인자 또는 형질전환 성장 인자인 나노피브릴 구조물.
  52. 제50항에 있어서, 나노 섬유가 하나 이상의 미분화 인자를 방출하는 나노피브릴 구조물.
  53. 제50항에 있어서, 미분화 인자의 방출 속도가 나노피브릴 구조물의 분해 또는 용해 속도에 의해 결정되는 나노피브릴 구조물.
  54. 제1항에 있어서, 배양 용기로 삽입하기 위해 조정된 너비 및 깊이를 포함하는 나노피브릴 구조물.
  55. 제54항에 있어서, 나노피브릴 구조물의 너비 및 깊이가 배양 플레이트중 웰로 삽입하기 위해 조정되는 나노피브릴 구조물.
  56. 제54항에 있어서, 배양 용기가 단일 웰 배양 플레이트, 다중 웰 배양 플레이트, 챔버 배양 슬라이드, 다중-챔버 배양 슬라이드, 커버슬립, 컵, 플라스크, 튜브, 병, 관류 챔버, 발효기 및 생체 반응기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 나노피브릴 구조물.
  57. 제1항의 나노피브릴 구조물을 포함하는 조직 배양 용기.
  58. 제57항에 있어서, 단일 웰 배양 플레이트, 다중 웰 배양 플레이트, 챔버 배양 슬라이드, 다중-챔버 배양 슬라이드, 커버슬립, 컵, 플라스크, 튜브, 병, 관류 챔버, 발효기 및 생체 반응기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조직 배양 용기.
  59. 중합체 및 생체 활성 분자를 포함하며, 세포 배양시 살아있는 세포의 성장을 위한 환경을 포함하고, 콜라겐, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 난수용성 약제학적 화합물 또는 이들의 혼합물은 실질적으로 포함하지 않는 나노피브릴 구조물.
  60. 하나 이상의 나노 섬유의 네트워크를 전기방사하는 단계를 포함하는, 제1항에 따르는 나노피브릴 구조물의 제조 방법.
  61. 기판 표면 위로 하나 이상의 나노 섬유의 네트워크를 전기방사하는 단계를 포함하는, 제7항에 따르는 나노피브릴 구조물의 제조 방법.
  62. a) 제1항에 따르는 둘 이상의 나노피브릴 구조물을 층상화시켜 세포 배양시 살아있는 세포의 성장을 위한 환경을 포함하는 다층 나노피브릴 어셈블리를 형성하고,
    b) 살아있는 세포를 어셈블리 위로 침착시키고,
    c) 침착된 세포의 성장 및/또는 미분화를 촉진하는 조건하에 어셈블리를 배양하는 단계를 포함하는, 조직의 제조 방법.
  63. 제62항에 있어서, 층상 나노피브릴 구조물이 스페이서에 의해 분리되는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 스페이서가 마이크로 섬유, 부직물 또는 네트를 포함하는 방법.
  65. 제63항에 있어서, 스페이서가 다공성 필름을 포함하는 방법.
  66. 제64항에 있어서, 마이크로 섬유가 셀룰로즈, 전분, 폴리아미드, 폴리에스테르 또는 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함하는 방법.
  67. 제62항에 있어서, 개개 나노피브릴 구조물이 하나 이상의 성장 인자, 유착성 화합물 및/또는 표적 화합물을 포함하는 방법.
  68. a) 각각 특정 세포 형태를 함유하는 제1항에 따르는 개개 나노피브릴 구조물 상에서 다수의 세포를 배양하고,
    b) 둘 이상의 개개 나노피브릴 구조물을 층상화시켜 다층 세포 배열을 형성하며,
    c) 세포의 증식 및/또는 미분화를 촉진하는 조건하에 배열을 배양시키는 단계를 포함하는, 조직의 제조 방법.
  69. 제68항에 있어서, 층상 나노피브릴 구조물이 스페이서에 의해 분리되는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 스페이서가 마이크로 섬유, 부직물 또는 네트를 포함하는 방법.
  71. 제69항에 있어서, 스페이서가 다공성 필름을 포함하는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 마이크로 섬유가 셀룰로즈, 전분, 폴리아미드, 폴리에스테르 또는 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함하는 방법.
  73. 제68항에 있어서, 개개 나노피브릴 구조물이 하나 이상의 성장 인자, 유착성 화합물, 탈유착성 화합물 및/또는 표적 화합물을 포함하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 각각의 개개 나노피브릴 구조물의 성장 인자, 유착성 화합물, 탈유착성 화합물 및/또는 표적 화합물이 특정 세포 형태의 성장 및/또는 미분화를 촉진하도록 선택되는 방법.
  75. 지질을 포함하는 전기방사 섬유.
  76. 제75항에 있어서, 지질이 친지성 화합물, 인지질 화합물, 스핑고 지질 화합물 또는 이들의 혼합물인 전기방사 섬유.
  77. 제76항에 있어서, 지질이 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘 린, 콜레스테롤 또는 이들의 혼합물인 전기방사 섬유.
  78. 제76항에 있어서, 비-세포독성 중합체를 추가로 포함하는 전기방사 섬유.
  79. 제78항에 있어서, 중합체가 생분해 가능한 전기방사 섬유.
  80. 제78항에 있어서, 중합체가 수용성인 전기방사 섬유.
  81. 제78항에 있어서, 중합체가 수불용성인 전기방사 섬유.
  82. 제78항에 있어서, 중합체가 폴리에스테르인 전기방사 섬유.
  83. 제82항에 있어서, 폴리에스테르가 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(글리콜레이트) 또는 폴리(락테이트)인 전기방사 섬유.
  84. 제78항에 있어서, 중합체가 폴리아미드인 전기방사 섬유.
  85. 제84항에 있어서, 폴리아미드가 나일론인 전기방사 섬유.
  86. 제75항에 있어서, 나노 크기의 무기 충전제를 추가로 포함하는 전기방사 섬 유.
  87. 제75항에 있어서, 섬유의 직경이 약 50 내지 약 1000 ㎚인 전기방사 섬유.
  88. 제87항에 있어서, 섬유의 직경이 약 300 ㎚인 전기방사 섬유.
  89. 제75항에 있어서, 섬유가 하나 이상의 생체 활성 분자를 추가로 포함하는 전기방사 섬유.
  90. 제89항에 있어서, 하나 이상의 생체 활성 분자가 지질, 탄수화물, 다당류, 아미노산, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 하이브리드 분자인 전기방사 섬유.
  91. 제90항에 있어서, 지질이 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 콜레스테롤 또는 이들의 혼합물인 전기방사 섬유.
  92. 제90항에 있어서, 다당류가 셀룰로즈, 전분, 글리코겐, 알긴산, 키토산 또는 히알루로난인 전기방사 섬유.
  93. 제75항에 있어서, 섬유가 섬유에 대한 세포의 결합을 촉진하는 생물학적 화 합물을 추가로 포함하는 전기방사 섬유.
  94. 제75항에 있어서, 섬유가 하나 이상의 알데히드, 알코올, 아민, 설프하이드릴 또는 광활성화 가능한 작용기를 추가로 포함하는 전기방사 섬유.
  95. 제94항에 있어서, 광활성화 가능한 그룹이 카벤 또는 니트렌인 전기방사 섬유.
  96. 제75항에 있어서, 섬유가 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 전기방사 섬유.
  97. 제96항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자가 혈관 내피 성장 인자, 골 형태원성 인자 β, 상피 성장 인자, 내피 성장 인자, 혈소판-유도 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린 성장 인자 또는 형질전환 성장 인자인 전기방사 섬유.
  98. 제75항에 있어서, 섬유가 하나 이상의 미분화 인자를 포함하는 전기방사 섬유.
  99. 제98항에 있어서, 하나 이상의 미분화 인자 뉴로트로핀, 콜로니 촉진 인자 또는 형질전환 성장 인자인 전기방사 섬유.
  100. 제75항에 있어서, 섬유가 하나 이상의 유착성 분자를 포함하는 전기방사 섬유.
  101. 제100항에 있어서, 하나 이상의 유착성 분자가 피브로넥틴 또는 라미닌이거나, 이들 거대분자로부터 유도된 유착성 펩티드인 전기방사 섬유.
  102. 친지성 분자 및 중합체를 전기방사하는 단계를 포함하는, 제75항에 따르는 전기방사 섬유의 제조 방법.
  103. 중합체 및 중합체의 충전에 영향을 주는 부가 조성물을 포함하는 용액을 전기방사하는 단계를 포함하고, 이때 본 방법에 의해 제조된 다수의 나노 섬유가 부가 조성물을 함유하지 않는 중합체 용액으로부터 제조된 다수의 나노 섬유에 비하여 가는 섬유의 %가 더 많은, 다수의 나노 섬유의 제조 방법.
  104. 제103항에 있어서, 가는 섬유의 직경이 약 5 내지 약 1000 ㎚인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 가는 섬유의 직경이 약 50 내지 약 400 ㎚인 방법.
  106. 제104항에 있어서, 가는 섬유의 직경이 약 5 내지 약 50 ㎚인 방법.
  107. 제103항에 있어서, 부가 조성물이 지질을 포함하는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 지질이 콜레스테롤인 방법.
  109. 중합체 및 부가 조성물을 포함하는 용액을 전기방사하는 단계를 포함하는, 탄성이 변화된 나노 섬유의 제조 방법.
  110. 제109항에 있어서, 부가 조성물이 가교결합제를 포함하는 방법.
  111. 제109항에 있어서, 부가 조성물이 지질을 포함하는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 지질이 콜레스테롤인 방법.
  113. 섬유 직경이 약 50 내지 약 1000 μ이고, 평균 섬유간 공간이 약 2 μ 이상이며, 기질 경도가 약 30%인 나노섬유 기질을 포함하며, 여기서 기질이, 외벽의 높이가 약 10 μ 내지 약 100 ㎜이고, 상부 및 기저의 면적이 독립적으로 약 5 내지 약 4 x 105 mm2인 외벽이 있는 상부와 기저를 갖는 세포 성장 배지.
  114. 제113항에 있어서, 배양 용기 및 배지.
  115. 제113항에 있어서, 외벽의 높이 및 상부와 기저의 면적이 배양 웰의 치수대로 조정되는 배양 웰 및 배지.
  116. 나노 섬유 네트워크를 포함하는 세포 성장 배지.
  117. 제116항에 있어서, 배양 용기로 삽입하기 위해 조정되는 배지.
  118. 형광 마커를 포함하는 전기처리된 섬유.
  119. 제118항에 있어서, 지질을 추가로 포함하는 전기처리된 섬유.
  120. 제119항에 있어서, 지질이 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 콜레스테롤 또는 이들의 혼합물인 전기처리된 섬유.
  121. 제118항에 있어서, 형광 마커가 비-광표백성인 섬유.
  122. 제121항에 있어서, 형광 마커가 나노 결정인 섬유.
  123. 제122항에 있어서, 나노 결정이 양자 도트인 섬유.
  124. 제118항에 있어서, 형광 마커가 형광단인 섬유.
  125. 제118항에 있어서, 형광 마커가 pH 무감성인 섬유.
  126. 제118항에 있어서, 형광 마커가 이온 민감성인 섬유.
  127. 제118항에 있어서, 형광 마커가 다른 분자와의 착화합물화에 대해 민감성인 나노 섬유.
  128. 제118항에 있어서, 나노 섬유의 자체 형광성을 감소시키는 광학 부가제를 추가로 포함하는 나노 섬유.
  129. 나노 섬유를 형광 마커에 의해 표지하는 단계를 포함하는, 나노 섬유의 동정 방법.
  130. a) 형광 마커를 나노 섬유의 화학적 특성 또는 물리적 특성에 지정하고,
    b) 나노 섬유를 형광 마커에 의해 표지하는 단계를 포함하는, 나노 섬유의 화학적 특성 또는 물리적 특성의 동정 방법.
  131. 제130항에 있어서, 물리적 특성이 직경인 방법.
  132. 제130항에 있어서, 화학적 특성이 생체 활성 분자인 방법.
  133. 제132항에 있어서, 생체 활성 분자가 성장 인자, 미분화 인자, 섬유상 단백질, 유착 단백질 또는 이들의 혼합물인 방법.
  134. 다층 어셈블리를 형성하기 위하여 층상화되는 둘 이상의 제1항에 따르는 나노피브릴 구조물을 포함하는, 다층 나노피브릴 어셈블리.
  135. 제134항에 있어서, 두께가 있는 스페이서와, 제1 및 제2 표면을 추가로 포함하며, 이때 스페이서의 제1 표면이 제1 나노피브릴 구조물의 표면과 접하고, 스페이서의 제2 표면이 제2 나노피브릴 구조물의 표면과 접하여, 제1 및 제2 나노피브릴 구조물이 스페이서의 두께에 의해 분리되도록 하는 다층 나노피브릴 어셈블리.
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