CN110665066B - 一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种等离子体表面接枝神经生长因子的纳米纤维的制备方法，包括(1)将一定量壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；(2)采用纺丝液进行静电纺丝，得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；(3)将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化；(4)取小鼠肿瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并用DNA酶消化后得到激活因子；(5)活化的纳米纤维浸泡在含有神经生长因子和激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干。这种纳米纤维是一种能够诱导神经损伤部的再生的医疗用材料，可以用于制造神经再生组件，能够促进神经元的生长。

Description

一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，尤其涉及一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法。
背景技术
针对由外伤或肿瘤切除等引起的神经损伤的治疗，经常采取将已切断的神经彼此直接缝合的神经缝合、或者采集患者自身的健康神经并将其移植到损伤部的自体神经移植等方法。然而，在直接缝合神经的方法中，有时会施加张力而残留知觉异常或疼痛，自体神经移植则存在以下问题：牺牲了健康部位的神经，并且，神经采集部有时会出现疼痛或麻木等。
从1980年代初期开始，人们尝试着使用生物相容性材料连接末梢神经的断裂部位以使神经再生，对于直线状的神经缺损部，存在着几种用于神经再生的器具。但是由于神经细胞的特殊性，尤其是神经元生长与增殖的营养条件非常苛刻，所以一直以来无法高效实现周围神经组织再生。
很多研究都发现，包括前列腺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和皮肤癌的肿瘤中，都能观察到新生神经纤维(神经元的轴突延伸)、神经纤维的渗透和扩展。这个过程有点儿类似肿瘤组织旁的血管，往肿瘤里面长毛细血管。而这些长进来的神经纤维，会释放一些神经信号，促进肿瘤的生长和转移。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，本发明制备方法大大提高了神经生长因子与纤维的结合率，负载量更大，制得的神经再生纳米纤维能够更好地促进神经元生长及神经损伤后的再生。
为解决上述问题，本发明提供了一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
S1：将壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
S2：采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
S3：将所述壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后进行等离子处理活化得到活化纳米纤维；
S4：取小鼠肿瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并用DNA酶进行消化反应，得到激活因子；
S5：将所述活化纳米纤维浸泡在含有神经生长因子和所述激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干，得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
优选的，步骤S1中，所述壳聚糖的粘均分子量为5.0×105，脱乙酰度为80～85％；所述聚氧化乙烯的平均分子量为1.0×106；所述乙酸溶液的浓度为90v/v％。
优选的，所述纺丝液中壳聚糖和聚氧化乙烯的总浓度为10～30g/L，其中，壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比为1:1～4。
优选的，步骤S4中，所述小鼠肿瘤细胞包括Colon 26小鼠结肠癌细胞、KLN 205小鼠肺癌鳞癌细胞、LL/2小鼠Lewis肺癌细胞、Neuro-2a小鼠脑神经母细胞瘤、B16小鼠黑色素瘤细胞、J558小鼠多发性骨髓瘤细胞和RM1小鼠前列腺癌细胞中的一种。
优选的，步骤S4中，所述DNA酶与所述小鼠肿瘤细胞的细胞量的比为400～5000U:1×104个。
优选的，步骤S4中，所述消化反应温度30～40℃，消化反应的时间2～4h。
优选的，步骤S5中，所述含有神经生长因子和所述激活因子的DMEM培养基中还含有细胞培养添加剂，神经生长因子NGF的浓度为40～80mg/L，细胞培养添加剂的浓度为40～80mg/L，激活因子浓度以蛋白计为90～400mg/L。
优选的，步骤S5中，接枝反应的浸泡浴比为1:100～300，浸泡温度为0～4℃，浸泡时间为12～24h。
优选的，步骤S5中，负压闪爆的真空度为0.100～0.024mBar。
优选的，步骤S5中，所述冻干的温度为-30～-20℃，真空度为0.100～0.024mBar，冻干时间为3～5d。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1)常规的神经再生方法无法实现和促进神经元的再生和增殖，本发明采用肿瘤中提取的激活因子，模拟肿瘤微环境，诱导神经细胞增殖、分化，从而大大提高了神经细胞的存活率和增殖效率。
2)本发明的纳米纤维制备方法利用多项技术，包括静电纺丝技术、低温等离子处理技术、负压闪爆技术等，这些技术的使用大大提高了神经生长因子、激活因子与纤维的结合率，负载量更大，制得的纳米纤维能够更好地促进神经元生长及神经损伤后的再生。因此，本发明的纳米纤维与同类的材料相比诱导神经元生长的效果更加优异。
附图说明
图1是本发明实施例及对比例处理下的神经元增殖率。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
本发明提供了一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
S1：将壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
S2：采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
S3：将所述壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后进行等离子处理活化得到活化纳米纤维；
S4：取小鼠肿瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并用DNA酶进行消化反应，得到激活因子；
S5：将所述活化纳米纤维浸泡在含有神经生长因子和所述激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干，得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
首先，将壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；本发明中壳聚糖和聚氧化乙烯均为本领域普通技术人员熟知的市售商品，壳聚糖优选选择粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖，聚氧化乙烯优选选择平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯。乙酸优选选择浓度为90％(v/v)的乙酸溶液。
本发明中将壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，搅拌均匀，得到的纺丝液中壳聚糖和聚氧化的的总浓度优选为10～30g/L，更优选为20g/L；壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比优选为1:1～4，更优选为1:3。
制备完纺丝液后，采用纺丝液进行静电纺丝，得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维。本发明静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件优选为，电压为12～20KV，更优选为15KV，距离7～10cm，更优选为8cm，进样速率0.3～1.0ml/h，更优选为0.5ml/h，温度25～35℃，更优选为30℃。
得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维后，将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化得到活化纳米纤维。本发明中等离子处理处理活化的目的是使纤维可以更多的吸附神经生长因子和激活因子。洗涤终点pH优选为7，烘干的温度优选为37～45℃，更优选为37℃，烘干时间优选为2～4h，更优选为4h。等离子体处理的条件优选为：气体采用氮气或氧气，更优选为氧气，处理功率为250～300W，更优选为280W，压强为50～60Pa，更优选为55Pa，处理时间为10～15min，更优选为15min。
然后制备激活因子。具体为：取小鼠肿瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并用DNA酶进行消化反应后得到激活因子。本发明中小鼠肿瘤细胞优选采用Colon 26小鼠结肠癌细胞、KLN205小鼠肺癌鳞癌细胞、LL/2小鼠Lewis肺癌细胞、Neuro-2a小鼠脑神经母细胞瘤、B16小鼠黑色素瘤细胞、J558小鼠多发性骨髓瘤细胞和RM1小鼠前列腺癌细胞中的一种。DNA酶与细胞量的比优选为400～5000U:1×104个，更优选为2000U:1×104个，所述消化反应温度优选为30～40℃，更优选为37℃，消化时间优选为2～4h，更优选为3h。
得到活化纳米纤维和激活因子后，将神经生长因子NGF、细胞培养添加剂和激活因子加入DMEM培养基，得到含有含有神经生长因子和激活因子的DMEM培养基，然后将活化纳米纤维浸泡在含有神经生长因子和激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干，得到含有激活因子的神经再生纳米纤维。
本发明中所制备的含有神经生长因子和激活因子的DMEM培养基中NGF的浓度优选为40～80mg/L，更优选为80mg/L，细胞培养添加剂的浓度优选为20～40ml/L，更优选为40mg/L。本发明中细胞培养添加剂优选采用B27。激活因子浓度以蛋白计优选为90～400mg/L，更优选为300mg/L。本发明中，接枝反应的浸泡浴比优选为1:100～300，更优选为1:200，浸泡温度优选为0～4℃，更优选为4℃，浸泡时间优选为12～24h，更优选为24h；所述负压闪爆的真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar；所述冻干的温度优选为-30～-20℃，更优选为-30℃，真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar，冻干时间优选为3～5d，更优选为4d。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
S1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和1.5g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
S2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
S3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
S4、取小鼠Neuro-2a脑神经母细胞瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并以2000U:1×104个的比例用DNA酶消化，消化温度37℃，消化时间3h，得到激活因子；
S5、将步骤S3得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/L NGF、40mg/L B27和300mg/L(以蛋白计)激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
实施例2
S1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和0.5g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
S2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
S3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
S4、取小鼠B16黑色素瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并以400U:1×104个的比例用DNA酶消化，消化温度30℃，消化时间2h，得到激活因子；
S5、将步骤S3得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LNGF、40mg/L B27和90mg/L(以蛋白计)激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
实施例3
S1、将0.6g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和2.4g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
S2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
S3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
S4、取小鼠RM1前列腺癌细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并以5000U:1×104个的比例用DNA酶消化，消化温度40℃，消化时间3h，得到激活因子；
S5、将步骤S3得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/L NGF、40mg/L B27和400mg/L(以蛋白计)激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
对比例1：
S1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和1.5g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
S2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
S3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
S4、将步骤S3得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/L NGF和40mg/L B27的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d。
对比例2：
1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和1.5g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7.2，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
4、将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LNGF和40mg/L B27的DMEM培养基中，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
5、将完成接枝反应的纳米纤维离心，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d。
对比例3：
1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和1.5g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h；
4、将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LNGF和40mg/L B27的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
5、将完成接枝反应的纳米纤维离心，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d。
将实施例与对比例的纳米纤维放入培养皿中，进行常规的神经元培养。经72h培养后，显微计数神经元个数，测定神经细胞增殖率，结果如图1所示。由图1可知，实施例处理条件下的神经元细胞增殖率明显高于对比例。因此，本发明实施例与对比例相比能够显著促进神经元的增殖。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
S2：采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
S3：将所述壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后进行等离子处理活化得到活化纳米纤维；
S4：取小鼠肿瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并用DNA酶进行消化反应，得到激活因子；
S5：将所述活化纳米纤维浸泡在含有神经生长因子和所述激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干，得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
2.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述壳聚糖的粘均分子量为5.0×105，脱乙酰度为80～85％；所述聚氧化乙烯的平均分子量为1.0×106；所述乙酸溶液的浓度为90v/v％。
3.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述纺丝液中壳聚糖和聚氧化乙烯的总浓度为10～30g/L，其中，壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比为1:1～4。
4.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述小鼠肿瘤细胞包括Colon 26小鼠结肠癌细胞、KLN 205小鼠肺癌鳞癌细胞、LL/2小鼠Lewis肺癌细胞、Neuro-2a小鼠脑神经母细胞瘤、B16小鼠黑色素瘤细胞、J558小鼠多发性骨髓瘤细胞和RM1小鼠前列腺癌细胞中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述DNA酶与所述小鼠肿瘤细胞的细胞量的比为400～5000U:1×104个。
6.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述消化反应温度30～40℃，消化反应的时间2～4h。
7.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述含有神经生长因子和所述激活因子的DMEM培养基中还含有细胞培养添加剂，神经生长因子NGF的浓度为40～80mg/L，细胞培养添加剂的浓度为40～80mg/L，激活因子浓度以蛋白计为90～400mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S5中，接枝反应的浸泡浴比为1:100～300，浸泡温度为0～4℃，浸泡时间为12～24h。
9.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S5中，负压闪爆的真空度为0.100～0.024mBar。
10.根据权利要求1所述的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述冻干的温度为-30～-20℃，真空度为0.100～0.024mBar，冻干时间为3～5d。
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