CN111729622A - 一种苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶及其应用，所述的水凝胶通过物理纤维缠绕形成三维网络，其纤维孔径在10微米左右。所述的LPG凝胶中的纳米纤维呈左手螺旋性，DPG凝胶中的纳米纤维呈右手螺旋性。所述的左右螺旋的纳米纤维都具有相同的纤维直径(50±10nm)和螺距(480±40nm)。所述的苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶在眼科和神经科学领域的应用，以及在外胚层来源的干细胞(如视网膜干细胞、神经干细胞等)中的应用。

Description

一种苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶及其应用
技术领域
本发明涉及一种调控视网膜干细胞(RPC)增殖和分化的手性超分子材料，具体的说涉及一种苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶的制备加工的材料合成技术，以及基于该材料调控RPC增殖和分化的研究，属于生物医学再生领域、组织工程领域。
背景技术
视网膜退行性疾病主要包括年龄相关性变性(AMD)、视网膜色素变性(RP)、Stargardt’s病等。目前对于此类疾病的治疗主要包括神经营养支持保护治疗、视网膜假体治疗、基因替代治疗、药物治疗、光遗传疗法等[1]。视网膜退行性疾病的发病机制从细胞学角度上讲主要涉及RPE和(或)光感受器细胞的损伤和丢失有关。由于视网膜神经细胞不具有再生性，损伤后的细胞不能够完成自我修复。上诉的方法目前只能够延缓视网膜退行性疾病的进展而不能够治愈该类疾病。目前基于视网膜干细胞的移植治疗成为研究热点，在治疗视网膜退行性疾病中显示出巨大的潜力。
视网膜干细胞移植治疗存在着两大重要问题亟待解救：视网膜干细胞的增殖能力有限和视网膜干细胞分化为神经细胞的的能力较弱。研究发现可降解的生物支架材料可以通过材料的性能影响视网膜干细胞的增殖和分化的能力，因此在组织工程以及再生医学领域拥有着无限的前景。因为水凝胶和细胞外基质的特性相似，是用于人体的第一类聚合物[2]，在组织再生方面已经得到了广泛的应用，如透明质酸水凝胶[3]、壳聚糖[4]、聚(L-乳酸-ε-己内酯)(PLCL)[5]等。但是PLCL 缺乏细胞粘附的识别位点以至于细胞亲和力较低，壳聚糖生物溶解性和静电纺丝性差，透明质酸水凝胶存在稳定性差、易降解、在体内保留时间短等不足的问题，限制了这类材料的生物学上的应用。目前已商业化的水凝胶多为高分子水凝胶，但由于高分子水凝胶的合成复杂、交联剂毒性、难生物降解、凝胶-溶胶转变缓慢等缺陷[6]，限制了其在细胞培养、组织工程等生物材料方面的应用。
鉴于目前水凝胶材料在生物医学领域应用的诸多的问题，课题组合成设计了一种手性超分子水凝胶材料。超分子水凝胶是小分子通过物理相互作用形成纳米纤维的三维网络把水包裹后形成的，成胶后的含水量在99％以上，与生物体内细胞的水环境很相似；同时小分子自组装形成的纳米纤维结构与胶原蛋白的结构和尺寸也极其类似，更好的模拟了细胞外基质的成分结构。此外手性超分子水凝胶的手性作用在调节细胞的增殖分化方面也发挥着重要的作用。
参考文献：
[1]P.Mitchell,G.Liew,B.Gopinath,T.Y.Wong,Lancet(London,England)2018,392,1147-1159.
[2]O.Wichterle,D.LíM，Nature1960,185,117-118.
[3]M.L.Kang,S.Y.Jeong,G.I.Im,Tissue engineering.Part A 2017,23,630-639.
[4]S.Yu,X.Xu,J.Feng,M.Liu,K.Hu,International journal of pharmaceutics2019,560,282-293.
[5]N.Ni,J.Ji,S.Chen,D.Zhang,Z.Wang,B.Shen,C.Guo,Y.Zhang,S.Wang,X.Fan,Z.You,M.Luo,P.Gu,Macromolecular bioscience 2016,16,1334-1347.
[6]X.Q.Dou,C.L.Feng,Advanced materials(Deerfield Beach,Fla.)2017,29.
发明内容
本发明的目的是为了提供一种苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶及其应用，以解决现有技术的上述技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一种苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶，如式1所示：
Figure RE-GDA0002646773840000031
星号处为手性碳原子所在，星号处标注为S或者R，其中，S为左旋分子，R 为右旋分子。
所述的水凝胶通过物理纤维缠绕形成三维网络，其纤维孔径在10微米左右。所述的LPG凝胶中的纳米纤维呈左手螺旋性，DPG凝胶中的纳米纤维呈右手螺旋性。所述的左右螺旋的纳米纤维都具有相同的纤维直径(50±10nm)和螺距(480 ±40nm)。
上述水凝胶的制备方法，其步骤为：
(1)将1,4-苯二甲酰氯(2.6g,13.0mmol)溶解在在干燥的二氯甲烷 (DCM,20mL)中滴加100mLD-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(6.0g,26.1mmol)的二氯甲烷和三乙胺(Et3N,8.0mL,58.3mmol)的溶液中，室温下搅拌24h，除去多余溶剂后将残留物溶解到100mL的乙醇中，过滤收集不溶性物质干燥得到 pPG(DPGe-OMe)2(5.3g,10.9mmol,84％)。
(2)在20mLpPG(DPGe-OMe)2(3.0g,6.14mmol)的甲醇悬浮液溶液中，加入10mLNaOH(2.0M)水溶液，缓慢冷却至室温搅拌24小时后得到澄清溶液。用 3.0MHCl酸化并将溶液PG值调节到3.0以下，得到凝胶状沉淀；将凝胶抽滤，用去离子水反复清洗3次，真空干燥得到pPG(DPGe-OH)2(DPG2,2.6g,5.6mmol,91％)。
(3)将pPG(DPGe-OH)2溶解在80mL的一缩乙二醇中，滴加0.5mL浓盐酸， 130℃下搅拌3.5小时，得到澄清溶液倒入300mL冰水混合物。凝胶状沉淀通过抽滤，冰水淋洗多次，真空干燥得到DPG(3.0g,4.7mmol,77％)。DPG的收率为 59％。
(4)将步骤一中的D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐换为L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐，使用同样的方法进行制备得到LPG(2.8g,98％)。
(5)手性水凝胶的制备过程:取上述得到的DPG和LPG材料，加入去离子水，加热至完全溶解后，在室温下静置冷却后，得到半透明的水凝胶。
(6)非手性水凝胶的制备过程：取等体积的DPG和LPG材料，加入去离子水，加热至完全溶解后，在室温下静置冷却后，得到半透明的水凝胶。
所述的苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶在眼科和神经科学领域的应用，以及在外胚层来源的干细胞(如视网膜干细胞、神经干细胞等)中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明中设计的手性超分子水凝胶分子是小分子通过物理相互作用形成纳米纤维的三维网络把水包裹后形成的，不存在交联剂毒性、难生物降解、凝胶 -溶胶转变缓慢等缺陷，在生物医学再生领域具有很好的前景；
2、本发明中设计的手性超分子水凝胶对于视网膜干细胞的干性都有明显的增强作用，同时本发明中设计的手性超分子水凝胶能够通过手性的的翻转调控视网膜干细胞的分化行为(左手螺旋LPG可以抑制细胞的分化，而右手螺旋DPG 促进细胞的分化)，这是同类的材料不能实现通过手性翻转就可以实现的。
3、本发明手性水凝胶高效的调控了视网膜干细胞的增殖和分化。
附图说明
图1为1,4-苯二甲酰胺苯丙氨酸衍生物的两种对映体超分子水凝胶材料表征；
其中，(a-c)冷冻干燥之后的LPG(a)、DPG(b)、RPG(c)水凝胶的SEM 图像。(d)LPG、DPG、RPG的圆二色谱(e)LPG、DPG、RPG的振动圆二色谱图。
图2为扫描电镜检测了0、4、7天的材料结构；
图3为RPC的鉴定(a)通过免疫细胞化学检测Nestin的表达(b)通过免疫细胞化学检测Vimentind的标的；(c)通过免疫细胞化学检测Pax-6的表达； (d)Nestin、Vimentind、Pax-6三者的RPC的鉴定。
图4(a)Live-dead染色(b)Live-dead染色后的细胞存活率的统计(c) qPCR检测炎症因子的表达水平(d)western blot检测炎症因子的表达；
图5为细胞在材料分化培养的形态学；
图6为细胞在材料上的迁移状况，
图7(a)qPCR检测分化标志物的表达(b)western blot检测分化标志物的表达(c)免疫细胞化学检测分化标志物的表达；
图8为高通量测序检测；
图9为GO分析DPG和对照组的通路富集；
图10(a)qPCR检测RA通路中的相关的分子mRNA的表达水平(b)western blot检测RA通路中的相关的分子蛋白的表达水平；
图11为ELISA检测培养7天后的细胞上清液中的RBP4分子的浓度；
图12为涂有材料的孔板的荧光图像；
图13为分子模拟计算(a)LPG分子模式图(b)DPG分子模式图(c)LPG 分子和RBP4蛋白分子相互作用的模式图(d)DPG分子和RBP4蛋白分子相互作用的模式图(e)LPG分子和RBP4蛋白分子相互作用的能量图(f)DPG分子和 RBP4蛋白分子相互作用的能量图；
图14为裸鼠皮下注射水凝胶(a)裸鼠皮下注射(b)心肝脾肺肾的HE染色；
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
本发明实施例所采用的苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶，如式1所示：
Figure RE-GDA0002646773840000051
星号处为手性碳原子所在，星号处标注为S或者R，其中，S为左旋分子，R 为右旋分子。
上述水凝胶的制备方法，其步骤为：
(1)将1,4-苯二甲酰氯(2.6g,13.0mmol)溶解在在干燥的二氯甲烷(DCM,20mL)中滴加100mLD-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(6.0g,26.1mmol)的二氯甲烷和三乙胺(Et3N,8.0mL,58.3mmol)的溶液中，室温下搅拌24h，除去多余溶剂后将残留物溶解到100mL的乙醇中，过滤收集不溶性物质干燥得到 pPG(DPGe-OMe)2(5.3g,10.9mmol,84％)。
(2)在20mLpPG(DPGe-OMe)2(3.0g,6.14mmol)的甲醇悬浮液溶液中，加入10mLNaOH(2.0M)水溶液，缓慢冷却至室温搅拌24小时后得到澄清溶液。用3.0MHCl酸化并将溶液PG值调节到3.0以下，得到凝胶状沉淀；将凝胶抽滤，用去离子水反复清洗3次，真空干燥得到pPG(DPGe-OH)2(DPG2,2.6g,5.6mmol,91％)。
(3)将pPG(DPGe-OH)2溶解在80mL的一缩乙二醇中，滴加0.5mL浓盐酸， 130℃下搅拌3.5小时，得到澄清溶液倒入300mL冰水混合物。凝胶状沉淀通过抽滤，冰水淋洗多次，真空干燥得到DPG(3.0g,4.7mmol,77％)。DPG的收率为 59％。
(4)将步骤一中的D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐换为L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐，使用同样的方法进行制备得到LPG(2.8g,98％)。
(5)手性水凝胶的制备过程:取上述得到的DPG和LPG材料，加入去离子水，加热至完全溶解后，在室温下静置冷却后，得到半透明的水凝胶。
(6)非手性水凝胶的制备过程：取等体积的DPG和LPG材料，加入去离子水，加热至完全溶解后，在室温下静置冷却后，得到半透明的水凝胶。
扫描电子显微镜下两种材料在冷冻干燥后和在干凝胶的状态下的结构如图 1所示。由图1(a、b、c)可知凝胶通过物理纤维缠绕形成三维网络，其纤维孔径在10微米左右。图1(d、e)可知LPG凝胶中的纳米纤维呈左手螺旋性，DPG 凝胶中的纳米纤维呈右手螺旋性。在对两种凝胶中的纳米纤维进行统计分析发现，左右螺旋的纳米纤维都具有相同的纤维直径(50±10nm)和螺距(480±40nm)。
如图2所示，为了考察水凝胶材料所形成的细胞培养环境的稳定性。课题组通过扫描电镜检测了0、4、7天的材料结构，证实材料在7天内未完全降解，RPC 的一系列的生物学现象是由于材料的存在而引起的。
首先课题组对RPC进行鉴定，如图3所示，通过免疫细胞化学技术检测RPC 的特异性标志物如Nestin(巢丝蛋白)、Vimentin(波形蛋白)、Pax-6高表达(达到百分之九十以上)，完成对RPC的鉴定。
如图4所示，接下来将细胞种在底部铺有水凝胶的孔板内进行活死细胞染色(染色中存活细胞为绿色荧光，死亡细胞为红色荧光)以及通过qPCR检测炎症因子的表达水平。结果表明三种水凝胶不仅没有引起强烈的炎症反应，而且可以降低炎症刺激，生物安全性较好。
再将细胞种在水凝胶上进行分化培养，不同处理组的细胞的形态如图5所示，其中LPG明显抑制细胞的分化(视网膜干细胞形成突触较粗短)，而DPG促进细胞的分化(视网膜干细胞形成突触较细长)。
接下来，为了研究水凝胶对视网膜干细胞的迁移的影响，我们进行了划痕实验(即是细胞融合度达到95％以上以后，进行划痕，在特定的时间点观察细胞的迁移状况)，结果如图6所示，DPG明显的促进视网膜干细胞的迁移，但是LPG 抑制视网膜干细胞的迁移，RPG对于视网膜干细胞的迁移没有显著影响。
如图7所示，在蛋白和基因水平上通过qPCR、western blot、免疫细胞化学染色进一步的证明材料DPG明显的促进细胞的分化而LPG抑制细胞的分化。
通过高通量测序我们发现DPG明显的增加促进神经的相关的标志物的表达。结果如图8所示。
接下来我们通过GO和KEGG分析，发现视黄酸代谢(RA)通路在DPG组中被激活如图9所示，同时在高通量测序中发现参与该通路的重要分子ALDH1A1 在DPG中也明显升高。结合课题组在前期研究RA对RPC的实验中的结论(REST, regulated by RA through miR-29aand the proteasome pathway,plays a crucial role in RPC proliferation anddifferentiation，IF5.959)，因此课题组猜测DPG可能通过激活RA通路进一步的促进细胞的分化。
通过qPCR和western blot实验我们的结果表明DPG通过激活RA通路促进细胞的分化，促进RA通路中的相关分子的表达，如图10所示。
接下来我们进行探究材料是如何激活RA通路进一步促进细胞的分化，我们通过美联免疫吸附实验(ELISA)检测培养7天后的细胞的上清液中的RBP4分子的含量，如图11所示，结果表明在DPG组中RBP4分子的含量最低，而LPG中的RBP4分子的含量最高。我们猜测DPG通过结合更多的RBP4分子进而激活了 RA通路促进细胞的分化。
同时我们将材料孵育在含有RBP4蛋白的溶液中在1小时、3小时、6小时后，孵育荧光二抗，祛除背景强度的条件下通过荧光显微镜进行拍照观察。如图12 所示。
为了检测蛋白质和两种手性材料分子之间的相互作用，我们进行了分子模拟计算出材料分子和蛋白分子RBP4结合所需要的能量的大小，结果表明DPG和 RBP4结合所需要的能量少，作用力更强。如图13所示。
如图14所示，将材料注射到裸鼠的皮下进行检测材料的生物安全性，我们的结果表明材料注射到裸鼠皮下没有引起明显的炎症反应，同时对于生物的心肝脾肺肾等重要的脏器没有明显的毒副作用。
由上述测试数据可见，本发明基于D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐底物化学结构；使用苯丙氨酸的手性结构合成的手性材料在眼科和神经科学领域的应用，以及在外胚层来源的干细胞(如视网膜干细胞、神经干细胞等) 中的应用。

Claims (6)

1.一种苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶，其特征在于：如式1所示：
Figure FDA0002462168090000011
星号处为手性碳原子所在，星号处标注为S或者R，其中，S为左旋分子，R为右旋分子。
2.根据权利要求1所述的一种苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶，其特征在于：所述的水凝胶通过物理纤维缠绕形成三维网络，其纤维孔径在10微米左右。所述的LPG凝胶中的纳米纤维呈左手螺旋性，DPG凝胶中的纳米纤维呈右手螺旋性。所述的左右螺旋的纳米纤维都具有相同的纤维直径(50±10nm)和螺距(480±40nm)。
3.权利要求1-2任意之一所述苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：其步骤为：
(1)将1,4-苯二甲酰氯(2.6g,13.0mmol)溶解在在干燥的二氯甲烷(DCM,20mL)中滴加100mLD-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(6.0g,26.1mmol)的二氯甲烷和三乙胺(Et3N,8.0mL,58.3mmol)的溶液中，室温下搅拌24h，除去多余溶剂后将残留物溶解到100mL的乙醇中，过滤收集不溶性物质干燥得到pPG(DPGe-OMe)2(5.3g,10.9mmol,84％)；
(2)在20mLpPG(DPGe-OMe)2(3.0g,6.14mmol)的甲醇悬浮液溶液中，加入10mLNaOH(2.0M)水溶液，缓慢冷却至室温搅拌24小时后得到澄清溶液。用3.0MHCl酸化并将溶液PG值调节到3.0以下，得到凝胶状沉淀；将凝胶抽滤，用去离子水反复清洗3次，真空干燥得到pPG(DPGe-OH)2(DPF2,2.6g,5.6mmol,91％)；使用同样的方法进行制备得到pPG-(LPGe-OH)2(LPF2,2.8g,98％)；
(3)水凝胶的制备过程:取上述两种材料，加入去离子水，加热至完全溶解后，在室温下静置冷却后，得到半透明的水凝胶。
4.权利要求1-2任意之一所述苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶在眼科和神经科学领域的应用。
5.权利要求1-2任意之一所述苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶在外胚层来源的干细胞中的应用。
6.根据权利要求5所述的苯丙氨酸衍生的手性超分子水凝胶在视网膜干细胞、神经干细胞中的应用。
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