CN1439432A

CN1439432A - 等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管或膜及其制备方法

Info

Publication number: CN1439432A
Application number: CN 03115939
Authority: CN
Inventors: 张菁; 谢涵坤; 胡群华; 陈皓
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2003-09-03
Anticipated expiration: 2023-03-21
Also published as: CN1216652C

Abstract

一种等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管或膜，其特点主要在导管或膜表面有一层通过等离子体表面聚合修饰形成的含有作为后一步固定化反应的活性基团的聚合物涂层，再通过共价键将神经再生促进剂化学键合固定在导管或膜的表面，在导管内中间还插入有与管轴平行的纤维、无纺布或海绵状材料填充物而组成。由于本发明神经导管和膜是采用独特的等离子体表面修饰神经再生促进剂固定化的方法制成，因而神经再生促进剂可集中在导管内部、管壁表面发挥作用，诱导神经细胞贴壁生长，不会随体液的流出流入而扩散到机体的其他部位，从而在神经再生期间长效地发挥作用，促进神经再生修复功能的提高。同样，膜可用于体外快速培养神经细胞。

Description

等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管或膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管或膜及其制备方法，神经导管可以植入生物体内修复缺损神经，膜材可以体外用于神经细胞的培养。

背景技术

神经系统是人体最主要的器官，它控制着人体的感官运动功能。神经一旦缺损，常常意味着人体某些部位的感觉、运动功能的丧失，给患者造成极大的痛苦。但到目前为止，缺损神经的修复和功能的重建仍是人类关注的重点和难题。

目前，缺损神经的临床修复主要采取自体、异体神经移植；外膜、束膜吻合；神经导管桥接术、损伤神经部位的药物辅助治疗、电磁辅助治疗等。自体神经移植是目前最有效的神经修复方法，即将患者腓骨神经取下一段移植到需要的缺损部位，但它增加了手术的次数与难度，引起患者自体神经取出部位功能丧失，同时具有来源有限等问题。而异体神经移植具有免疫排斥的问题。外膜与束膜吻合术是直接将损伤或断离的神经近体端与远体端进行手术缝合，对损伤轻微或短间歇的缺损神经修复具有良好疗效，但由于神经没有伸展功能，缝合产生的张力会影响神经的再生，对长间歇的神经缺损修复也无能为力。神经导管桥接术是利用神经具有一定的再生修复能力(1mm/天)，在缺损神经的近体端与远体端通过导管搭桥，诱导神经沿导管方向再生，同时，营造一个有利于神经再生功能发挥的微环境，可以促进缺损神经的再生修复。是目前神经再生修复的研究热点。

神经导管桥接术已从对导管基质材料的研究，转向导管微结构的研究，同时，与分子生物技术结合，通过吸附或填充各种神经再生促进剂，促进长间歇缺损神经的再生修复是当前的发展趋势。神经导管基质材料目前趋向于使用具生物相容性与可吸收性的胶原、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯、聚壳聚糖等。90年代初的美国专利“US4963146”是目前各类可吸收神经导管的雏形。它具有生物相容性和可吸收性、半透性、可通过管壁进行营养物质的传输与新陈代谢；具有缝合与运动所需的机械强度与性能；同时还包含有葡萄糖蛋白、外皮生长因子、神经生长因子、人体昆布氨酸等神经再生促进剂；日本专利JP[31]162397(中国专利CN1304296A)改进导管微结构，同时用昆布氨酸等涂覆导管纤维材料，促进猫、猴的较长间歇神经缺损的再生修复。

上述神经导管的研究，大都应用了各类神经再生促进剂。如神经细胞营养因子(NGF)睫状神经营养因子(CNTF)或纤维细胞生长因子(FGF)，人昆布氨酸(laminine)，纤维连接蛋白(fibronection)等等。尽管其详细的机理还不清楚，但都发现对神经生长具有确切的促进作用。但在上述神经导管应用中，这些神经再生促进剂大都采用物理吸附的方式导入导管内部或导管材料表面，由于神经导管管壁必须是一半透性的体系，有利于体液中营养物质进入导管内部以及代谢物的排出，因此，在体液的作用下，这些物理吸附的神经生长促进剂就容易透过管壁早期流出，造成神经生长促进剂在体内的扩散，影响神经生长促进剂集中在管内发挥作用，同时可能引起机体的不良反映。因此一种新的神经导管或膜的研制是个很重要的研究课题。

发明内容

基于上述神经生长促进剂在神经导管内的应用现状，提出了本发明等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管和膜及其制备方法。本发明等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管或膜特点是：它是由生物可吸收降解材料制成的管或膜，在其表面有一层通过等离子体表面聚合修饰形成的含有作为后一步固定化反应的活性基团的聚合物涂层，再通过共价键将神经再生促进剂化学键合固定在导管或膜的表面，在导管内中间还插入有与管轴平行的纤维，无纺布或海绵状材料等填充物而组成。填充后的孔隙率为90-99％。

本发明等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管或膜的制备方法包括下列步骤：

1.将生物可吸收降解材料制作成导管或膜

将生物可吸收降解材料如胶原、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯(PGLA)等，优选PGLA，分子量为10-50万，常规熔融纺丝制成纤度0.8-2.8克/袋的长丝，再通过园编法编织成管，外管径0.8-5.0mm，管壁厚度0.05-0.5mm，管内中间插入有与管轴平行的胶原、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯等纤维、无纺布或海绵状材料填充物，管内填充后孔隙率为90-99％。或者通过熔融法热压成薄膜，薄膜厚为0.02-0.05mm，或熔融法成膜在可以用于细胞培养的玻璃片上。

2.等离子体表面修饰

将上述制作的导管剪成2-5cm的长度。将需要处理的导管或薄膜及需要填充进导管的纤维、无纺布或海绵状材料置于频率20KHz-13.56MHz的等离子体的反应器中，反应器可以进行脉冲调制，使放电在“开”与“关”之间间歇进行，脉冲比(“开”的时间除以“开”和“关”的时间总和)为1％-99％，“开”的时间范围为1ms-50ms。反应器电极为电容耦合式。抽真空至本底真空度3.5×10^-2Pa，将含有氨基、羧基的单体如氨基酸：例如丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸，丙烯酰胺，乙烯基乙酸或丙烯酸配成浓度10％到100％的水溶液，通过氩气、氦气、氖气、氮气等非聚合性气体鼓泡导入反应器。调节流量计控制气体流量为5-150sccm，真空度范围5-300Pa，放电功率2W-260W，聚合时间0.1hr-5hr，放电聚合后取出，导管或膜表面形成一层聚合物涂层。红外测量结果表明，通过调节脉冲比，聚合物中可以更多地保留原有单体结构中的氨基、羧基，保留量视单体种类、聚合条件而变化。例如，在乙烯基乙酸聚合情况下，在峰值功率20W，真空度35Pa，氩气流量120sccm条件下，随脉冲比从100％变化到10％，X光电子能谱(XPS)测量结果表明乙烯基乙酸聚合修饰膜中氧的含量从13％变化到17％。所保留的氨基、羧基作为必需的基团参加后续的固定化反应。

3.神经再生促进剂的固定化反应

将上述聚合修饰过的导管或膜经环氧己烷或紫外线消毒，然后置于浓度为1-50％的碳二亚胺类催化剂配成的PBS溶液中，室温反应20-100分钟后取出，过剩的催化剂用PBS溶液冲洗两遍。然后放入浓度(30-300ng/ml)的神经再生促进剂蛋白如睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子(NGF)、脑原性神经营养因子(BDNF)等的PBS溶液中，溶液与待处理材料的体积比至少为1∶1，2-10℃条件下反应15-40hr取出，PBS溶液冲洗三遍。通过Elisa方法测定固定化神经再生促进剂的浓度，例如，采用R&D公司的DNT-00人体-CNTF Elisa定量试剂盒，将固定了神经再生促进剂CNTF的膜作为已经结合了CNTF的包埋抗体，通过CNTF的抗体(抗CNTF β-牛乳糖苷酶)与CNTF的免疫反应，再通过抗CNTF β-牛乳糖苷酶底物的反应和光度测定，测得膜上有效地固定了CNTF神经再生促进剂。固定化神经再生促进剂的浓度可为12-41ng/cm²。由于只有与膜化学键合的神经再生促进剂才能在反应中被检测到，所以该测量结果说明膜上已经有效地固定了神经再生促进因子。固定有神经再生促进因子的神经导管和膜即为本发明等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管和神经培养膜。

经过上述制备方法获得的神经导管和填充材料组合后，可用于体内缺损神经的再生修复，由于导管表面含有固定化的神经再生促进剂，促进了神经元的生长发育，大大地提高了再生神经的神经信号传递速度、中段神经轴突的截面积和数量。

经过上述制备方法获得的膜可以用于各种体外神经细胞培养，由于膜表面含有固定化的神经再生促进剂，大大地加快了神经细胞贴璧生长的速度，缩短细胞培养时间。

本发明等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂方法，主要是首先通过等离子体表面修饰，在神经导管材料表面获得可进行下一步化学反应的活性基团，再通过碳二亚胺类生物催化剂，在低温下，通过共价键将具有蛋白质结构的神经再生促进因子化学键合在神经导管材料表面，该方法具有以下优点：

1.射频连续波等离子体聚合反应所得聚合物含较多交联结构，而且原单体中COOH、NH₂、CHO等官能团较难完整地保留。通过对射频等离子体进行脉冲调制，可以使放电在“开”与“关”之间间歇进行，在放电处于“开“的阶段，等离子体反应按照常规等离子体反应进行，主要为活性种与较多交联结构的产生阶段；在放电处于“关“的阶段，等离子体反应具有自由基或者离子聚合反应的模式，主要为链增长聚合阶段；控制脉冲比、功率等反应条件，可以控制保留更多的氨基、羧基等可以进行下一步固定化反应的活性基团，以满足后续固定化反应的要求。

2.脉冲射频等离子体修饰是一种材料表面修饰方法，只影响材料表面几千埃的深度，因而只对导管材料的表面性能有影响，不会影响材料的其它本体特性。

3.通过碳二亚胺类生物催化剂，固定化缩聚反应可在低温下完成，通过共价键将具有蛋白质结构的神经再生促进因子化学键合在神经导管材料表面。由于固定化反应在低温进行，对神经再生促进因子生物活性的影响也较小。

4.由于神经再生促进因子通过共价键固定在神经导管材料表面，因而可集中在导管内部填充材料表面或管壁表面发挥作用，诱导神经细胞的贴壁生长，不会随体液的流出流入而扩散到机体的其他部位，从而在神经再生期间长效地发挥作用，促进神经导管神经修复功能的提高。

附图说明

图1是等离子体放电聚合物聚赖氨酸(a)及其单体(b)的红外光谱图。

图2是等离子体放电聚合物聚乙烯乙酸中C_1s的电子能谱图。

a-e脉冲比分别为1％，5％，10％，60％，100％(放电功率20W)

f脉冲比10％(放电功率200W)

图3是胎儿视神经细胞(12周)在体外膜上的培养试验结果

a.在鼠尾胶包被的玻片上(2天)

b.在鼠尾胶包被的玻片上(8天)

c.在经等离子体修饰的PGLA膜片上(2天)

d.在经等离子体修饰的PGLA膜片上(8天)

图4是神经胶质细胞(GFAP阳性为神经胶质细胞)和神经元细胞(NF阳性为神经元细胞)在体外膜上进行的免疫组化试验结果。

a.在鼠尾胶包被的玻片上(GFAP-6天)

b.在鼠尾胶包被的玻片上(NF-12天)

c.在等离子体修饰的PGLA膜上(GFAP-6天)

d.在等离子体修饰的PGLA膜上(NF-12天)

图5是本发明神经导管在大鼠体内进行缺损神经的再生修复试验示意图。

具体实施方式

实施例1赖氨酸等离子体表面修饰涂层膜的制备

分子量20万的PGLA熔融在玻璃片上，冷却成均匀透明薄膜。置入13.56MHz，直径10cm，长55cm的玻璃等离子体反应器中，电极为电容耦合式。抽真空至真空度3.5×10^-2pa，通入配制好的浓度30％的赖氨酸水溶液，通过氩气导入反应器。调节流量计控制气体流量为100sccm，真空度50Pa，调节脉冲比为80％，“开”的时间间隔为3ms，功率40w，开启电源放电聚合3hr，得聚赖氨酸涂层PGLA膜，赖氨酸涂层的红外光谱如图1所示，聚合修饰膜中较好地保留了氨基酸的酰胺I(1620cm^-1处C＝O伸缩振动峰)、酰胺II(1520cm^-1处N-H变形振动峰)、酰胺III基因(1351cm^-1处C-N伸缩振动峰)。

实施例2 乙烯基乙酸等离子体表面修饰涂层膜的制备

分子量20万的PGLA熔融在玻璃片上，冷却成均匀透明薄膜。置入13.56MHz，直径10cm，长55cm的玻璃等离子体反应器中，电极为电容耦合式。抽真空至真空度3.5×10^-2pa，通入乙烯基乙酸溶液，通过氩气导入反应器。调节流量计控制气体流量为30sccm，真空度范围120Pa，功率20w，开启电源放电聚合2hr，调节脉冲比为100-1％，“开”的时间间隔为10ms，得聚乙烯基乙酸修饰涂层PGLA膜。乙烯基乙酸涂层的XPS谱如图2所示，C-C、C-O、C＝O官能团中的C_1s原子结合能分别是284.6eV、286.0eV、287.6eV。从图2可见，当调节脉冲比从100变化到1％，与氧相连的C_1s(C-O、C＝O)强度和与碳相连的C_1s(C-C)强度比增加，说明修饰聚合膜中含氧官能团的增加。从其宽扫描谱及O_1s精细谱分析得知，当调节脉冲比从100变化到1％，氧的含量从17％变化到13％，[O_1s]/[C_1s]比从0.21变化到0.16。

实施例3神经再生促进剂CNTF在膜上的固定化反应

将实施例1制得的赖氨酸等离子体涂层修饰的PGLA膜经室温环氧乙烷消毒，将碳二亚胺类生物催化剂配成20％浓度的PBS溶液。神经再生促进因子CNTF(睫状神经营养因子)配成浓度50ng/ml PBS水溶液。PGLA膜置于碳二亚胺类溶液中30min，取出后无菌蒸馏水冲洗，再置入CNTF溶液中，溶液与待处理材料的体积比为2∶1，4℃反应32hr。取出后用PBS溶液冲洗三遍待用。Elisa方法测得膜上固定的CNTF浓度为13ng/cm²。

实施例4神经培养膜上进行体外神经细胞培养试验

取12周龄人工流产的胎儿眼球，分离得到视网膜细胞，用巴氏吸管反复轻轻吹打至细胞分散，然后分别均匀接种于实施例3得到的膜上及鼠尾胶包被的玻片上，然后将接种后的薄膜置于24孔板中，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，每2天换液1次。进行胎儿视网膜细胞培养。每天用倒置显微镜观察两者的生长差异。实验结果显示，视网膜神经细胞在等离子体修饰固定化CNTF的PGLA膜上生长速度加快，2天后，视网膜神经细胞已经爬满膜片。生长速度明显优于鼠尾胶包被玻片上的生长速度，参见图3。

图3中c及图3中d为等离子体修饰固定化的PGLA薄膜上胎儿视神经细胞在两天和八天的生长情况，图3中a及图3中b分别为鼠尾胶包被的玻片胎儿视神经细胞在两天和八天的生长情况。由图3可见，两天后即在等离子体修饰固定化的PGLA薄膜上观察到大量胎儿视神经细胞贴壁生长，生长速度较鼠尾胶涂层的膜片快，到第8天已经完全铺满整个膜片表面。

实施例5神经培养膜进行体外神经胶质细胞(GFAP)和神经元细胞(NF)的免疫组化试验

分子量45万的PGLA熔融在玻璃片上，冷却后形成均匀透明薄膜。将1×1cm²的膜片16片，置入频率20KHz、直径10cm、长55cm的等离子体反应器中，电极为电容耦合式。抽真空至真空度3.5×10^-2pa，通入配制好的浓度50％的赖氨酸水溶液，通过氩气导入反应器。调节流量计控制气体流量为170sccm，真空度范围30Pa，调节脉冲比为10％，“开”的时间间隔为10ms，功率80w，开启电源放电聚合1hr.。得到等离子体涂层修饰的PGLA膜。

将上述等离子体涂层修饰的PGLA膜经室温环氧乙烷消毒，将碳二亚胺生物催化剂配成38％浓度的PBS溶液，将PGLA膜置于碳二亚胺溶液中88min，取出后无菌蒸馏水冲洗。置入CNTF浓度130ng/ml PBS水溶液，溶液与待处理材料的体积比为1∶1。5℃反应20hr。取出后用PBS溶液冲洗三遍待用。Elisa方法测得膜上固定的CNTF为20ng/cm2。然后取14周龄人工流产的胎儿眼球，分离得到视网膜细胞，按照与上述实施例4相同的条件接种、培养，同时接种培养的还有鼠尾胶包被的玻片。同时终止细胞培养，进行GFAP和NF的免疫组化实验，通过出现的阳性细胞的数量和质量，判断星状胶质细胞和神经元细胞生长发育情况。图4中a及图4中b分别为鼠尾胶包被的玻璃片上GFAP和NF阳性细胞生长情况，图4中c及图4中d分别为等离子体修饰涂层的PGLA膜上GFAP和NF阳性细胞生长情况发现等离子体修饰涂层的PGLA膜上GFAP和NF阳性细胞数都较鼠尾胶包被的玻璃片上多。说明培养两天的情况下，鼠尾胶包被的玻璃片上神经细胞生长发育不如等离子体修饰涂层的PGLA膜，也说明等离子体修饰涂层的PGLA膜有效地促进了神经元细胞的生长发育。

实施例6使用神经导管在大鼠体内进行缺损神经的再生修复试验

取PGLA制成2cm长的导管及管内填充用的PGLA纤维按实施例1和3的实验步骤，进行等离子体修饰固定化制成PGLA神经导管，将该PGLA神经导管植入大鼠左侧1.5cm缺损股神经处，为实验组。右侧为对照组(未画出)，采用未经任何涂层处理的PGLA神经导管。每组6只大白鼠。套接法桥接。观察期1个月。观察期间，察看局部伤口愈合和足部有无溃疡形成。发现所有大白鼠伤口I期愈合。术后两周，大白鼠足部开始出现溃疡。右侧对照组足部溃疡出现率明显高于左侧实验组(P＜0.05)，差异有显著性意义。观察期结束时，测定肌肉复合动作电位(CMAP)最大波幅、潜伏期并计算出神经传导速度。并解剖暴露神经导管，观察神经导管的大体形态，发现神经导管贴附于肌肉表面，管壁完整，神经管两端与坐骨神经两端连接，无神经瘤形成。然后神经导管分中段、远段两部分取材、染色，观察神经导管管壁变化，神经组织再生状况，并采用图象分析系统计算有髓神经纤维数目、有髓神经纤维平均直径和有髓神经纤维截面积，并进行统计学处理。结果如表1和图5所示。与未涂层的对照组相比，涂层的实验组的神经传导速度、中段神经轴突个数、中段神经纤维面积都有很大提高。说明经脉冲等离子体表面修饰固定化的神经导管对缺损神经的修复有很好的促进作用。

表1手术后一个月对照组和实验组的神经比较

	对照组	实验组	P值
	对照组	实验组	P值	传导速度(m/s)中段神经轴突个数(个/mm²)中段神经纤维面积(mm²)	0962±42212.77±7.24	17.13±11.262384±79639.66±11.35	P＜0.05P＜0.05P＜0.05

Claims

1、一种等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的神经导管或膜，其特征在于是由生物可吸收降解材料制成的导管或膜，在其表面有一层通过等离子体表面聚合修饰形成的含有作为后一步固定化反应的活性基团的聚合物涂层，再通过共价键将神经再生促进剂化学键合固定在导管或膜的表面，在导管内中间还插入有也经过该修饰固定化处理的与管轴平行的纤维、无纺布或海绵状材料填充物而组成。

2、如权利要求1所述的神经导管或膜，其特征在于所述生物可吸收降解材料可以是胶原、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯，分子量为10-50万。

3、如权利要求1所述的神经导管或膜，其特征在于所述聚合物涂层是由含有氨基、羧基的单体聚合而形成的聚合物涂层。

4、如权利要求3所述的神经导管或膜，其特征在于所述含有氨基、羧基的单体可以是氨基酸、丙烯酰胺、乙烯基乙酸或丙烯酸。

5、如权利要求4所述的神经导管或膜，其特征在于所述的氨基酸可以是丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸。

6、如权利要求1所述的神经导管或膜，其特征在于所述神经再生促进剂可以是睫状神经营养因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子。

7、如权利要求1所述的神经导管或膜，其特征在于所述填充物纤维可以是胶原、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯纤维。

8、如权利要求1所述的神经导管或膜，其特征在于所述导管内填充后孔隙率为90-99％。

9.一种等离子体表面修饰固定化神经再生促进剂的导管或膜的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

1).将生物可吸收降解材料制作成导管或膜

导管的外管径为0.8-5.0mm，管壁厚度为0.05-0.5mm，导管内中间插入有与管轴平行的纤维、无纺布或海绵状材料填充物，管内填充后孔隙率为90-99％；膜厚为0.02-0.05mm；

2).等离子体表面修饰

将导管及填充物或膜置于频率为20KHz-13.56MHz的等离子体的反应器中，对反应器进行脉冲调制，脉冲比为1-99％，放电“开”的时间为1-50ms，通过非聚合性气体将含有氨基、羧基单体配成的浓度为10-100％的水溶液导入反应器中，气体流量为5-150sccm，真空度为5-300Pa，放电功率2-260W，聚合时间0.1-5hr，放电聚合后导管或膜表面形成一层聚合物涂层；

3).神经再生促进剂的固定化反应

将聚合修饰过的导管或膜与碳二亚胺类催化剂室温反应20-100分钟，再与神经再生促进剂于2-10℃，反应15-40hr，进行固定化。

10、如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述生物可吸收降解材料可以是胶原、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯，分子量为10-50万。

11、如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述填充物纤维可以是胶原、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯纤维。

12、如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述非聚合性气体是氩气、氦气、氖气、氮气。

13、如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述含有氨基、羧基的单体可以是氨基酸、丙烯酰胺、乙烯基乙酸或丙烯酸。

14、如权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述的氨基酸可以是丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸。

15、如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述神经再生促进剂可以是睫状神经营养因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子。