KR20190112503A - 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 및 이의 제조방법 - Google Patents

기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라겐 및 단량체가 연속가교되어 다공성을 나타내는 하이드로겔은 단량체의 농도 조절을 통하여 기계적 강도가 조절될 수 있으며, 이렇게 조절된 하이드로겔의 기계적 물성은 세포가 성장, 증식 및 활동에 매우 중요한 세포 생리 조절 인자 임이 확인됨에 따라, 본 발명의 콜라겐 및 단량체가 연속가교된 콜라겐 겔은 다양한 강도의 연령별 인공피부로 제공될 수 있다.

Description

기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 및 이의 제조방법{Hydrogels with controlled mechanical strengths and method for preparing thereof}
본 발명은 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 및 이의 제조방법을 제공한다.
피부는 인체에서 가장 큰 기관으로, 주변 독성물질과 미생물로부터 인체를 보호하고 수분 증발을 방지하는 역할을 한다. 일반적으로 인체의 피부조직은 크게 세 부분으로 나뉘어지는데, 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층과 그 아래층의 진피층, 그리로 피하조직으로 이루어진다. 이 중 표피층은 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막(basement membrane)으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜라닌세포, 면역세포로 이루어지며, 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 이 세포가 분비한 여러 세포외기질(extracellular matrix)로 이루어진다.
상처를 입거나 손상된 피부는 이종조직이식(xenografts), 동종조직이식(allografts) 및 자가이식(autografts)과 같은 다양한 원천으로부터 재생된다. 그러나 항원성 및 주게의 제한적 면적등으로 인해 이와 같은 피부 대체물은 피부 재생 목적을 이루기가 용이하지 못함에 따라, 피부 조직 재생에 관한 조직공학적 접근이 요구되고 있다.
조직공학에서 결정적인 인자는 구조체 제조로, 피부 재생을 유도하는 이상적인 구조체를 제조하기 위해, 생체 재로는 뛰어난 생체적합성, 적절한 마이크로구조, 조절 가능한 생분해성 및 적절한 기계적 특성을 나타내어야 한다.
널리 이용되고 있는 피부 조직 재생용 합성 및 천연 폴리머로는 셀룰로스 유도체, 카라기난(carrageenan), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 실리콘, 알지네이트 및 콜라겐 등이 있다. 특히 콜라겐은 조직공학에 있어서 가장 장래성있는 구조체 재료로, 다양한 교차결합제를 이용하여 구조체의 기계적 성질을 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 뛰어난 생체적합성과 생분해성으로 인해 조직공학에 이용되고 있다.
그러나 가장 천연적인 생체재료인 알지네이트 및 실크 피브로인과 마찬가지로 콜라겐은 실온에서 가공성이 낮고 매우 높은 친수성으로 인해 직접 쾌속성형 공정(direct rapid-prototyping process)으로 제조될 경우, 정확하게 제어된 공극 구조를 갖는 입체 콜라겐 구조체를 얻기 어렵다는 문제점이 있다.
또한, 종래의 인공 진피 구조체는 불안정성을 나타내어 물성 제어에 어려움이 있으며, 인체 피부의 노화에 따른 모사체 제조가 불가능하다.
대한민국공개특허 제10-2011-0032381호 (2011.03.30. 공개)
본 발명은 정확하게 강도가 제어된 입체 콜라겐 구조체를 제공하기 위해, 콜라겐 및 단량체가 연속가교되어 다공성을 나타내는 하이드로겔을 제공하고, 상기 하이드로겔 내 진피세포를 담지시킴으로써 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔을 제공하고자 한다.
본 발명은 콜라겐 및 단량체가 연속가교되어 다공성 기공을 가지는 하이드로겔로 이루어지고, 상기 하이드로겔 내로 진피세포가 담지되는 것을 특징으로 하는, 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 콜라겐 용액 및 완충 용액으로 이루어진 혼합용액을 인큐베이션하여 콜라겐 겔을 제조하는 단계(제1단계); 상기 제1단계에서 제조된 콜라겐 겔에 단량체, 가교제 및 개시제로 이루어진 혼합용액을 도포하고 인큐베이션하는 단계(제2단계); 상기 제2단계의 인큐베이션된 콜라겐 겔에 자외선을 조사하여 콜라겐과 단량체가 연속가교된 하이드로겔을 제조하는 단계(제3단계); 상기 제3단계에서 제조된 하이드로겔을 동결건조시키는 단계(제4단계); 및 상기 동결건조된 하이드로겔에 진피 세포 용액을 도포한 후 인큐베이션하는 단계(제5단계)를 포함하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인공피부용 하이드로겔을 포함하는 인공피부를 제공한다.
본 발명에 따르면, 콜라겐 및 단량체가 연속가교되어 다공성을 나타내는 하이드로겔은 단량체의 농도 조절을 통하여 기계적 강도가 조절될 수 있으며, 이렇게 조절된 하이드로겔의 기계적 물성은 세포가 성장, 증식 및 활동에 매우 중요한 세포 생리 조절 인자 임이 확인됨에 따라, 본 발명의 콜라겐 및 단량체가 연속가교된 콜라겐 겔은 다양한 강도의 연령별 인공피부로 제공될 수 있다.
도 1은 연속가교를 통한 피부 진피세포 담지 콜라겐 겔의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 연속가교된 콜라겐 겔 내 형성된 기공을 확인한 SEM(Scanning electron microscopic) 이미지이다 (scale bars = 1.0 μM).
도 3은 단량체 및 개시제의 농도 변화에 따른 아크릴아마이드(acrylamide, AAm) 하이드로겔의 탄성률 변화 확인 결과이다.
도 4는 연속가교를 통한 하이드로겔 기반의 콜라겐 겔의 탄성률 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 콜라겐 겔의 탄성률에 따른 세포 대사 활성을 확인한 결과이다.
도 6은 겔 강도 따른 글리코사미노글루칸(glycosaminoglycan; GAG) 합성 및 분비 수준을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
콜라겐 겔의 강도를 제어하기 위해서 종래에는 2가 또는 다가 알데하이드(aldehyde)를 갖는 짧은 가교제 (cross-linker)를 사용하였으나, 콜라겐 가교에 참여하지 않고 겔 안에 남아있는 알데하이드 분자단이 세포에 독성을 나타내는 문제점이 확인됨에 따라, 본 발명자들은 인체 또는 세포에 보다 안전하게 콜라겐 겔의 강도를 제어하기 위한 방법을 연구하던 중 생체 재료인 콜라겐과 단량체인 아크릴아마이드가 연속가교된 하이드로겔 기반의 콜라겐 겔을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 콜라겐 및 단량체가 연속가교되어 다공성 기공을 가지는 하이드로겔로 이루어지고, 상기 하이드로겔 내로 진피세포가 담지되는 것을 특징으로 하는, 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔을 제공할 수 있다.
상기 하이드로겔은 총 100 중량부에 대하여, 콜라겐 0.1 내지 1.0 중량부 및 단량체 3 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.
보다 상세하게는 하이드로겔 100 중량부에 대하여, 콜라겐 0.6 중량부 및 단량체 3 내지 10 중량부로 포함되며, 상기 단량체의 농도에 의해 하이드로겔의 기계적 강도가 조절될 수 있다.
상기 단량체는 상기 함량의 범위 이하로 포함될 경우 하이드로겔의 형태를 이루지 못하는 문제점이 야기될 수 있으며, 상기 함량의 범위 이상으로 포함될 경우 기계적 강도가 증가하여 진피 세포의 성장, 증식 및 활동에 대한 문제점이 야기될 수 있다.
상기 단량체는 아크릴아마이드(acrylamide), N-이소프로필아크릴아마이드(N-isopropylacrylamide ), 아크릴산(acrylic acid) 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(Poly(ethylene glycol) diacrylate)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진피 세포는 1 × 104 내지 1 × 106 세포/mL의 농도로 하이드로겔에 담지될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 콜라겐 용액 및 완충 용액으로 이루어진 혼합용액을 인큐베이션하여 콜라겐 겔을 제조하는 단계(제1단계); 상기 제1단계에서 제조된 콜라겐 겔에 단량체, 가교제 및 개시제로 이루어진 혼합용액을 도포하고 인큐베이션하는 단계(제2단계); 상기 제2단계의 인큐베이션된 콜라겐 겔에 자외선을 조사하여 콜라겐과 단량체가 연속가교된 하이드로겔을 제조하는 단계(제3단계); 상기 제3단계에서 제조된 하이드로겔을 동결건조시키는 단계(제4단계); 및 상기 동결건조된 하이드로겔에 진피 세포 용액을 도포한 후 인큐베이션하는 단계(제5단계)를 포함하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 단량체는 콜라겐 겔 100 중량부에 대하여, 3 내지 10 중량부로 포함되며, 상기 단량체의 농도에 의해 하이드로겔의 기계적 강도가 조절될 수 있다.
상기 단량체는 아크릴아마이드(acrylamide), N-이소프로필아크릴아마이드(N-isopropylacrylamide ), 아크릴산(acrylic acid) 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(Poly(ethylene glycol) diacrylate)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 가교제는 메틸렌비스아크릴아마이드(N,N'-methylenebisacrylamide), 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(Poly(ethylene glycol) diacrylate) 및 메타크릴 알지네이트(Methacrylic alginate)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 제3단계의 혼합용액은 개시제를 추가로 더 포함될 수 있다.
상기 개시제는 이르가큐어-2959(Irgacure-2959)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제3단계는 단량체 및 가교제로 이루어진 혼합용액이 도포된 콜라겐 겔에 360 내지 379nm 자외선을 조사하여 콜라겐 내 단량체를 광중합함으로서 콜라겐과 단량체가 연속가교된 하이드로겔을 제조할 수 있다.
상기 제4단계의 하이드로겔을 동결건조시키는 단계는 -120 내지 -125℃, 진공 조건으로 하이드로겔을 동결건조시킬 수 있다.
상기 제5단계의 진피 세포는 1 × 104 내지 1 × 106 세포/mL의 농도로 동결건조된 하이드로겔에 도포될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인공피부용 하이드로겔을 포함하는 인공피부를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 연속가교된 콜라겐 겔 제조 및 특성 확인
1. 연속가교된 콜라겐 겔 제조
4℃ 저온에서 콜라겐 용액(collagen type I, 6.1 mg/ml, Advanced BioMatrix Inc., USA)에 일정량의 RES 완충용액(reconstituting buffer solution; 0.26M NaHCO3(sodiumbicarbonate), 0.2M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 및 0.04M NaOH)을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 순수 콜라겐 겔을 제조하였다.
하이드로겔 기반의 콜라겐 겔을 제조하기 위해, 단량체로 아크릴아마이드(acrylamide, AAm, Sigma, USA), 가교제로 메틸렌비스아크릴아마이드(N,N'-methylenebisacrylamide, MBA, Sigma) 및 개시제로 Irgacure-2959 (Sigma)를 사용하였다.
먼저, 일정량의 콜라겐 용액과 RES 완충용액을 1.0mm 두께를 갖는 두 개의 스페이서가 놓인 석영 판에 도입하고 또 다른 석영 판으로 덮은 후, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 콜라겐 겔을 제조하였다. 이후, AAm 및 MBA 혼합액을 콜라겐 겔에 도포하고 석영 판을 덮어 3분 동안 콜라겐 섬유 사이로 충분히 스며들도록 하였다. 이때, 가교제 MBA의 농도는 0.1 %(w/v)로 고정하고 AAm의 농도를 5 내지 10% (w/v)로 다양하게 조절하였다.
마지막으로 365nm UV(UV lamp, Vilber Lourmat, France)를 10분 동안 조사하여 콜라겐 겔 내부에서 AAm 단량체를 광중합(photo-polymerization)함으로써, 하이드로겔 기반의 콜라겐 겔을 연속가교 방법으로 제조하였다. 이렇게 제조된 겔은 직경 8mm, 두께 1mm로 규격화하여 물성 분석 및 세포 담지 연구에 사용하였다.
연속가교 과정을 거쳐 제조된 콜라겐 겔을 -121℃, 진공 조건에서 동결건조 하여 도 2와 같이 콜라겐 내부에 다공성 기공을 도입하였으며, 건조된 겔을 UV로 10분 동안 멸균(sterilized)시켰다.
2. 연속가교된 콜라겐 겔의 강도확인
상기 실시예 1과 같이 다양한 농도의 단량체를 이용하여 제조된 콜라겐 겔의 물성을 확인하기 위해, 각 콜라겐 겔의 영 탄성률(E, elastic modulus)을 변형률에 대한 응력의 비로 계산하여 각 시료마다 측정된 평균값을 확인하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4와 같이 콜라겐 겔에 연속가교를 통하여 도입된 AAm 농도가 증가됨에 따라, 1.5 kPa에서 3.0 kPa까지 다양한 강도를 갖는 콜라겐 겔이 제조된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 단량체 농도 조절을 통하여 연속가교된 콜라겐 겔을 다양한 강도를 나타내는 피부 구조체로 제공될 수 있음이 확인되었다.
< 실시예 2> 진피세포가 담지된 콜라겐 겔 제조 및 특성 확인
1. 진피세포가 담지된 콜라겐 겔 제조
실시예 1과 같이 제조된 다공성 기공이 도입된 건조 콜라겐 겔은 진피세포 용액을 빠르게 흡수하는 동시에 팽윤(swelling)하기 때문에, 진피세포를 겔 내부에 포집(encapsulation)할 수 있다. 먼저, 진피섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDFs, Gibco, USA)응 M106 (Gibco) 배양액에 2%(v/v) LSGS (low serum growth supplement, Gibco)와 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, P/S, Biowest, France)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 콜라겐 겔 용액 1 ml 당 세포 1.0 × 105 cells 농도로, 건조된 젤 위에 도포(100 μL)하여 20분간 콜라겐 겔을 빠르게 팽윤하는 동시에 겔 내부에 세포를 담지시켰다. 세포를 봉입한 콜라겐 겔은 PBS(phosphate-buffered saline, Biowest)로 2번 세척하고 LSGS 및 P/S가 첨가된 M106 배양액에서 2주 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
2. 진피세포가 담지된 콜라겐 겔 내 세포 대사활동 수준 확인
2주간의 인큐베이션 배양 후 1.5 kPa를 나타내는 콜라겐 겔에서 세포의 대사활동 수준을 기준으로하여 각각의 콜라겐 겔에서 겔 강도에 따른 세포 대사활동 수준을 표준화하였다.
그 결과, 도 5와 같이 1.5 kPa와 비교하여 3.0 kPa의 겔에서 세포 대사활동이 약 2배 정도 감소된 것으로 확인됨에 따라, 겔의 강도가 증가할수록 세포 대사활동 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
3. 진피세포가 담지된 콜라겐 겔 내 글리코사미노글루칸 (GAG) 합성 수준 확인
콜라겐 겔 내부에서 겔 강도에 따른 세포의 글리코사미노글루칸(glycosaminoglycan; GAG) 합성 및 분비 수준을 확인하였다.
다양한 강도의 콜라겐 겔 내부에서 세포들이 합성 및 분비한 GAG를 수준을 확인하기 위해, 각 콜라겐 겔을 알시안 블루(alcian blue)로 염색한 후, 염색 정도를 ImageJ로 분석하고 기준 GAG 농도와 비교하여, 겔 강도에 따른 상대적인 GAG 발현 수준을 각 겔의 세포수로 표준화하여 나타내었다.
그 결과, 도 5B와 같이 1.5 kPa의 강도를 갖는 순수 콜라겐 겔에서는 5×104 cells 당, 약 8.1 μg/ml의 GAG가 분비되었으나, 강도가 2배 증가한 3.0 kPa의 콜라겐 겔에서는 5×104 cells 당, 약 17.3 μg/ml로 GAG 분비량이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
앞서 확인한 도 4의 세포 증식 결과와 비교해 볼 때, 강도가 증가한 겔에서 세포 성장 및 증식은 감소되었지만 GAG 합성 및 분비는 활성화된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 콜라겐 겔의 기계적 물성은 세포가 성장, 증식 및 활동에 매우 중요한 세포 생리 조절 인자 임을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 본 발명의 연속가교된 콜라겐 겔은 다양한 강도를 갖는 인공피부로 제공될 수 있음이 확인되었다.
< 비교예 1> 콜라겐 용액, 완충 용액 및 하이드로겔 혼합용액을 이용하여 동시가교된 콜라겐 젤의 특성 확인
콜라겐 용액, 완충 용액 및 단량체 용액을 혼합한 혼합액을 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 콜라겐 겔 형성을 유도하였다.
이후, 365nm UV를 조사하여 AAm 단량체를 광중합하여 동시가교된 하이드로겔 기반의 콜라겐 겔을 제조하였다.
상기 실시예 2와 같은 과정으로 동결건조 후 진피세포 담지 및 배양을 수행하였다.
그 결과, 콜라겐 용액, 완충 용액 및 하이드로겔 혼합용액을 이용한 콜라겐 겔에서는 콜라겐 섬유의 형성이 잘 이루어지지 않았으며, 이는 기계적 강도는 제어할 수 있으나, 진피세포와 세포외기질 간 접착이 잘 이루어지지 않아 세포 성장, 증식 및 활동에 제한이 될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 콜라겐 및 단량체가 연속가교되어 다공성 기공을 가지는 하이드로겔로 이루어지고, 상기 하이드로겔 내로 진피세포가 담지되는 것을 특징으로 하는, 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 총 100 중량부에 대하여, 콜라겐 0.1 내지 1.0 중량부 및 단량체 3 내지 10 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 인공피부용 하이드로겔.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 단량체의 농도에 의해 하이드로겔의 기계적 강도가 조절되는 것을 특징으로 하는 인공피부용 하이드로겔.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 단량체는 아크릴아마이드(acrylamide), N-이소프로필아크릴아마이드(N-isopropylacrylamide ), 아크릴산(acrylic acid) 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(Poly(ethylene glycol) diacrylate)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인공피부용 하이드로겔.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 진피 세포는 1 × 104 내지 1 × 106 세포/mL의 농도로 하이드로겔에 담지되는 것을 특징으로 하는 인공피부용 하이드로겔.
  6. 콜라겐 용액 및 완충 용액으로 이루어진 혼합용액을 인큐베이션하여 콜라겐 겔을 제조하는 단계(제1단계);
    상기 제1단계에서 제조된 콜라겐 겔에 단량체 및 가교제로 이루어진 혼합용액을 도포하고 인큐베이션하는 단계(제2단계);
    상기 제2단계의 인큐베이션된 콜라겐 겔에 자외선을 조사하여 콜라겐과 단량체가 연속가교된 하이드로겔을 제조하는 단계(제3단계);
    상기 제3단계에서 제조된 하이드로겔을 동결건조시키는 단계(제4단계); 및
    상기 동결건조된 하이드로겔에 진피 세포 용액을 도포한 후 인큐베이션하는 단계(제5단계)를 포함하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단량체는 콜라겐 겔 100 중량부에 대하여, 3 내지 10 중량부로 포함되며, 상기 단량체의 농도에 의해 하이드로겔의 기계적 강도가 조절되는 것을 특징으로 하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 단량체는 아크릴아마이드(acrylamide), N-이소프로필아크릴아마이드(N-isopropylacrylamide ), 아크릴산(acrylic acid) 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(Poly(ethylene glycol) diacrylate)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 제3단계는 단량체 및 가교제로 이루어진 혼합용액이 도포된 콜라겐 겔에 360 내지 379nm 자외선을 조사하여 콜라겐 내 단량체를 광중합함으로서 콜라겐과 단량체가 연속가교된 하이드로겔을 제조하는 것을 특징으로 하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 제3단계의 혼합용액은 개시제를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 제4단계의 하이드로겔을 동결건조시키는 단계는 -120 내지 -125℃, 진공 조건으로 하이드로겔을 동결건조시키는 것을 특징으로 하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법.
  12. 청구항 6에 있어서, 상기 제5단계의 진피 세포는 1 × 104 내지 1 × 106 세포/mL의 농도로 동결건조된 하이드로겔에 도포되는 것을 특징으로 하는 기계적 강도가 제어된 인공피부용 하이드로겔 제조방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 5항 중 어느 한 항에 따른 인공피부용 하이드로겔을 포함하는 인공피부.
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