CN103230369B - 一种针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂及其制备方法 - Google Patents
一种针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂。该核酸适配子纳米制剂为由壳聚糖和核酸适配子组成的球形微粒，壳聚糖包裹核酸适配子，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比大于20∶1；所述核酸适配子纳米制剂的粒径为100～300nm，电位为+4～+28mV；所述核酸适配子为Seq58。本发明还提供所述核酸适配子纳米制剂的制备方法。本发明针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂能竞争性地抑制TGF-β与其受体TβRⅡ结合，并具有良好的血清稳定性及缓释性，有望成为抗青光眼滤过术后瘢痕形成及防治其他纤维化相关疾病的新型生物工程药物。
Description
技术领域
本发明属于生物工程药物和药剂学领域，特别是涉及一种针对转化生长因子βⅡ型受体(transforming growth factor-β receptor Ⅱ,TβR Ⅱ)的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP(chitosan(Seq58)-nanoparticle)及其制备方法。
背景技术
青光眼是一种常见的不可逆性致盲眼病，是人类的第二大致盲性疾病，病理性眼压升高是其主要特点。目前临床上主要使用药物、激光和手术治疗的方法来降低眼压。滤过性手术被证明是适合于药物降眼压无效患者的最佳手术方法。与其它手术不同，青光眼滤过术后并不希望伤口完全修复，而是形成不完全愈合，以便房水外流，但该手术失败率高达15％-30％，主要原因是滤过通道瘢痕的形成。针对青光眼滤过手术后瘢痕的形成,目前主要的对抗手段是术中、术后采用抗瘢痕药物,临床上应用较广泛的是抗代谢药丝裂霉素C(mitomycin,MMC)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)等，这类药物能有效提高青光眼术后的早期滤过，但其毒副作用不容忽视，常出现较多的并发症，如滤过泡渗漏、角膜上皮缺损、持续性低眼压等。因此，寻找一种疗效好、特异性强且毒副作用小的抗瘢痕药物已成为近年来青光眼研究的热点。
研究发现，瘢痕化的发生及发展与多种致纤维化因子的活性密切相关，如TGF-β、PDGF、FGF、VEGF等，其中转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)占主要地位[1]，其亚型TGF-β2在眼部瘢痕疾病的发生中又起主要作用[2]。TGF-β与其受体TβRⅡ(转化生长因子βⅡ型受体)结合作为始动环节，促使成纤维细胞转分化为具有收缩功能的肌成纤维细胞，在瘢痕化的发生中起着关键作用[3]。因此，对抗TGF-β的生物学作用在减少瘢痕形成及防止组织纤维化中有着极其重要的意义。对抗TGF-β的现有策略主要包括：(1)干预配体TGF-β的表达水平及活性；(2)利用受体拮抗剂阻断TGF-β与其Ⅱ型受体TβRⅡ的结合，阻止TGF-β信号传入细胞；(3)干预TGF-β受体后信号传递途径。
目前已有很多关于配体TGF-β的特异性抗体[4]、反义寡核苷酸(ASODN)[5]以及小分子干扰RNA(siRNA)[6]的相关研究，大部分结果都显示可减少青光眼滤过术后的结膜瘢痕形成，但在实际应用中各有利弊。单抗对TGF-β的阻封效果较弱，在体内容易被降解且多次用药有免疫原性；ASODN和siRNA可以减少TGF-β蛋白的生成，但是动物实验中其组织特异性和穿膜效率差，其应用还有待研究。
利用受体拮抗剂阻断TGF-β与其Ⅱ型受体TβRⅡ的结合，阻止TGF-β信号传入细胞，不失为一种可以尝试的方法。本发明的申请人通过计算机联网检索，仅检索到2篇关于TGF-βⅢ型受体核酸适配子的文献[7,8]，并未检索到与TβRⅡ相关的抗体及适配子的文献。同时，该两篇关于TGF-βⅢ型受体核酸适配子的文献筛选TβRⅢ适配子的目的仅是用作细胞标记物，与抗瘢痕并无关系。通过配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SELEX)，从大容量的随机寡核苷酸库中筛选出对靶分子具有高度结合能力的寡核苷酸，这些寡核苷酸被称之为核酸适配子(aptamer,又称适配体)。适配子因其自身独特的空间构象，能够与特定的靶分子相结合，包括蛋白质、核酸、小分子有机物、金属离子等。核酸适配子由于具有高亲和力、高特异性、易体外合成等特点，已在基础研究、临床诊断与治疗以及新药研发等诸多领域展示了广阔的应用前景。
因此，本发明的申请人应用SELEX技术，从大容量的随机寡核苷酸库中获得了高亲和力、高特异性的靶向TβRⅡ的核酸适配子—Seq58，并通过作用于人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)，证明了Seq58可阻碍TGF-β与TβRⅡ结合。但是核酸适配子普遍存在易被核酸酶降解、作用时效短等缺点[9]。化学性修饰，例如硫代修饰能够增强核酸的稳定性，但同时增强了其细胞毒性及非特异效应。因此，选择一种有效且安全的方法来保持核酸适配子的生物活性，显得很有必要。壳聚糖(chitosan)作为一种天然的可生物降解的线性聚合物，来源丰富，理化性质相对稳定，因为其良好的生物降解性、生物相容性、较低的免疫原性，以及突出的大分子粘附能力，近年被广泛应用于大分子、核酸、蛋白质的载体研究中[10]。已有研究发现壳聚糖纳米化后作为寡核苷酸的载体，可有效保护寡核苷酸免于被核酸酶所降解。因此，将壳聚糖纳米微粒作为核酸适配子Seq58的载体，有望成为保持并延长Seq58生物活性的一种理想手段。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂，即核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP，并通过实验初步评价所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP对抗血清核酸酶及缓释适配子的能力、与细胞结合的情况以及其生物活性。
本发明的再一目的是提供所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的制备方法。
本发明的还一目的是提供所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的用途。
为实现上述目的，本发明采取如下措施：
本发明所述针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP为由壳聚糖和核酸适配子组成的球形微粒，壳聚糖包裹核酸适配子，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比大于20∶1；所述核酸适配子纳米制剂的粒径为100～300nm，电位为+4～+28mV；所述核酸适配子为Seq58。
优选地，本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比为20～30∶1。
优选地，本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP中壳聚糖的平均分子量为100000～200000，脱乙酰度>90％。
本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的制备方法，包括如下步骤：
(1)核酸适配子的制备
将核酸适配子Seq58充分溶解于TE缓冲液中，得1nmol/μl的核酸适配子溶液，-20℃冷藏备用；
(2)壳聚糖溶液的制备
精密称取平均分子量为100000～200000，脱乙酰度>90％的壳聚糖溶于2％醋酸中，其中醋酸用量按照壳聚糖质量∶醋酸体积＝1g∶200～300mL计算，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值至5～6，加入双蒸水至壳聚糖的浓度为1.5～2.0mg/ml，用0.22μm一次性针头式滤器过滤后，置于无菌小瓶中，4℃冷藏备用，得壳聚糖溶液；
(3)核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的制备
将步骤(1)制备的1nmol/μl核酸适配子溶液加入到1.0～1.5ml三聚磷酸钠溶液中，所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的浓度为0.9mg/ml，得混合液；用5号针头将该混合液逐滴滴入到2.0～3.5ml步骤(2)制备的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比大于20∶1，滴加速度为40～50滴/min，至溶液出现白色乳光，再向其中滴加0.04～0.06ml Tween-80(2％，v/v)，并加入双蒸水，定容至6ml，室温孵育30min，最后用0.22μm一次性针头式滤器过滤后，置于无菌小瓶中，4℃冷藏备用，即得核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP。
本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的生物活性与使用浓度有关。当CS(Seq58)-NP使用浓度大于25nM时，能够明显地抑制成纤维细胞的增殖及转分化。
本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP可按本领域已知方法制成对抗斑痕形成的外用凝胶制剂，所述外用凝胶制剂为透明质酸钠凝胶、壳聚糖凝胶或聚丙烯酸凝胶，所述外用凝胶制剂中核酸适配子纳米制剂的浓度为大于25nM。
本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP可按本领域已知方法制成对抗斑痕形成的外用生物膜制剂，所述外用生物膜制剂为透明质酸钠膜、壳聚糖膜或脂质体膜，所述外用生物膜制剂中核酸适配子纳米制剂的浓度为大于25nM。
本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP可用于制备应用于实验室及临床的TβRⅡ检测试剂盒。
本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP可与药学上可以接受的辅料或其它药物组成组合物。
优选地，上述所述的组合物为由核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP与缓释材料组成的组合物。
本发明通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及体外缓释的方法评价所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP对抗血清核酸酶及缓释适配子的能力，表明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP能够对抗血清超过48小时，CS(Seq58)-NP能够缓释核酸适配子Seq58超过96小时；接着通过荧光标记CS(Seq58)-NP，及与人tenon’s囊成纤维细胞共培养，评价CS(Seq58)-NP与细胞结合的情况，表明CS(Seq58)-NP能与TβRⅡ特异性结合；进一步对CS(Seq58)-NP的生物活性研究表明，CS(Seq58)-NP能抑制成纤维细胞增殖达35.1％；在血清存在的情况下，CS(Seq58)-NP能够明显抑制人tenon’s囊成纤维细胞的转分化超过36小时，抑制率达44.8％，远高于未经包裹时的裸核酸适配子Seq58。
亦即是说，本发明所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP能竞争性地抑制TGF-β与其受体TβRⅡ结合，并具有良好的血清稳定性及缓释性，有望成为抗青光眼滤过术后瘢痕形成及防治其他纤维化相关疾病的新型生物工程药物。
本发明的实施对严重危害人类健康的青光眼及其他纤维化相关疾病的预防及治疗具有重要的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP对抗血清的能力。
图2为核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的缓释能力。
图3为荧光标记以后的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP与细胞的结合情况。
图4为核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP抑制成纤维细胞增殖的能力。
图5为核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP抑制成纤维细胞转分化的能力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的发明内容作进一步的详细描述。应理解，本发明的实施例只用于说明本发明而非限制本发明，在不脱离本发明技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1 核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的制备
(1)核酸适配子溶液的制备
将上海生工生物工程技术服务有限公司合成的核酸适配子序列Seq58充分溶解于TE缓冲液中，得1nmol/μl的核酸适配子溶液，-20℃冷藏备用；
(2)壳聚糖溶液的制备
精密称取平均分子量为100000～200000，脱乙酰度>90％的壳聚糖溶于2％醋酸中，其中醋酸用量按照壳聚糖质量∶醋酸体积＝1g∶200～300mL计算，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值至5～6，加入双蒸水至壳聚糖的浓度为1.5～2.0mg/ml，用0.22μm一次性针头式滤器过滤后，置于无菌小瓶中，4℃冷藏备用，得壳聚糖溶液；
(3)核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的制备
将步骤(1)制备的1nmol/μl核酸适配子溶液加入到1.0～1.5ml交联剂三聚磷酸钠溶液中，所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的浓度为0.9mg/ml，得混合液；用5号针头将该混合液逐滴滴入到2.0～3.5ml步骤(2)制备的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1，滴加速度为40～50滴/min，至溶液出现白色乳光，再向其中滴加0.04～0.06mlTween-80(2％，v/v)，并加入双蒸水定容至6ml，室温孵育30min，最后用0.22μm一次性针头式滤器过滤后，置于无菌小瓶中，4℃冷藏备用，即得不同壳聚糖∶Seq58摩尔比的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP。
本实施例制备的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP为球形微粒，粒径为100～300nm，电位为+4～+28mV。
实施例2 核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的血清稳定性验证
取适量实施例1制得的各CS(Seq58)-NP，以及未经包裹的裸Seq58加入到EP管中，保持各EP管中Seq58含量为0.018nmol，用双蒸水定容至0.9ml(各管中Seq58终浓度都为20nM)；再向各EP管中加入0.1ml胎牛血清，空白对照组不加血清，每个壳聚糖∶Seq58摩尔比的CS(Seq58)-NP均设5管；将各EP管置于37℃水浴中，每隔一定时间段(2小时、6小时、12小时、24小时、48小时)从每组EP管中各取1支EP管，置于65℃水浴10min以灭活血清酶的活性，再向其中加入5μl肝素钠(1000IU/ml)以解析出CS(Seq58)-NP中的Seq58；每组充分混匀后取40μl上样，行聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％，含7M尿素)，在1×TBE溶液中恒压200V电泳1h；电泳完毕后，将凝胶置于1∶10000的SYBR-Green II染料中染色40min，最后于凝胶成像系统下观察未被酶解的Seq58条带。
结果表明，按不同壳聚糖∶Seq58摩尔比制备的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP在血清中的稳定性不同，说明各组制剂对抗血清核酸酶的能力各不相同(见图1)。其中，壳聚糖∶Seq58摩尔比为20及30的CS(Seq58)-NP，在经过48小时的反应以后，仍然有一半左右的Seq58未受到血清酶的降解，表明按壳聚糖∶Seq58摩尔比20及以上制备出的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP具有良好的血清稳定性，能保护适配子Seq58免于核酸酶降解。
实施例3 核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的缓释能力验证
取适量实施例1制备的各壳聚糖∶Seq58摩尔比的CS(Seq58)-NP，加入到EP管中，保持各管中Seq58含量为0.02nmol，用pH＝7的PBS定容至1ml；将各管置于37℃恒温摇床上，每隔一定时间段(12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时)取出各管于4℃下离心1小时(10000rpm)，取0.8ml上清液在260nm处测定吸光度，计算该时间段释放出的Seq58含量，再补加0.8ml PBS缓冲液回EP管，继续放回37℃恒温摇床上，最后计算各时间点累计释放Seq58百分率，以累计释放Seq58百分率对时间作图。
结果表明，按不同壳聚糖∶Seq58摩尔比制备的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的缓释能力各不相同，缓释时间大致与壳聚糖的含量成正比(见图2)。其中，壳聚糖∶Seq58摩尔比为20及30的CS(Seq58)-NP，96小时时尚未释放完所有的Seq58，但壳聚糖∶Seq58摩尔比为20及30的CS(Seq58)-NP缓释情况并无统计学差异，表明壳聚糖∶Seq58摩尔比为20及以上的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP具有良好的缓释能力，能够缓释Seq58超过96小时。本发明申请人优选壳聚糖∶Seq58摩尔比为20的CS(Seq58)-NP，因为壳聚糖含量增高会降低CS(Seq58)-NP的载药量。
实施例4 核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的细胞结合能力验证
按实施例1的方法制备壳聚糖∶Seq58摩尔比为20及以上的CS(Seq58)-NP，在交联的过程中加入荧光蛋白FITC，制得荧光标记的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP-FITC；以乱序的Seq58(Scrambled Seq58)作为对照组，也按实施例1的方法制备出CS(Scra)-NP-FITC。
取第4代人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)，1×105个细胞每孔接种于6孔板，于37℃二氧化碳孵箱中孵育24小时；将荧光标记的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP-FITC及对照组CS(Scra)-NP-FITC分别加入6孔板中，与细胞共同孵育2小时；2小时后使用PBS于摇床上洗涤三遍，每遍10分钟，再加入4％多聚甲醛固定细胞，封片液封片；最后于激光共聚焦显微镜下观察CS(Seq58)-NP-FITC及CS(Scra)-NP-FITC与细胞的结合情况。
结果表明，激光共聚焦显微镜下能够观察到荧光标记的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP-FITC呈绿色荧光，并且与细胞排列相一致；而使用乱序Seq58制备出的CS(Scra)-NP-FITC组几乎无荧光信号(见图3)，表明核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP能够特异性与转化生长因子βⅡ型受体(TβRⅡ)结合。
实施例5 核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP抑制成纤维细胞增殖的能力验证
按实施例1的方法制备壳聚糖︰Seq58摩尔比为20及以上的CS(Seq58)-NP。
取第4代人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)，1×104个细胞每孔接种于96孔板，于37℃二氧化碳孵箱中孵育24小时。各孔分别加入浓度为5、10、25、50、100nM的CS(Seq58)-NP，并加入2ng/ml的TGF-β2，共同刺激细胞48小时，对照组为相应浓度的空白壳聚糖CS-NP加入2ng/ml的TGF-β2，阴性对照组只加培养基，阳性对照组只加TGF-β2；每组设3个副孔，48小时以后，按MTT试剂盒说明书进行操作。最后于酶标仪上检测各孔在570nm处的吸光度；细胞相对增值率＝(Asample-ADMEM/ATGF-β2-ADMEM)×100。
结果表明，核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP能够明显抑制成纤维细胞的增殖，并且与浓度呈正相关(见图4)。相比之下空白壳聚糖也具有轻微的抑制成纤维细胞增殖的能力，但比CS(Seq58)-NP弱很多。当核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP使用浓度为25nM，50nM，100nM时，能够抑制成纤维细胞的增殖分别达25.8％，32.4％，35.1％，即当核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP使用浓度大于25nM时，能够明显地抑制成纤维细胞的增殖。
实施例6核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP抑制成纤维细胞转分化的能力验证
按实施例1的方法制备壳聚糖︰Seq58摩尔比为20及以上的CS(Seq58)-NP。
取第4代人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)，使用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基于50ml细胞培养瓶中培养，待细胞长至70％融合左右，按如下分组刺激细胞：2ng/ml的TGF-β2，2ng/ml的TGF-β2+25nM的Seq58，以及2ng/ml的TGF-β2+25nM的CS(Seq58)-NP，分别刺激细胞6小时，12小时，24小时，48小时。刺激结束以后，裂解细胞，提取总蛋白，Western Blot法检测各组细胞中α-SMA(成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞的标志性蛋白)的表达情况。
结果表明，在血清存在的情况下，未经包裹的裸Seq58仅能抑制TGF-β2介导的HTFs转分化12小时左右，而制成核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP以后，能够抑制TGF-β2介导的HTFs转分化超过36小时，抑制率达44.8％(见图5)。
实施例7核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的用途
取本发明核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP，按本领域常规方法制成对抗斑痕形成的透明质酸钠凝胶、壳聚糖凝胶、聚丙烯酸凝胶等外用凝胶制剂，其外用凝胶制剂中核酸适配子纳米制剂的浓度为大于25nM。
取本发明核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP，按本领域常规方法制成对抗斑痕形成的透明质酸钠膜、壳聚糖膜或脂质体膜等外用生物膜制剂，其外用生物膜制剂中核酸适配子纳米制剂的浓度为大于25nM。
取本发明核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP按本领域常规方法制备成应用于实验室及临床的TβRⅡ检测试剂盒。
本发明核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP还可与药学上可以接受的辅料或其它药物组成组合物，包括与缓释材料组成的组合物。
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[10]Katas H,Alpar HO.Development and characterisation of chitosannanoparticles for siRNA delivery.J Control Release,2006,115:216-225.
该专利由国家自然科学基金面上项目(81170852)、全军医学科技“十二五”科研项目(CWS11J137)资助。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院
<120> 一种针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂及其制备方法
<160> 1
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Seq58
acattgctgc gtgatcgcct cacatgggtt tgtctggtcg atttggaggt ggtgggtggc 60
Claims (8)
1.一种针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂，其特征在于：所述核酸适配子纳米制剂为由壳聚糖和核酸适配子组成的球形微粒，壳聚糖包裹核酸适配子，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比为20∶1；所述核酸适配子纳米制剂的粒径为100～300nm，电位为+4～+28mV；所述核酸适配子为Seq58。
2.根据权利要求1所述的一种针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂，其特征在于：所述壳聚糖的平均分子量为100000～200000，脱乙酰度>90％。
3.一种制备如权利要求1所述的针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂的方法，包括如下步骤：
(1)核酸适配子溶液的制备
将核酸适配子Seq58充分溶解于TE缓冲液中，得1nmol/μl的核酸适配子溶液，-20℃冷藏备用；
(2)壳聚糖溶液的制备
精密称取平均分子量为100000～200000，脱乙酰度>90％的壳聚糖溶于2％醋酸中，其中醋酸用量按照壳聚糖质量∶醋酸体积＝1g∶200～300mL计算，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值至5～6，再加入双蒸水至壳聚糖的浓度为1.5～2.0mg/ml；用0.22μm一次性针头式滤器过滤后，置于无菌小瓶中，4℃冷藏备用，得壳聚糖溶液；
(3)核酸适配子纳米制剂的制备
将步骤(1)制备的1nmol/μl核酸适配子溶液加入到1.0～1.5ml三聚磷酸钠溶液中，所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的浓度为0.9mg/ml，得混合液；用5号针头将该混合液逐滴滴入到2.0～3.5ml步骤(2)制备的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比为20∶1，滴加速度为40～50滴/min，至溶液出现白色乳光，再向其中滴加体积比为2％的0.04～0.06ml Tween-80，并加入双蒸水，定容至6ml，室温孵育30min，最后用0.22μm一次性针头式滤器过滤后，置于无菌小瓶中，4℃冷藏备用，即得针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂。
4.权利要求1或2所述的针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂用于制备体外抑制成纤维细胞增殖及转分化的凝胶制剂的用途，其特征在于：所述凝胶制剂为透明质酸钠凝胶、壳聚糖凝胶或聚丙烯酸凝胶，所述凝胶制剂中针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂的浓度为大于25nM。
5.权利要求1或2所述的针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂用于制备体外抑制成纤维细胞增殖及转分化的生物膜制剂的用途，其特征在于：所述生物膜制剂为透明质酸钠膜、壳聚糖膜或脂质体膜，所述生物膜制剂中针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂的浓度为大于25nM。
6.权利要求1或2所述的针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂用于制备应用于实验室及临床的转化生长因子βⅡ型受体检测试剂盒的用途。
7.权利要求1或2所述的针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂与药学上可以接受的辅料或其它药物组成的组合物。
8.根据权利要求7所述的针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂与药学上可以接受的辅料或其它药物组成的组合物，其特征在于：所述组合物由针对转化生长因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂与缓释材料组成。
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