KR101453064B1 - 의료용 비분해성 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법 - Google Patents

의료용 비분해성 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 불소계 고분자, 폴리실세스퀴녹세인 및 폴리페놀 함유 폴리실세스퀴녹세인을 포함하는 골조직 재생용 비분해성 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생체적합성, 기계적 강도, 유연성, 다공성, 항염증 및 항산화 활성을 갖는 비분해성 나노섬유 멤브레인을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

의료용 비분해성 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법{The nondegradable nano-fibers membrane for medical and method of manufacturing therof}
본 발명은 골조직 재생 효과가 뛰어난 비분해성 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 불소계 고분자, 폴리실세스퀴녹세인 및 에피갈로카테친갈레이트를 포함함으로써, 우수한 생체적합성, 기계적 강도, 유연성, 다공성, 항염증 및 항산화 활성을 갖는 비분해성 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
폴리실세스퀴녹세인(polyhedral oligomeric silsesquioxane; POSS)는 유기-무기 혼성물질로서 케이지의 안쪽부분(core)은 실리카로 되어있고 바깥부분은 8개의 유기작용기로 둘러싸여 있는 1-3nm 크기의 독특한 구조를 지닌 화합물로써 POSS 바깥쪽의 유기작용기로 인하여 다양한 유기용매에 잘 녹고, 고분자와의 상용도도 우수하기 때문에 유기물질과 혼성화를 가역적으로 만들 수 있는 장점이 있다(Kyung-Min Kim, Organic-inorganic nanocomposites of polystyrene with polyhedral oligomeric silsesquioxane, Polymer,30:5 380-384, 2006). 따라서, 유기화합물을 POSS 분자를 통합(incorporation) 시킴으로써 세포 생체이용률(bioavailability) 및 분화(differentiation)를 유리하게 하는 나노적 토폴로지(nanoscopic topology)를 제공이 가능하다.
POSS 분자와 같은 고도로 강성이고, 형태 특이적이며(shape specific), 화학적으로 적응시킬 수 있는(tailorable) 나노구조는, 표면 특성을 나노스케일로 조화시키므로 모든 살균법과 적합한 표면을 제공한다. 시험관내(in vitro) 면역조직화학 실험을 통해 특정 타입의 POSS 나노구조가 뼈 기질 세포(bone stroma cell; BSC)의 증식 및 분화 및 애퍼타이트(apatite)의 침전을 유발하는 것으로 나타났다. BSC의 이러한 증식 및 분화는 적당한 형태의 POSS 나노구조가 생물활성(bioactive)이며 따라서 또한 생체적합성(biocompatible) 및 재흡수성(resorbable)이라는 암시를 제공한다(Yu-Mi Ha, Novel silicificated PVAc/POSS composite nanofibrous mat via facile electrospinning technique: Potential scaffold for hard tissue engineering, Colloids And Surfaces B: Biointerfaces, 102, 795-802, 2013).
최근 임플란트의 보급이 대중화 되면서 손상된 골조직을 복원하기 위하여 적절한 멤브레인을 사용하여 골조직의 성장을 촉진함과 동시에 연조직의 침입을 막아 충분한 골조직의 재생이 가능한 공간을 확보해 주는 골유도재생술에 관한 연구가 진행 중이다. 이러한 골유도재생술에는 골조직재생의 촉진과 더불어 연조직의 침입을 막기 위해 공간을 확보할 수 있는 우수한 강도의 멤브레인이 핵심이다.
현재 생체적합성을 가진 비분해성 고분자를 이용하여 골조직 재생용 나노섬유 멤브레인을 제조하고, 골유도재생술에 적용하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
전기방사법을 이용하여 제조된 나노섬유형 소재는 높은 비표면적을 지니고 있으며 세포외기질(ECM)과 유사한 구조로 인하여 단백질 흡착 및 초기 세포 부착반응에 탁월하다고 알려져 있다.
폴리실세스퀴녹세인을 이용한 종래의 기술로서는 대한민국 특허출원 제10-2007-7027092호에서 폴리실세스퀴녹세인을 포함하는 신체 모방물질 및 그 제조방법에 관하여 개시하였다. 또, 대한민국 특허출원 제10-2010-0129445호에서는 실크단백질을 이용한 치주 골조직 유도 재생용 차폐막 및 그 제조방법에 관하여 개시하였다.
하지만 상기 종래기술들은 폴리실세스퀴녹세인이나 실크단백질 단독으로 사용된 골조직 재생 기능성 차폐막 제조방법만을 개시하였을 뿐, 생체적합성, 항염증 및 항산화 활성을 갖도록 폴리실세스퀴녹세인에 폴리페놀을 결합시켜 기능성과 강도를 증대시킨 골조직 재생용 나노섬유 멤브레인을 제조하기 위한 어떠한 암시도 개시된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은, 생체적합성, 유연성, 다공성, 항염증 및 항산화 활성을 갖는 강도가 증대된 골조직 재생용 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은, 용매에 불소계 고분자를 용해시켜 전기방사 용액을 형성하는 단계와; 효소반응을 이용하여 폴리페놀 함유 폴리실세스퀴녹세인 합성물(P/E 합성물)을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 P/E 합성물을 불소계 고분자 용액에 분산시켜 비분해성 나노섬유 멤브레인을 수득하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 비분해성 나노섬유 멤브레인의 골 조직재생 효과를 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 생체적합성, 유연성, 다공성, 항염증 및 항산화 활성을 갖는 강도가 증대된 골조직 재생용 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명 P/E 합성물 제조 반응식을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명 P/E 합성물 및 POSS와 EGCG의 UV/vis spectrometer 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 P/E합성물의 NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 (a) 비교예 1 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인, (b) 비교예 2의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (c) 제조예 1의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (d) 제조예 2의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (e) 제조예 3의 비분해성 나노섬유 멤브레인의 SEM 촬영 사진도이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 비분해성 나노섬유 멤브레인 (a)-(e)의 XPS측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 비분해성 나노섬유 멤브레인 (a)-(e)의 ATR-FTIR측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 비분해성 나노섬유 멤브레인 (a)-(e)의 세포 증식력 및 부착력 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 비분해성 나노섬유 멤브레인 (a)-(e)의 세포의 증식력 및 부착력을 나타낸 SEM 촬영 사진도이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 비분해성 나노섬유 멤브레인 (a)-(e)의 세포의 분화력 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 상기 도 3에 따른 비분해성 나노섬유 멤브레인 (a)-(e)의 항염증성 측정 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 비분해성 나노섬유 멤브레인 (b) 및 (e)의 생리식염수의 피내유도 실험 결과를 나타낸 그래프이다
도 12는 본 발명에 따라 제조된 비분해성 나노섬유 멤브레인 (b) 및 (e)의 피외유도 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에 따르면, 불소계 고분자, 에피갈로카테친갈레이트 등 폴리페놀 함유 폴리실세스퀴녹세인(이하 P/E 합성물이라 한다)을 포함한다.
본 발명에 따르면, 폴리실세스퀴녹세인은 아미노프로필아이소부틸 폴리실세스퀴녹세인 (Aminopropylisobutyl POSS), 아미노프로필아이소옥틸 폴리실세스퀴녹세인 (Aminopropylisooctyl POSS), 아미노프로필페닐 폴리실세스퀴녹세인 (Aminopropylphenyl POSS), 아미노에틸아미노프로필아이소부틸 폴리실세스퀴녹세인 (Aminoethylaminopropylisobutyl POSS), 옥타아미노페닐 폴리실세스퀴녹세인 (Octaaminophenyl POSS), 옥타암모늄 폴리실세스퀴녹세인 (Octaammonium POSS), 아미노페닐사이클로헥실 폴리실세스퀴녹세인 (Aminophenyl cyclohexyl POSS), 아미노페닐아이소부틸 폴리실세스퀴녹세인 (Aminophenyl isobutyl POSS)중 선택되는 1종 또는 2종 이여도 무관하다.
본 발명에 따르면, 불소계 고분자 용해를 목적으로 사용하는 용매는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVdF)를 용해시켜 전기방사한 것이용매는 염화 메틸렌 (methylene chloride), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone), 아니솔 (anisole), 아세트산 에틸(ethyl acetate), 아세트산 메틸(methylacetate), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone), 헥사플루오로이소프로판올 (hexafluoroisopropanol), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 2-피롤리돈(2-pyrollidone), 구연산 트리에틸(triethyl citrate), 유산 에틸(ethyl lactate), 프로필렌 카보네이트(propylene carbonate), 벤질 알코올(benzyl alcohol), 벤조산 벤질(benzyl benzoate), 미글리올 810(Miglyol810), 이소프로판올(isopropanol), 에탄올(ethanol), 초임계 이산화탄소(super critical carbon dioxide), 아세토니트릴(acetonitrile) 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 용매여도 무관하다.
본 발명에 따르면, P/E 합성물/불소계 고분자로 이루어진 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인의 생체적합성, 유연성, 다공성, 항염증 및 항산화 활성은 폴리실세스퀴녹세인/불소계 고분자로 이루어진 복합 지지체보다 70% 이상의 현저히 우수한 활성을 갖는다.
본 발명에 있어서 폴리페놀은 카테친, 에피카테친, 에피갈로카테친, 에피카테친갈레이트, 에피갈로카테친갈레이트, 안토시아닌, 아이소푸무론, 아이소플라본, 쿠르쿠민, 클로로겐산, 카페인산, 퀘르세틴, 루틴, 크리신, 아피제닌, 루데올린, 캠페롤, 미리세틴, 나린진, 나린제닌, 제니스틴, 택시폴린, 시아니딘, 아피제니딘, 헤스페리딘 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상 이어도 무관하다.
본 명세서에 달리 정의하지 않는 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당 업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시예 또는 실험예에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라, 다른 형태, 예를 들어, "가지는", “이루어지는” 및 "구성되는"는 제한적이지 않다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 바람직한 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 본 발명 P/E 합성물제조
폴리실세스퀴녹세인(POSS, Hybrid Plastics) 0.175g을 테트라하이드로퓨란(THF) 10mL에 용해하여 0.2mM POSS용액을 제조하였다. 그리고 에피갈로카테친갈레이트(EGCG, Sigma-Aldrich Co.) 0.183g을 이소프로필 알코올(IPA) 7.5mL에 용해하여 제조한 0.4mM EGCG 용액을 증류수 7.5mL에 희석하여 0.2mM EGCG용액을 제조하였다. 상기 제조한 0.2mM POSS용액과 0.2mM EGCG용액을 부피비 2:3(v/v)으로 혼합하여 POSS/EGCG 혼합용액을 제조하였다.
이와 별도로 호스래디시 퍼옥시다아제(HRP) 4mg을 증류수 1mL에 용해하여 제조한 HRP 용액 1mL을 상기 제조한 POSS/EGCG 혼합용액 25mL과 혼합하여 탈수소반응을 위한 반응액을 제조하였다.
상기 반응액에 0.5% 과산화수소(v/v)를 2mL/h의 속도로 3시간 동안 투입하여 도 1에 나타낸 바와 같이 탈수소반응을 시키고 반응이 끝난 합성용액은 회전 농축기를 사용하여 증발시켜 수득한 고농도로 농축된 갈색의 반투명한 합성용액은 증류수 200mL와 혼합하여 합성물을 침전시킨 다음 원심분리하여 상등액을 제거하고, 또 다시 미반응물을 제거하기 위해서 초음파 세척 후에 원심분리하여 상등액을 재차 게거하였다. 이들 실험을 3회 이상 실시하여 미반응 물질을 완전히 제거하고자 하였다. 세척이 끝난 합성물은 48시간 동안 40℃에서 진공건조하여 분말상태의 POSS에 EGCG가 결합된 본 발명 POSS-EGCG합성물(P/E)을 제조하였다.
제조예 1: 본 발명 P/E 합성물을 고분자 중량 대비 2중량%를 포함하는 불소계 고분자 나노섬유
디메틸폼아마이드(DMF) 6mL과 THF 4mL로 혼합된 혼합용매에 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVdF) 1.8g을 넣고 60℃에서 8시간 교반시켜 고분자 용액을 제조하였다.
상기 제조된 고분자 용액에 상기 실시예 1에 따라 제조된 본 발명 P/E 합성물을 PVdF 고분자 무게 대비 2 중량%(36mg)로 THF 1mL에 용해한 다음, 고분자 용액과 혼합한 다음 8시간 상온에서 교반시켜 고분자 용액:P/E 합성물 혼합물을 제조한 다음 전기방사 함으로써 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인을 제조하였다. 전기방사는 전압 18kV, 방사거리 16cm, 용액 방사 속도는 2mL/h로 고정하여 수행하였다.
제조예 2: 본 발명 P/E 합성물을 고분자 중량대비 4중량%를 포함하는 불소계 고분자 나노섬유
본 발명 P/E 합성물을 고분자대비 중량 대비 4 중량%로 사용하는 것을 제외하고는, 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 비분해성 나노섬유 멤브레인을 제조하였다.
제조예 3: 본 발명 P/E 합성물을 고분자 중량대비 6중량%를 포함하는 불소계 고분자 나노섬유
본 발명 P/E 합성물을 고분자 중량 대비 6중량%로 사용하는 것을 제외하고는, 상기 제조예 1 또는 2와 동일한 방법으로 비분해성 나노섬유 멤브레인을 제조하였다.
비교예 1: 불소계 고분자 나노섬유
POSS 또는 P/E합성물을 사용하지 않는 것을 제외하고는, 상기 제조예 1 내지 3과 동일한 방법으로 비분해성 나노섬유 멤브레인을 제조하였다.
비교예 2: POSS 만을 포함하는 불소계 고분자 나노섬유
POSS를 고분자 중량 대비 6 중량%로 사용하는 것을 제외하고는, 상기 제조예 1 내지 3과 동일한 방법으로 비분해성 나노섬유 멤브레인을 제조하였다.
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< 실시예 2> 본 발명 P/E 합성물을 포함하는 불소계 고분자 나노섬유의 특성분석
본 실시예 2의 모든 관찰, 분석 실험 결과는 (a) 비교예 1의 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인, (b) 비교예 2의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (c) 제조예 1의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (d) 제조예 2의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (e) 제조예 3의 비분해성 나노섬유 멤브레인의 순서로 나타냈다.
실험예 1: 본 발명 P/E 합성물의 화학적 특성 및 구조분석
상기 실시예 1에 따라 제조한 본 발명 P/E합성물의 화학적 특성과 구조는 UV-visible spectrometer(U-2900, Hitachi)와 핵자기공명(NMR, AVANCE Ⅲ 400, Bruker Biospin, NMR 1H 400MHz)을 이용하여 측정하였다.
분석결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 EGCG에 기인하는 214 nm의 흡수피크가 P/E합성물에서는 223 nm에 이동하고, 또 275nm 부근의 흡수피크가 P/E합성물에서 동일농도임에도 불구하고 흡광도가 높게 나타나는 것으로부터 POSS에 EGCG가 잘 도입되었다는 것을 확인할 수 있었다.
또, 본 발명 P/E합성물의 구조는 도 3 NMR 스펙트럼에 나타난 바와 같이 P/E합성물의 POSS구조에 기인하는 피크가 0.94ppm, 1.83ppm, 0.58ppm, 1.56ppm, 2.88ppm에서 확인되었고, EGCG의 H6과 H8에 해당하는 6.17ppm의 피크를 제외한 모든 피크를 확인할 수 있었다. 상기와 같은 NMR 측정 결과는 EGCG와 POSS를 합성하는 과정에 POSS의 아미노기가 EGCG의 H6과 H8의 위치에 결합하게 되면서 해당 피크가 사라진 것으로 사료된다.
실험예 2: 본 발명 P/E 합성물이 포함된 비분해성 나노섬유 멤브레인의 표면분석
본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인들의 형태를 분석은 상기 제조예 1 내지 제조예 3 및 비교예 1과 비교예 2에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인 각 표면을 주사전자현미경(SEM, JSM-6335F, JEOL, 15.0kV, ×5,000), X선 광전자 분광법(XPS, Quanter SXM, ULVAC-PHI, 280eV) 및 전반사 측정 푸리에 변환 적외선 분광법(ATR-FTIR, ALPHA, Bruker Optics, 300-4000nm)을 이용하여 관찰하는 방법을 통하여 수행하였다.
관찰결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 (a) PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인의 경우 무질서한 방향으로 섬유가 배열된 부직포 형태이며, 비드(bead)가 없는 섬유상을 나타냄을 알 수 있었다. (b) POSS의 첨가 여부에 따른 섬유직경의 변화 및 비드의 발생이 발견되지 않는 것으로 보아 POSS가 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인 내에 성공적으로 분포되었음을 알 수 있었다. 도 4(c) 내지 (e)로부터, 다양한 농도의 P/E 합성물의 첨가에 의한 섬유직경의 변화 및 비드의 발생이 발견되지 않는 것으로 보아 P/E 합성물이 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인 내에 성공적으로 분포되었음을 알 수 있었다
상기 제조예 1 내지 제조예 3 및 비교예 1과 비교예2에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인의 원소 정보는 XPS를 이용하여 측정하였다.
분석결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 (a)PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인의 경우 285eV 부근에서 C1s 피크, 688eV 부근에서 F1s피크를 확인하였다. 도 5 (b) 내지 (e)로부터 POSS 또는 P/E 합성물의 경우 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인과 동일한 특성을 나타내는 피크가 확인되었고 400eV 부근에서 N1s피크, 532eV 부근에서 O1s피크가 관찰됨으로써 EGCG를 포함 또는 비 포함하는 POSS 합성물이 성공적으로 포함되었음을 확인할 수 있었다.
상기 제조예 1 내지 제조예 3 및 비교예 1과 비교예 2에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인의 흡광도는 ATR-FTIR을 사용하여 측정하였다.
측정결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 (a) PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인의 경우 501, 627, 766, 1278cm-1 부근에서 C-F stretching 피크, 855, 877, 1076, 1163cm-1 부근에서 C-H stretching 피크를 확인하였다. 도 6 (b) 내지 (e)로부터 POSS 또는 P/E 합성물의 경우에도 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인과 동일한 특성을 나타내는 피크가 확인되었고 1120cm-1 부근에서 Si-O-Si cage 피크가 관찰됨으로써 POSS 또는 P/E 합성물이 성공적으로 PVdF 비분해성 나노섬유에 혼합되었음을 확인하였다.
실험예 3: 본 발명 P/E 합성물이 포함된 비분해성 나노섬유 멤브레인의 생체적합성 조사
상기 제조예 1 내지 제조예 3 및 비교예 1과 비교예 2에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인의 생체적합성은 골형성 전구세포 (MC3T3-E1, ATCC)를 사용하여 평가하였다.
세포의 증식력과 부착력 측정
골형성 전구세포는 10% 우태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 α-MEM에서 배양되었다.
상기 제조예 1 내지 제조예 3 및 비교예 1에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인은 UV를 이용하여 멸균처리 한 다음 무균상태에서 75%, 50%, 25% 에탄올로 각 각 소독하고 인산완충식염수(PBS)를 이용하여 2회 세척하여 준비하였다.
상기 방법에 따라 멸균된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인을 24-well 플레이트 바닥에 밀착시킨 다음, 세포 접착이 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인의 표면에서만 일어날 수 있도록, 유리링을 비분해성 나노섬유 멤브레인 위에 밀착시켰다. 상기와 같이 준비된 세포배양용 24 -well 플레이트에 골형성 전구세포를 2 × 104cells/well의 농도로 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인에 올려진 유리링 안쪽으로 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 환경에서 4시간, 1, 3, 5, 7일 동안 각각 배양하여 세포의 부착 및 증식 능력을 MTT법을 이용하여 평가하였다.
평가결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 조골세포의 초기 4시간 내지 1일 부착은 (a)PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인과 (b)POSS 또는 (c 내지 e)P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인에서 큰 차이 없이 비슷한 경향을 나타내었다.
그러나 3일이 경과한 이후부터 본 발명 P/E 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인 6(c)-6(e)의 부착률 증가 속도가 (a)PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인과 (b)POSS만을 함유한 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인보다 현저하게 빠르게 진행되었다.
상기와 같은 결과는 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인에 존재하는 EGCG(폴리페놀)-세포간의 상호작용을 통해 세포의 증식 및 부착거동이 더욱 활발하게 이루어 졌기 때문이라고 사료된다.
또, 본 발명 P/E 합성물 첨가농도별로 나타난 결과는 6중량% 함유된 본 발명 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(e)의 생체적합성이 가장 우수하게 나타났다.
생체적합성 평가결과는 도 8에 나타낸 바와 같이 조골세포의 초기 점착은 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(a)과 POSS 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(b) 보다 P/E합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인 (c 내지 e)이 조금 많은 세포의 부착률을 나타냈다.
하지만 3일이 경과한 이후부터는 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(a)과 POSS만을 함유한 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인 (b)은 큰 성장을 보이지 않는데 반해, 본 발명 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인 (c 내지 e)은 세포의 증가 속도가 현저하게 빠르게 진행되었다.
이는 본 발명 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(c 내지 e) 내에 존재하는 EGCG(폴리페놀)-세포간의 상호작용을 통해 세포의 증식 및 부착거동이 더욱 활발해 졌기 때문이라고 사료된다.
또, 본 발명 P/E 합성물 첨가농도별로 나타난 결과는 P/E 합성물이 6중량% 함유된 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(e)의 생체적합성이 가장 우수하게 나타났다.
세포의 분화력 측정
본 발명 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인의 조골세포의 분화능 평가는 알칼린 포스파타제(ALP) 활성 실험을 이용하여 검정하였다.
상기 실험예 세포의 증식력과 부착력 측정과 동일한 방법으로 준비된 세포배양용 24-well 플레이트에 조골세포를 5 × 104cells/well의 농도로 분주하고, 배지로는 10% 우태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 α-MEM을 사용하여 3, 5, 7, 14, 21일 동안 각각 배양하였다. 상기 각각의 기간 동안 세포를 배양한 다음에 배지를 제거하고 나노섬유 멤브레인 표면에 남아있는 세포를 계면활성제를 이용하여 용해시키고 이들 용해물의 상층액을 취하여 ALP Assay KIT (DALP-250, GENTAUR)를 이용하여 흡광도를 측정함으로 인해 ALP 활성 정도를 측정하였다. 단, 필요한 부분에서는 부분적으로 본 실험에 적합하도록 재설계하였다. 재현성 검토를 위해서 각 비분해성 나노섬유 멤브레인마다 동일한 시료를 사용하여 상기 모든 세포 테스트를 수행하였다.
실험결과, 도 9에 나타난 바와 같이 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(a)과 비교했을 때, POSS만을 함유한 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(b)은 조골세포 분화에 거의 영향을 주지 않았다. 하지만, 본 발명 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(c 내지 e)의 조골세포 분화가 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인 (a)과 POSS만을 함유한 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(b)보다 활발하여 14일 이후부터 흡광도가 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
또, 본 발명 P/E 합성물 첨가농도별로 나타난 결과는 P/E 합성물이 6중량% 함유된 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(e)의 조골세포 분화력이 가장 높게 나타났다.
항염증활성 평가
상기 제조예 1 내지 제조예 3 및 비교예 1에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인의 항염증 활성은 리포폴리사카라이드(LPS)로 염증반응이 유도된 mouse유래 탐식세포인 RAW264.7 세포를 이용하여 검정하였다.
Murine macrophage cell line인 RAW264.7 세포를 페니실린(100 IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)과 10%의 FBS를 함유한 DMEM 배지를 이용해서 1 × 105 cells/well 조절한 후, 상기 제조예 1 내지 제조예 3 및 비교예 1 및 비교예2에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인이 들어가 있는 24-well 플레이트에 접종하고, 5% CO2 및 37℃에서 24시간 동안 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 새로운 배지를 1mL 처리 후 30분간 CO2 인큐베이터에서 배양 후 100 ㎕의 LPS(최종농도 1 ㎍/㎖)를 함유한 배지를 처리하여 인큐베이터(5% CO2, 37℃)에서 24시간 동안 배양하였다.
IL-6의 정량은 LPS로 염증반응이 유도된 Raw 264.7 세포(1 × 105 cells/well)의 배양액을 이용하여 실시하였다. 상기 배양 배지 50 ㎕를 IL-6 단백질 항체가 부착된 플레이트에 분주 한 다음 ELISA kit(R&D Systems)를 통하여 측정하였다.
실험결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 본 발명 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(c 내지 e)의 항염증 활성이 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(a) 및 POSS만 함유된 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인(b)에 비해 70% 이상 활성이 높게 나타났다.
< 실시예 3> 본 발명 P/E 합성물을 포함하는 불소계 고분자 나노섬유의 생물학적 안정성 조사
본 실시예 3의 실험 결과는 (a) 비교예 1의 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인, (b) 비교예 2의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (c) 제조예 1의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (d) 제조예 2의 비분해성 나노섬유 멤브레인, (e) 제조예 3의 비분해성 나노섬유 멤브레인의 순서로 나타냈다.
실험예 4: 급성 및 아급성 독성시험
실험동물
5주령 SD rat(대한바이오링크)을 25±1℃, 습도 50±5%, 12 L/12 D의 명암주기가 유지되는 환경에서 일주일간 적응시킨 다음 실험군 당 3개체 씩으로 하여 급성 실험을 수행하였다.
추출액 제조
상기 제조예 1 내지 제조예 3 및 비교예 1과 비교예 2에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인 각 4g을 생리식염수 20mL를 추출 용매로 이용하여 각각 37도 항온수조에서 72시간 동안 진탕하여 추출액을 제조하였다.
상기 추출액 5mL/kg(100% 추출액 이용)을 SD rat 꼬리 정맥으로 주입하고 7일 동안 치사율, 자율운동성, 공격성, 비정형운동성, 수면이상 등의 반응을 관찰하였다.
상기 추출액 5mL/kg(100% 추출액 이용)을 SD rat 꼬리 정맥으로 주입하고 7일 동안 치사율, 자율운동성, 공격성, 비정형운동성, 수면이상 등의 반응을 관찰하였다.
실험결과, 하기 표 1 내지 3에 나타낸 바와 같이 상기 제조예 2 및 제조예 3과 비교예 2에 따라 제조된 본 발명 비분해성 나노섬유 멤브레인 모든 나노섬유 멤브레인에서 독성 반응이 없는 것으로 나타났다.
본 발명 제조예 2에 따라 제조된 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인의 독성평가 결과
치사율 자율운동성 공격성 비정형운동성 수면이상
주사직후 없음 없음 없음 없음 없음
1시간 없음 없음 없음 없음 없음
3시간 없음 없음 없음 없음 없음
24시간 없음 없음 없음 없음 없음
2일 없음 없음 없음 없음 없음
4일 없음 없음 없음 없음 없음
5일 없음 없음 없음 없음 없음
6일 없음 없음 없음 없음 없음
7일 없음 없음 없음 없음 없음
본 발명 제조예 3에 따라 제조된 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인의 독성평가 결과
치사율 자율운동성 공격성 비정형운동성 수면이상
주사직후 없음 없음 없음 없음 없음
1시간 없음 없음 없음 없음 없음
3시간 없음 없음 없음 없음 없음
24시간 없음 없음 없음 없음 없음
2일 없음 없음 없음 없음 없음
4일 없음 없음 없음 없음 없음
5일 없음 없음 없음 없음 없음
6일 없음 없음 없음 없음 없음
7일 없음 없음 없음 없음 없음
본 발명 비교예 2에 따라 제조된 P/E 합성물 함유 PVdF 비분해성 나노섬유 멤브레인의 독성평가 결과
치사율 자율운동성 공격성 비정형운동성 수면이상
주사직후 없음 없음 없음 없음 없음
1시간 없음 없음 없음 없음 없음
3시간 없음 없음 없음 없음 없음
24시간 없음 없음 없음 없음 없음
2일 없음 없음 없음 없음 없음
4일 없음 없음 없음 없음 없음
5일 없음 없음 없음 없음 없음
6일 없음 없음 없음 없음 없음
7일 없음 없음 없음 없음 없음
실험예 5: 지연성 과민반응 시험
실험동물
5주령 SD rat(대한바이오링크)을 25±1℃, 습도 50±5%, 12 L/12 D의 명암주기가 유지되는 환경에서 일주일간 적응시킨 다음 실험군 당 3개체 씩 하여 지연성 과민반응 시험을 수행하였다.
피내유도단계
상기 제조예 3 및 비교예 2에 따라 제조된 나노섬유 멤브레인의 추출액 2종을 각각 SD rat의 견갑골 부위에 상기추출액을 생리식염수를 이용하여 10%로 묽혀 2mL/kg으로 진피 주사하여 투여하고 투여 후 7일 동안 관찰하였다
관찰결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 실험군 모두에서 홍반이나 부종이 나타나지 않았다.
피외유도단계
상기 제조예 3 및 비교예 2에 따라 제조된 나노섬유 멤브레인의 추출액을 생리식염수를 이용하여 10%로 묽히고 이들 용액을 각각 여과종이(3M, 2cm × 3cm)에 충분히 적셔 SD rat의 피부표면에 붙여서 occlusive dressing 실시하고 48시간 후에 드레싱을 제거하여 본 발명 나노섬유 멤브레인의 추출액에 의한 변화를 확인하였다.
실험결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 patch를 붙인 부분에 아무런 이상이 나타나지 않았으며 실험군 모두 정상적인 피부상태를 관찰할 수 있었다.
본 발명은 불소계 고분자, 폴리실세스퀴녹세인 및 에피갈로카테친갈레이트함유 폴리실세스퀴녹세인을 포함하는 골조직 재생용 비분해성 나노섬유 멤브레인 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생체적합성, 기계적 강도, 유연성, 다공성, 항염증 및 항산화 활성을 갖는 비분해성 나노섬유 멤브레인을 제공함으로 생물의약소재산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims (9)

  1. 폴리실세스퀴녹세인 용액과 폴리페놀 용액을 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 혼합용액에 호스래디시 퍼옥시다아제 탈수소효소 용액을 첨가한 다음 과산화수소를 투입하여 탈수소반응을 유도하는 단계와; 상기 탈수소화반응을 통하여 수득한 반응액의 용매를 농축기로 증발시켜 폴리페놀 함유 폴리실세스퀴녹세인(P/E) 합성물을 수득하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 P/E 합성물을 증류수로 혼합한 다음 침전시키고 이를 원심분리하여 상등액을 제거하고 P/E 합성물의 침전물을 수득하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 침전물을 증류수로 세척하여 잔량의 불순물을 제거하고 파우더상태의 P/E 합성물을 얻는 단계와; 이와 별도로 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVdF) 고분자 용액을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 고분자용액과 P/E 합성물을 혼합한 혼합물을 전기방사하는 단계를 포함하는 것이 특징인 비분해성 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 폴리실세스퀴녹세인 용액과 폴리페놀 용액 혼합물의 혼합비가 1:1 내지 1:2 (mol:mol)인 것이 특징인 비분해성 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
  5. 제 1항 또는 제 4항 중 어느 하나의 방법에 따라 제조된 것이 특징인 비분해성 나노섬유 멤브레인.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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IHARA, N. et al., APPL. MICROBIAL. BIOTECHNOL.(2005) Vol.66, pp.430-433 *
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