JP5620631B2 - 細胞培養用足場材料、その製造方法、細胞培養用モジュール - Google Patents

Description

本発明は、医薬品、化学物質、化粧品等の物質の薬効試験、毒性試験、安全性試験を、容易かつ迅速に行うための細胞培養用足場材料、その製造方法、及びこの細胞培養用足場材料を用いた細胞培養用モジュールに関する。

従来から、医薬品、化学物質、化粧品等の、人体に影響を及ぼす可能性のある物質については、薬効試験、毒性試験、安全性試験が必要とされ、通常これらの試験には種々の動物を用いた動物実験が行われている。しかし、動物実験はヒトと動物種の違いや、動物の個体差を考慮しなければならず、データの信頼性の点から、多くの実験を繰り返す必要があり、それに伴い経費や試験時間を要するとともに、試験に供する多数の動物の確保や飼育する場所と手間がかかるなどの問題があった。特に、薬物の代謝系がヒトに近いとされているブタのような大型の動物を大量に共試することは、実質的に不可能である。さらに最近では、動物実験においても動物愛護の機運が高まりつつあり、以上のような問題の解決策として、動物の培養細胞を用いた評価試験法、すなわち動物実験代替法が開発されている。

生体外で細胞を効率的に培養するためには、培養細胞に栄養と空気（酸素）を補給する必要がある。その例として、中空糸膜を用いて細胞培養に必要な栄養分や空気（酸素）を供給する手法が提案されている（特許文献１）。これによれば、選択透過性を有する中空糸膜とガス透過性を有する中空糸膜を用いることにより、培養液と酸素を細胞培養空間に供給することが開示されている。しかしながら、細胞培養の効率は高まるものの培養液体中に細胞が存在するため、有用物質の生産等には好適であるが、培養細胞が組織を形成することが難しく、動物実験代替法には適用することは困難であった。

動物細胞、特に付着性動物細胞を高密度で培養する方法として、半透膜機能を有する中空繊維と繊維状細胞支持体を用いた細胞培養器が提案されている（特許文献２）。しかしながら、用いる中空繊維は細胞の産生するタンパク様物質を透過しない半透膜であるため、細胞の代謝物等のモニタリングには好ましくない。また、繊維状細胞支持体は細胞培養容器に固定された状態で中空繊維の間隙に配置されているため、培養細胞への中空繊維からの栄養分補給や代謝老廃物の回収効率に劣るものであった。

細胞組織体の形成を促進するため、中空糸の内腔または外腔に遠心力を用いて細胞を高密度に充填し、かつ中空糸を利用して酸素や栄養分の供給、代謝老廃物の除去が提案されている（特許文献３）。しかしながらこの方法では、充填した細胞と中空糸が直接接するため、中空糸表面が細胞吸着によって閉塞し、酸素や栄養の供給、代謝老廃物の除去が不十分であるという問題があった。

近年、ナノオーダーの繊維径を有するナノファイバーを、細胞培養や組織形成の足場材料として用いることが注目されており（非特許文献１、非特許文献２）、例えば、溶融紡糸によって作製されたナノファイバーを足場材料に用いる方法が開示されている（特許文献４）。また、有機系ナノファイバーを溶媒に分散した混合液を利用してナノファイバーのパターンを形成し、さらには細胞培養に有効な機能性薬剤をこのパターンに吸着させることにより、細胞の接着、増殖、分化を制御する方法が提案されている（特許文献５）。しかしながら、これらの方法では、細胞の成育に必要な栄養分や空気（酸素）を補給することまでは考慮されていなかった。

培養液を供給する中空糸と、細胞を培養するための不織布などの多孔性担体を有する細胞培養用モジュールは、既に提案されている（特許文献６）。しかしながらこの方法は、中空糸モジュール内に多孔性担体が配置されるだけであり、必ずしも培養液を供給する中空糸と多孔性担体が近接していないため、細胞分泌物は保持しやすいが、栄養の補給効率が悪く、代謝老廃物の除去は全く不十分であった。

さらに、多孔質中空糸膜の内腔に細胞を充填し、栄養分とともに中空糸外部に化学物質や薬剤などの被験物質を流し、被験物質の細胞による代謝や代謝速度をモニタリングする試験方法および装置が知られている（特許文献７）。しかしながらこの方法では、充填した細胞と中空糸が直接接するため、やはり中空糸表面が細胞吸着によって閉塞し、酸素や栄養の供給、代謝老廃物の除去が不十分となるという問題があった。

特許第３０２６５１６号 特開２００２−１１２７６３号 特許第３７２５１４７号 特開２００６−２５４７２２号 特開２００７−４４１４９号 特開２００３−１８０３３４号 特開２０００−１８９１８９号 高分子，５５，３，１４２（２００６） Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．，１１，１０１（２００５）

本発明は、上記に挙げた課題を解決しようとするものであり、細胞培養において、十分な栄養分や空気（酸素）の供給、代謝老廃物の除去、細胞増殖促進能を有する細胞培養用足場材料、その製造方法、及びこの足場材料を用いた細胞培養用モジュールを提供することを目的とする。

本発明は、中空糸膜がメッシュ状に配置され、該中空糸膜外表面上及び／又は該中空糸膜間に、単繊維の直径が１〜１０００ｎｍのナノファイバーが配置された、細胞培養足場材料に関する。
さらに本発明は、メッシュ状に配置した中空糸膜をノズルとターゲットの間に配置して、ナノファイバーをエレクトロスピニングする、上記細胞培養足場材料の製造方法に関する。
また本発明は、上記の細胞培養足場材料を用いた、細胞培養用モジュールに関する。

本発明によれば、効率的に細胞を培養することが可能であることに加え、その代謝老廃物をオンラインでモニタリングすることも可能であり、化学物質や薬物などの動物代替実験法などによる試験を効率的に行うことができる。

以下、本発明の好適な実施の形態について説明する。
本発明の細胞培養用足場材料は、メッシュ上に配置した中空糸膜上、あるいは中空糸膜で形成されたメッシュの空隙部内に、単繊維の直径が１〜１０００ｎｍのナノファイバーを配置したものである。

中空糸膜の膜基材ポリマーとしては、中空糸膜状に成形できるものであればよく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスルフォン、ポリアリルスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリアクリロニトリル、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、２種類以上のポリマーの混合物等が挙げられる。

中空糸膜の外径は、５０μｍ以上３０００μｍ以下が好ましく、１００μｍ以上２０００μｍ以下がより好ましい。このような範囲を超えた場合、外径が５０μｍ未満の場合は、中空糸膜の中空部分が小さくなるために、例えば培養液を送液する際の差圧が大きくなり、代謝老廃物の除去が不十分になるなどの問題が生じるおそれがあり、外径が３０００μｍ以上になると、単位体積に占める中空糸膜の表面積が小さくなるため、例えば培養細胞への栄養供給やガス供給が不十分になるおそれがある。

中空糸膜の膜厚は、５μｍ以上５００μｍ以下が好ましい。膜厚が５μｍ以下の場合、栄養供給やガス供給の際の加圧により中空糸膜が破壊するおそれがあり、膜厚が５００μｍ以上の場合はろ過抵抗が大きくなり、培養細胞への栄養供給やガス供給、代謝老廃物の除去が不十分になるおそれがある。なお、中空糸膜が多層膜である場合の膜厚は、各層の膜厚の総和（全層の膜厚）である。
中空糸膜の内径は、中空糸膜の外径と膜厚によるため一概には言えないが、通常１０μｍ以上である。

中空糸膜としては、精密ろ過膜、限外ろ過膜、ガス分離膜などを用いることができる。これらは必要に応じて適宜選択することができるが、例えば精密ろ過膜を用いることにより培養細胞に栄養分を補給することができ、ガス分離膜を用いることにより培養細胞に酸素を含むガスを供給することができる。

特定の物質を細胞に供給したり、特定の代謝老廃物を除去したりするために、物質選択透過性を有する中空糸膜を用いることができる。この物質選択透過性を有する中空糸膜としては、上述の精密ろ過膜や限外ろ過膜を挙げることができ、さらに、膜素材そのものに物質選択透過性を有する中空糸膜や、中空部分に選択透過性を有する物質が充填された多孔質中空糸膜を挙げることができる。
このような物質選択透過性を有する中空糸膜を用いることによって、培養液中の特定成分や化学物質や薬物などの被験物質を培養細胞に効率的に供給することが可能となり、老廃物や代謝物を系外に排出させて、これをモニタリングすることも可能となる。

培養細胞に効率的に空気、酸素、およびその他のガスを選択的に供給するため、上述のように、ガス分離膜を用いることができる。ガス供給は多孔質中空糸膜を用いても可能であるが、例えばガス分離機能を有する非多孔性の基材を、多孔性の基材で支持した中空糸膜等が好適である。このようなガス分離機能を有する中空糸膜を用いることにより、培養液中にバブルレスでガスを供給できるので、培養細胞へのダメージを防止できる。また、培養液などの液体が中空糸の中空部分に入り込んで中空部を閉塞することを防止することができる。

本発明においては、親水化処理された中空糸膜を用いることができる。中空糸膜を親水化処理することにより、培養液などの液体成分の供給を容易にすることができ、中空糸膜表面への細胞接着を制御することができる。中空糸膜を親水化処理する方法としては、例えば中空糸膜をエチレン−ビニルアルコール共重合体などの親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理することが挙げられる。

本発明の細胞培養用足場材料では、２種類以上の中空糸膜を用いることもできる。例えば、栄養を供給するための精密ろ過膜、気体を供給するためのガス分離膜、特定の成分を培養細胞に供給したりあるいは特定成分の代謝老廃物を排出するための物質選択透過性中空糸膜を、任意に組み合わせることができる。

本発明で用いる中空糸膜は、メッシュ状に配置する。例えば、所定の間隔でシート状に配置した中空糸膜と、これに対して概ね直行する方向に所定の間隔でシート状に配置した中空糸膜を配置して、中空糸膜をメッシュ状に配置することができる。メッシュ状に配置する中空糸膜のシートの層数は特に制限されないが、２層以上１０層以下が好ましい。２種類以上の中空糸膜でメッシュを形成する場合、種類の異なる中空糸膜を同一中空糸膜シート中に混在させても良いし、同一中空糸膜をシート状に配置した後に、シート状に配置した種類の異なる中空糸膜を積層することによってメッシュを形成させることも可能である。中空糸膜を介して所望の液体や気体を供給、あるいは代謝老廃物を除去するためにどのような中空糸膜のメッシュとするかは、本発明の細胞培養足場材料をモジュール化する際のポート部の設計に依存する。

本発明ではナノファイバーを使用する。ナノファイバーの直径は１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下が好ましく、２０ｎｍ以上３００ｎｍ以下がより好ましい。単繊維の直径がこのような範囲を外れた場合、１ｎｍ未満では単繊維の強度が不足するおそれがあり、１０００ｎｍ以上では比表面積の効果が不十分になるおそれがある。ナノファイバーの特徴の一つは比表面積の大きさであり、単繊維の直径が小さくなるほど指数関数的に比表面積が大きくなり、吸着特性が大きくなることから、培養細胞の足場材料として好適である。ナノファイバー基材については特に制限されないが、ナノファイバー紡糸の観点からは、溶剤可溶性のポリマーが好ましい。しかし、本発明で使用するナノファイバーの紡糸方法は特に限定されるものではなく、湿式紡糸、溶融紡糸、エレクトロスピニング等の方法を適宜選択することができる。

本発明におけるナノファイバーの単繊維の直径は、以下のようにして測定することができる。まず、ナノファイバー、またはその集合体の表面を電子顕微鏡を用いて観察する。電子顕微鏡としては、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）が好ましい。観察倍率は５０００倍〜５万倍程度である。観察倍率が５０００倍未満であると、ナノファイバーの繊維径の決定が困難になる。次いで、得られたＳＥＭ写真よりナノファイバーの単繊維の直径を求める。単繊維の直径は、ＳＥＭ写真中任意の２０本のナノファイバー表面の幅を計測し、その平均をナノファイバー単繊維の直径とする。
単繊維の直径を求める際には、画像解析ソフトを用いることが好ましい。画像解析ソフトによって得られる単繊維の直径は、画像解析のための画質調整、画像解析ソフトの種類等によって若干変動があるが、その差は通常の実験誤差の範囲内である。

本発明のナノファイバーには、生理活性物質を吸着または固定することにより、例えば、培養細胞の接着、増殖、分化、機能発現の制御を行うことができる。生理活性物質としては、機能性ポリマー、アミノ酸、タンパク質、糖鎖、ビタミン類などが挙げられる。特に、細胞培養に有効な生理活性物質、例えば細胞の増殖、分化、機能発現に重要な役割を有する生理活性物質の総称であるサイトカインを用いると効果的である。サイトカインとしては、インターロイキン、増血因子、増殖因子などが挙げられる。あるいは、細胞−細胞外マトリックス、細胞−細胞間の接着に関与するインテグリン、カドヘリンなどの細胞接着基質を用いることも効果的である。また、薬剤や化学物質などの被験物質をナノファイバーに吸着または固定することによって、細胞培養試験を行うことも可能である。

メッシュ状に配置された中空糸膜の外表面上、及び／又は膜間にナノファイバーを配置し、本発明の細胞培養足場材料を得る方法としては、例えば、中空糸膜シート上あるいは中空糸膜メッシュ上にナノファイバーを配置し、この上に別の中空糸膜シートあるいは中空糸膜メッシュを積層する方法や、予めナノファイバーで覆われた中空糸膜をメッシュ状にする方法を挙げることができる。
また、本発明の細胞培養足場材料は、ナノファイバーを溶媒中に分散させた混合液を、中空糸膜メッシュ上に滴下したり、この混合液中に中空糸膜メッシュを配置、あるいは中空糸膜が浸漬された溶媒中にナノファイバーを分散させ、溶媒を除去したりすることによって、中空糸膜のメッシュ上および、または中空糸膜のメッシュの空隙内にナノファイバーを配置させることによっても得ることができる。

また、本発明の細胞培養足場材料は、複数のナノファイバーからなるシート状物をメッシュ状に配置した中空糸膜上に配置し、これを積層することによって得ることができる。このシート状物は、ナノファイバーを抄紙したり、ナノファイバーの紡糸方法の一つであるエレクトロスピニング法を適用したりすることによって得ることができる。
このシート状物の製造方法は適宜選択することができるが、エレクトロスピニング法を採用した場合には、ナノファイバーの紡糸と同時にシート状物の成形を行うことができる。

さらに、以下に説明する通り、メッシュ状に配置した中空糸膜の存在下で、ナノファイバーを紡糸することも可能である。
従って、本発明においては、細胞培養足場材料の製造方法としてエレクトロスピニング法を採用するのが、この製造が効率的にできる点で特に好ましい。

ここで、エレクトロスピング法を用いた本発明の細胞培養足場材料の製造方法について、簡単に説明する。エレクトロスピンング法の基本的な装置構成は、ノズル、ターゲット、直流高圧電源からなる。ノズルに紡糸原液を供給しつつ高電圧を印加すると、紡糸原液に電気的反発力が生じ、紡糸原液がターゲットに向かって噴射され、紡糸条件が適当な場合にターゲット上にナノオーダーの繊維、すなわちナノファイバーを得ることができる。

ナノファイバーを得るための紡糸条件は、ポリマーの分子量、溶媒、溶液の濃度、印加電圧、ノズルと金属コレクターとの距離等であり、これらを適宜調節する。溶液のポリマー濃度は、使用するポリマーの種類や分子量、溶媒により異なるため、一概には言えないが、ポリマー濃度があまりにも低いと生産性が低下することや、繊維状物が得られにくいことがあり、ポリマー濃度が高すぎると粘度が上昇し噴射させにくいことから、一般的には０．１〜４０ｗｔ％程度に調整することが好ましい。

エレクトロスピニング法に用いるナノファイバー基材は、溶剤に可溶なポリマーが好ましい。エレクトロスピニング可能なポリマーとしては、ナイロン４，６、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１２、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテルイミド、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリスルフォン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリフッ化ビニリデン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、シルク、酢酸セルロース、キトサン、コラーゲン等を挙げることができる。しかし、これらに限定されるものではなく、これらのポリマーブレンドや、無機物や炭素材料を含有させることも可能である。また、溶剤に不溶なポリマーであっても熱可塑性ポリマーであれば、レーザーエレクトロスピニング法を適用することも可能である。

用いるポリマーの分子量については特に限定されることはないが、分子量が低すぎると曳糸性が低下するおそれがあり、分子量が高すぎると粘度が高くなり、紡糸が困難になるおそれがある。これらのような場合でも、ポリマー濃度を調節することによってエレクトロスピニングを可能にすることもできる。また、添加剤を加えるなどして、紡糸原液の表面張力や導電性を調整することも可能である。

用いる溶媒は、上記濃度でポリマーを溶解させることができれば特に限定されることはない。例えばアセトン、トリアセチン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの溶剤を用いることができるが、揮発性の高い溶媒を用いると溶媒が揮発することで、ノズルの先端にポリマーが詰まりやすいなどの問題が生じるおそれがある。また溶解性の向上などのため、数種類の溶媒をブレンドして用いても構わない。

印加する電圧の好ましい範囲は用いるポリマーの種類や物性により異なるため一概には言えないが、一般的には０．１〜５０ｋＶの範囲が好ましく、１ｋＶ〜４０ｋＶがより好ましい。ノズルとターゲットの距離は、用いるポリマーの種類や物性や印加電圧にもよるので一概には言えないが、距離が短すぎると放電が生じ、長すぎると噴射性が悪化することなどから１０ｍｍ〜１０００ｍｍの範囲が好ましく、３０ｍｍ〜５００ｍｍとすることがさらに好ましい。ターゲットは、平板状、ロール状、エッジ状、グリッド状など特に制限はなく、ノズルとターゲットの間に中空糸膜のメッシュを配置することで、中空糸膜のメッシュ上および、または中空糸膜のメッシュの空隙内にナノファイバーを形成することができる。

例えば、中空糸膜メッシュをターゲット上に配置してエレクトロスピニングすることによって、中空糸膜のメッシュ上にナノファイバーを配置したり、中空糸膜のメッシュ間隔を広くすることによって、中空糸膜の空隙内にもナノファイバーを配置したりすることができる。あるいは、表面または空隙にナノファイバーが配置された中空糸膜のメッシュを複数積層することも可能である。さらには、メッシュ状にする前の中空糸膜をノズルとターゲットの間に配置してエレクトロスピンングを行うことにより表面をナノファイバーで覆われた中空糸膜を作製し、これをメッシュ上に積層することも可能である。

本発明の細胞培養用足場材料を用いて、例えば、これを容器中に液密に封入することによって、細胞培養用モジュールを得ることができる。さらに、細胞培養用モジュールに、中空糸膜両端の中空糸膜中空部の開口部と、この開口部に繋がるポート部を設けることによって、中空糸膜から排出された老廃物や代謝物などを外部機器に導入することが可能となり、オンラインでの分析が可能になる。

また、本発明の細胞培養用足場材料において、２種類の中空糸膜として、ガス分離膜である中空糸膜と物質選択透過性を有する中空糸膜を用い、ガス分離膜である中空糸膜の片端中空部より酸素を含むガスを供給しつつ、もう一方の端部中空部より該ガスを排出させ、かつ選択透過性を有する中空糸膜の片端中空部より培養細胞の栄養を供給したり、もう一方の端部中空部より該培養細胞の老廃物や代謝物を排出させたり、これらの排出される成分をオンラインで分析したりすることにより、細胞を培養しながら連続的に細胞の生育状況を評価することも可能である。

さらに、本発明の細胞培養用モジュール中に培養した細胞に被験物質を投与し、老廃物や代謝物を含む溶液を中空糸膜の片端中空部より排出させ、この溶液を分析しモニタリングすることによって、被験物質を投与した場合の細胞が受けるストレスを経時的に評価することができる。
また、細胞が培養された本発明の細胞培養用モジュールにおける中空糸膜の片端中空部に被験物質を供給し、もう一方の端部より老廃物や代謝物を含む溶液を排出させ、この溶液を分析しモニタリングすることによって、細胞の状態を評価することができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらに限定されるものではない。なお、実施例中で用いた評価方法および製造装置は以下の通りである。
＜製造装置＞
メッシュ状の中空糸膜へのナノファイバーの配置は、カトーテック製のＮＥＵナノファイバーエレクトロスピングユニットを用いた。紡糸条件は、ターゲットである金属ドラムの周速度を１ｍ／ｍｉｎ、印加電圧を１２ｋＶ、ノズル先端とターゲットの距離を１２０ｍｍとした。

＜ナノファイバーの観察＞
ナノファイバーの観察は、日本電子（株）製の走査型電子顕微鏡ＪＳＭ−６０６０Ａを用いた。

＜ナノファイバーの単繊維の直径＞
ナノファイバーの単繊維の直径は、ＳＥＭ写真を画像解析ソフト（（株）プラネトロン製、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．４．５．０．２４）を用いて画像解析することによって求めた。ＳＥＭ写真のスケールに対して、画像解析のスケールが合うように調整した後、ＳＥＭ写真中の任意の２０本のナノファイバーの表面の幅を求め、その平均値をナノファイバーの単繊維の直径とした。

＜細胞形状の観察＞
細胞形状の観察は、カール ツァイス社製の共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ５ＰＡＳＣＬを用いた。

（実施例１：細胞培養足場材料の作製）
中空糸膜として、親水化された多孔質中空糸膜（三菱レイヨンエンジニアリング製ＥＸ２７０ＦＳ）（中空糸膜Ａ）と、ガス分離機能を有する三層複合中空糸膜（三菱レイヨンエンジニアリング製ＭＨＦ２００ＴＬ）（中空糸膜Ｂ）を用いた。
中空糸膜Ａを２ｍｍ間隔で配置し、次いでこれに対して概ね直交するように中空糸膜Ｂを２ｍｍ間隔で配置した。次に、先に配置した各中空糸膜Ａの間に中空糸膜Ａを、同様に先に配置した各中空糸膜Ｂの間にも中空糸膜を配置することにより、１ｍｍ間隔でそれぞれの中空糸膜を配置し中空糸膜メッシュを作製した。
この際、中空糸膜Ａと中空糸膜Ｂで構成されるメッシュ部分は約２０ｍｍ×２０ｍｍになるようにした。作製した中空糸膜メッシュをアルミホイル上に固定し、メッシュ部分にのみナノファイバーが形成されるように、メッシュ部分以外の場所をテープで覆った後、アルミホイルとともにドラム型のターゲットに固定した。
ナノファイバー基材としては、重量平均分子量（Ｍｗ）が約３５００００、アクリロニトリル含量が約９７％のポリアクリロニトリル系重合体を用いた。このポリアクリロニトリル系重合体をジメチルアセトアミドに１０ｗｔ％になるように溶解して紡糸原液とした。この紡糸原液を１８Ｇのノズル（ニードル）が取り付けられたシリンジ内に充填し、作製した中空糸膜メッシュ上にエレクトロスピニングを行って細胞培養用足場材料を作製した。
エレクトロスピニングした後、エレクトロスピニングされた中空糸膜メッシュを固定するため、メッシュ部分の周囲から約１５ｍｍほど離れた位置をポッティングした。ポッティングにはポリウレタン樹脂を用いた。ポリウレタン樹脂は、日本ポリウレタン工業（株）のコロネート４４０３とニッポラン４２２３を１／１（ｗｔ比）で調合したものを使用し、メッシュ部分の周囲から約１５ｍｍほど離れた位置に型枠を設けてその外側の中空糸膜部分をポッティング樹脂で固めた。
得られた細胞培養用足場材料の光学顕微鏡写真を図１、図２に示す。図１は作製した足場材料の全体像、図２はメッシュ部分の断面写真である。
これらより、中空糸膜メッシュ上にエレクトロスピニングすることにより中空糸膜メッシュ上にナノファイバーが形成されていることがわかる。
図３、図４は、得られた細胞培養用足場材料の走査型電子顕微鏡で観察した写真であり、それぞれナノファイバーの表面および断面である。図３の写真から画像解析を行った結果、ナノファイバー単繊維の直径は約１５０ｎｍであるとともに、図４からナノファイバー層の厚さは、５〜５０μｍであることが分かる。

（実施例２：細胞培養用モジュールの作製）
中空糸膜Ａおよび中空糸膜Ｂは実施例１と同じものを用いた。また、中空糸膜Ａを４ｍｍ間隔で配置し、次いでこれに対して概ね直交するように中空糸膜Ｂを４ｍｍ間隔で配置した。次に、先に配置した各中空糸膜Ａの間に中空糸膜Ａを、同様に先に配置した各中空糸膜Ｂの間にも中空糸膜を配置することにより、２ｍｍ間隔でそれぞれの中空糸膜を配置し、中空糸膜Ａと中空糸膜Ｂで構成されるメッシュ部分を約１０ｍｍ×１０ｍｍとした以外は、実施例１と同様にして細胞培養用足場材料を作製した。
次いで、中空糸膜メッシュ部分の周囲から約１ｍｍの位置から外側に幅約５ｍｍで、実施例１と同じポッティング樹脂を用いて型枠を作製した。さらに中空糸膜の先端をシリコンチューブを用いて束ね、シリコンチューブ内と束ねた中空糸膜の外側を上記と同じポッティング樹脂で固め、ポート部を作製した（図５）。

（実施例３：ウシ血管内皮細胞の培養）
中空糸膜Ａと中空糸膜Ｂで構成される中空糸膜メッシュを１００ｍｍ×１００ｍｍとした以外は、実施例２と同様にして、細胞培養用足場材料を作製した。
この細胞培養足場材料のメッシュ部分を中心から直径２１ｍｍで円形に切り出したものを、実施例１で用いたポッティング用ウレタン樹脂を用い、円形カバーグラス(松浪硝子工業（株）製、φ２１ｍｍ)に固定し、これを６穴細胞培養プレートのウェル底面に置いて細胞培養を行った。その際、比較として、上記で作製した細胞培養用足場材料からナノファイバーを除去して中空糸膜メッシュのみとしたものも用い、細胞培養を行った。
細胞培養に用いるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、日本製薬（株）製のＤＭＥＭ試薬を用いて調製した。
カバーグラスを置いた細胞培養プレートの各ウェルにウシ血管内皮細胞（理化学研究所細胞バンクから入手）を０．５×１０^６ Ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ_２ 条件下で培養した。
１週間培養後、カバーグラスを細胞培養プレートから取り出し共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した。
図６、図７は細胞培養足場材料に接着した細胞を共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した写真であり、図６はナノファイバーがある細胞培養足場材料での、図７はナノファイバーを除去した細胞培養足場材料での写真である。
図６から、ナノファイバーがある細胞培養足場材料ではウシ血管内皮細胞が細胞培養足場材料全面に広がっている。これは細胞培養足場材料が細胞培養に適した材料であることがわかる。また、中空糸のある部分でも細胞が接着していることは中空糸膜から栄養や酸素が供給される際に有利である。
図７から、ナノファイバーを除去した細胞培養足場材料ではウシ血管内皮細胞が中空糸膜の一部に接着しているだけであることがわかる。これは細胞培養足場材料に多くの細胞を接着させるためにナノファイバーがあることが有効であることを示している。

本発明によれば、医薬品、化学物質、化粧品など物質の薬効試験、毒性試験、安全性試験を、容易かつ迅速に行うことができる。

実施例で得られた細胞培養用足場材料の光学顕微鏡写真 実施例で得られた細胞培養用足場材料の光学顕微鏡写真 実施例で得られた細胞培養用足場材料の走査型電子顕微鏡写真 実施例で得られた細胞培養用足場材料の走査型電子顕微鏡写真 実施例２で得られたポート部を有する細胞培養用モジュールの写真 実施例３で得られた細胞培養用足場材料に接着した細胞の共焦点顕 微鏡写真 実施例３で得られた細胞培養用足場材料に接着した細胞の共焦点顕 微鏡写真

Claims (5)

1. 親水化処理された中空糸膜と、ガス分離機能を有する三層複合中空糸膜とがメッシュ状に配置され、該メッシュ上に、単繊維の直径が１〜１０００ｎｍのナノファイバーが配置された、細胞培養足場材料。
2. １〜２ｍｍ間隔で中空糸膜がメッシュ状に配置されている、請求項１記載の細胞培養足場材料。
3. ナノファイバーとして、ポリアクリロニトリル系重合体を用いた、請求項１又は２記載の細胞培養足場材料。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養足場材料を用いた、細胞培養用モジュール。
5. 中空糸膜両端の中空糸膜中空部の開口部と、該開口部に繋がるポート部とを有する、請求項４記載の細胞培養用モジュール。